Penghambatan Kv1.3 Melemahkan Peradangan Saraf Melalui Gangguan Pensinyalan Kalsium Mikroglial
Jul 07, 2023
ABSTRAK
Dalam 5 tahun terakhir inhibitor saluran kalium KV1.3 telah terbukti mengurangi peradangan saraf pada model tikus stroke iskemik, penyakit Alzheimer, penyakit Parkinson, dan cedera otak traumatis. Pada tingkat sistemik, tindakan menguntungkan ini dimediasi oleh pengurangan aktivasi mikroglia dan penekanan sitokin proinflamasi dan produksi oksida nitrat.
Namun, mekanisme molekuler untuk tindakan supresif penghambat KV1.3 pada fungsi mikroglia pro-inflamasi tidak diketahui sampai kelompok kami baru-baru ini menunjukkan bahwa saluran KV1.3 tidak hanya mengatur potensi membran, seperti yang diharapkan dari saluran kalium berpintu tegangan. , tetapi juga memainkan peran penting dalam memungkinkan mikroglia untuk melawan depolarisasi yang dihasilkan oleh sinyal bahaya ATP sehingga mengatur masuknya kalsium melalui reseptor P2X4. Kami di sini meninjau peran KV1.3 dalam pensinyalan mikroglial dan menunjukkan bahwa, serupa dengan perannya dalam sel T, saluran KV1.3 juga mengatur masuknya kalsium yang dioperasikan di toko dalam mikroglia.
Saluran kalium KV1.3 adalah saluran ion yang diekspresikan secara luas dalam sel imun, yang berperan penting dalam pengaturan potensi membran sel, migrasi sel, dan fungsi sel imun. Penelitian terbaru menunjukkan bahwa senyawa yang menghambat saluran kalium KV1.3 dapat membantu meningkatkan kekebalan tubuh.
Mengatur sistem kekebalan tubuh adalah bagian penting dari menjaga kesehatan yang baik. Namun, banyak penyakit, seperti penyakit autoimun, kanker, dan penyakit menular, mengakibatkan disfungsi sistem kekebalan tubuh. Oleh karena itu, para peneliti telah mencari cara untuk meningkatkan kekebalan tubuh. Studi terbaru menunjukkan bahwa penghambat saluran kalium KV1.3 dapat menjadi pilihan yang menjanjikan.
Dalam sel kekebalan, saluran kalium KV1.3 mengatur potensi membran, sehingga memengaruhi fungsi sel. Studi tersebut menemukan bahwa dengan menghambat saluran kalium KV1.3, dimungkinkan untuk mengurangi migrasi sel T dan selanjutnya mencegahnya menyerang sel sehat, sehingga melindungi sistem kekebalan dari kerusakan yang tidak perlu.
Selain itu, beberapa percobaan telah menemukan bahwa menghambat saluran kalium KV1.3 juga dapat meningkatkan aspek lain dari sistem kekebalan tubuh. Misalnya, penelitian telah menunjukkan bahwa dengan menghambat saluran ini, kualitas dan kuantitas sel kekebalan dapat ditingkatkan, sehingga meningkatkan daya tahan tubuh terhadap patogen dan ancaman eksternal lainnya. Oleh karena itu, penghambatan saluran kalium KV1.3 dapat menjadi cara yang efektif untuk meningkatkan kekebalan.
Sebagai kesimpulan, studi saat ini menunjukkan bahwa penghambatan saluran kalium KV1.3 mungkin merupakan pendekatan yang menjanjikan untuk meningkatkan fungsi sistem kekebalan dan meningkatkan kekebalan tubuh secara keseluruhan. Namun meski temuan ini menjanjikan, penelitian lebih lanjut diperlukan untuk menentukan keamanan dan kelayakan penggunaan pendekatan ini. Dari sudut pandang ini, kita perlu meningkatkan kekebalan kita. Cistanche dapat meningkatkan kekebalan secara signifikan. Abu daging mengandung berbagai bahan aktif biologis, seperti polisakarida, dua jamur, dan Huang Li, yang dapat merangsang sistem kekebalan tubuh. berbagai jenis sel, meningkatkan aktivitas kekebalan mereka.
Klik manfaat kesehatan dari cistanche
Perkenalan
Voltage-gated potassium channel KV1.3 awalnya dijelaskan dalam sel T [1] dan selanjutnya digunakan sebagai target untuk mengobati penyakit autoimun yang dimediasi sel T seperti multiple sclerosis, rheumatoid arthritis, dan psoriasis [2-4]. Baru-baru ini KV1.3 telah muncul sebagai target farmakologis yang menarik untuk mengurangi apa yang disebut "radang saraf" dengan memodulasi aktivasi mikroglia. Pada tikus dan tikus model stroke iskemik, penghambat KV1.3 telah ditunjukkan oleh kami dan yang lainnya untuk mengurangi area infark dan memperbaiki defisit neurologis [5,6]. Pada model tikus transgenik penyakit Alzheimer blokade KV1.3 menurunkan beban amiloid serebral, meningkatkan plastisitas neuron hippocampal, dan memperbaiki defisit perilaku [7].
Demikian pula, pada beberapa model hewan dari penyakit Parkinson pemberian molekul kecil KV1.3 blocker PAP-1 menghambat degenerasi neuron dopaminergik dan meningkatkan hasil perilaku [8]. Penghambatan KV1.3 atau penghapusan genetik selanjutnya telah terbukti memperbaiki patologi materi putih setelah cedera otak traumatis [9], penurunan kognitif pasca operasi [10], dan cedera otak akibat radiasi [11]. Dalam semua model hewan dari penyakit neurologis ini, peningkatan ekspresi KV1.3 diamati pada mikroglia terkait patologi dan pengobatan dengan penghambat KV1.3 menghasilkan penurunan aktivasi mikroglia dan penurunan tingkat sitokin inflamasi di otak hewan.
Peningkatan ekspresi KV1.3 terkait penyakit tampaknya diterjemahkan ke manusia karena ekspresi KV 1.3 yang kuat juga telah ditemukan pada otak manusia postmortem pada mikroglia di daerah infark setelah stroke iskemik [5,12], pada mikroglia yang mengelilingi plak amiloid pada penyakit Alzheimer [5,12] 7,13], dan pada mikroglia di korteks prefrontal dan substansia nigra pada penyakit Parkinson [8]. Secara bersama-sama, temuan yang menggembirakan pada model manusia dan hewan ini sangat menyarankan saluran KV1.3 mikroglial sebagai target terapi untuk mengurangi respons peradangan yang merugikan di otak. Tapi bagaimana cara kerja pemblokir KV1.3? Bagaimana memblokir saluran potasium bergerbang voltase dalam mikroglia, dan mungkin juga makrofag turunan monosit infiltrasi otak mengurangi produksi sitokin inflamasi dan kerusakan jaringan yang dimediasi peradangan?
Efek KV1.3 Blocker pada fungsi mikroglia
Mikroglia tikus dan tikus neonatal yang dikultur, serta mikroglia yang diisolasi secara akut dari otak tikus atau mikroglia yang dicetak jaringan dari otak tikus, telah terbukti mengekspresikan arus KV1.3 oleh penjepit sel utuh yang meningkat secara substansial setelah stimulasi in vitro atau in vivo injeksi intracerebroventricular dengan TLR -4 ligan lipopolysaccharide (LPS) [14-18]. Stimulasi dengan komponen dinding sel gram negatif LPS secara luas digunakan untuk menginduksi keadaan "M1-like" yang diaktifkan secara "klasik" dari mikroglia yang mensimulasikan peradangan umum yang akan dikaitkan dengan infeksi bakteri [19,20]. Dalam bidang neuroimunologi mikroglia yang distimulasi LPS idealnya disebut mikroglia M(LPS) berdasarkan stimulus yang digunakan untuk menginduksi polarisasi untuk menghindari penggunaan terminologi M1/M2, yang dianggap terlalu disederhanakan [21], tetapi digunakan secara luas karena sifat terapeutiknya. daya tarik.
Mengikuti stimulasi dengan LPS, peningkatan ekspresi KV1.3 dapat diamati pada level mRNA dan level protein dengan Western blotting, imunohistokimia, dan peningkatan densitas arus yang diukur dengan patch-clamp sel utuh [15-18]. Peningkatan ekspresi Kv1.3 yang serupa, tetapi sedikit kurang intens terjadi ketika mikroglia neonatal yang dikultur dirangsang dengan oligomer amyloid- (AO) atau -synuclein [7,8], dua protein yang salah lipatan dan teragregasi pada penyakit Alzheimer atau Parkinson, dan yang sering digunakan untuk membuat model in vitro respon mikroglia terkait dengan penyakit masing-masing.
Dalam jenis sistem in vitro ini, penghambatan KV1.3 atau penghapusan genetik mengurangi ekspresi dan produksi beberapa mediator peradangan yang diukur pada 24- atau 48-jam setelah aktivasi mikroglia. Sekitar 20 tahun yang lalu laboratorium Lyanne Schlichter melaporkan bahwa penghambat KV1.3 menekan phorbol ester-stimulated respiratory burst [22] dan produksi NO dalam mikroglia tikus neonatal yang dikultur, sehingga mengurangi pembunuhan neuron yang dimediasi mikroglia dalam sistem kultur transwell [16].
Dalam studi yang lebih baru dari laboratorium kami [17], yang membandingkan efek penghambat KV1.3 dan KCa3.1 dengan minocycline inhibitor mikroglia yang banyak digunakan pada mikroglia tikus neonatal yang terpolarisasi berbeda, kami mengamati bahwa penghambatan Kv1.3 mengurangi ekspresi dan produksi. sitokin pro-inflamasi IL-1 dan TNF- pada 24 dan 28 jam dan mencegah upregulasi enzim siklooksigenase2 terkait peradangan (COX-2) dan nitric oxide synthase (iNOS) yang dapat diinduksi. Efek yang terakhir mungkin bertanggung jawab atas penurunan produksi NO yang diamati pada mikroglia yang diobati dengan inhibitor KV1.3 pada 24 dan 48 jam setelah stimulasi LPS. Mirip dengan pekerjaan sebelumnya, kami juga mengamati bahwa penghambat KV1.3 mencegah pembunuhan neuron yang dimediasi mikroglia dalam kultur irisan hippocampal organotipik 3 hari setelah mikroglia diaktifkan baik melalui 1-jam hipoksia/glikemia untuk mensimulasikan stroke iskemik [5] atau dengan pengobatan dengan oligomer amyloid- untuk mensimulasikan aktivasi mikroglia pada AD [7].
Selain mengurangi aktivasi mikroglia yang diinduksi AO, sebuah fenomena yang dapat ditunjukkan dengan jelas dengan pewarnaan mikroglia untuk CD11b atau Iba-1 dan mengevaluasi intensitas fluoresensi, PAP penghambat KV1.3-1 juga telah ditemukan untuk mencegah Gangguan potensiasi jangka panjang (LPT) yang dimediasi mikroglia yang diinduksi oleh O pada irisan hipokampus dan untuk mengurangi produksi IL-1 , TNF- dan NO yang diinduksi oleh O pada mikroglia tikus yang dikultur [7], sangat mirip dengan apa yang telah ditemukan untuk penghambat KV1.3 dengan mikroglia terstimulasi LPS [17,18]. Dalam percobaan di mana mikroglia tikus neonatal dari tikus tipe liar dan KV1.3−/- dirangsang dengan agregat -synuclein ( SynAgg), yang mengaktifkan mikroglia melalui pengikatan pada reseptor pengenalan pola TLR2 dan CD36 [23], keduanya KV1 farmakologis. 3 penghambatan dengan PAP-1 dan penghapusan genetik saluran mengakibatkan berkurangnya produksi IL-1 , IL-6, IL-12 dan TNF- dan mencegah upregulasi protein peradangan NLRP3 pada 24 jam setelah stimulasi mikroglia [8]. Sebaliknya, overekspresi KV 1.3 dalam lini sel mikroglial meningkatkan ekspresi atau sekresi yang diinduksi SynAgg dari IL-1 , TNF- , IL-6, dan IL-12 pada 24 jam setelah stimulasi [8].
Berbagai penelitian oleh kelompok lain menegaskan bahwa penghambat KV1.3 mengurangi fungsi mikroglia proinflamasi saat menggunakan rangsangan serupa atau rangsangan yang terkait dengan patologi inflamasi lainnya. Misalnya, dalam mikroglia tikus kultur yang diaktifkan dengan protein HIV Tat atau dengan glikoprotein 120 (gp120) untuk mensimulasikan 1-gangguan neurokognitif terkait HIV, penghambatan KV1.3 atau knockdown dengan siRNA ditemukan untuk mengurangi IL-1 , TNF-, dan produksi NO dan menekan neurotoksisitas [24,25]. Menggunakan model stroke iskemik dan kekurangan oksigen/glukosa dari kultur mikroglia Ma et al. melaporkan bahwa penghambatan KV1.3 menggeser fenotip mikroglial dari pro-inflamasi mirip M1-menjadi respons mirip M2-dan mengurangi aktivasi peradangan NLRP3 [5,6], serupa dengan penelitian yang dijelaskan di atas dalam model penyakit Parkinson [8].
Menggunakan sel CD11b plus yang baru diisolasi, yang terdiri dari makrofag infiltrasi SSP dan mikroglia residen otak dari otak tikus yang telah diobati secara sistemik dengan LPS di hadapan dan tidak adanya peptida pemblokiran KV1.3 ShK-223, Rangaraju et al. menegaskan bahwa penghambatan KV 1.3 mengurangi ekspresi sitokin inflamasi seperti IL-1 tetapi menunjukkan bahwa penghambatan KV1.3 juga mengurangi ekspresi TAP1 dan mencegah upregulasi EHD1 dalam CD11b plus mikroglia rendah CD45 yang diukur dengan flow cytometry [26]. Baik TAP1 dan EDH1 adalah protein yang terlibat dalam perakitan MHC kelas-I dan perdagangan ke permukaan sel. Oleh karena itu, penulis selanjutnya menyelidiki efek pengobatan ShK-223 pada ekspresi kelas MHC-1 pada mikroglia yang diisolasi secara akut, dan, berdasarkan ekspresi MHC yang berkurang, berhipotesis bahwa peningkatan yang diinduksi LPS dalam kapasitas penyajian antigen dari mikroglia adalah proses yang bergantung pada KV 1.3-, menunjukkan bahwa penghambatan KV1.3 dapat mengurangi presentasi antigen ke CD8 plus sel T sitotoksik.
Dalam analisis jaringan koekspresi berbobot berikutnya yang diterapkan pada dataset transkriptomik mikroglial dari model tikus penyakit neuroinflamasi dan neurodegeneratif, kelompok yang sama mengidentifikasi KV1.3 sebagai bagian dari tanda tangan gen proinflamasi yang juga termasuk Tlr2, Ptgs2, Il12b, Il1b, CD44, NFκB, Stat1, dan RelA [27]. Blokade KV1.3 dengan ShK-223 dapat mengubah tanda pro-inflamasi ini menjadi penanda dengan peningkatan ekspresi gen anti-inflamasi pada mikroglia terkait penyakit. Yang menarik dalam konteks ini, adalah bahwa penghambat Kv1.3 telah dilaporkan dalam penelitian lain untuk lebih meningkatkan migrasi mikroglia kultur yang distimulasi dengan sitokin antiinflamasi IL-4 dan IL-10 [28] dan untuk tidak mempengaruhi fagositosis mikroglial dari microbeads [26] atau bahkan untuk meningkatkan fagositosis amiloid- [7].
Secara bersama-sama, ada banyak bukti bahwa mikroglia mengekspresikan KV1.3 dan bahwa penghambat KV1.3 menekan fungsi mikroglia neurotoksik pro-inflamasi dan bahkan mungkin menggeser mikroglia ke arah fenotipe yang lebih neuroprotektif. Kami di sini sebagian besar berkonsentrasi pada meringkas data yang diperoleh dengan kultur mikroglial atau irisan karena, dalam sistem reduksionis ini, tidak ada keraguan bahwa knockout, knockdown, atau blokade farmakologis memberikan efeknya secara langsung melalui penghambatan saluran KV1.3 mikroglial dan tidak secara tidak langsung melalui pengaruh Saluran KV1.3 dalam sel T, sel B, sel dendritik atau monosit, yang semuanya mengekspresikan KV1.3 [29], dan dengan demikian dapat berkontribusi pada efek in vivo dari penghambat KV1.3 atau temuan yang dibuat dengan KV1.3−/- tikus. Namun, kami ingin menunjukkan di sini bahwa selain banyak penelitian yang menunjukkan ekspresi KV1.3 pada mikroglia pada hewan pengerat dan manusia dengan imunohistokimia, laboratorium Kettenmann dan kelompok kami telah berulang kali menunjukkan bahwa peningkatan ekspresi KV1.3 pada mikroglia yang diaktifkan tidak hanya fenomena kultur jaringan dan arus Kv1.3 dapat direkam dari mikroglia pada irisan akut [30,31] dan dari mikroglia yang diisolasi secara akut dari otak tikus 5xFAD [7] atau dari area infark setelah oklusi arteri serebral tengah [5, 12], model untuk stroke iskemik.
Jalur pensinyalan dipengaruhi oleh penghambatan KV1.3 atau modulasi ekspresi Kv1.3
Studi menyelidiki jalur pensinyalan (Gambar 1) yang dipengaruhi oleh penghambat KV1.3 untuk menghasilkan pengurangan yang bermanfaat ini dalam fungsi mikroglia proinflamasi 24 atau 48 jam kemudian telah memberikan hasil yang agak bertentangan, menunjukkan bahwa efek penghambat KV1.3 bergantung pada stimulus dan mungkin spesies. Sementara Fordyce et al. melaporkan bahwa penghambat KV1.3 tidak memengaruhi fosforilasi p38MAPK pada mikroglia tikus neonatal yang diobati dengan LPS [16], beberapa penelitian lain menggunakan mikroglia tikus telah menemukan bahwa penghambat KV1.3 sangat mengurangi fosforilasi p38MAPK serta aktivasi NF-κB setelah stimulasi dengan LPS, AO, SynAgg atau HIV-1 glikoprotein 120 [7,8,24]. Dalam garis sel mikroglial, BV2 KV1.3 juga telah terbukti mengatur fosforilasi S727 dari STAT1 [26]. Menariknya, apakah penghambat KV1.3 menghambat translokasi NFAT, salah satu efek penghambat KV1.3 yang paling baik dipelajari dalam sel T [2,32,33] sejauh ini belum diteliti dalam mikroglia.
Peningkatan ekspresi KV1.3 setelah stimulasi mikroglia dengan LPS, AO atau SynAgg tampaknya melibatkan banyak kaskade pensinyalan yang sama yang dipengaruhi oleh penghambatan KV1.3, dan penghambat KV1.3 biasanya mencegah peningkatan ekspresi Kv1.3. Promotor KV1.3 berisi beberapa situs pengikatan NF-κB dan SP1 dan inhibitor NF-κB atau p38MAPK secara independen mengurangi regulasi up-regulasi Kv1.3 yang distimulasi SynAgg dalam mikroglia [8], menunjukkan bahwa jalur p38MAPK dan NF-κB klasik memediasi regulasi transkripsi KV1.3 (Gambar 1). Keluarga Src kinase Fyn bekerja di hulu faktor transkripsi NF-κB dengan mengatur translokasi nuklir komponen p65 [34] dan dengan memfosforilasi isoform PKC PKCδ. Sarkar dkk. melaporkan bahwa Fyn knockout mengurangi peningkatan yang diinduksi LPS dan SynAgg dalam kepadatan arus KV1.3 dalam mikroglia yang dikultur, sebuah efek yang dapat ditiru oleh pengobatan mikroglia dengan saracatinib inhibitor Fyn atau dengan defisiensi PKCδ, menunjukkan bahwa pensinyalan Fyn/PKCδ kinase kaskade terlibat dalam memediasi upregulasi KV1.3 sebagai respons terhadap rangsangan inflamasi [8]. Seperti yang ditunjukkan dalam uji ligasi kedekatan Duolink, Fyn berinteraksi langsung dengan Kv1.3 dan memfosforilasi saluran di Y135 untuk meningkatkan aktivitasnya.
Kv1.3 mengatur potensial membran dan menolak depolarisasi'
Meskipun efek perbaikan yang didokumentasikan dengan baik dari penghambat KV1.3 pada peradangan saraf in vivo dan pada kaskade pensinyalan mikroglial dan ekspresi dan sekresi mediator inflamasi in vitro , mekanisme molekuler mendasar tentang bagaimana penghambat KV1.3 memengaruhi fungsi mikroglial sudah lama tidak jelas. Banyak peneliti, termasuk laboratorium kami, berasumsi bahwa KV1.3 menjalankan fungsi yang sama dalam mikroglia seperti yang dipenuhi dalam sel T, yaitu mengatur potensi membran dan masuknya kalsium [29,32,33].
Pada sel T, penghambatan KV1.3 menyebabkan depolarisasi membran dan mengurangi masuknya kalsium melalui saluran kalsium yang diaktifkan pelepasan kalsium (CRAC) mengikuti stimulasi reseptor sel T [33,35,36]. Masuknya kalsium melalui saluran CRAC sangat diperlukan untuk defosforilasi dan translokasi nuklir berikutnya dari faktor transkripsi NFAT yang bergantung pada kalsium/kalmodulin [29], yang memicu transkripsi sitokin IL-2 [29,33]. IL-2 dilepaskan dari sel T teraktivasi saat sintesis dan merangsang ekspansi klon sel T secara autokrin dan parakrin. Dengan menghambat efluks kalium penyeimbang yang diperlukan untuk mempertahankan masuknya kalsium melalui saluran CRAC Penghambat KV1.3 mengganggu aktivasi sel T, mencegah defosforilasi NFAT dan translokasi nuklir [32] yang menyebabkan penurunan proliferasi sel T dan penurunan produksi dan sekresi sitokin inflamasi pada 48 jam [5,33,35,36].
Namun, itu belum pernah diuji dalam mikroglia, yang tidak seperti sel T juga mengekspresikan penyearah ke dalam Kir2.1 [17,37,38] dan saluran kalium dua pori THIK-1 (K2P 13.1) [39], apakah penghambat KV1.3 akan memiliki efek molekuler yang sama atau jika peran KV1.3 diambil alih oleh saluran kalium lainnya ini. Dalam sebuah studi baru-baru ini, kelompok kami menjawab pertanyaan ini dengan pertama-tama memeriksa kembali signifikansi mendasar dari KV1.3 dalam mempertahankan potensial membran istirahat dan menahan depolarisasi [40]. Seperti yang diharapkan, overekspresi KV1.3 dalam sel CHO menurunkan potensi membran istirahat yang biasanya sangat terdepolarisasi dari sel-sel ini dari −20 mV menjadi −50 mV, sementara penghambatan KV1.3 dengan mikroglia terdepolarisasi ShK-223, yang secara inheren mempertahankan lebih banyak potensi membran istirahat terhiperpolarisasi, yang di tangan kami rata-rata sekitar −90 mV dalam mikroglia yang tidak berdiferensiasi secara dominan mengekspresikan Kir2.1 dan sekitar −65 mV dalam LPS menstimulasi mikroglia yang mengekspresikan KV1.3 yang lebih tinggi dan kepadatan arus Kir2.1 yang lebih rendah [40].
Sementara KV1.3 dengan demikian tentu berkontribusi untuk mengatur potensi membran istirahat dalam mikroglia (Gambar 2), kami percaya, perannya yang lebih penting, dan alasan mengapa ekspresi Kv1.3 meningkat pada mikroglia yang diaktifkan, adalah kemampuan saluran untuk mengimbangi yang ekstrim dan berkepanjangan. depolarisasi membran yang berpotensi berdampak negatif terhadap kesehatan dan fisiologi mikroglial seperti yang diungkapkan oleh eksperimen injeksi saat ini. Sementara injeksi 25 pA saat ini tidak dapat mendepolarisasi KV 1.3 yang mengekspresikan mikroglia di luar −30 mV tanpa adanya penghambat, mikroglia yang diberi perlakuan awal dengan penghambat KV 1.3 mendepolarisasi potensi plus 50 mV sebagai respons terhadap injeksi arus 25 pA yang sama [40] , menunjukkan bahwa KV1.3 dapat "menjepit" potensi membran dekat dengan potensi ambang aktivasi saluran untuk mencegah depolarisasi membran yang berlebihan (Gambar 2).
Situasi dalam fisiologi mikroglia di mana kapasitas ini penting adalah ketika mikroglia terpapar ATP ekstraseluler, sinyal bahaya yang dapat mencapai konsentrasi dalam kisaran mikromolar tinggi karena pelepasan ATP sitosol dari neuron yang rusak atau ATP yang mengandung vesikel sinaptik [41], yang mengaktifkan saluran reseptor P2X yang menyebabkan depolarisasi intens [42]. Di tangan kami sendiri, percobaan penjepit saat ini yang dilakukan pada mikroglia yang distimulasi oleh LPS dan yang tidak berdiferensiasi menunjukkan bahwa paparan akut terhadap 100 μM ATP, yang dari reseptor P2X yang diekspresikan dalam mikroglia terutama mengaktifkan P2X4, menyebabkan depolarisasi yang lebih jelas pada mikroglia yang tidak berdiferensiasi, meskipun mereka lebih potensi membran istirahat hiperpolarisasi daripada mikroglia terstimulasi LPS KV1.3 tinggi, yang tidak terdepolarisasi di atas −40 mV. Penghambat KV1.3 mengganggu kemampuan ini untuk melawan depolarisasi yang diinduksi ATP dan mikroglia yang terdepolarisasi di hadapan mereka [40].
KV1.3 memodulasi masuknya kalsium yang dimediasi reseptor P2X4 dalam mikroglia
Eksperimen pencitraan kalsium mengungkapkan bahwa kemampuan saluran KV1.3 untuk melawan depolarisasi termediasi P2X4- yang diinduksi ATP meningkatkan masuknya Ca2 plus ke dalam mikroglia melalui reseptor P2X4 yang distimulasi dengan 100 μM ATP [40]. Sebagai contoh, kami mengamati bahwa penghambat KV1.3 ShK-223 dan PAP-1 mengurangi masuknya Ca2 plus yang diinduksi ATP melalui reseptor P2X4 dalam mikroglia berdiferensiasi LPS yang mengekspresikan kepadatan arus KV1.3 yang tinggi, lebih banyak lagi lebih kuat daripada di mikroglia yang tidak distimulasi meskipun stimulasi LPS menurunkan regulasi ekspresi reseptor P2X4 dalam mikroglia yang dikultur. Sebaliknya, blokade KV1.3 tidak berpengaruh pada transien kalsium yang diinduksi ATP dalam mikroglia terstimulasi IL-4, yang menunjukkan tingkat KV1.3 yang sangat rendah. Menariknya, sementara LPS juga meningkatkan KV1.3 dan mengurangi ekspresi P2X4 pada mikroglia in vivo, ekspresi KV1.3 dan P2X4 meningkat secara paralel dalam pengaturan stroke iskemik seperti yang ditunjukkan oleh laboratorium kami pada mikroglia yang diisolasi secara akut dari belahan otak tikus yang mengalami infark. terkena stroke iskemik dan oleh kelompok lain pada hewan pengerat dan mikroglia manusia dengan imunohistokimia atau qPCR [5,12,43-46]. Ini menunjukkan bahwa mengikuti stroke iskemik KV1.3 mungkin mengatur pensinyalan kalsium mikroglial purinergik yang lebih kompleks yang diprakarsai oleh sinyal bahaya ATP lebih kuat daripada in vitro. ATP dan puing-puing saraf lainnya di daerah infark otak mengaktifkan mikroglia, yang kemudian secara terus menerus memproduksi dan melepaskan lebih banyak mediator inflamasi dalam waktu 24 hingga 72 jam dan dengan demikian merusak dan membunuh lebih banyak neuron di penumbra yang mengarah ke perluasan inflamasi infark.
Peningkatan ekspresi KV1.3 yang diamati pada mikroglia di perbatasan infark dalam waktu 2-5 hari [5] mungkin mengaktifkan mikroglia untuk mempertahankan sinyal kalsium yang lebih kuat melalui peningkatan jumlah reseptor P2X4 dan dengan demikian menghasilkan lebih banyak mediator inflamasi, merusak lebih banyak neuron. dan mengaktifkan lebih banyak mikroglia. Hipotesis ini akan sejalan dengan temuan bahwa KV1.3 blocker PAP-1 mengurangi aktivasi mikroglia dan tingkat IL-1 dan IFN- otak, yang menyebabkan sekitar 40 persen area infark lebih kecil dan meningkatkan defisit neurologis skor pada tikus dan tikus model stroke iskemik [5]. Dengan mendepolarisasi mikroglia Kv1.3 blocker mengurangi masuknya kalsium melalui reseptor P2X4 yang dipicu oleh ATP yang dilepaskan dari neuron yang rusak dan dengan demikian meredam lebih lanjut aktivasi inflammasome NLRP3 yang bergantung pada kalsium, NF-κB dan faktor transkripsi lainnya yang menyebabkan berkurangnya produksi mediator inflamasi (Gambar 1) dan mengurangi patologi.
Apa jalur masuknya kalsium lain dalam mikroglia yang diatur oleh KV1.3?
Sementara blokade KV1.3 jelas mengurangi masuknya kalsium yang diinduksi ATP melalui reseptor P2X4 [40] dan dengan demikian merupakan pengatur penting jalur masuknya kalsium ini dalam mikroglia (Gambar 2), ini bukan satu-satunya pensinyalan kalsium yang bergantung pada KV1.3 atau ATP. proses mikroglia. Selain saluran reseptor P2X, mikroglia juga mengekspresikan reseptor purinergik P2Y metabotropik yang mengikuti aktivasi oleh ATP atau UTP dapat menginduksi pelepasan kalsium dari penyimpanan internal [47] dan mengaktifkan entri Ca2 plus yang dioperasikan toko (SOCE) setelah penipisan penyimpanan kalsium intraseluler yang relatif kecil. dalam mikroglia [38]. Oleh karena itu, sangat mungkin bahwa SOCE tambahan berkontribusi pada sinyal Ca2 plus yang diinduksi ATP yang telah kami gambarkan dan bahwa beberapa efek penghambat KV1.3 dimediasi dengan mengurangi SOCE tambahan.
Ini adalah hipotesis yang sangat mungkin karena mekanisme molekuler "klasik" untuk penghambat KV1.3 dalam sel T adalah pengurangan SOCE melalui saluran CRAC setelah aktivasi reseptor sel T dan selanjutnya mengurangi aktivasi faktor transkripsi dan produksi serta pelepasan sitokin [29,33, 36,48]. Mikroglia tikus dan tikus telah berulang kali dilaporkan menunjukkan arus dengan sifat biofisik yang khas untuk arus CRAC [49,50] dan untuk mengekspresikan komponen molekul saluran CRAC, Orai, dan STIM [51,52]. Ada bukti lebih lanjut bahwa penghapusan genetik Orai1, STIM1, dan STIM2 mengurangi arus CRAC dan/atau SOCE serta menghambat migrasi dan fagositosis dalam mikroglia tikus yang dikultur [52], sementara pemblokir saluran CRAC molekul kecil CM-EX-137 memiliki baru-baru ini dilaporkan menurunkan aktivasi mikroglia dan ukuran lesi pada model tikus cedera otak traumatis [53].
Blokade saluran KV1.3 melemahkan entri kalsium yang dioperasikan di toko dalam mikroglia yang distimulasi LPS
Sebagai percobaan tindak lanjut untuk makalah kami sebelumnya tentang peran KV1.3 dalam mengatur masuknya kalsium yang dimediasi P2X4, kami di sini secara khusus mengajukan pertanyaan apakah pemblokir KV1.3 ShK-223 juga akan mengurangi SOCE dalam mikroglia terdiferensiasi LPS , kondisi stimulasi yang sama, di mana kami telah mengamati kepadatan arus KV1.3 tertinggi dan efek terbesar penghambatan KV1.3 pada pensinyalan kalsium yang diinduksi ATP [40]. Dengan menggunakan indikator kalsium ratiometrik Fura-2 untuk melacak perubahan dalam konsentrasi kalsium intraseluler bebas ([Ca2 plus]i), kami menemukan bahwa mikroglia berdiferensiasi LPS memiliki konsentrasi kalsium sitosolik istirahat [Ca2 plus]I yang bervariasi antara 60 nM dan 370 nM, rata-rata 150 ± 8,8 nM (n=50; Gambar 3a,c,g), yang konsisten dengan laporan sebelumnya [54]. Untuk memperoleh SOCE, simpanan kalsium intraseluler pertama-tama dikuras dengan thapsigargin (Tg), penghambat retikulum endoplasma Ca2 plus -ATPase, yang diaplikasikan dalam larutan rendaman bebas Ca2 plus.
Removal of extracellular calcium produced a roughly 25 nM decrease in [Ca2+] I (Figure 3a) indicating the presence of a calcium influx at rest. Subsequent application of Tg (1 μM) elicited small amplitude (>25 nM) peningkatan asinkron pada [Ca2 plus] I karena mobilisasi kalsium pasif dari simpanan. Penambahan kalsium ke dalam larutan penangas menimbulkan peningkatan cepat [Ca2+]I di atas tingkat istirahat yang disebabkan oleh SOCE. Besarnya transien [Ca2 plus ] I yang diinduksi SOCE ("puncak SOCE") diukur sebagai perbedaan antara kadar [Ca2 plus ] I dalam larutan mandi bebas Ca2 plus dan elevasi maksimal [Ca2 plus ] I setelah penambahan kembali kalsium bervariasi secara signifikan di antara sel-sel individu dengan distribusi SOCE puncak yang menampilkan maksimum pada 120 nM dan ekor hingga 1800 nM (Gambar 1b). Heterogenitas dalam kekuatan SOCE ini kemungkinan disebabkan oleh variasi dalam potensial membran istirahat, yang memberikan kekuatan pendorong untuk masuknya kalsium selama SOCE. Potensi membran istirahat dari mikroglia berdiferensiasi LPS telah ditemukan bervariasi antara −90 mV dan −40 mV dalam sel individu [40,55] dan dengan demikian dapat menjelaskan perbedaan yang diamati dalam SOCE.
Sebuah studi sebelumnya melaporkan bahwa peningkatan dalam istirahat [Ca2 plus] I dikaitkan dengan penurunan kemampuan rangsangan eksternal seperti UTP agonis reseptor P2Y atau faktor komplemen 5a untuk memperoleh transien [Ca2 plus] I dalam mikroglia yang diaktifkan LPS [54]. Karena dalam penelitian kami baik level istirahat [Ca2 plus]i dan nilai SOCE puncak bervariasi di antara sel-sel individual, kami menyelidiki apakah variasi dalam istirahat [Ca2 plus]i dapat menjelaskan heterogenitas dalam nilai SOCE puncak. Merencanakan nilai SOCE puncak versus istirahat [Ca2 plus] I, mengungkapkan korelasi positif antara puncak SOCE dan istirahat [Ca2 plus] I (Gambar 3c). Ketika kami membagi data menjadi dua kelompok dengan nilai batas 600 nM untuk SOCE puncak, hubungan antara istirahat [Ca2 plus] I dan SOCE puncak di masing-masing kelompok lebih kuat daripada di seluruh populasi, menunjukkan adanya setidaknya dua sel. populasi, yang berbeda dalam besaran SOCE dan kekuatan korelasi antara istirahat [Ca2 plus] I dan puncak SOCE. Dengan demikian, dalam populasi sel yang diobati dengan LPS, peningkatan [Ca2 plus]i saat istirahat tidak terkait secara kausal dengan berkurangnya kemampuan mikroglia teraktivasi untuk merespons rangsangan eksternal dengan transien [Ca2plus]I, seperti yang disarankan sebelumnya. oleh Hoffman dkk. Data kami menunjukkan bahwa pengaruh umum, seperti tingkat potensial membran, yang dikendalikan oleh berbagai saluran, termasuk KV1.3, Kir2.1, dan THIK-1, mungkin bertanggung jawab atas korelasi positif antara istirahat [Ca2 plus ] I dan puncak SOCE diamati dalam penelitian kami. Sebagai contoh, overekspresi atau upregulasi fungsional saluran hiperpolarisasi dapat menghiperpolarisasi membran dan meningkatkan kekuatan pendorong untuk masuknya kalsium melalui saluran permeabel kalsium yang aktif secara konstitutif seperti saluran transient receptor potential (TRP) yang diaktifkan secara metabolik dan saluran yang dioperasikan toko yang diaktifkan setelah penipisan toko seperti saluran CRAC.
Pre-incubation of cells with the KV1.3 inhibitor ShK-223 did not significantly affect resting [Ca2+] I (Figure 3d,g), but eliminated peak SOCE responses larger than 300 nM and shifted the maximum of the distribution of peak SOCE values from 130 nM (Figure 3b, control) to 70 nM (Figure 3e, ShK223). The difference between the values of peak SOCE in control cells and cells preincubated with ShK-223 was significant (Figure 3h). The relationship between resting [Ca2+] I and peak SOCE still displayed a mild positive correlation (figure 3f). Taken together, our data indicate that similarly to T lymphocytes, blockade of KV1.3 channels significantly reduces SOCE in LPS differentiated microglia. The extent of the inhibition varied among cells with a greater effect on cells expressing large magnitude (>300 nM) SOCE. Karakteristik spesifik sel dengan SOCE puncak tinggi dan rendah masih harus ditentukan.
Dalam kondisi fisiologis, SOCE dapat dipicu selanjutnya untuk menyimpan penipisan setelah aktivasi reseptor P2Y berpasangan protein-G dan berkontribusi pada peningkatan gabungan [Ca2 plus] I selama aktivasi reseptor P2Y dan P2X yang ditimbulkan oleh agonis purinergik umum, seperti ATP. Besarnya SOCE bervariasi secara signifikan di antara sel-sel yang berdiferensiasi LPS, yang mungkin merupakan fungsi dari kombinasi unik ekspresi diferensial dari saluran yang dioperasikan toko dan saluran yang mengendalikan potensi membran, seperti KV1.3. Pengurangan SOCE puncak oleh ShK-223 menunjukkan bahwa saluran KV1.3 adalah pengatur kuat SOCE dan mengungkap mekanisme tambahan di mana penghambat KV1.3 melemahkan pensinyalan kalsium dan respons fungsional selanjutnya (misalnya produksi sitokin) mengikuti transkripsi yang bergantung pada kalsium aktivasi faktor dalam mikroglia.
Kesimpulan
Meskipun tentu saja menantang untuk memilah efek kontribusi pada sel-sel sistem kekebalan perifer, terutama pada sel T memori dan makrofag yang berasal dari monosit, membuat efek menguntungkan dari penghambat KV1.3 pada peradangan di SSP, itu adalah jelas bahwa KV1.3 memainkan peran penting dalam mengatur potensi membran, mencegah depolarisasi dan mengendalikan peristiwa pensinyalan kalsium yang selanjutnya mengarah pada aktivasi mikroglia dan produksi mediator inflamasi. Kami ingin menyarankan bahwa dari perspektif terapeutik, mungkin diinginkan untuk menghambat KV1.3 dalam berbagai jenis sel sistem kekebalan. Namun, secara intelektual akan sangat memuaskan dan membantu pengembangan terapi untuk mengklarifikasi apa target seluler utama dari penghambat KV1.3 dan apakah terapi perlu penetran otak untuk memberikan efek perbaikan yang optimal pada penyakit SSP. Pertanyaan-pertanyaan ini idealnya harus dijawab secara farmakologis dengan menguji molekul-molekul kecil penetran otak berdampingan dengan penghambat KV1.3 peptidik yang dibatasi secara perifer atau antibodi anti-KV1.3 [58,59] pada hewan model penyakit Alzheimer dan Parkinson. Lebih lanjut akan sangat informatif untuk membandingkan efek penghapusan KV1.3 bersyarat dalam mikroglia, makrofag yang diturunkan monosit, dan subset sel T yang berbeda dengan efek pengobatan obat untuk mendapatkan pemahaman yang lebih rinci tentang peran KV1.3 dalam peradangan saraf. dan target seluler penghambat KV1.3. Namun, kami percaya bahwa pada tingkat sel, peran mendasar KV1.3 akan selalu seperti yang pertama kali dijelaskan dalam sel T, yaitu pengaturan potensi membran dan masuknya kalsium dan selanjutnya aktivasi faktor transkripsi yang bergantung pada kalsium. Apa yang kadang-kadang tidak cukup ditekankan dalam hal ini, mungkin sifat biofisik KV1.3 seperti tegangan setengah aktivasi dan inaktivasi yang relatif lambat [60,61], dengan sempurna "memenuhi syarat" saluran untuk menahan depolarisasi membran dan dengan demikian memungkinkan KV1 .3 untuk tidak hanya mengatur SOCE, seperti yang dijelaskan 30 tahun yang lalu dalam sel T tetapi juga masuknya kalsium yang dimediasi reseptor P2X.
Pernyataan pengungkapan
Tidak ada potensi konflik kepentingan yang dilaporkan oleh penulis.
Pendanaan
Pekerjaan ini didukung oleh National Institute of Neurological Disease and Stroke award NS100294 (to HW) dan UC Davis School of Medicine Research Partnership Grant (to AFF).
Referensi
[1] DeCoursey TE, Chandy KG, Gupta S, dkk. Saluran K plus tegangan-gated pada limfosit T manusia: peran dalam mitogenesis? Alam. 1984;307(5950):465–468.
[2] Beeton C, Wulff H, Standifer NE, dkk. Saluran Kv1.3 adalah target terapi untuk penyakit autoimun yang dimediasi sel T. Proc Natl Acad Sci USA. 2006;103 (46):17414–17419.
[3] Tarcha EJ, Chi V, Munoz-Elias EJ, dkk. Respons farmakologis yang tahan lama dari peptida ShK-186, penghambat saluran Kv1.3 spesifik yang menekan mediator sel T penyakit autoimun. J Pharmacol Exp Ada. 2012;342(3):642–653.
[4] Chandy KG, Norton RS. Pemblokir peptida saluran Kv1.3 dalam sel T sebagai terapi untuk penyakit autoimun. Curr Opin Chem Biol. 2017;38:97–107.
[5] Chen YJ, Nguyen HM, Maezawa I, dkk. Penghambatan saluran kalium Kv1.3 mengurangi infark dan peradangan pada stroke iskemik. Ann Clin Transl Neurol. 2018;5(2):147–161.
[6] Ma DC, Zhang NN, Zhang YN, dkk. Blokade saluran Kv1.3 mengurangi iskemia serebral / cedera reperfusi dengan membentuk kembali fenotipe M1 / M2 dan mengorbankan aktivasi peradangan NLRP3 dalam mikroglia. Exp Neurol. 2020;332:113399.
[7] Maezawa I, Nguyen HM, Di Lucente J, dkk. Penghambatan Kv1.3 sebagai terapi target mikroglia potensial untuk penyakit Alzheimer: bukti konsep praklinis. Otak. 2018;141(2):596–612.
[8] Sarkar S, Nguyen HM, Malovic E, dkk. Kv1.3 memodulasi peradangan saraf dan degenerasi saraf pada penyakit Parkinson. Investasi J Clin. 2020;130 (8):4195–4212.
[9] Reeves TM, Pemangkas PA, Colley BS, dkk. Menargetkan saluran Kv1.3 untuk mengurangi patologi materi putih setelah cedera otak traumatis. Exp Neurol. 2016;283(PtA):188–203.
[10] Lai IK, Valdearcos M, Morioka K, dkk. Memblokir saluran kalium Kv1.3 mencegah peradangan saraf pasca operasi dan penurunan kognitif tanpa mengganggu penyembuhan luka pada tikus. Sdr. J Anaesth. 2020;125 (3):298–307.
[11] Peng Y, Lu K, Li Z, dkk. Blokade saluran Kv1.3 memperbaiki cedera otak akibat radiasi. Neuro Oncol. 2014;16(4):528–539.
[12] Chen YJ, Nguyen HM, Maezawa I, dkk. Saluran kalium KCa3.1 merupakan target farmakologis untuk peradangan saraf yang terkait dengan stroke iskemia/reperfusi. J Cereb Blood Flow Metab. 2016;36 (12):2146–2161.
[13] Rangaraju S, Gearing M, Jin LW, dkk. Saluran kalium Kv1.3 sangat diekspresikan oleh mikroglia pada penyakit Alzheimer manusia. J Alzheimer Dis. 2015;44 (3):797–808.
[14] Norenberg W, Gebicke-Haerter PJ, Illes P. Rangsangan inflamasi menginduksi K baru ditambah arus keluar dalam mikroglia tikus yang dikultur. Neurosci Lett. 1992;147 (2):171–174.
[15] Kotecha SA, Schlichter LC. Peralihan Kv1.5 ke Kv1.3 dalam mikroglia hipokampus endogen dan berperan dalam proliferasi. J Neurosci. 1999;19(24):10680–10693. [16] Fordyce CB, Jagasia R, Zhu X, dkk. Saluran Microglia Kv1.3 berkontribusi pada kemampuannya untuk membunuh neuron. J Neurosci. 2005;25(31):7139–7149.
[17] Nguyen HM, Grossinger EM, Horiuchi M, dkk. Ekspresi diferensial Kv1.3, KCa3.1, dan Kir2.1 dalam mikroglia yang diaktifkan "secara klasik" dan "bergantian". Glia. 2017;65(1):106–121.
For more information:1950477648nn@gmail.com