Arsitektur Tiga Dimensi Nefron pada Ginjal Normal dan Kistik

Kontak: emily.li@wecistanche.com

Thomas Blanc1,2,7 , Nicolas Goudin3,7 , Mohamad Zaidan1,4,7 , Meriem Garfa Traore3 , Frank Bienaime1,5, Lisa Turinsky1 , Serge Garbay1 , Cle´ment Nguyen1 , Martine Burtin1 , Ge´rard Friedlander1,6 , Fabiola Terzi1,8 dan Marco Pontoglio1,8

Cistanche baik untuk ginjal

KATA KUNCI: penyakit ginjal kistik; ginjal; nefron; nefronofisis;pembersihan jaringan

Fungsi ginjal sangat bergantung pada struktur tiga dimensi nefron yang kompleks. Setiap distorsi bentuknya dapat menyebabkandisfungsi ginjal. Metode histologis tradisional menghadirkan keterbatasan utama untuk rekonstruksi jaringan tiga dimensi. Di sini, kami menggabungkan pembersihan jaringan, mikroskop multi-foton, dan penelusuran digital untuk rekonstruksi nefron tunggal dalam kondisi fisiologis dan patologis. Rangkaian darinefronberbeda dalam lokasi, bentuk dan ukuran sesuai dengan fungsinya diidentifikasi. Menariknya, nefron cenderung terletak di bidang. Ketika teknik ini diterapkan pada modelpenyakit ginjal kistik, kista ditemukan hanya berkembang di segmen nefron tertentu. Sepanjang segmen yang sama, kista bersebelahan dalam tubulus normal yang tidak berdilatasi. Selain itu, bentuk kista bervariasi menurut segmen nefron. Dengan demikian, temuan kami memberikan strategi yang berharga untuk memvisualisasikan struktur kompleks ginjal pada tingkat nefron tunggal dan, yang lebih penting, memberikan dasar untuk memahami proses patologis seperti cystogenesis.

Pernyataan Terjemahan

Metode kliring menyediakan alat yang unik untuk memahami bagaimana perubahan morfologi menyebabkan konsekuensi patologis. Ginjal adalah organ penting yang mempertahankan homeostasis tubuh melalui penanganan air, metabolit, dan elektrolit, yang sangat bergantung pada struktur dimensional 3-kompleks nefron. Ketika organisasi struktural ini diubah, patofisiologi ginjal terjadi kemudian. Dalam penelitian ini, kami telah mengembangkan metode yang kuat berdasarkan pembersihan optik,

mikroskop multifoton, dan penelusuran digital untuk mempelajari ginjal pada tingkat nefron tunggal dalam kondisi fisiologis dan patologis. Secara khusus, kami menyediakan rekonstruksi dimensi 3-pertama dari ginjal polikistik pada skala nefron tunggal. Metode ini dapat diterapkan pada beberapa konteks patologis, memungkinkan kita untuk lebih memahami proses kompleks kerusakan ginjal dan, akibatnya, untuk mengembangkan strategi terapi yang lebih bertarget.

Ginjal mempertahankan homeostasis tubuh melalui struktur nefron 3-dimensi (3D) yang kompleks. Ketika organisasi struktural ini diubah, patofisiologi ginjal terjadi kemudian.Penyakit ginjal kronisditandai dengan perkembangan lesi ginjal. Menariknya, ahli patologi telah melaporkan heterogenitas luas dalam distribusi lesi selama penyakit ginjal kronis.1,2 Apakah ini mencerminkan fakta bahwa segmen nefron tertentu dapat rusak secara berbeda, atau sebagai alternatif, bahwa beberapa nefron memiliki kerentanan yang berbeda untuk terluka secara keseluruhan. , tidak diketahui. Untuk mengatasi masalah ini, adalah wajib untuk merekonstruksi bentuk 3D nefron dalam konteks patologis.

Untuk pengetahuan kita,nefronhanya telah sepenuhnya direkonstruksi menggunakan bagian 2D serial.3–5 Meskipun pemotongan histologis standar memberikan resolusi tinggi, rekonstruksi 3D melelahkan dan sulit diperoleh. Hal ini terutama disebabkan oleh distorsi mekanis, yang merupakan efek tak terhindarkan dari prosedur pemotongan. Selain itu, rekonstruksi 3D dari gambar 2D tidak memungkinkan pencitraan langsung struktur 3D di jaringan yang dipasang secara keseluruhan.

Mikroskop multifoton telah meningkatkan kemampuan kami untuk mendeteksi perubahan morfologi pada bagian yang tebal. Namun, batasan yang signifikan adalah kedalaman akses yang dangkal karena hamburan cahaya. Dengan meminimalkan perbedaan indeks bias, agen kliring telah secara dramatis meningkatkan kemampuan untuk kedalaman gambar.6,7 Terlepas dari kenyataan bahwa agen kliring pertama diperkenalkan seabad yang lalu,8 baru-baru ini beberapa protokol kliring telah dikembangkan, sebagian besar untuk otak 0,9-17 Studi terbaru telah menunjukkan potensi mereka untuk pencitraan organ padat lainnya, seperti hati, pankreas, atau ginjal.18-26

cistanche untuk penyakit ginjal

Penyakit ginjal polikistik, kelainan genetik heterogen yang melibatkan mutasi pada beberapa gen silia, adalah penyakit ginjal herediter yang paling umum.27,28 Penyakit ginjal polikistik ditandai dengan perkembangan kista yang mengarah pada penghancuran total ginjal.28 Studi mikrodiseksi menyarankan bahwa kista dapat berkembang baik sebagai "dorongan keluar" dari segmen nefron, seperti pada polikistik autosomal dominanpenyakit ginjal; sebagai perluasan ectatic dari saluran pengumpul (CD), seperti pada polikistik resesif autosomalpenyakit ginjal; atau secara eksklusif di tubulus meduler, seperti pada nephronophthisis (NPHP).27,29 Namun, bagaimana kista berkembang dalam 3D dan mengatur satu sama lain dan tubulus tetangga yang normal masih belum diketahui.

Di sini, kami menggabungkan pembersihan optik dengan mikroskop multifoton untuk memberikan wawasan baru tentang bagaimananefrondibentuk dan diatur dalam kondisi fisiologis dan bagaimana mereka dimodifikasi selama penyakit, seperti cystogenesis. Hasil kami menunjukkan bahwa ada 3 jenis nefron dan pembuluh darah dapat mempengaruhi organisasi spasial nefron. Menariknya, kami mengamati bahwa nefron cenderung terletak pada bidang tertentu. Tanpa diduga, ketika kami menerapkan teknik ini pada tikus jck, kami mengamati bahwa kista hanya berkembang di segmen nefron tertentu dengan kista fusiform yang bercampur dengan tubulus normal.

HASIL

Pengaturan eksperimen

Untuk mempelajari bentuk keseluruhannefrondalam kaitannya dengan lingkungan mereka, kami mengadopsi teknik berdasarkan kliring optik dan mikroskop multifoton (Gambar Tambahan S1A). Dengan membandingkan protokol pembersihan optik yang berbeda, kami menentukan bahwa untuk ginjal, benzil alkohol/bensil benzoat (BABB) adalah yang paling tepat dalam hal efisiensi (Gambar Tambahan S1B dan C dan Tabel Tambahan S1).

Rekonstruksi 3D dan penelusuran digital memerlukan gambar berkualitas tinggi dengan resolusi tinggi dan rasio sinyal-ke-latar belakang yang tinggi. Kami mengamati bahwa sinyal optik yang disediakan oleh fluoresensi asli tidak seragam pada bagian ginjal. Secara khusus, gambar dari medula sangat kontras dengan rasio sinyal-ke-latar belakang yang rendah (Gambar Tambahan S2). Untuk meningkatkan rasio sinyal-ke-latar belakang, kami menodai bagian dengan asam periodik-Schiff (Gambar Tambahan S1D), karena kami secara empiris mencatat bahwa pewarnaan ini memunculkan kontras tinggi pada bagian tipis selama 2-fluoresensi foton. Namun, sinyalnya tidak seragam di seluruh bagian ginjal yang diwarnai asam-Schiff periodik yang tebal (Gambar Tambahan S1E). Oleh karena itu, kami mewarnai bagian ginjal dengan lektin yang digabungkan dengan flfluorochrome: aglutinin kacang tanah dan aglutinin bibit gandum, yang mewarnai glomeruli dan tubulus, dan Griffonia simplicifolia aglutinin, yang menandai pembuluh darah.30 Hebatnya, dengan kombinasi lektin ini, sinyal-ke- rasio latar belakang meningkat secara dramatis secara keseluruhanbagian ginjal, dengan peningkatan yang signifikan pada bidang xy dan sumbu z (Gambar Tambahan S1E dan Film Tambahan S1).

Visualisasi segmen nefron 3D

Untuk memvisualisasikan bentuk seluruh nefron, kami menelusuri jalurnya, mulai dari kutub urinarius glomerulus dan berakhir di persimpangan CD (Film Tambahan S2). Terlepas dari kenyataan bahwa lektin yang digunakan secara global mengikat semua segmen nefron, kami melihat bahwa ketika diperiksa dengan cermat, lektin ini dicirikan oleh pola tertentu dalam cara mereka mewarnai membran basal atau luminal di segmen nefron yang berbeda. Dengan kata lain, kami memanfaatkan pola stereotip pewarnaan lektin untuk mengidentifikasi segmen nefron yang berbeda. Dengan cara ini, kita dapat dengan mudah mengidentifikasi 6 entitas: tubulus proksimal (PT), tungkai tipis (TL) lengkung Henle (HL), tungkai menaik tebal (TAL) HL, tubulus kontortus distal (DCT), tubulus penghubung (CNT). ), dan CD. Transisi antara PT dan TL ditandai dengan hilangnya tiba-tiba sinyal brush border PT yang khas dan dengan penurunan lebar lumen, yang hampir tidak ada di TL (Gambar 1a). Sebaliknya, transisi antara TL dan TAL ditandai dengan peningkatan yang signifikan pada diameter tubulus eksternal dan lebar lumen yang relatif konstan (Gambar 1b). Secara keseluruhannefron, transisi TAL ke DCT secara sistematis ditemukan di kutub vaskular glomerulus. Transisi ini ditandai dengan pembesaran tiba-tiba diameter tubulus eksternal yang sebagian besar disebabkan oleh peningkatan diameter lumen yang signifikan (Gambar 1c). Transisi antara DCT dan CNT ditandai dengan pengurangan diameter dan lumen tubulus (Gambar 1d). Akhirnya, hubungan antara CNT dan CD kortikal ditandai dengan peningkatan tiba-tiba pada diameter dan lumen tubulus (Gambar 1e). Kuantifikasi transisi morfologis ini signifikan secara statistik (Gambar 1f), dan relevansinya diverifikasi dengan pewarnaan dengan penanda tubular tertentu (Angka Tambahan S3–S5 dan Film Tambahan S3–S5).

Bentuk dan ukuran PT berbeda menurut kedalamannya

Pewarnaan tebalbagian ginjalmemungkinkan kami untuk melacak koordinat evolusi spasial seluruh segmen PT. Menariknya, kami menemukan bahwa bentuknya sangat bervariasi dan ditentukan oleh posisi glomeruli mereka di korteks. Secara global, kami mengidentifikasi 3 pola. Kor pertama merespons nefron paling dangkal (SN) (Gambar 2a; Film Tambahan S6), yang menempati bagian paling luar korteks (30 persen paling eksternal dekat dengan kapsul ginjal). Bagian-bagiannya yang berbelit-belit membentuk struktur kompak dengan hanya 6 sampai 7 lilitan di sekitar glomerulusnya sendiri, menempati ruang yang sangat kecil dan padat. Konvolusi SN ini berakhir di pars recta yang panjang dan lurus yang turun ke medula. Di ujung yang berlawanan dari spektrum ini, kami mengamati pola kedua darinefronterletak di bagian terdalam korteks (40 persen lebih dalam kedalaman internal), di sebelah medula (nefron juxtamedullary [JNs]) (Gambar 2a; Gambar Tambahan S6 dan Film Tambahan S6). PTs mereka dicirikan oleh loop pendek awal yang secara sistematis turun ke arah papila dan kemudian U berbalik naik ke arah kapsul ginjal. Berbeda dengan SN, tubulus berbelit-belit proksimal JN dicirikan oleh gulungan besar yang berevolusi di sekitar glomerulus mereka sendiri dan menempati domain besar yang dikemas secara longgar di korteks juxtamedullary. Bagian PT JN yang berbelit-belit memiliki 10 hingga 15 lilitan, membentuk domain besar. Akhirnya, pola ketiga termasuk nefron yang terletak di bagian tengah korteks (nefron tengah [MN]) (Gambar 2a; Film Tambahan S6). Menariknya, tubulus ini memiliki bentuk dan orientasi spasial yang mewakili transisi antara SN dan JN. Faktanya, mereka berisi 8 hingga 9 lilitan dengan kumparan yang lebih besar dari SN, tetapi lebih kecil dari JN. Selain itu, MN memiliki pars recta yang lebih panjang daripada JN. Menariknya, perbandingan global dari bentuk PTs menunjukkan bahwa SN dan MN memiliki pola yang homogen sedangkan JN sangat heterogen (Gambar Tambahan S6). Selain itu, rekonstruksi spasial beberapa nefron mengungkapkan bahwa PT tidak pernah berbaur (Film Tambahan S6), menunjukkan bahwa setiap nefron menempati ruang individualnya sendiri di korteks.

Analisis morfometrik mengkonfirmasi perbedaan besar dalam ukuran dan bentuk SN dan JN, dengan aspek perantara untuk MN. PT JN lebih dari 2-kali lipat lebih panjang dari PT SN (Gambar 2b); namun, kelurusan lebih besar pada SN daripada pada JN (Gambar 2c), konsisten dengan pengamatan bahwa tubulus JN jauh lebih berliku-liku (Gambar 2a; Gambar Tambahan S6).

Gambar 1|Kriteria morfologi digunakan untuk mengidentifikasi segmen nefron. ( a – e ) Morfologi segmen nefron yang berbeda pada tikus kontrol. Nefron ditelusuri dari kutub urinarius glomerulus ke saluran pengumpul (tubulus proksimal [PT]: pirus; tungkai tipis [TL] lengkung Henle: abu-abu muda; tungkai menaik tebal [TAL] lengkung Henle: abu-abu gelap; tubulus berbelit-belit distal [DCT]: merah muda; tubulus penghubung [CNT]: kuning; saluran pengumpul kortikal [CCD]: oranye). Panah menunjukkan diameter segmen nefron yang berbeda. (Lanjutan)

Gambar 1|(Lanjutan) (f) Kuantifikasi diameter tubulus luar dari segmen nefron yang berbeda. Data dinyatakan sebagai SEM rata-rata. Analisis varians dilanjutkan dengan uji Tukey-Kramer: **P < 0.01,="" ***p=""><>

Gambar 3|Rekonstruksi nefron tiga dimensi (3D) mengungkapkan 3 jenis nefron yang berbeda. ( a ) Gambar 3D representatif dari seluruh nefron (panel kiri) dari glomeruli ke saluran pengumpul di korteks superfisial (biru), korteks tengah (hijau), dan wilayah juxtamedullary (merah) pada tikus kontrol. Segmentasi nefron (panel kanan) untuk 3 jenis nefron yang berbeda. Batang 150 mm. (b) Kuantifikasi jarak antara 2 tungkai lengkung Henle untuk 3 jenis nefron. (c) Kuantifikasi panjang nefron untuk (lanjutan)

Gambar 3|(lanjutan) 3 jenis nefron. (d) Kuantifikasi panjang segmen yang berbeda dari nefron menurut jenis nefron. Data dinyatakan sebagai mean -SEM. Analisis varians diikuti dengan uji Tukey-Kramer: nefron juxtamedullary (JN) versus nefron superfisial (SN): ###P < 0.001;="" jn="" versus="" nefron="" tengah="" (mn):="" *="" p="">< 0.05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001.="" cnt,="" tubulus="" penghubung;="" dct,="" tubulus="" berbelit-belit="" distal;="" pt,="" tubulus="" proksimal;="" tal,="" cabang="" menaik="" tebal="" dari="" loop="" henle;="" tl,="" tungkai="" tipis="" dari="" loop="">

Ukuran glomerulus bervariasi dengan kedalaman

Kami kemudian menganalisis kedalaman dan diameter glomeruli yang dipilih secara acak dari masing-masing 3 zona. Analisis morfometrik mengungkapkan bahwa glomeruli terletak rata-rata 783 dan 355 mm dari kapsul ginjal di JNs dan SNs, masing-masing. Seperti yang dilaporkan sebelumnya, kami mengamati bahwa ukuran glomeruli bervariasi menurut kedalamannya. Secara khusus, volume glomerulus JNs adalah 3 kali lebih besar daripada SNs dan MNs (Gambar 2d).

Rekonstruksi nefron 3D

Kami kemudian menelusuri evolusi spasial seluruh nefron dari PT ke CNT. Pandangan global dari rekonstruksi 3D mereka menegaskan bahwa bentuk nefron berbeda antara SN, MN, dan JN (Gambar 3a; Film Tambahan S7). Perbedaan ini terutama disebabkan oleh struktur PT. Selain itu, kami mengamati bahwa HL memiliki organisasi spasial 3D yang berbeda. Secara khusus, TL dan TAL dipisahkan lebih jauh di JN daripada di SN dan MN (Gambar 3b). Analisis morfometrik mengungkapkan bahwa JN secara global 2-kali lipat lebih lama dari SN (Gambar 3c). Peningkatan panjang terdistribusi secara proporsional di semua segmen, kecuali TAL dan DCT, yang cenderung memiliki panjang absolut yang sama di semua tipe nefron (Gambar 3d). Ini menunjukkan bahwa pemanjangan nefron adalah proses berpola yang sangat homogen.

Pembuluh arkuata mempengaruhi konvolusi PT yang berdampingan

Untuk mendapatkan perspektif yang lebih komprehensif tentangstruktur ginjal, kami mengambil keuntungan dari pewarnaan Griffonia simplicifolia aglutinin, yang memungkinkan kami untuk melacak pembuluh arkuata dan cabangnya ke dalam pembuluh radiata kortikal (Gambar 4a; Film Tambahan S8). Menariknya, rekonstruksi 3D nefron dan pembuluh darah secara bersamaan menunjukkan bahwa pembuluh arkuata cenderung berada dalam organisasi spasial paralel yang mengejutkan dengan tubulus di dekatnya. Secara khusus, kami mengamati bahwa jalur yang diikuti oleh JN tertentu (JN dibatasi) cenderung mengikuti jalur kapal terdekat (Gambar 4b; Film Tambahan S9). Hebatnya, bias ini (diamati hanya dalam subset nefron JN) menyumbang heterogenitas besar dalam bentuk PT (Gambar Tambahan S6). Analisis morfometrik mengungkapkan bahwa PTs "terkendala" secara signifikan lebih panjang dan lebih berliku-liku (mengurangi kelurusan) daripada yang "tidak dibatasi" (Gambar 4c dan d). Perlu dicatat bahwa bagian berbelit-belit dari SN dan MN diposisikan di atas pembuluh arkuata dan tidak dibatasi.

Tubulus cenderung terletak di bidang

Menariknya, pemeriksaan bentuk 3D nefron menunjukkan bahwa nefron cenderung terletak pada bidang (Gambar 5a; Film Tambahan S10). Untuk mengukur parameter ini dan untuk menilai kemungkinan bias statistik dari konformasi ini, kami mengukur kecenderungan umum tubulus untuk membengkok keluar dari bidang yang ditentukan oleh loopnya. Pengukuran kami menunjukkan bahwa dibandingkan dengan model simulasi jalan acak yang dihasilkan dengan rangkaian pengukuran sudut dan panjang berurutan yang sama antara titik yang berurutan (Gambar 5b), tubulus cenderung berevolusi dengan penyimpangan yang lebih kecil dari bidang (Gambar 5c). Ini menunjukkan bahwa tubulus cenderung membatasi jalurnya di sepanjang bidang. Perbedaan yang diamati sangat signifikan secara statistik (P <>

cistanche dapat meningkatkan fungsi ginjal

Rekonstruksi nefron 3D mengungkapkan pola spesifik untuk perkembangan kista

Untuk menentukan apakah protokol kami memungkinkan untuk melacak nefron dalam jaringan patologis yang tidak terorganisir, kami mengkarakterisasi bentuk dan distribusi spasial kista pada tikus jck, model NPHP dan penyakit kistik yang banyak digunakan. Gambar 31–33 3D menunjukkan bahwa meskipun dari munculnya kista yang menonjol, jalur 3D umum nefron tidak berbeda secara signifikan dari tikus kontrol (Film Tambahan S11). Demikian pula, analisis morfometrik menegaskan bahwa panjang global nefron, volume glomerulus, dan panjang masing-masingnefronsegmen sebanding dengan tikus kontrol (Gambar Tambahan S7). Sebagai catatan, karena perkembangan kista, kami tidak dapat membedakan TL dari TAL di HL. Semua nefron mengembangkan kista fusiform (Film Tambahan S11 dan S12). Salah satu fitur yang paling mencolok adalah pengamatan bahwa pelebaran kistik fusiform terjadi di beberapa lokasi di sepanjang yang samanefronsegmen (Film Tambahan S12 dan S13). Menariknya, kami mengamati bahwa kista tidak pernah berkembang di PTs dan tungkai menurun HL (Gambar 6a; Film Tambahan S12). Sebaliknya, mereka sebagian besar terdeteksi di tungkai naik HL, DCT, CNT, dan di bagian atas CD, secara berkelanjutan dengan CNT (Gambar 6a; Film Tambahan S12). Secara khusus, kami mengamati bahwa DCT, serta segmen CNT, memiliki kemungkinan yang meningkat secara khusus untuk mengembangkan kista di masing-masing bagian yang lebih distal (Gambar 6b). Analisis morfometrik kuantitatif dari gambar rekonstruksi 3D mengungkapkan bahwa total volume kista pernefronsangat tinggi di CNT (Gambar 7a). Selain itu, kami mengamati bahwa pembesaran kista pada HL dan DCT lebih besar pada JN daripada pada SN dan MN (Gambar 7a; Film Tambahan S12). Selain itu, kejadian kista secara signifikan lebih tinggi pada JNs daripada jenis nefron lainnya (Gambar 7b). Kami juga mengamati bahwa rata-rata jarak glomerulus (dihitung pada 5 glomeruli terdekat) cenderung meningkat secara khusus pada tikus kistik, terutama di korteks yang lebih superfisial (Gambar Tambahan S8).

Rekonstruksi 3D dari banyak kista mengungkapkan bahwa mereka sangat bervariasi dalam bentuk dan volume (Gambar 6c; Film Tambahan S11 dan S13). Pada ekstremitas asenden HL, kista memiliki bentuk fusiform dengan diameter kecil. Dalam DCT, kista memiliki bentuk yang agak bulat dan lebih besar dan diselingi di antara tubulus yang tidak berdilatasi. Menariknya, transisi antara DCT dan CNT secara sistematis dicirikan oleh struktur normal yang tidak berdilatasi. Sebaliknya, di CNT, kami secara sistematis mengamati struktur kistik melebar yang berdekatan langsung dalam kontak dengan CD. Menariknya, pada CD, struktur ini secara progresif menyusut ke ukuran tubulus normal. Lebih jauh, tidak ada kista lebih lanjut yang dapat dideteksi di bagian CD yang berdekatan. Fitur lain yang konsisten adalah organisasi spasial yang aneh dari kista di ekstremitas menaik HL. Faktanya, meskipun kista lebih dalam dan lebih dekat ke loop di SN, mereka lebih dangkal dan lebih dekat ke DCT di JN (Gambar 6c). Sekali lagi, kista menempati posisi perantara di MN (Gambar 6c).

Gambar 5|Tubulus nefron cenderung berkembang sebagai struktur datar. (a) Jalur khas tubulus proksimal nefron. Jalur ini menggambarkan kecenderungannya untuk berbaring di pesawat. Planaritas evolusi jalur dapat dilihat lebih baik bila diputar dengan benar dan disejajarkan dengan sudut pandang pengamat (lihat representasi kanan dari segmen tabung yang sama, yang, di sisi kiri, direpresentasikan pada segmen tabung yang berbeda). sudut). (b) Representasi skema jalur tabung yang terdiri dari 4 segmen (antara 5 titik yang menentukan jalur tabung yang ditunjukkan sebagai contoh). Sejauh mana jalur cenderung "keluar dari bidangnya" dapat diwakili oleh sudut yang ditunjukkan di sini sebagai "beta." (Lanjutan)

Gambar 5|(Lanjutan) Sudut ini diukur antara segmen p3-p4 terhadap bidang (didefinisikan oleh titik sebelumnya p3, p2, dan p1) dan diwakili oleh persegi panjang abu-abu gelap dalam skema. Perhitungan sudut beta kemudian dihitung secara rekursif sepanjang himpunan titik di jalur tubular. Untuk mengevaluasi sejauh mana bias sudut beta ini, kami mensimulasikan jalan acak (simulasi Monte Carlo [MC]) dengan menggunakan rangkaian sudut alfa berurutan yang sama dari setiap jalur tubular (diukur antara semua segmen berurutan). Jalan acak ini menghasilkan jalur dengan kumpulan sudut alfa dan sudut beta acak yang identik. (c) Plot biola dari distribusi global sudut beta dan hasil MC di tubulus proksimal (PT), thin limb (TL) dari Henle loop, tebal ascending limb (TAL) dari Henle loop, distal berbelit-belit tubulus ( DCT), dan tubulus ikat (CNT). MC, P <>

DISKUSI

Metode histologis tradisional terbatas dalam kemampuannya untuk mendeteksi perubahan patologis yang mempengaruhi bentuk global nefron. Di sini, kami menyajikan pendekatan yang kuat berdasarkan pembersihan jaringan yang memiliki potensi untuk menjawab pertanyaan penting tentang arsitektur ginjal dengan detail spasial yang belum pernah terjadi sebelumnya dalam kondisi normal dan patologis. Hasil kami mengkonfirmasi keberadaan 3 jenis nefron, yang berbeda dalam lokasi, bentuk, dan ukurannya, konsisten dengan spesifikasi fungsionalnya. Selain itu, kami menunjukkan bahwa nefron cenderung terletak di bidang dan beradaptasi dengan organisasi spasial kapal. Menariknya, ketika kami menerapkan teknik ini pada modelpenyakit ginjal kistik, kami mengamati bahwa kista berkembang di semua

nefron, tetapi hanya pada segmen tertentu. Menariknya, kami menunjukkan bahwa bentuk kista bervariasi menurut segmen nefron, dan bahwa di sepanjang nefron yang sama, kista berinterkalasi dengan tubulus normal yang tidak berdilatasi. Secara keseluruhan, hasil ini memberikan karakterisasi 3D pertama dari pengaturan spasial nefron dan pembuluh darah dan yang terpenting memberikan dasar untuk memahami proses patologis, seperti cystogenesis.

Pembersihan optik ginjal merupakan tantangan karena tingkat autofluoresensi dan kepadatan sel yang tinggi. Dengan membandingkan protokol pembersihan yang berbeda, kami mengidentifikasi di BABB teknik yang kuat untuk menerapkan visualisasi dan rekonstruksi struktur yang terletak di bagian terdalam dariginjal, yaitu medula. Selain itu, BABB cepat dan terukur dan, setelah dibersihkan, sampel dapat disimpan selama berbulan-bulan sebelum akuisisi gambar. Keuntungan utama lain dari teknik ini adalah biayanya yang rendah. Agen kliring dapat menyebabkan penyusutan atau pembesaran struktur.9-17 Namun, karena modifikasi ukuran ginjal ini isotropik, pengukuran relatif diperkirakan tidak akan terpengaruh atau membiaskan interpretasinya. Salah satu batasan terpenting adalah anotasi struktur yang sangat memakan waktu. Namun demikian, ada semakin banyak teknik berdasarkan pembelajaran mendalam yang harus dengan cepat mengatasi keterbatasan ini.

Konsisten dengan hasil yang diperoleh dengan teknik klasik, penelitian kami menunjukkan bahwa nefron berbeda dalam bentuk dan panjangnya sesuai dengan posisinya. Secara khusus, kami mengamati bahwa JN memiliki PT berbelit-belit yang lebih berkembang dan glomeruli yang lebih besar dan 2 kali lebih panjang dari SN. Pertambahan panjang adalah hasil dari proses yang harmonis karena pemanjangan mempengaruhi secara proporsional semua segmen nefron. Kami juga mengamati bahwa JN memiliki HL yang lebih besar. Secara keseluruhan, data ini dengan jelas menunjukkan bahwa mikroanatomi SN dan JN secara signifikan berbeda dan bahwa MN menampilkan fitur perantara. Menariknya, studi fisiologis telah menunjukkan bahwa nefron juga berbeda secara fungsional.2 Peristiwa morfogenetik yang mendasari perbedaan ini belum diketahui. Dengan demikian tergoda untuk berspekulasi bahwa struktur tertentu dari JN dapat menjelaskan kekhususan fungsinya.

Menariknya, dengan menyediakan untuk pertama kalinya rekonstruksi 3D nefron dan pembuluh sekitarnya, kami menemukan batasan spasial antara pembuluh arkuata dan subkelompok nefron. Dengan demikian, dapat dibayangkan untuk berpikir bahwa kapal dapat menentukan jalannyanefronmemanjang selama pengembangan.34,35 Pemeriksaan bentuk 3D nefron yang dikombinasikan dengan simulasi komputasi juga mengungkapkan bahwa nefron tidak pernah bercampur dan bahwa setiap nefron cenderung terletak pada bidang. Signifikansi fungsional dari pengamatan ini masih harus dijelaskan.

Perkembangan kista selamapenyakit ginjal polikistikmasih merupakan proses yang menarik. NPHP, suatu kondisi patologis yang ditandai dengan perkembangan kista, adalah penyakit genetik paling umum yang menyebabkan penyakit ginjal stadium akhir pada anak-anak dan remaja. Dua puluh gen NPHP telah diidentifikasi sejauh ini.36 Di antara mereka, NEK8 mengkodekan anggota keluarga kinase terkait mitosis A yang tidak pernah ada, yang berperan dalam fungsi silia dan perkembangan siklus sel.37 Nek8 awalnya dicirikan sebagai gen yang bermutasi pada jck mice.32 Khususnya, mutasi pada domain protein yang sama telah terbukti menyebabkan NPHP9 pada manusia.38 2Studi D menunjukkan bahwa perkembangan kista berbeda secara dramatis di antara berbagai bentuk penyakit ginjal polikistik.27,29 Khususnya , di NPHP, kista tampaknya diturunkan secara eksklusif dari CD dan DCT.31 Meskipun informatif, studi imunohistokimia ini tidak dapat membantah kemungkinan bahwa hilangnya penanda tubular tertentu39 secara artifisial menjelaskan pengamatan ini. Dengan demikian, penelitian 3D kami memberikan bukti pertama yang jelas bahwa perkembangan kista adalah proses yang mungkin hanya melibatkan segmen nefron tertentu. Menariknya, meskipun NIMA (Never In mitosis gen A)-Related Kinase 8 (NEK8) diekspresikan dalam sitoplasma semua segmen nefron, ekspresinya dalam silia terbatas pada DCT dan CD. Karena hanya segmen ini yang rentan untuk mengembangkan kista,31 kita dapat mendalilkan bahwa gangguan fungsi silia NEK8 adalah peristiwa penting untuk pembentukan kista. Menariknya, kami juga mengamati bahwa kista fusiform bersambung dengan tubulus normal yang tidak berdilatasi. Fakta bahwa mutasi germline resesif mengarah ke fenotipe patologis hanya dalam subset sel menunjukkan bahwa peristiwa kedua dapat memicu perkembangan kista di sel-sel ini, seperti yang disarankan untuk polikistik autosomal dominan.penyakit ginjal.40,41

Kami juga mengamati bahwa pembesaran kista lebih dominan di JNs daripada di SNs, setidaknya mengingat kista yang terletak antara PT dan CNT. Secara konsisten, telah dilaporkan bahwa dalam konteks glomerulosklerosis, lesi glomerulus ditemukan lebih sering di JNs daripada di SNs.1,21,42 Apakah terlalu banyak bekerja karena peningkatan singlenefronLaju fifiltrasi glomerulus dan aktivitas transpor/enzim menyebabkan peningkatan kerentanan JNs untuk memburuk adalah hipotesis menarik yang perlu diselidiki lebih lanjut.

Singkatnya, kami menjelaskan teknik baru untuk mencitrakan ginjal dalam 3D dengan spesifisitas dan resolusi molekul yang memadai untuk secara langsung merekam distribusi spasial dan kuantitatif dari struktur internal yang diberi label khusus (nefron, pembuluh darah, dan kista). Mengingat kemudahan, kecepatan, dan kemampuan untuk kuantifikasi langsung, kami mengantisipasi bahwa teknik ini akan menjadi alat yang ampuh untuk memahami patofisiologi ginjal.

Gambar 6|Rekonstruksi nefron tiga dimensi (3D) mengungkapkan bahwa kista hanya berkembang di segmen nefron tertentu. ( a ) Gambar 3D representatif dengan rendering volume kista dari seluruh nefron (panel kiri) dari glomeruli ke saluran pengumpul di korteks superfisial (biru), korteks tengah (hijau), dan wilayah juxtamedullary (merah) pada tikus jck. Segmentasi nefron (panel kanan) untuk 3 jenis nefron yang berbeda. Batang 150 mm. ( b ) Probabilitas untuk mengembangkan kista di segmen nefron yang berbeda pada tikus jck. (Lanjutan)

Gambar 6|(Lanjutan) Sumbu horizontal adalah panjang nefron yang dinormalisasi sesuai dengan 50 bin (tubulus proksimal [PT], pirus; Henle loop [HL], putih; tubulus berbelit-belit distal [DCT], merah muda; tubulus penghubung [CNT], kuning) . ( c ) Gambar rekonstruksi kista 3D representatif dengan rendering volume kista dari HL (panel kiri), DCT (panel tengah), dan CNT dan saluran pengumpul kortikal (CCD) (panel kanan) di superfisial (panel atas), tengah (panel tengah), dan nefron juxtamedullary (panel bawah) pada tikus jck. Batang 50 mm.

METODE

Hewan

Semua prosedur hewan telah disetujui oleh "Layanan Vétérinaires de la Préfecture de Police de Paris" dan oleh komite etik Université Paris Descartes. Tikus FVB / N berusia dua bulan (n 20) digunakan untuk mengatur kondisi eksperimental untuk pembersihan ginjal. Penelitian kemudian dilakukan pada 2-tikus jantan jck berumur seminggu (n 4) dan kontrol littermates (n 3).

Persiapan jaringan ginjal

Sebelum dibunuh, tikus diberi perfusi, melalui kateterisasi intrakardiak, dengan 25 ml saline heparin (1000 IU/l) diikuti oleh 75 ml paraformaldehida 4 persen dalam saline buffer fosfat (PBS). Eksperimen dilakukan dengan anestesi xylazine (Rompun 2 persen , Bayer, Leverkusen, Jerman, 6 mg/g berat badan) dan ketamin (Clorketam 1000, Vetoquinol SA, Lure, Prancis, 120 mg/g berat badan).

Untuk studi pembersihan, ginjal difiksasi dalam 4 persen paraformaldehida selama 4 jam dan tertanam dalam agarosa 4 persen dan bagian setebal 1,5-mm yang mengelilingi hilus ginjal dipotong dan disimpan dalam PBS pada 4 C.Bagian ginjalpertama-tama diwarnai dan kemudian dibersihkan.

Untuk studi imunohistokimia pada sayatan tipis,ginjaldifiksasi dalam 4 persen paraformaldehyde semalaman dan bagian tertanam paraffifin dan 4-mm dipotong.

pewarnaan

Pewarnaan asam-Schiff periodik. Bagian ginjal 1,5-mm diinkubasi dalam asam periodik murni atau 1:100 PBS-diencerkan-Schiff selama 5 menit pada suhu kamar sebelum dibersihkan.

Imunohistokimia pada bagian tipis paraffifin-embedded. Bagian empat mikrometer dari ginjal yang tertanam paraffifin dipanaskan untuk pengambilan antigen dan diinkubasi semalaman pada suhu 4 C dengan lektin yang digabungkan dengan flfluorochrome untuk melacak tubulus (rhodamin agglutinin kacang tanah [RL-1072-5] dan rhodamine wheat germ aglutinin [RL{{ 6}}], Vector Laboratories, Burlingame, CA, diencerkan pada 1:200) dan antibodi primer spesifik segmen untuk menggambarkan segmen tubular yang berbeda (Lotus tetragonolobus lectin yang terbiotinilasi [B-1325], Vector Laboratories, diencerkan pada 1: 100; tikus anti-Calbindin D28K [D-4], Santa Cruz, Heidelberg, Jerman, diencerkan pada 1:200; kambing anti AQP2 [C-17], Santa Cruz, diencerkan pada 1:200) . Keesokan harinya, bagian-bagian tersebut diinkubasi dengan antibodi sekunder selama 1 jam pada suhu kamar (Alexa Fluor 488 conjugate [S32354], Invitrogen; antigoat Alexa Fluor 488 [A-11055], Invitrogen; anti-mouse Alexa Fluor 488 [A-21202], Invitrogen, Carlsbad, CA; semua diencerkan pada 1:500) sebelum diwarnai dengan 40,6-diamidino-2-fenilindole. Semua gambar diperoleh dengan mikroskop Nikon Eclipse E800 (Champigny sur Marne, Prancis) dan disiapkan menggunakan perangkat lunak FiJi (versi 1.50).

Pewarnaan lektin pada bagian yang tebal. Bagian ginjal setebal 1.5-mm diinkubasi pada suhu 4 C selama 1 bulan di Texas Red atau flfluorescein isothiocyanate ditambah lektin: aglutinin kacang tanah (RL-1072-5) dan aglutinin bibit gandum (RL{{6} }), diencerkan pada 1:100 dalam 0,1 persen PBS azida dan 0,1 persen Triton-X. Bagian kemudian dicuci setiap hari selama 2 minggu dengan PBS sebelum dibersihkan.

Pembersihan optik

Untuk pembersihan kerak, 1,5-mm bagian ginjal diinkubasi dalam ScaleA2 (4 M urea, 0.1 persen Triton X-100, 10 persen gliserol) atau ScaleB4 (8 M urea, 0,1 persen Triton X-100) selama 2 minggu, hingga 1 tahun, pada 4 C.

Untuk pembersihan BABB, 1.5-mm bagian ginjal didehidrasi dalam pembilasan etanol berurutan pada suhu kamar. Sampel kemudian diinkubasi dalam BABB (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO) dengan perbandingan 1:2 selama minimal 2 hari pada suhu 4 C.

Akuisisi gambar mikroskop dua foton

Jaringan dicitrakan dengan gel berair pada mikroskop multifoton terbalik (LaVision BioTec) yang dilengkapi dengan Laser Titanium-Sapphire Mai Tai HP (Spectra-Fisika, Santa Clara, CA) (Gambar Tambahan S1A). Panjang gelombang eksitasi adalah 815 nm pada daya 8 persen. Kami menggunakan objektif perendaman air 20 (XLUMPLFL20XW, Olympus [Tokyo, Jepang]; aperture numerik, 0,95; jarak kerja, 2,0 mm). Untuk akuisisi fluoresensi, kami menggunakan detektor non-descanned pada 80 persen dengan fifilter bandpass 593/40 nm.

Langkah pertama terdiri dari akuisisi gambar mosaik 2D di tumpukan z tengah dengan menggunakan parameter akuisisi suboptimal (400 mm 400 mm dan 1011 1011 piksel, dengan tumpang tindih 10 persen dan rata-rata garis pada 2) untuk memandu pemilihan medan pusat yang paling relevan (Gambar Tambahan S9A). Setelah kisi xy dan bidang z yang diinginkan ditentukan, parameter disesuaikan untuk memperoleh gambar berkualitas tinggi. Pendekatan seperti itu mengurangi wilayah yang diinginkan menjadi 5 12 bidang per z tumpukan. Kemudian, kami memperoleh 850 z tumpukan/irisan optik (ukuran langkah 1-mm) yang mengelilingi hilus ginjal di bagian tengahbagian ginjal.

Jahitan, pemrosesan, dan penelusuran gambar

Setiap tumpukan disusun menurut metode yang dikembangkan oleh Preibisch et al., 43 yang memungkinkan penyambungan banyak koleksi gambar dengan menggunakan plugin "Penjahitan Grid/Koleksi" dari perangkat lunak Fiji (http://fifiji.sc/Fiji) . Karena kami mengamati perubahan penting antara 2 gambar yang berdekatan setelah penyambungan, kami menulis program pencocokan khusus dengan Python. Program ini mengkompensasi pergeseran gambar, memungkinkan kita untuk menyelaraskan gambar dengan benar (Gambar Tambahan S9B). Gambar yang dikoreksi dengan jahitan dianalisis menggunakan Imaris versi 8.4.2 (Bitplane, Zurich, Swiss). Tubulus dan pembuluh dilacak menggunakan mode manual paket pelacak fifilamen dari Imaris dan digabungkan dengan Imaris Xtension yang kami kembangkan dengan MATLAB (https://www.dropbox.com/s/sm9u5em3orjrpmc/Standalone_Gabung{{12 }} Filament_Tool.zip?dl¼0) (Gambar Tambahan S9C). Glomeruli dan kista direkonstruksi 3D menggunakan mode manual dari paket permukaan Imaris. Organisasi spasial glomeruli 3D ditampilkan menggunakan mode manual dari paket bintik-bintik Imaris.

Morfometri

Panjang segmen tubular, panjang nefron, dan kelurusan ditentukan menggunakan paket pelacak fifilamen Imaris. Menurut perangkat lunak Imaris, kelurusan diukur sebagai rasio antara jarak antara 2 titik dan panjang jalur segmen nefron. Tiga puluh satu PTs dan 12 nefron utuh direkonstruksi dan diukur pada 3 tikus tipe liar, sedangkan 37 PTs dan 17 nefron utuh direkonstruksi dan diukur pada 4 tikus jck. Kista dan

volume glomerulus ditentukan dengan menggunakan "paket permukaan" dari Imaris. Tiga puluh satu dan 34 glomeruli diukur masing-masing pada tikus tipe liar dan tikus jck. Tujuh puluh empat kista diukur secara total.

Sudut "keluar bidang" dari belokan tabung (ditunjukkan sebagai "beta") diukur antara bidang (didefinisikan oleh 3 titik berurutan) dan arah dengan titik keempat berturut-turut berikutnya dalam ruang (Gambar 5b). Untuk mengevaluasi signifikansi statistik dari bias yang diamati, kami mensimulasikan distribusi sudut beta dengan rotasi acak sudut beta (simulasi Monte Carlo) dalam struktur yang disusun oleh segmen yang sama dengan set sudut alfa yang sama.

Untuk perhitungan probabilitas untuk mengembangkan lesi kistik di sepanjangnefronsegmen, kami mewakili setiap nefron dengan satu set titik dalam ruang. Setiap titik diberi penjelasan mengenai keberadaan kista versus struktur normal dan jenis segmen. Probabilitas pada setiap panjang standar (ditetapkan pada 50 nampan) dihitung sebagai rasio antara jumlah poin dengan anotasi kistik dan jumlah total poin di nampan.

Untuk perhitungan jarak rata-rata glomerulus, kami mempertimbangkan untuk setiap glomerulus jarak rata-rata glomerulus yang dihitung pada 5 glomerulus terdekat.

Analisis data dan statistik

Data dinyatakan sebagai SEM rata-rata. Perbedaan antara kelompok eksperimen dievaluasi dengan menggunakan analisis varians diikuti, ketika signifikan (P < {{0}}.05),="" dengan="" uji="" tukey-kramer.="" ketika="" hanya="" 2="" kelompok="" yang="" dibandingkan,="" uji="" mann-whitney="" digunakan.="" analisis="" statistik="" dilakukan="" dengan="" menggunakan="" perangkat="" lunak="" graph="" prism="" (san="" diego,="" ca,="" versi="">

PENYINGKAPAN

Semua penulis menyatakan tidak ada kepentingan bersaing.

UCAPAN TERIMA KASIH

Kami berterima kasih kepada Laboratoire Experimentation Animale et Transgenese (LEAT), Platform Histologi dan Pencitraan Struktur Federative de Recherche Necker atas bantuan teknisnya. Kami berterima kasih kepada Pierre Isnard, Marie-Claire Gubler, dan Nicolas Kuperwasser untuk membaca kritis naskah. Karya ini didukung oleh Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Université Paris Descartes, Assistance Publique – Hôpitaux de Paris, Agence Nationale de la Recherche, Whoami Laboratoire d'Excellence Who am I, Roche Pharma Research and Early Development (Basel , Swiss), dan Institut Roche de Recherche et de Médecine Translationnelle (Paris, Prancis).

KONTRIBUSI PENULIS

TB, NG, dan MZ merancang dan melakukan eksperimen dan menganalisis data. FB, LT, MGT, dan SG juga melakukan beberapa eksperimen dan menganalisis data. MB dan CN melakukan percobaan tikus. TB dan MZ juga berkontribusi dalam penulisan naskah. GF merevisi naskah. FT dan MP menyediakan kerangka konseptual dan merancang studi, mengawasi proyek, dan menulis makalah.

cistanche dapat menguatkan ginjal

MATERI TAMBAHAN

File Tambahan (PDF)

Gambar S1. Setup eksperimental, prosedur akuisisi, dan pemrosesan gambar.

Gambar S2. Batas sinyal autofluoresensi dalam resolusi xy dan z.

Gambar S3. Gambar dua dimensi transisi antara PT dan TL pada bagian ginjal tertanam paraffifin 4-mm.

Gambar S4. Gambar dua dimensi transisi antara TAL dan DCT pada bagian ginjal tertanam paraffifin 4-mm.

Gambar S5. Gambar dua dimensi dari transisi antara DCT dan CNT pada bagian ginjal tertanam paraffifin 4-mm.

Gambar S6. Rekonstruksi tiga dimensi mengungkapkan 3 bentuk tubulus proksimal yang berbeda.

Gambar S7. Rekonstruksi tiga dimensi mengungkapkan bahwa panjang dan segmentasi nefron tidak dipengaruhi oleh kista.

Gambar S8. Kepadatan glomeruli terkendali dan ginjal kistik.

Gambar S9. Prosedur akuisisi dan pengolahan citra pasca perawatan.

Tabel S1. Perbandingan metode kliring. File Tambahan (Film)

Film S1. Pewarnaan lektin secara nyata meningkatkan resolusi dan rasio signal-to-background.

Film S2. Menelusuri jalur tubulus.

Film S3. Rekonstruksi tiga dimensi dari ginjal yang dibersihkan menunjukkan persimpangan antara tubulus proksimal dan ekstremitas tipis dari loop Henle.

Film S4. Rekonstruksi tiga dimensi dari ginjal yang dibersihkan menunjukkan persimpangan antara cabang tebal menaik dari loop Henle dan tubulus berbelit-belit distal.

Film S5. Rekonstruksi tiga dimensi dari ginjal yang dibersihkan menunjukkan persimpangan antara tubulus berbelit-belit distal dan tubulus penghubung.

Film S6. Bentuk dan ukuran tubulus proksimal berbeda menurut kedalamannya.

Film S7. Rekonstruksi nefron tiga dimensi pada tikus kontrol.

Film S8. Menelusuri jalur kapal dari kapal arkuata ke kapal radiata kortikal.

Film S9. Pembuluh arkuata memodelkan bentuk tubulus proksimal juxtamedullary.

Film S10. Nefron cenderung terletak di pesawat.

Film S11. Rekonstruksi nefron tiga dimensi menunjukkan pola spesifik untuk perkembangan kista.

Film S12. Segmentasi nefron tiga dimensi mengungkapkan bahwa kista berkembang di segmen nefron tertentu.

Film S13. Pengaturan spasial dan keterkaitan nefron dan pembuluh darah di ginjal polikistik

REFERENSI

1. Kaya AR. Kerentanan glomeruli juxtamedullary yang sampai sekarang belum terdeskripsikan pada nefrosis lipoid. Rumah Sakit Bull Johns Hopkins. 1957;100:173–186.

2. Bankir L, Bouby N, Trinh-Trang-Tan MM. Heterogenitas anatomi nefron. Ginjal Int Suppl. 1987;20:S25–S39.

3. Christensen EI, Grann B, Kristoffersen IB, dkk. Rekonstruksi tiga dimensi nefron tikus. Am J Fisiol Fisiol. 2014;306:F664–F671.

4. Zhai XY, Birn H, Jensen KB, dkk. Rekonstruksi tiga dimensi digital dan ultrastruktur tubulus proksimal tikus. J Am Soc Nephrol. 2003;14:611–619.

5. Zhai XY, Thomsen JS, Birn H, dkk. Rekonstruksi tiga dimensi nefron tikus. J Am Soc Nephrol. 2006;17:77–88.

6. Puelles VG, Moeller MJ, Bertram JF. Kita bisa melihat dengan jelas sekarang: pembersihan optik dan morfometrik ginjal. Curr Opin Nefrol Hipertensi. 2017;26:179–186.

7. Seo J, Choe M, Kim SY. Teknik pembersihan dan pelabelan untuk jaringan biologis skala besar. Sel Mol. 2016;39:439–446.

8. Spalteholz W. ber das Durchsichtigmachen von menschlichen und tierischen Präparaten und seine theoretischen Bedingungen, selanjutnya Anhang: ber Knochenfärbung. Leipzig, Jerman: S. Hierzel; 1914.

9. Hama H, Kurokawa H, Kawano H, dkk. Skala: pendekatan kimia untuk pencitraan fluoresensi FL dan rekonstruksi otak tikus transparan. Nat Neurosci. 2011;14:1481–1488.

10. Ertürk A, Becker K, Jährling N, dkk. Pencitraan tiga dimensi organ yang dibersihkan dengan pelarut menggunakan 3DISCO. Protokol Nat. 2012;7:1983–1995.

11. Kuwajima T, Sitko AA, Bhansali P, dkk. ClearT: metode pembersihan bebas deterjen dan pelarut untuk jaringan saraf dan non-saraf. Perkembangan. 2013;140:1364–1368.

12. Ke MT, Imai T. Kliring optik sampel otak tetap menggunakan SeeDB. Curr Protoc Neurosci. 2014;66:2.22.1–2.22.19.

13. Chung K, Deisseroth K. CLARITY untuk pemetaan sistem saraf. Metode Nat. 2013;10:508–513.

14. Tomer R, Ye L, Hsueh B, Deisseroth K. CLARITY tingkat lanjut untuk pencitraan jaringan utuh yang cepat dan beresolusi tinggi. Protokol Nat. 2014;9:1682–1697.

15. Yang B, Treweek JB, Kulkarni RP, dkk. Fenotip sel tunggal dalam jaringan utuh transparan melalui pembersihan seluruh tubuh. Sel. 2014;158: 945–958.

16. Susaki EA, Tainaka K, Perrin D, dkk. Pencitraan seluruh otak dengan resolusi sel tunggal menggunakan koktail kimia dan analisis komputasi. Sel. 2014;157:726–739.

17. Alanentalo T, Asayesh A, Morrison H, dkk. Pencitraan molekuler tomografi dan kuantifikasi 3D dalam organ tikus dewasa. Metode Nat. 2007;4:31–33.

18. Parra SG, Chia TH, Zinter JP, dkk. Mikroskop multifoton dari organ tikus yang dibersihkan. J Biomed Opt. 2010;15:036017.

19. Renier N, Wu Z, Simon DJ, dkk. iDISCO: metode sederhana dan cepat untuk imunolabel sampel jaringan besar untuk pencitraan volume. Sel. 2014;159: 896–910.

20. Lee H, Park JH, Seo I, dkk. Peningkatan penerapan teknologi pembersihan jaringan elektroforesis, CLARITY, ke organ padat yang utuh termasuk otak, pankreas, hati, ginjal, paru-paru, dan usus. BMC Dev Biol. 2014;14:1–7.

21. Iversen BM, Amann K, Kvam FI, dkk. Peningkatan tekanan dan ukuran kapiler glomerulus memediasi glomerulosklerosis di korteks juxtamedullary SHR. Am J Fisiol Fisiol. 1998;274:F365–F373.

22. Angelotti ML, Antonelli G, Conte C, Romagnani P. Pencitraan ginjal: dari mikroskop cahaya hingga resolusi super. Transplantasi Nephrol Dial. 2021;36:19–28.

23. Puelles VG, van der Wolde JW, Schulze KE, dkk. Validasi metode tiga dimensi untuk menghitung dan mengukur podosit di seluruh glomeruli. J Am Soc Nephrol. 2016;27:3093–3104.

24. Pannabecker TL, Dantzler WH, Layton HE, Layton AT. Peran arsitektur tiga dimensi dalam mekanisme pemekatan urin dari medula bagian dalam ginjal tikus. Am J Fisiol Fisiol. 2008;295:F1271–F1285.

25. Saritas T, Puelles VG, Su XT, dkk. Pembersihan optik di ginjal mengungkapkan remodeling tubulus yang dimediasi kalium. Perwakilan Sel 2018;25:2668–2675.e3.

26. Schuh CD, Polesel M, Platonova E, dkk. Pencitraan struktural dan fungsional gabungan ginjal mengungkapkan perbedaan aksial utama dalam endositosis tubulus proksimal. J Am Soc Nephrol. 2018;29:2696–2712.

27. Braun DA, Hildebrandt F. Ciliopathies. Perspektif Cold Spring Harb Biol. 2017;9:a028191.

28. Bergmann C, Guay-Woodford LM, Harris PC, dkk. Penyakit ginjal polikistik. Nat Rev Dis Prim. 2018;4:50.

29. Wilson PD. Penyakit ginjal polikistik. N Engl J Med. 2004;350:151–164.

30. Laitinen L, Virtanen I, Saxén L. Perubahan pola glikosilasi selama perkembangan embrio ginjal tikus seperti yang diungkapkan dengan konjugat lektin. J Histokimia Sitokimia. 1987;35:55–65.

31. Smith LA, Bukanov NO, Husson H, dkk. Perkembangan penyakit ginjal polikistik pada tikus ginjal kistik remaja: wawasan tentang patogenesis, kelainan silia, dan fitur umum dengan penyakit manusia. J Am Soc Nephrol. 2006;17:2821–2831.

32. Liu S, Lu W, Obara T, dkk. Cacat pada kinase keluarga Nek baru menyebabkan penyakit ginjal kistik pada tikus dan ikan zebra. Perkembangan. 2002;129:5839–5846.

33. Franke M, Baeßler B, Vechtel J, dkk. Pemetaan resonansi magnetik T2 dan pencitraan berbobot difusi untuk deteksi dini cystogenesis dan respons terhadap terapi pada model tikus penyakit ginjal polikistik. Ginjal Int. 2017;92:1544–1554. 34. Barry DM, McMillan EA, Kunar B, dkk. Penentu molekuler spesialisasi vaskular nefron di ginjal. Komunitas Nat. 2019;10: 5705.

35. Perretta-Tejedor N, Jafree DJ, Long DA. Komunikasi endotel-epitel pada penyakit ginjal polikistik: peran pensinyalan faktor pertumbuhan endotel vaskular. Sinyal Sel. 2020;72:109624.

36. Srivastava S, Molinari E, Raman S, Sayer JA. Banyak gen-satu penyakit? Genetika nephronophthisis (NPHP) dan gangguan terkait NPHP. Pediatri depan. 2017;5:287.

37. Fry AM, O'Regan L, Sabir SR, Bayliss R. Regulasi siklus sel oleh keluarga protein kinase NEK. Ilmu Sel J. 2012;125:4423–4433.

38. Otto EA, Trapp ML, Schultheiss UT, dkk. Mutasi NEK8 mempengaruhi lokalisasi silia dan sentrosom dan dapat menyebabkan nephronophthisis. J Am Soc Nephrol. 2008;19:587–592.

39. Wilson PD. Polaritas apiko-basal pada epitel penyakit ginjal polikistik. Biochim Biophys Acta. 2011;1812:1239–1248.

40. Happé H, Leonhard WN, van der Wal A, dkk. Cedera tubular toksik pada ginjal dari tikus penghapusan Pkd1-mempercepat cystogenesis disertai dengan polaritas sel planar yang tidak teratur dan jalur pensinyalan Wnt kanonik. Hum Mol Gen. 2009;18: 2532–2542.

41. Piontek K, Menezes LF, Garcia-Gonzalez MA, dkk. Sebuah saklar perkembangan kritis mendefinisikan kinetika pembentukan kista ginjal setelah kehilangan Pkd1. Nat Med. 2007;13:1490–1495.

42. Ikoma M, Yoshioka T, Ichikawa I, Fogo A. Mekanisme kerentanan unik glomeruli kortikal dalam ginjal matang untuk sklerosis glomerulus fokal yang parah. Pediatr Res. 1990;28:270–276.

43. Preibisch S, Saalfeld S, Tomancak P. Jahitan yang optimal secara global dari akuisisi gambar mikroskopis 3D. Bioinformatika. 2009;25: 1463–1465.