Lamivudine Meningkatkan Penurunan Kognitif pada Tikus SAMP8: Mengintegrasikan dalam Evaluasi Farmakologi Vivo dan Farmakologi Jaringan
May 30, 2023
Taxol Alternatif Ramuan Cina Cistanche
Kata kunci:Aspergillus favus · Jojoba · Jamur endofit · Nanopartikel emas · Taxol · -Iradiasi · Pengoptimalan nutrisi
Perkenalan
Taxol adalah salah satu spektrum luas yang paling dikomersialkanobat antikanker[1]. Aktivitas Taxol berkembang dari spesifisitasnya yang unik untuk mengikat heterodimer tubulin-subunit seluler, mempromosikan polimerisasi tubulin, sehingga mengganggu pembelahan mitosis sel tumor [2]. Taxol menunjukkan aktivitas yang kuat melawan payudara, paru-paru, kepala, dan leher, kanker rahim, dan bentuk lanjutan dari sarkoma Kaposi [3]. Taxol pertama kali dihasilkan dari kulit pohon yew Taxus brevifolia "famili Taxaceae" [4, 5]; Namun, hasil yang lebih rendah dari Taxol yang sedang<0.001%, i.e., to produce 1 g Taxol, it requires~10 kg of plant bark that collected from 3 to 5 trees [6], is the main challenge. In addition, the vulnerability of this plant to unpredicted fluctuations with the environmental conditions strongly influences the Taxol yield, heterogeneity, and reproducibility [7–9]. Exploring the Taxol producing potency of the endophytic fungi inhabiting medicinal plants raises the hope for overcoming the low yield by the above-mentioned method [10, 11], due to their fast growth, cost-effectiveness, independence on climatic changes, and feasibility for genetic manipulation [12, 13]. Subsequently, a plethora of endophytic fungi with metabolic potency to produce Taxol has been reported as reviewed [1, 14–25]. However, the anticipation of these fungi for industrial production of Taxol has been challenged by the attenuation and loss of Taxol productivity by the fungal storage and multiple subculturing [21, 22, 26–28]. Thus, searching for a novel fungal isolate with affordable metabolic stability and sustainability for Taxol production is the challenge. Medicinal plants of well-known ethnopharmacological relevance and traditional pharmaceutical applications could be the repertoire of novel fungal isolates with unique features of metabolic stability for Taxol biosynthesis. Among the most common medicinal plants, jojoba "Simmondsia chinensis" is a monogenetic dioecious grey-green shrub belonging to the Simmondsiaceae family. Jojoba seeds contain up to 65% of light golden and odorless high-viscosity oily metabolites [29]. Jojoba oil has been frequently used for the relief of headaches, throat inflammation, and wound treatment [30, 31]. As well as Jojoba oil has been used as an anti-inflammatory and antimicrobial agent [30, 31]. The leaves of jojoba are rich with antioxidant flavonoid compounds that are traditionally used for treating of various disorders such as asma,peradangan, Dankanker[32]. Dengan demikian, tujuan utama dari pekerjaan ini adalah untuk mengeksplorasi isolat jamur baru dari tanaman jojoba dengan stabilitas metabolisme yang unik untuk produksi Taxol, untuk mengevaluasi berbagai pendekatan untuk memaksimalkan hasil Taxol mereka, serta untuk meningkatkan aktivitas antiproliferatif dari senyawa Taxol yang diekstraksi. melalui konjugasi dengan nanopartikel emas, dimediasi oleh iradiasi gamma.
Bahan dan metode
Isolasi dan Kultur Jamur Endofit
Berbagai bagian jojoba (Simmondsia chinensis) seperti daun, kulit kayu, ranting, dan tunas dikumpulkan dari Fakultas Pertanian, Universitas Kairo, dan digunakan sebagai sumber jamur endofit. Bagian tanaman dikumpulkan dan dicuci dengan air keran mengalir, permukaannya disterilkan dengan etanol 70 persen selama 1 menit dan kemudian dibilas dengan air steril [28]. Bagian tanaman yang telah disterilkan permukaannya dipotong menjadi potongan-potongan kecil dalam kondisi steril dan ditempatkan pada media agar kentang dekstrosa (PDA), Czapek's-Dox, dan media agar ekstrak malt [33-36], dan pelat tersebut diinkubasi pada suhu 30 derajat selama 10 hari. Efektivitas sterilisasi permukaan bagian tanaman dinilai dengan sentrifugasi air bilasan, kemudian 500 ul air steril ditambahkan ke endapan dan disepuh ke dalam media PDA [37]. Isolat jamur endofit yang telah dimurnikan diinokulasi pada PDA miring selama 7 hari dan disimpan pada suhu 4 derajat.
Skrining, Ekstraksi, dan Kuantifikasi Taxol dari Jamur Endofit
Jamur endofit pulih yang menghuni jojoba disaring untuk produksi Taxol dengan menumbuhkan kaldu dekstrosa kentang (PDB) [38]. Satu steker dari masing-masing isolat fun gal berumur 7 hari diinokulasi ke dalam 100 ml tugas Erlenmeyer PDB/250 ml, diinkubasi selama 15 hari pada suhu 30±1 derajat , dalam kondisi gemetar (120 rpm). Setelah inkubasi, biakan disaring, dan filtrat diubah dengan 0,2 persen natrium bikarbonat untuk mengendapkan asam lemak. Taxol telah diekstraksi dengan diklorometana, dan fase organik dikumpulkan dan diuapkan hingga kering, dan residunya dilarutkan kembali dalam metanol [17, 39]. Taxol dipisahkan dan diidentifikasi dengan TLC menggunakan Merck 1 mm (20×20 cm) pre-coated silica gel plates (TLC Silica gel 60 F254, Darmstadt, Jerman), dideteksi dengan penyinaran UV pada 254 nm [39]. Bintik-bintik yang diduga Taxol dikikis dari pelat gel silika TLC dan dilarutkan dalam metanol, divortex dengan kuat selama 10 menit, dan disentrifugasi pada 1000 rpm selama 5 menit. Partikel silika yang diendapkan dihilangkan, dan supernatan diambil untuk kuantifikasi Taxol dan pemeriksaan kemurnian dengan HPLC (YOUNG In, Chromass, 9110 plus Quater nary Pump, Korea) dari kolom fase terbalik C18 (Eclipse Plus C18 4.6 ×150 mm, 3,5 μm, Kat. # 959,963–902). Fase gerak yang digunakan adalah metanol/asetonitril/air (25:35:40, v/v/v) dengan laju aliran 1,0 ml/menit selama 20 menit [40], dan fraksi Taxol diukur pada 227 nm, dan identitas dan konsentrasi kimia dikonfirmasi dari waktu retensi dan daerah puncak serapan dibandingkan dengan sampel asli.
Identifikasi Morfologis dan Molekuler Jamur Endofit yang Dipulihkan
Isolat jamur endofit diidentifikasi hingga tingkat spesiesnya berdasarkan ciri makro dan mikromorfologinya dengan menumbuhkan media PDA, Czapek's-Dox, dan ekstrak malt sesuai dengan kunci referensi [33-36]. Identitas isolat jamur penghasil Taxol yang paling kuat selanjutnya dikonfirmasi secara molekuler berdasarkan urutan internal transcribed spacer (ITS) [41, 42]. DNA genomik jamur (gDNA) diekstraksi dengan menghancurkan miselia (~0.2 g) dalam nitrogen cair, lalu memasukkannya ke dalam 1 ml buffer ekstraksi CTAB (2 persen CTAB, 2 persen PVP40, { {21}}.2 persen 2-mercaptoethanol, 20 mM EDTA, 1,4 M NaCl dalam 100 mM Tris−HCl, pH 8.0). Set primer PCR adalah ITS4 5′-GGAAGTAAAAGTCGT AACAAGG-3′ dan ITS5 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′. Reaksi PCR mengandung 10 ul campuran induk 2×PCR (i-Taq™, Kat. No. 25027), 2 ul gDNA, 1 ul tiap primer (10 pmol/ul), dan diisi hingga 20 ul dengan suling steril air. PCR diprogram untuk denaturasi awal pada 94 derajat selama 2 menit, denaturasi pada 94 derajat selama 30 detik, anil pada 55 derajat selama 10 detik, ekstensi pada 72 derajat selama 30 detik selama 35 siklus, dan ekstensi akhir pada 72 derajat selama 2 min. Amplikon PCR dianalisis dengan gel agarosa 1,5 persen dalam bufer 1×TBE (Ambion Cat# AM9864), menggunakan 1 kb DNA ladder (Cat. # PG010-55DI) dan divisualisasikan dengan sistem dokumentasi gel. Amplikon dimurnikan dan diurutkan oleh Applied Biosystems Sequencer, HiSQV Bases, Versi 6.0 dengan set primer yang sama. Urutan yang diperoleh adalah pencarian BLAST secara non-redundan pada database NCBI, diimpor ke perangkat lunak MEGA 6.0, dan diselaraskan dengan algoritme otot Clustal W [43] dan pohon filogenetik dibangun dengan metode penggabungan tetangga dari MEGA 6.0 [44].
Struktur Kimia Taxol yang Diekstraksi
Bintik-bintik diduga Taxol dikikis dari pelat gel silika TLC dan dimurnikan, dan kemurnian serta konsentrasi ditentukan oleh analisis UV-Vis pada λ 227 nm (RIGOL, Ultra-3000 Series) dibandingkan dengan Taxol asli [39]. Media kosong dalam kondisi yang sama digunakan sebagai baseline negatif untuk analisis spektrofotometri. Spektrum FT-IR dari sampel Taxol murni dianalisis dengan spektrofotometer JASCO FT-IR 3600. Sampel Taxol dihaluskan dengan pelet KBr, ditekan menjadi cakram di bawah vakum, dan penyerapannya diukur di wilayah 400 hingga 4000 cm−1 [3], dibandingkan dengan yang asli. Struktur kimia Taxol yang diekstraksi dikonfirmasi dari spektroskopi HNMR (JEOL, ECA-500II, 500 MHz NMR) dibandingkan dengan Taxol asli. Sampel dilarutkan dalam CDCl3, pergeseran kimia diberikan dalam ppm (skala δ), dan konstanta kopling dinyatakan dalam hertz (Hz).
Pengaruh Berbagai Jenis Media terhadap Produksi Taxol
Dua sumbat agar (9 mm) dari biakan berumur 7 hari dari masing-masing isolat jamur diinokulasi dalam rangkap tiga ke dalam 100 ml medium/250 ml labu Erlenmeyer dari dextrose kentang (PDB), Czapekʼs-Dox (CZD), M1D, dan ekstrak malt (ME ) media kaldu. Kontrol yang tidak diinokulasi dari masing-masing media yang bebas spora jamur digunakan sebagai kontrol negatif, diinkubasi pada suhu 30 derajat selama 15 hari dalam kondisi yang sama. Setelah inkubasi, biakan jamur disaring, dan Taxol diekstraksi dan ditentukan seperti yang disebutkan di atas.
Optimasi Bioproses Kondisi Gizi untuk Memaksimalkan Hasil Taxol
Optimalisasi komposisi media untuk memaksimalkan hasil Taxol oleh isolat jamur ampuh dilakukan dengan metodologi permukaan respon menggunakan desain Placket-Burman diikuti dengan desain komposit pusat [17-20, 45]. Dari desain RSM, variabel positif dan signifikan yang mempengaruhi produksi Taxol oleh isolat jamur kuat dinilai menggunakan paket perangkat lunak statistik oleh Design-Expert 7.0 (Stat Ease Inc., Minneapolis, USA). Setiap percobaan dijalankan dalam tiga ulangan biologis dan nilai rata-rata dipertimbangkan. Setelah inkubasi pada kondisi yang diinginkan, biomassa jamur disaring, dan Taxol diekstraksi dan diukur dengan TLC dan HPLC seperti dijelaskan di atas.
Desain Plaket‑Burman
Desain saku rok-Burman telah sering digunakan untuk optimalisasi komponen media untuk pertumbuhan jamur dan produksi metabolit sekunder bioaktif, mengevaluasi variabel signifikan yang mempengaruhi produksi Taxol [18, 20, 46]. Pemilihan faktor didasarkan pada media yang digunakan dalam penapisan kualitatif dan kuantitatif. Sebelas faktor telah dimasukkan; ekstrak malt, pepton, sukrosa, soytone, glutamin, ekstrak daging sapi, dan suhu, pH, waktu inkubasi, dan nilai dan faktor kecepatan pengocokan bervariasi pada dua level, dan rentang level minimum dan maksimum dipilih. Statistik Design-Expert 7.0 digunakan untuk menghasilkan 12 percobaan. Untuk setiap percobaan, produksi Taxol ditentukan dalam tiga ulangan biologis, dan rata-rata hasil Taxol dipertimbangkan.
Analisis regresi data dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak statistik. Pengaruh masing-masing variabel dihitung (Biometrika, 2020), menggunakan persamaan berikut:
di mana, E adalah efek dari variabel pengujian, M plus , dan M− adalah konsentrasi Taxol percobaan pada parameter yang masing-masing berada pada level yang lebih tinggi dan lebih rendah, dan N adalah jumlah percobaan yang dilakukan. Pengaruh masing-masing variabel terhadap produksi ditentukan dengan menghitung nilai-E masing-masing.
Dimana Tot tinggi adalah total respon pada level tinggi, Tot rendah adalah total respon pada level rendah, dan No adalah jumlah percobaan.
Rancangan Komposit Sentral dan Interaksi Antar Faktor Yang Mempengaruhi Produksi Taxol
Faktor positif paling signifikan yang mempengaruhi produksi Taxol oleh isolat jamur terpilih dioptimalkan menggunakan desain eksperimen model CCD tipe permukaan respons [47]. Dengan menggunakan CCD, konsentrasi komponen media dioptimalkan, dan interaksinya yang dipelajari digunakan untuk menghasilkan total 20 percobaan untuk ketiga variabel. Untuk menentukan tingkat optimal variabel untuk produksi Taxol dari isolat jamur potensial, kurva permukaan respon tiga dimensi (3D) diplot untuk mempelajari interaksi antara berbagai faktor dan untuk menentukan kondisi variabel dari masing-masing faktor yang mempengaruhi produksi Taxol. Grafik 3D dilakukan dengan menahan konstanta tiga faktor pada tingkat yang ideal dan memplot respons hasil Taxol yang diperoleh untuk berbagai tingkat dari dua faktor lainnya.
Pengaruh Iradiasi Gamma terhadap Hasil Taxol
Isolat endofit kuat yang menghasilkan Taxol terpapar -iradiasi dengan 60sumber Kobalt (sel Gamma 4000-A-India) pada dosis radiasi gamma yang berbeda (0.25–3.0 kGy) dibandingkan untuk kontrol budaya non-iradiasi; laju dosis 1,2 kGy/jam pada saat percobaan. Media yang dioptimalkan diinokulasi oleh biakan iradiasi di bawah kondisi kultur standar, dibandingkan dengan inokulum spora yang tidak diiradiasi sebagai kontrol. Kultur diinkubasi pada 30 ± 2 derajat selama 15 hari pada rotary shaker (120 rpm). Setelah inkubasi, biakan disaring dan Taxol diekstraksi, dimurnikan, dan diukur dengan TLC dan HPLC seperti dijelaskan di atas.
Sintesis dan Karakterisasi Nanopartikel Emas (AuNPs); Konjugasi dengan Taxol
Aktivitas Antikanker Taxol
Aktivitas konjugat Taxol dan Taxol-PVP-AuNP yang dimurnikan terhadap karsinoma hati (HPG2), dan karsinoma payudara (MCF7) ditentukan oleh 3- (4,5-dimethylthiazol- 2-yl) uji -2,5-difenil tetrazolium bromida (MTT) [48]. Pelat sumur 96-disemaikan dengan 103 sel per sumur, dan diinkubasi semalaman pada suhu 37 derajat , kemudian ditambahkan konsentrasi obat yang berbeda, dan pelat diinkubasi kembali selama 48 jam. Reagen MTT (25 ul) ditambahkan, dan diinkubasi selama 2 jam, dan warna ungu dari kompleks formazan yang dikembangkan diukur pada λ570 nm. Nilai IC50 dinyatakan dengan jumlah obat yang mengurangi pertumbuhan 50 persen dari jumlah awal sel tumor yang dinormalisasi menjadi kontrol positif.
Aktivitas Antimikroba dari Konjugat Taxol dan Taxol-AuNPs
Aktivitas antimikroba konjugat Taxol dan Taxol-AuNPs dinilai terhadap isolat bakteri yang berbeda; Bacillus subtilis ATCC 6633 dan Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, dan Enterobacter agglomerans, selain Candida albicans. Sel bakteri yang diuji disuspensikan dalam air pepton steril untuk mendapatkan inokulum standar ~0.5 McFarland (1–1.5)× 1{{10}}8 CFU/ ml pada λ6{{18 }}0 nm. Penghambatan pertumbuhan (mm) pertumbuhan mikroba patogen dinilai dengan metode difusi cakram agar. Disk antibiotik standar steril dengan diameter 6,0 mm digunakan sebagai kontrol positif. Cakram antibiotik steril (6,0 mm) diisi dengan 20 ul metanol dan asam amoksisilin-klavulanat (AMC) sebagai kontrol negatif dan positif. Disk dimuat dengan konsentrasi Taxol, Taxol-PVP-AuNPs, dan AuNPs yang sama (1,0 ug/ml). Tiga ulangan biologis disiapkan. Pelat diinkubasi pada 37 derajat selama 24 jam, dan zona inhibisi diukur. Asam klavulanat amoksisilin (AMC) dan nistatin digunakan untuk menormalkan aktivitas antimikroba Taxol. Zona hambat pertumbuhan ditentukan dengan vernier caliper (mm).
Analisis Statistik
Perbedaan Fisher yang paling tidak signifikan dari uji post hoc.
Deposisi jamur
Hasil
Isolasi Jamur Endofit dari Jojoba; Penyaringan untuk Produksi Taxol
Dua puluh empat isolat jamur endofit ditemukan dari kulit batang, ranting, daun, dan tunas jojoba yang dimuat pada media PDA, CZD, dan ME. Isolat jamur ini berasal dari kulit kayu (6 isolat), ranting (7 isolat), daun (4 isolat), dan pucuk (7 isolat) seperti yang tercatat pada Tabel 1. Isolat jamur ini diidentifikasi terlebih dahulu sampai tingkat spesies berdasarkan morfologinya. fitur menurut kunci universal, termasuk dalam tiga genus, yaitu Aspergillus, Penicillium, dan Fusarium. Di antara isolat tersebut, prevalensi genus Aspergillus dilaporkan (83,4 persen ), sedangkan Fusarium dan Penicillium diwakili oleh 8,3 persen . Genus Aspergillus diwakili oleh lima spesies yaitu A. favus (3 isolat), Aspergillus oryzae (5 isolat), A. niger (5 isolat), A. fumigatus (4 isolat), dan A. terreus (3 isolat). Produktivitas Taxol oleh isolat jamur yang dipulihkan dinilai dengan menumbuhkan PDB, inkubasi pada kondisi standar, ekstraksi, dan kuantifikasi Taxol dengan TLC dan HPLC (Gbr. 1). Dari hasil tersebut, produktivitas Taxol maksimum dilaporkan oleh A. favus Bd1 (88,65 µg/l), diikuti oleh P. polonicum Br1 (54,42 µg/l), A. niger Lv1 (43,95 µg/l), A. oryzae Bd1 (38,87 µg/l), F. oxysporum Tw1 (26,80 µg/l), A. niger Lv2 (23.01 µg/l), dan A. fumigatus Bd2 (17,62 µg/ l). Identitas kimia struktural Taxol dari produsen jamur tertinggi terungkap dari spektrum UV-Vis mereka, dibandingkan dengan spektral kimia dari Taxol asli. Selain itu, struktur kimia Taxol yang diekstraksi dari empat isolat jamur paling ampuh telah divalidasi oleh analisis FT-IR (Gbr. 1). Hebatnya, Taxol yang diekstraksi dari isolat jamur yang kuat menunjukkan paradigma spektral yang sama dengan Taxol asli. Puncak pada 3393,3 cm−1 ditetapkan untuk hidroksil (OH). Sementara puncak di 2923.5 ditetapkan ke regangan CH alifatik, puncak di 1661.0 cm−1 sesuai dengan frekuensi peregangan C=O. Puncak yang diamati pada 1452.0–1404.0 cm−1 disebabkan oleh frekuensi peregangan NH. Frekuensi peregangan gugus karbonil-oksigen diamati pada 1109 cm−1. Puncak yang diamati pada rentang 1020–979,7 cm−1 disebabkan oleh adanya tikungan C dan H aromatik. Dari analisis kromatografi dan spektral dapat disimpulkan bahwa Taxol yang diekstrak identik dengan aslinya. Rupanya, aktivitas metabolisme dari spesies jamur yang sama sangat berfluktuasi dengan tanaman yang berbeda, memastikan interaksi biologis yang unik dan pelepasan sinyal spesifik dari bagian tanaman untuk memicu ekspresi sistem mesin biosintesis Taxol. Menariknya, fluktuasi pada sistem metabolisme tidak hanya bergantung pada bagian tanaman tetapi juga pada interaksi isolat-isolat, misalnya rendemen Taxol dari isolat A. niger yang menghuni daun jojoba adalah 43,9 µg/l, sedangkan rendemen Taxol adalah nol untuk isolat A. niger yang diambil dari kulit tanaman.
Identifikasi Morfologis dan Molekuler Penghasil Taxol Ampuh
Fitur morfologis dari isolat jamur kuat yang memproduksi Taxol diperiksa sesuai dengan kunci deskriptif makroskopis dan mikroskopis, seperti yang dijelaskan dalam Bahan dan Metode, dan mengungkapkan kedekatan morfologisnya dengan A. favus (Gbr. 2). Isolat jamur ditumbuhkan pada PDA pada suhu 30 derajat selama 10 hari dan gambaran makroskopis dan mikroskopis mengungkapkan identitasnya seperti kepala konidial, cara percabangan, identitas stigma, dan ontologi konidial, dan pembentukan tubuh buah, menurut universal kunci morfologi [33], dan ditemukan identik dengan Aspergillus favus. Isolat A. favus penghasil Taxol yang kuat diidentifikasi lebih lanjut berdasarkan urutan ITS mereka, menggunakan gDNA sebagai templat. Amplikon PCR (~550 bp) dari A. favus diselesaikan, dimurnikan, dan diurutkan (Gbr. 2). Urutan ITS dari A. favus adalah ledakan non-redundan yang dicari di database NCBI, menampilkan 99 persen kemiripan dengan A. favus, dengan nilai E. nol, dan cakupan kueri 95 persen. Dengan demikian, dari analisis mikroskopis dan molekuler, isolat target dipastikan sebagai A. favus dan diendapkan pada GenBank dengan nomor aksesi MW485934.1, serta isolat tersebut telah diendapkan di Assiut University Mycological Center (AUMC), Mesir dengan nomor deposisi AUMC13892. Isolat saat ini memiliki kemiripan 99 persen dengan isolat A. favus MW485934, MT446145, KJ863514, MW522551,
Gbr. 1 Tampilan morfologi tanaman jojoba. B Plate kultur jamur endofit penghasil Taxol yang kuat; A. favus Bd1 (13), A. niger Lv1 (21), Penicillium polonium (23), dan A. oryzae Bd (25) pada PDA setelah 8 hari inkubasi pada suhu 30 derajat . Isolat jamur ditanam pada PDB, dan diinkubasi pada kondisi standar, dan Taxol diekstraksi dan diperiksa dengan TLC (C). D kromatogram HPLC dari Taxol dari isolat jamur kuat. E Hasil Taxol yang dihitung dari HPLC. F, analisis spektral UV-Vis dari Taxol yang diekstraksi dari isolat jamur. Analisis G FT-IR dari Taxol yang diekstraksi dibandingkan dengan yang asli
Gambar 2 Gambaran makromorfologi A. favus endofit jojoba setelah 3, 5, dan 8 hari pertumbuhan pada PDA. Ciri mikromorfologi, konidia kepala A. favus dengan perbesaran 400X. C PCR amplikon A. favus wilayah ITS 500 bp, normalisasi ke tangga 1 kb (Kat.#. SM0312). D Analisis filogenetik ITS A. favus dengan metode kemungkinan maksimum [44]
