Penyakit Ginjal: Bagaimana Nikel Menginduksi Autophagy di Ginjal?

Untuk informasi selengkapnya:Ali.ma@wecistanche.com

Bagian : Nikel menginduksi autophagy melalui jalur PI3K/AKT/mTOR dan AMPK di ginjal tikus

Heng Yin, Zhicai Zuo & dkk.

1. Perkenalan

Nikel(Ni), unsur alam, tersebar luas di kompartemen lingkungan termasuk tanah, air, dan udara (Schrenk et al, 2020). Ni (Nikel)senyawa dan logam Ni (Nikel)memiliki banyak aplikasi industri dan komersial, seperti produksi paduan, elektroplating, baterai nikel-kadmium, dan katalis dalam industri kimia dan makanan (Genchi et al., 2020). Namun, penggunaan industri Ni yang luas (Nikel)menyebabkan pencemaran lingkungan yang meluas, yang meningkatkan risiko manusia terpapar Ni melalui makanan dan air minum (Das et al, 2018). Meskipun Ni (Nikel) merupakan mikronutrien penting bagi manusia dan hewan, paparan berlebihan terhadap Ni sangat berbahaya bagi kesehatan manusia (Das et al., 2018).

Dengan meningkatnya insiden Ni (Nikel)kontaminasi dalam beberapa tahun terakhir, toksikologi Ni, termasuk imunotoksisitas, hepatotoksisitas, nefrotoksisitas, dan toksisitas paru, telah menarik perhatian yang meningkat (Gathwan et al.,2013; Deng et al.,2016; Hasanein dan Felegari, 2017; Guo et al., 2020a .2020b). Ituginjal, sebagai organ target penting dalam Ni (Nikel)toksikologi, dengan akumulasi Ni (Nikel)dan Ni (Nikel)senyawa di dalamnya melalui paparan kronis dapat menyebabkan kerusakan ginjal yang signifikan (Elangovan et al, 2018). Penelitian yang ada dari tim peneliti kami telah menunjukkan induksi stres oksidatif, apoptosis, peradangan, dan penghentian siklus sel diginjalayam pedaging oleh NiCl2 (Nikelklorida 2) dalam makanan melebihi 300 mg/kg (Guo et al, 2014, 2016a,2016b). Beberapa penelitian menunjukkan bahwa mekanisme toksikologi Ni ginjal meliputi kerusakan oksidatif, pemutusan untai DNA, dan apoptosis (Lee et al, 2001; Chen et al., 2010).

Memainkan bagian penting dalam homeostasis seluler,autofagitelah ditemukan memiliki hubungan dengan kejadian dan patogenesis beragam penyakit (Martin et al, 2019). Studi terbaru menunjukkan bahwa kematian sel dapat dimediasi oleh out-of-control atau overstimulasiautofagi(Denton dan Kumar, 2019). Sebagai proses intraseluler yang kompleks dan sangat teratur,autofagidimulai dari pembentukan vesikel bermembran ganda yang dikenal sebagai autofagosom yang menelan bagian sitosol dan organel (Martin et al, 2019). Selanjutnya, autofagosom mengambil bagian dalam proteolisis zat yang ditelan setelah pindah ke lisosom.

Autofagisensitif terhadap berbagai jenis stres seluler, seperti pertumbuhan atau kekurangan faktor nutrisi, hipoksia, kerusakan DNA, spesies oksigen reaktif (ROS), agregasi protein, patogen intraseluler, atau kerusakan organel (Dodson et al, 2013). Ini adalah proses yang sangat kompleks untuk mengaturautofagi, yang melibatkan banyak jalur pensinyalan, termasuk adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK), phosphatidylinositol 3-kinase-I(PI3K), dan target mamalia jalur rapamycin (mTOR)(Cao et al2021). Dan, jalur mTOR memiliki efek penting dalamautofagiinisiasi. Aktivitas mTOR adalah pos pemeriksaan inti dariautofagi, yang efek penghambatannya mengarah pada penghilangan defosforilasi ULK1autofagipenghambatan (Parzvch dan Klionsky, 2014). Selanjutnya, PI3K/Akt dan AMPK adalah regulator hulu utama mTOR(Gong et al,2020; Xu et al,2020). Penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa logam berat (seperti Cd, Hg, Cu, dan Pb) dapat menginduksi terjadinyaautofagi(Su dkk, 2017). Meskipun Huang et al. (2016) dan Son et al. (2017) telah menemukan bahwa Ni (Nikel)paparan secara efisien dapat menginduksiautofagipada sel epitel bronkus, mekanisme yang tepat masih belum jelas,

Efek Ni (Nikel)padaautofagitelah jarang dilaporkan, dan hanya sedikit penelitian yang tersedia tentang efek Ni pada ginjalautofagitikus secara in vivo. Oleh karena itu, pekerjaan saat ini bertujuan untuk mengkonfirmasi apakah NiCl2 (Nikelklorida 2)pengobatan dapat menginduksiautofagidan untuk mengevaluasi mekanisme potensial NiCl (Nikelkhlorida)-diinduksiautofagi, termasuk jalur AMPK dan PI3K/AKT/mTOR.

Nikel mempengaruhi ginjal dan menyebabkan penyakit ginjal

Klik ke Cistanche untuk penyakit ginjal

2. Bahan-bahan dan metode-metode

2.1. Bahan kimia dan antibodi

Nikelkhlorida(NiCl) disediakan oleh Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd(Chengdu, China). Dalam analisis imunoblot, semua antibodi dibeli dari Cell Signaling Technology (CST,USA), termasuk protein1 rantai ringan anti-kelinci terkait mikrotubulus 3B(LC3B)(Kucing no.43566T), anti-kelinci p62(SQSTM1)(Kucing no.5114D), anti-kelinci Beclin1 (Kucing no.3495T),anti-kelinciautofagiprotein terkait12 (Atg12)(Kucing no.4180T), anti-kelinci Atg5(Kucing no.12994T), anti-kelinci Atg16L1(Kucing no.8089T), anti-kelinci Atg7 (Kucing no.8558T), anti-kelinci Atg3 ( Kucing no.3415T),target mamalia anti-kelinci rapamycin (mTOR)(Kucing no.2983T),anti-kelinci p-mTOR(Kucing no.5536T),anti-kelinci unc-51 seperti kinase 1 (ULK1 )(Kucing no.8054D), anti-kelinci p-UIK1(Kucing no.5869T), anti-kelinci PI3K(Kucing no.4292S),anti-kelinci p PI3K(Kucing no.4228T,anti-kelinci Akt(Kucing no. .9272S), anti-kelinci p-Akt (Cat no.4060T), anti-kelinci mTOR(Cat no.2972S), anti-kelinci p-mTOR (Cat no. 5536S),anti-kelinci AMPK (Cat no.5831S ), anti-kelinci p-AMPK (Kucing no.2535S), dan -aktin (Kucing no.4970T).

2.2.Hewan dan perawatan

Total 160 tikus ICR jantan sehat berusia delapan minggu disediakan oleh Dashuo Biological Technology Company (Chengdu, China). Semua hewan dipelihara dalam kondisi konstan (suhu 25±2C;12-h siklus terang-gelap) di lingkungan aseptik, dan diberi pakan pelet standar dan air ad libitum. Tikus diklasifikasikan menjadi empat kelompok secara acak, masing-masing berisi empat puluh mic setelah aklimatisasi selama tujuh hari. Air suling diberikan secara intragastrik ke kontrol, sedangkan Ni (Nikel)(NiCl2 (Nikelklorida 2).6H2O) dengan dosis 7,5,15, dan 30 mg/kg diberikan secara intra-gastrik untuk hewan dalam kelompok eksperimen. Ni yang diadopsi di sini ditentukan sesuai dengan nilai rata-rata dosis mematikan (LD50, 306,11 mg/kg) yang dicapai dalam penelitian tentang toksisitas oral akut mencit jantan. NiCl (Nikelkhlorida),.6HZO diencerkan dengan menggunakan air suling sebelum melakukan percobaan. Keempat kelompok diberi dosis gavage 1 mL per 100 g berat badan sekali sehari selama 28 hari. Setelah perawatan selama 14 dan 28 hari, semua hewan dikorbankan secara manusiawi untuk diambilginjalsampel untuk analisis di bagian di bawah ini. Semua hewan percobaan dan prosedur dilakukan mengikuti persetujuan yang menerima persetujuan dari Perawatan Hewan dan Komite Etika di Universitas Pertanian Sichuan (No. Persetujuan:2012-024, Chengdu, China).

2.3. Penentuan indeks dan fungsi ginjal

Semua tikus ditimbang setiap minggu dan dikorbankan secara manusiawi ketika menyelesaikan perawatan, dan kemudianginjaltelah dipotong dan ditimbang. Ituginjalindeks yang digunakan adalah rasio antaraginjalberat badan dan berat badan.

Para peneliti mengukur nitrogen urea darah (BUN) dan kadar kreatinin serum (CRE) mengikuti instruksi dari kit komersial yang diproduksi oleh Naniing Jiancheng Bioengineering Institute of China (Nanjing, China),

2.4. Penentuan akumulasi ginjal Ni (Nikel)

Ginjalsampel diambil pada hari ke 28 selama percobaan. Kemudian, 1 mL HClO, dan 9 mL HNO. (Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd., China) digunakan untuk mencerna 0.5g porsi sampel selama 24 jam dalam tabung tahan suhu tinggi. Kemudian, tabung-tabung tersebut diletakkan di atas hot plate untuk menguapkan semua cairan, diikuti dengan suspensi residu menggunakan 10 mL 0,1 M/L HNO. Setelah itu, peneliti menganalisis sampel dalam hal Ni (Nikel)dengan bantuan spektrofotometer serapan atom nyala (AAS700, PerkinElmer, USA).

2.5. Pengamatan histopatologi dan ultrastruktur

Setelah dikumpulkan dan kemudian difiksasi dalam paraformaldehida 4 persen,ginjalsampel didehidrasi dengan alkohol, dibenamkan dalam parafin, diiris pada 5 um, dan diproses pewarnaan dengan hematoxylin dan eosin. Sebuah kamera digital (Nikon DS-Ri1, Jepang) digunakan untuk mengamati irisan dan mengambil foto untuk perubahan histopatologi. Sepuluh bidang mikroskopis masing-masingginjalditinjau. Gambar-gambar yang ditampilkan di koran adalah yang representatif.

Untuk evaluasi ultrastruktural, 2,5 persen glutaraldehida diterapkan untuk memperbaikiginjaljaringan (sekitar 1 mm5) pada suhu kamar. Ini diikuti oleh pasca-fiksasi jaringan ini dalam 1 persen osmium tetroksida, dikeringkan dalam aseton dan tertanam dalam resin epoksi. Irisan ultra tipis yang telah disiapkan diletakkan pada jaringan tembaga dan kemudian diwarnai menggunakan uranil asetat dan timbal asetat. Gambar ultrastruktur ditangkap menggunakan JEM-1400Miskop elektron transmisi flash (JEOL, Jepang).

memulihkan dan meningkatkan fungsi ginjal: cistanche

2.6. Imunohistokimia

Setelah di-dewax menggunakan xilena, irisan parafin direhidrasi dengan menggunakan larutan etanol bertingkat. Ini diikuti dengan mencuci dengan air suling dan PBS, dan 15 menit pemblokiran aktivitas peroksidase endogen (EPA) melalui inkubasi menggunakan 3 persen H,O.in metanol untuk pendinginan EPA. Untuk memfasilitasi pengambilan antigen, kami memperlakukan irisan melalui pemanasan microwave selama 15 menit dalam 0.01 M buffer natrium sitrat dengan pH 6,0.Setelah dijenuhkan dengan serum kambing 10 persen normal selama 30 menit, irisan kemudian menjalani inkubasi menggunakan antibodi primer semalam pada 4 derajat. 1 persen antibodi sekunder IgG kambing anti-kelinci/tikus terbiotinilasi (Boster, Wuhan, Cina) digunakan untuk menginkubasi irisan yang dicuci dengan PBS pada suhu 37 derajat selama 1 jam, dan kemudian pada suhu 37 derajat , kompleks streptavidin-biotin (SABC; , Wuhan, China) digunakan selama 30 menit. Ini diikuti dengan perendaman irisan dalam diaminobenzidine hidroklorida (DAB; Boster, Wuhan, Cina) untuk visualisasi reaksi imun. Akhirnya, setelah counterstaining ringan menggunakan hematoxylin, irisan didehidrasi dengan etanol, dibersihkan dengan xilena dan dipasang, berturut-turut.

Kepadatan optik terintegrasi (IOD) digunakan untuk kuantifikasi kadar protein LC3B dan p62. Metode analisis untuk nilai IOD mengacu pada Fanget al.(2018). Sistem kamera mikroskop digital Nikon DS-Ril (Jepang) diadopsi untuk mengambil gambar. Peneliti kemudian memilih lima bidang（0.064 mm²）di setiap area gambar dari setiap irisan untuk dianalisis dengan bantuan perangkat lunak Image-Pro Plus v6.0 (Media Cy-bernetics Inc, Bethesda, MD, USA ).

2.7. blotting barat

Ekstraksi protein dariginjalsampel dilakukan dengan menggunakan buffer lisis RIPA, dan reagen uji protein BCA (P0010S, Teknologi Beyotime, Cina) digunakan untuk mengukur konsentrasi. SDS-PAGE kemudian dilakukan untuk sampel protein, yang kemudian dipindahkan ke membran nitroselulosa. Diblokir menggunakan 5 persen susu skim selama 1 jam pada suhu kamar, membran diinkubasi dengan antibodi primer pada 4 derajat semalam. Setelah menggunakan antibodi sekunder terkonjugasi peroksidase lobak untuk diinkubasi selama 1 jam, XRS Chemidoc digunakan untuk mendeteksi pita protein pada membran menggunakan kit ECL (P0018A, Teknologi Beyotime, Cina).

2.8.Reaksi berantai polimerase real-time kuantitatif (qRT-PCR)

Ginjaldiambil dan digiling dengan nitrogen cair dalam mortar menggunakan alu dan kemudian diawetkan pada suhu rendah (-80 derajat), RNA total ginjal diekstraksi menggunakan RNAiso Plus (9108/9109, Takara, Otsu, Jepang) mengikuti rekomendasi dari produsen. Ini diikuti oleh sintesis DNA komplementer (cDNA) dengan kit reagen RR047A Prim-ScriptTM RT yang diproduksi oleh Takara di Jepang mengikuti instruksi. Setelah itu, qRT-PCR dilakukan melalui penggunaan LightCycler 480 Real-Time PCR System (Bio-Rad, USA) dan kit SYBR Premix Ex TaqTMII (DRR820A, Takara, Jepang). Primer yang digunakan untuk PCR tercantum dalam Tabel 1. -aktin digunakan untuk normalisasi ekspresi gen, dan ekspresi relatif mRNA dihitung melalui metode 2-4ac (Livak dan Schmittgen, 2001).

2.9. Analisis statistik

Data dinyatakan dalam bentuk mean ± standar deviasi dan dianalisis melalui analisis varians T3 LSD atau Dunnett. Perangkat lunak SPSS (versi 22.0, IBM Corp, Armonk, NY, USA) digunakan untuk semua analisis statistik untuk windows. P<0.05 represents="" a="" significant="">

Tabel 1: Urutan primer yang digunakan dalam penelitian,

3. Hasil

3.1.NiClz (Nikelkhlorida)merusak fungsi ginjal

Seperti yang ditunjukkan pada Gambar.1A, berat badan menurun dalam tiga kelompok yang diobati dengan NiCl2 (Nikelklorida 2). Dan, penurunan yang signifikan juga ditemukan pada bobot relatifginjal(P<0.05) in="" the="" 30="" mg/kg="" group="" at="" 28="" days="" (fig.="">

Serum CRE dan BUN digunakan sebagai biomarker standar untuk fungsi ginjal. Hasil fungsi ginjal ditampilkan pada Gambar.1C dan D, dan konsentrasi CRE dan BUN meningkat secara signifikan (P<0.05)in the=""> (Nikelklorida 2)-kelompok perlakuan pada hari ke 14 dan 28 kerabat dengan kontrol.

Gambar.1E menunjukkan bahwa ketiga Ni (Nikel)kelompok perlakuan memiliki konsentrasi Ni yang jauh lebih besar di ginjal (P<0.05)compared to="" the="">

3.2. NiCl (Nikelkhlorida)- menginduksi variasi histopatologi ginjal

Gbr.2 menunjukkan bahwa NiClz (Nikelkhlorida)pengobatan menyebabkan variasi histopatologis dariginjaldengan dosis dan waktu, melibatkan pembengkakan glomerulus bersama dengan ruang kapsuler yang menyempit, vakuolar, dan degenerasi granular pada epitel tubulus ginjal.

Gambar 2. NiCl2 (Nikelklorida 2)menyebabkan perubahan histopatologi pada ginjal.

Lesi histopatologi meliputi pembengkakan glomerulus bersama dengan penyempitan ruang kapsuler (*), degenerasi vakuolar (panah hitam) dan degenerasi granular (panah putih) pada epitel tubulus ginjal. Pewarnaan HE, bilah skala=50 m.

3.3.NiCl (Nikelkhlorida)menginduksi autophagy dan meningkatkan gen dan protein terkait autophagy di ginjal

LC3 dan p62 adalah biomarker penting dariautofagi(Gomez-San-chez dkk..2016). Dibandingkan dengan kontrol, ketiga NiCl2 (Nikelklorida 2) kelompok perlakuan menyaksikan peningkatan yang signifikan dalam tingkat protein LC3-I/I (P< 0.05)on="" days="" 14="" and="" 28,="" and="" a="" significant="" decrease="" in="" the="" protein="" level="" of="">< 0.05)(fig.3a-c).="" inconsistent="" with="" the="" protein="" experiment="" results,="" relative="" to="" the="" control="" group(fig.="" 3d="" and="" e),="" the="" treatment="" groups="" showed="" significantly="" increased="" mrna="" expression="" level="" of="" lc3=""><0.05)and significantly="" decreased="" mrna="" expression="" level="" of=""><0.05). otherwise,="">autofagijuga penentuan oleh TEM dalam penelitian ini. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar, 3F, pengamatan TEM menunjukkan bahwa jumlah autolisosom meningkat di jaringan ginjal setelah NiCl2 (Nikelklorida 2)paparan.

Gambar 3. NiCl2 (Nikelklorida 2)meningkatkan autophagy di ginjal tikus.

(A) Hasil western blot dari LC3 dan p62. (B, C) Kuantifikasi LC3-II/I dan p62. (DE) Ekspresi mRNA dari LC3 dan p62. (F)

Struktur ultrastruktural sel epitel tubulus proksimal (gambar kanan menunjukkan pembesaran parsial gambar kiri; panah hitam menunjukkan struktur autolisosom).

Nilai disajikan dengan rata-rata ± standar deviasi (n {{0}}). Kolom yang ditandai dengan huruf berbeda merupakan perbedaan nyata (P <>

Selanjutnya, imunohistokimia digunakan untuk mengukur kadar protein LC3B dan p62 diginjaljaringan dalam penelitian ini. Seperti ditunjukkan pada Gambar.4, sel-sel positif berwarna coklat, dan LC3B dan p62 terutama diekspresikan dalam sitoplasma sel epitel tubulus ginjal. Dibandingkan dengan kontrol, nilai IOD LC3B menunjukkan peningkatan yang signifikan (P< 0.05)in="" the="" three="" groups="" treated="" with=""> (Nikelkhlorida) pada hari 14 dan 28. Selain itu, nilai IOD p62 menurun secara signifikan (P< 0.05)in="" these="" three="" treatment="" groups="" on="" days="" 14="" and="" 28="" when="" in="" comparison="" with="" the="">

Gambar 4. Hasil imunohistokimia LC3B dan p62 pada ginjal mencit.

(A) Gambar imunohistokimia LC3B. (bilah skala=50 m) (B) Gambar imunohistokimia p62 (bilah skala=50 m)

(C) Kerapatan optik terintegrasi (IOD) dari LC3B. (D) Kerapatan optik terintegrasi (IOD) dari p62.

Nilai disajikan dengan rata-rata ± standar deviasi (n {{0}}). Kolom yang ditandai dengan huruf berbeda merupakan perbedaan nyata (P <>

Gen dan protein yang terkait denganautofagidan terlibat dalamautofagifluks diukur untuk lebih memverifikasi efek NiCl (Nikelkhlorida) padaautofagi. Ini termasuk Beclin1, Atg5, Atg12, Atg16L1, Atg7, dan Atg3 (Li dan Zhang.2019; Nishimura dan Tooze, 2020). Seperti yang ditunjukkan pada Gbr.5A-C, dibandingkan dengan kontrol, kelompok perlakuan Ni (Nikel)menunjukkan tingkat protein Beclinl, Atg5, Atg12, Atg16L1, Atg7, dan Atg3(P) yang secara signifikan lebih tinggi<0.05)on days="" 14="" and="" 28.="" additionally,="" the="" treatment="" groups="" of="" ni="" also="" exhibited="" significantly="" elevated="" mrna="" expressions="" of="" beclin1,="" atg5,="" atg12,="" atg16l1,="" atg7,="" and=""><0.05)on days="" 14="" and="" 28="" of="" the="" experiment="" (fig.6d-e)relative="" to="" the="">

Gambar 5. NiCl2 (Nikelklorida 2)meningkatkan gen dan protein terkait autophagy di ginjal tikus.

(A) Hasil western blot dari Beclin1, Atg5, Atg12, Atg16L1, Atg7, dan Atg3. (B&G) Kuantifikasi ekspresi protein Beclin1, Atg5, Atg12, Atg16L1, Atg7, dan Atg3.

(HM) Ekspresi mRNA dari Beclin1, Atg5, Atg12, Atg16L1, Atg7, dan Atg3. Nilai disajikan dengan rata-rata ± standar deviasi (n=8). Kolom yang ditandai dengan huruf yang berbeda merupakan perbedaan nyata (P <>

3.4.NiCl2 (Nikelklorida 2)menginduksi jalur PI3K/Akt/mTOR dan AMPK di ginjal

mTOR adalah pengatur penting dariautofagi(Wang et al., 2017). Dan jalur regulator hulu mTOR yang mapan termasuk PI3K/Akt dan AMPK (Gong et al..2020: Xu et al..2020). Dengan demikian, penelitian ini mengukur protein jalur AMPK dan PI3K/Akt.

Seperti Fg.6A dan B menunjukkan bahwa kadar protein p-PI3K, p-AKT, dan p-mTOR ditemukan mengalami penurunan yang signifikan (P< 0.05)in="" the="" three="" groups="" treated="" with=""> (Nikelklorida 2)pada hari 14 dan 28 percobaan relatif terhadap kontrol. Kelompok perlakuan menunjukkan kadar protein p-AMPK dan p-ULK1 secara signifikan lebih tinggi (P<0.05)than those="" of="" the="" control="" on="" days="" 14="" and="" 28.="" it="" can="" be="" seen="" from="" fig.6="" chat,="" compared="" to="" the="" control.="" the=""> (Nikelklorida 2)kelompok perlakuan ditemukan memiliki penurunan yang signifikan dalam ekspresi mRNA PI3K, AKT, dan mTOR (P<0.05)on days="" 14="" and="" 28.="" ampk="" and="" ulk1="" of="" the="" treatment="" groups="" showed="" significant="" increases="" in="" mrna="">< 0.05)on="" days="" 14="" and="" 28="" in="" comparison="" with="" the="" control.="">Hasil ini mengungkapkan bahwaautofagidiinduksi oleh NiCl2 (Nikelklorida 2)pada ginjal tikus melibatkan jalur AMPK dan PI3K/Akt/mTOR.

Gambar 6. NiCl2 (Nikelklorida 2)menginduksi jalur pensinyalan PI3K / Akt / mTOR dan AMPK di ginjal tikus.

(A) Hasil western blot p-PI3K, PI3K, p-AKT, AKT, p-AMPK, AMPK, p-mTOR, mTOR, p-ULK1, dan ULK1.

(BF) Kuantifikasi ekspresi protein p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, p-AMPK/AMPK, p-mTOR/mTOR, dan p-ULK1/ULK1. (G, K)

Ekspresi mRNA PI3K, AKT, AMPK, mTOR, dan ULK1. Nilai disajikan dengan rata-rata ± standar deviasi (n=8). Kolom yang ditandai dengan huruf berbeda merupakan perbedaan nyata (P <>

KLIK DI SINI UNTUK BAGIANⅡ