penelitian telah menunjukkan bahwa autophagy memainkan peran penting dalam regulasi deposisi LD seluler

Mohon hubungi{0}}untuk informasi lebih lanjut

2.14. Uji laktat dehidrogenase (LDH)

Menurut instruksi pabriknya, sel-sel disepuh dalam 96-pelat sumur pada 5000 sel/sumur, dan media kultur dikumpulkan untuk mengukur kadar LDH dengan kit uji (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute). Kemudian absorbansi sampel dideteksi dengan Multiskan Spectrum (Thermo Fisher Scientific) pada 450 nm.

2.15. BODIPY493/503, BODIPY 581/591 C11, dan pewarnaan merah tua MitoTracker

Sel hidup dicuci dengan PBS dan diinkubasi dengan 2 ug/ml BOD-IPY 493/503 (InvitrogenTM, Cat D3922) atau BODIPY 581/591 C11 (BD-C11）（2.0 M, InvitrogenTM, Cat D3861）dalam PBS selama 15 menit pada 37 derajat. Untuk pewarnaan MitoTracker Deep Red, sel hidup diinkubasi dengan 0,5 ug/ml MitoTracker Deep Red (InvitrogenTM, Cat M22426) dalam PBS selama 30 menit pada 37 derajat . Kemudian sel dicuci dua kali dalam PBS dan difiksasi dalam 3,5 persen PFA selama 10 menit diikuti dengan pencucian dan pewarnaan balik dengan Hoechst 3342 (Sigma, Cat B2261) selama 10 menit sebelum ditutup pada slide kaca untuk pencitraan.berapa banyak cistanche yang harus diambil?Gambar diamati dan foto diambil dengan mikroskop fluoresensi (Olympus, Tokyo, Jepang).

Silakan klik di sini untuk tahu lebih banyak

2.16.Pewarnaan Hoechst dan PI

Sel diwarnai dengan Hoechst 33.342（1 ul yang diencerkan dalam 500ul PBS, Sigma, Cat B2261）dan or）PI 0,1 ul yang diencerkan dalam 500ul PBS, Solarbio,(cistanche sleep) CA1020) selama 10 menit dan kemudian difiksasi dan diamati dengan mikroskop fluoresensi (Olympus, Tokyo, Jepang).

2.17.Alur sitometri

Sel dicerna dan dibilas dengan D-hank kemudian diwarnai dengan Annexin V-FITC（5 ul yang diencerkan dalam 500ul PBS）/PI 0,1 ul yang diencerkan dalam 500ul PBS) kit apoptosis (CA1020, Solarbio, Beijing, Chian ) sesuai dengan protokol pabrikan. Setelah itu, sel-sel apoptosis dianalisis menggunakan flow cytometry (jambu easyCyterM 8, Millipore, USA). ROS mitokondria dan pengukuran potensial membran mitokondria dilakukan seperti yang dipublikasikan 12】. Sel SH-SY5Y diwarnai dengan MitoSOX 2,5 M, Invitrogen, USA） atau dengan JC1 10 ug/ml, T-3168, Invitrogen, USA） pada 37 derajat selama 30 menit. Setelah dicuci dengan PBS dua kali, sel-sel tersebut kemudian disuspensikan kembali dalam PBS dingin yang mengandung 1 persen FBS untuk analisis aliran sitometrik. Data dianalisis dengan perangkat lunak FCS Express (Guava Easy CyterM8, Millipore, Hayward, CA, USA).

2.18. Tes pernapasan kuda laut

Fungsi pernapasan mitokondria dalam sel SH-SY5Y hidup diukur menggunakan penganalisis fluks ekstraseluler kuda laut (XFe96) (Agi-lent, Santa Clara, USA) melalui perubahan tingkat konsumsi oksigen OCR）. Sel-sel SH-SY5Y yang diunggulkan pada 3 × 10³ sel/sumur dibiarkan menempel pada pelat kultur sel Kuda Laut dan mencapai sekitar 80 persen pertemuan pada saat percobaan. (teh cistanche) Hari berikutnya, sel-sel diberi perlakuan awal dengan Ka dan kemudian terkena MPP* selama 24 jam. OCR terdeteksi dalam kondisi basal diikuti dengan penambahan berurutan 1 M oligomisin, 1 M FCCP, serta 1 M rotenon & antimisin A.

Cistanche dapat meningkatkan kekebalan

2.19. Analisis statistik

Data disajikan sebagai mean ± SEM. Signifikansi perbedaan ditentukan dengan uji-t Student, Analisis varians dua arah, atau analisis varians satu arah (ANOVA) diikuti dengan uji post hoc Tukey. Perbedaan tersebut dianggap signifikan pada P<>

3. Hasil

Hasil1. Ka mengembalikan disfungsi motorik dan meningkatkan kadar dopamin di striatum tikus model MPTP/p PD

Untuk menyelidiki efek neuroprotektif dari patogenesis Kaon PD, tikus jantan C57BL/6 4-bulan disuntik dengan neurotoksin MPTP untuk membentuk model MPTP/p PD dan diobati dengan Ka (Gbr. la). Setelah induksi model, uji rotarod dan uji tiang digunakan untuk mengevaluasi kinerja motorik dan perilaku tikus pada kelompok yang berbeda. Seperti yang ditunjukkan, waktu kinerja rotarod berkurang secara nyata pada tikus yang diobati dengan MPTP, dan efek ini dicegah oleh Ka (Gbr.1b). (manfaat cistanche tubulosa) Ka juga memulihkan defisit perilaku yang disebabkan oleh MPTP, seperti yang ditunjukkan oleh pengurangan waktu putar dan waktu total dalam uji tiang (Gbr. 1c dan d), tanpa mempengaruhi bobot tubuh tikus (Gbr. saya). Selanjutnya, analisis HPLC menunjukkan bahwa tingkat dopamin di striatum menurun secara signifikan pada tikus yang ditantang MPTP/p, dan tingkat ini dipulihkan dengan perlakuan Ka (Gbr. 1f). (ekstrak cistanche tubulosa) Perlakuan Ka juga mengurangi MPTP/ pengurangan p-diinduksi dalam asam dihidroksi-fenil asetat (DOPAC, metabolit dopamin) tingkat di striatum (Gbr.1g).cistanche herbal supermanHasil ini menunjukkan bahwa Ka mengembalikan disfungsi motorik dan meningkatkan kadar dopamin di striatum pada tikus PD yang diinduksi MPTP.

Hasil 2. Ka mengurangi hilangnya neuron DA pada SNpc tikus model MPTP/p PD

Selanjutnya, untuk mengevaluasi lebih lanjut efek neuroprotektif dari gangguan saraf DA yang diinduksi Kaon MPTP / p, kami memeriksa neuron tirosin hidroksilase (TH) di SNpc murine dengan imunostaining. Seperti ditunjukkan pada Gbr.2a dan b, MPTP/p menginduksi penurunan yang signifikan dalam jumlah neuron TH, yang dikurangi dengan pengobatan Ka. Selanjutnya, jumlah stereologis dari total neuron di SNpc, seperti yang didefinisikan oleh Nissl

Gambar.1. Pengobatan Ka meredakan disfungsi motorik dan meningkatkan kadar dopamin di striatum tikus model MPTP/p PD.

(a) Diagram skematis dari rancangan percobaan. (cistanche tubulosa reddit) (b) Waktu pada batang diukur untuk uji rotarod selama tiga hari berturut-turut. (cd) Waktu yang dibutuhkan untuk berbalik (waktu berbelok) dan menuruni tiang (waktu memanjat) dicatat untuk tes tiang. (e) Berat badan tikus diukur pada akhir penelitian. (fg)Dopamin (DA) dan asam dihidroksi-fenil asetat (DOPAC) di striatum dianalisis dengan kromatografi cair kinerja tinggi. Data dinyatakan sebagai mean±SEM.n=9-10 untuk setiap grup di (b,c,d);n=6-8 untuk setiap grup di (f,g).ns, tidak signifikan,* P<><><0.001, by="" one-way="" anova="" followed="" by="" tukey's="" post="" hoc="" test.="" mptp,1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine;="" ka,kaempferol.="" staining,="" verified="" that="" the="" loss="" of="" th+="" cells="" reflected="" cellular="" death="" but="" not="" the="" downregulation="" of="" th="" expression="" and="" showed="" that="" ka="" treatment="" restored="" the="" decrease="" in="" the="" number="" of="" nissl-positive="" neurons="" in="" the="" snpc="" of="" mptp-treated="" mice="" from="" 43.3%="" to="" 25.4%="" (fig.="" 2c="" and="" d).in="" addition,="">manfaat bioflavonoidKa secara signifikan memperbaiki pengurangan ekspresi protein TH dan DAT yang diinduksi MPTP, yang diukur dengan Western blotting (Gbr.2e-g). Bukti ini menegaskan efek neuroprotektif Kaon dalam model tikus PD.

Hasil 3. Ka mengurangi akumulasi vakuola LD dan stres oksidatif pada SNpc mencit yang diberi MPTP/p

Semakin banyak bukti telah menunjukkan keterlibatan LD dalam NDD [10], secara konsisten, penelitian kami sebelumnya mengidentifikasi peningkatan LD dalam SNpc tikus PD yang diinduksi MPTP [12]. LD dapat dengan mudah diidentifikasi dan menunjukkan struktur bulat, kepadatan rendah dengan homogen isi amorf [28]. Biasanya, LD dapat didegradasi melalui autophagy untuk menghindari akumulasi [29].beli cistancheUntuk menyelidiki apakah Ka dapat mengatur LDs di PD, akumulasi LDs dianalisis dengan mikroskop elektron transmisi (TEM) di SNpc kontrol, MPTP/p, dan MPTP/p tikus Ka. Seperti yang ditunjukkan dalam pekerjaan kami sebelumnya [12], jumlah dan ukuran LD adalah

meningkat pada tikus MPTP/p dibandingkan dengan kontrol yang diberi garam (Gbr. 3a dan b) dan berkurang secara signifikan pada tikus yang diberi Ka (Gbr. 3c-e). Selain itu, pada tikus yang diobati dengan Ka, LD juga lebih sering diamati di dekatnya, tertutup, atau terdegradasi oleh autolisosom, yang didefinisikan sebagai butiran lipofuscin padat elektron. Pewarnaan histologis lebih lanjut dari neuron TH dengan BODIPY, pewarna yang secara khusus memberi label lipid netral dan biasanya digunakan untuk mendeteksi LD [30], menunjukkan bahwa jumlah dan ukuran BODIPY plus LD di SNpc lebih tinggi pada tikus PD daripada kontrol, dan secara signifikan menurun dengan perlakuan Ka (Gbr.3f-h).

Jika LD tidak dapat didegradasi secara tepat waktu, LD yang terakumulasi dapat mengalami peroksidasi dan berkontribusi pada stres yang dimediasi ROS mitokondria [4],jarakyang memperkuat neurotoksisitas dan perkembangan penyakit. Oleh karena itu, kami memeriksa lebih lanjut profil ekspresi gen yang terkait dengan perlindungan terhadap toksisitas FA bebas (Gpx8), menetralkan spesies oksidatif, radikal superoksida (Sod3) dan hidrogen peroksida (Cat), dan metabolisme FA (Acsbg1 dan Dbi) seperti yang dilaporkan [31] , yang semuanya sangat menurun pada SNpc tikus yang diobati dengan MPTP dibandingkan dengan kontrol, dan efek ini diperbaiki pada tikus PD yang diobati dengan Ka (Gbr. 3i). Demikian pula, MPTP/p juga meningkatkan level ekspresi mRNA

Gbr.2. Ka memperbaiki hilangnya neuron DA pada SNpc tikus model MPTP/p PD.

(ab) Foto mikro neuron positif tirosin hidroksilase(TH) (a) dan jumlah stereologis neuron positif-TH di substansia nigra pars compacta (SNpc) (b). Bilah skala seperti yang ditunjukkan. (cd) Foto mikro sel positif-ungu cresyl (c) dan penghitungan stereologis sel-sel positif-ungu cresyl di SNpc (d). Bilah skala, 120 um. (misalnya) analisis Western blot ekspresi protein TH dan DAT dalam SNpc (e) dan analisis kuantitatif (f,g). Data terukur dinormalisasi ke kelompok kontrol salin. Data dinyatakan sebagai mean ± SEM.*P<><0.01, by="" one-way="" anova="" followed="" by="" tukey's="" post="" hoc="" test.n="4-5" for="" each="" group.="" ve,="" vehicle,="" ka,="" kaempferol;="" mptp,1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydroloyridine..="" (for="" interpretation="" of="" the="" references="" to="" color="" in="" this="" figure="" legend,="" the="" reader="" is="" referred="" to="" the="" web="" version="" of="" this="" article.="" of="" nadph="" oxidase="" subunits="" such="" as="" nox1,="" nox2,="" and="" nox4="" in="" the="" snpc="" of="" mptp/p="" mice,="" which="" were="" further="" blunted="" by="" ka="" treatment="" (fig.="" 3j).="" taken="" together,="" these="" data="" suggest="" that="" ka="" alleviates="" mptp/p-induced="" ld="" accumulation,="" peroxidation,="" and="" ros-mediated="">

Hasil 4. Ka melindungi sel SH-SY5Y terhadap MPP plus-induced apoptosis

MPP, metabolit aktif MPTP, menghambat enzim kompleks mitokondria dan menyebabkan kematian sel yang berhubungan langsung dengan PD [32]. Kami selanjutnya menyelidiki apakah Ka dapat mencegah apoptosis neuron yang diinduksi MPPt secara in vitro. Seperti ditunjukkan pada Gambar 4a dan b, MPPt(40 uM, 24h) menginduksi pelepasan LDH dari sel SH-SY5Y, dan Ka (30 dan 60 uM) secara signifikan melemahkan pelepasan LDH tanpa mempengaruhi kelangsungan hidup sel (Gbr. 4a). Karena Ka menginduksi efek perlindungan yang substansial pada konsentrasi 30 M Gbr. 4b）, kami menggunakan konsentrasi ini dalam percobaan selanjutnya. Hasil pewarnaan Hoechst/PI juga menunjukkan bahwa Ka secara signifikan mengurangi persentase sel dengan kondensasi kromatin yang diinduksi MPPt (Gbr. 4c dan d) dan apoptosis seluler, sebagaimana dibuktikan oleh peningkatan intensitas fluoresensi Hoechst (Gbr. 4c) dan persentase Sel diwarnai Hoechst/PI (Hoechst plus /PI')(Gbr. 4e). Juga, seperti yang dideteksi oleh flow cytometry, MPP plus menginduksi apoptosis sel, dibuktikan dengan peningkatan persentase sel yang diwarnai Annexin V (AV /PI dan AV plus /PI plus ) dilindungi oleh Ka (Gbr. 4f dan g). Selain itu, Ka secara khusus membalikkan perubahan yang diinduksi MPP dalam ekspresi protein terkait apoptosis, sebagaimana dibuktikan oleh peningkatan regulasi Bcl-2, penurunan regulasi Bax (Gbr. 4hi-j), dan pengurangan pembelahan caspase-3 (Gbr. 4h, k). Data ini menunjukkan bahwa Ka dapat menghilangkan efek merugikan dari MPPt pada kelangsungan hidup sel.

Hasil 5. Ka menekan akumulasi LD yang diinduksi MPPt dan peroksidasi lipid, yang memediasi kerusakan mitokondria dalam sel SH-SY5Y

Studi terbaru menunjukkan bahwa akumulasi LD yang tidak terduga dapat mengakibatkan peningkatan stres yang dimediasi peroksidasi lipid dan mempercepat disfungsi mitokondria, yang mendorong degenerasi saraf [10]. Pekerjaan kami sebelumnya juga menunjukkan bahwa peningkatan LD di SNpc dikaitkan dengan patologi PD pada tikus [12]. Untuk menyelidiki apakah efek perlindungan Ka terkait dengan akumulasi LD in vitro, pertama-tama kami melakukan pewarnaan spesifik LD dalam sel SH-SY5Y menggunakan BODIPY 493/503 dan mengamati peningkatan deposisi LD (peningkatan kadar lipid netral)

Hasil 6. Ka mempromosikan autophagy dan menurunkan produksi mtROS dalam sel SH-SY5Y MPP plus -treated

Biasanya, LD dikirim ke lisosom melalui autophagy dan dapat dipecah menjadi FA untuk menghindari peroksidasi. Namun, bukti menunjukkan bahwa autophagy terganggu, yang memainkan peran penting dalam PD [2]. Ketika autophagy melibatkan porsi LDs untuk dipecah dalam lisosom (Gbr. 6a), proses ini secara khusus disebut lipophagy [2]. Untuk menyelidiki apakah autophagy terlibat dalam efek neuroprotektif Ka, kami memeriksa tingkat protein terkait autophagy. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 6b-d, dalam sel SH-SY5Y yang dikultur, tingkat rantai ringan protein terkait mikrotubulus 3 (LC3)-II sangat berkurang, sedangkan ekspresi p62 meningkat secara nyata pada sel yang diobati dengan MPP plus, sebagaimana diukur dengan imunoblotting, dan efek ini secara signifikan dibalikkan oleh Ka. Kami selanjutnya memeriksa perubahan autophagy dengan immunostaining untuk LC3. Untuk memungkinkan autofagosom menumpuk di dalam sel, bafilomisin ditambahkan untuk mencegah fusi autofagosom dengan lisosom. Seperti yang ditunjukkan, peningkatan jumlah LC3b puncta terdeteksi dalam sel yang diobati dengan MPP*, menunjukkan gangguan degradasi autophagic, dan efek ini juga dibalikkan oleh Ka (Gbr. 6e dan f). Hasil ini menunjukkan bahwa LD dalam sel SH-SY5Y dimobilisasi oleh autophagy untuk penghapusan akhirnya dan bahwa Ka dapat mempromosikan autophagy untuk mengurangi akumulasi lipid teroksidasi. Peningkatan peroksidasi lipid dapat memperburuk kerusakan mitokondria dengan meningkatkan stres oksidatif mitokondria [4]. Selain itu, perlakuan Ka secara signifikan mengurangi generasi mtROS yang kuat, sebagaimana ditentukan oleh pewarnaan MitoSOX (Gbr. 6g dan h), dan menurunkan jumlah mitokondria yang tidak berfungsi, sebagaimana ditentukan oleh label khusus mitokondria untuk membedakan respirasi (merah tua MitoTracker) dan total ( MitoTracker green) mitokondria (Gbr. 6i dan j). Selain itu, untuk melihat langsung perubahan mitokondria, kami selanjutnya mendeteksi tingkat konsumsi oksigen (OCR) oleh penganalisis Seahorse XF. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 6k, respirasi mitokondria berkurang pada sel yang diobati dengan MPPt, sementara pengobatan Ka jelas membalikkan kerusakan yang disebabkan oleh MPP plus ini (Gbr. 6k).

Hasil7. Penghambatan autophagy membalikkan efek supresi dari akumulasi Kaon LD, disfungsi mitokondria, dan cedera saraf DA in vitro

Untuk memeriksa apakah autophagy adalah salah satu mekanisme utama yang digunakan Ka untuk memediasi neuroproteksi DA, inhibitor autophagy 3-MA digunakan. Kami menemukan bahwa efek penghambatan Ka pada cedera yang diinduksi MPP#, termasuk penurunan akumulasi LD (Gbr. 7a dan b), mengurangi produksi mtROS (Gbr. 7c dan d), dan mengurangi disfungsi mitokondria (Gbr.7e dan f) pada Sel SH-SY5Y, diblokir secara signifikan oleh 3-MA. Karena oksidasi LD dan disfungsi mitokondria terkait erat dengan kematian neuron DA, kami selanjutnya memeriksa neuron DA primer yang dikultur. Kami merawat mesencephalon TH plus neuron yang dikultur dengan Ka dan/atau MPPf dan menghitung jumlah dan panjang TH plus proses neuronal dengan immunostaining. Analisis morfologi mengungkapkan bahwa jumlah dan panjang proses neuronal berkurang secara nyata oleh MPP plus dan dilindungi oleh Ka, dan perlindungan ini selanjutnya dibalik oleh 3-MA (Gbr.7g-i). Data ini menunjukkan bahwa Ka mengurangi kerusakan saraf DA dengan mempromosikan autophagy.

Hasil 8. Membungkam Atg5 menghapuskan pencegahan kehilangan neuron yang dimediasi Ka secara in vivo

Untuk mengonfirmasi lebih lanjut bahwa Ka melindungi terhadap TH yang diinduksi MPTP / p ditambah kehilangan neuron dengan cara yang bergantung pada autophagy, kami membungkam Atg5 dengan menyuntikkan mikro virus terkait adeno (AAV) - yang mengekspresikan shRNA yang dicirikan sebelumnya terhadap Atg5 ke dalam mesencephalon bilateral (Gbr. .8a) seperti yang dijelaskan sebelumnya [25]. Dalam percobaan awal, kami mengamati bahwa transfeksi shRNA Atg5 selama 2 minggu mencapai ekspresi GFP yang cukup dalam TH plus neuron (Gbr. 8b) dan menghambat ekspresi ATG5 di SNpc tikus yang disuntikkan (Gbr. 8c). Kami menemukan bahwa Atg5-knockdown membalikkan efek neuroprotektif Ka, sebagaimana dibuktikan oleh ekspresi protein TH yang diregulasi (Gbr. 8d dan e) dan peningkatan jumlah TH plus neuron (Gbr. 8f dan g). Data ini lebih lanjut mendukung kontribusi autophagy terhadap efek perlindungan Ka pada tikus PD. Sebagai kesimpulan, kami mengkonfirmasi bahwa Ka melindungi terhadap cedera yang diinduksi MPTP / p dengan mengurangi oksidasi LD dan disfungsi mitokondria dengan mempromosikan autophagy.

4. Diskusi

Penelitian ini menunjukkan bahwa molekul kecil alami Ka adalah faktor kunci dimana pensinyalan autophagic dapat menghambat toksisitas oksidatif lipid. Hasil kami menunjukkan bahwa jalur autophagy adalah loop pengatur utama yang melaluinya Ka mengurangi peroksidasi LD dan kerusakan mitokondria selanjutnya dan berfokus pada peran toksisitas LD yang diatur oleh autophagy dalam mengurangi kerusakan mitokondria sambil mencegah neurodegenerasi karena stres oksidatif yang berlebihan (Gbr. 4b). 9).

LD adalah situs intraseluler penyimpanan lipid netral [5] dan sangat penting untuk metabolisme lipid dan homeostasis energi, sementara disfungsi LD telah dikaitkan dengan banyak penyakit [16]. Mengumpulkan bukti menunjukkan bahwa peran LD dalam biologi dan patologi secara signifikan lebih luas daripada yang diperkirakan sebelumnya. Di SSP, bukti telah menunjukkan bahwa peningkatan LD di neuron dan glia terlibat dalam patologi neurodegeneratif [10,36]. Secara rinci, LD telah terdeteksi baik di akson neuron Aplysia yang dikultur in vitro [37] dan di bagian otak dari Model penyakit Huntington [38]. Selain itu, ditunjukkan bahwa neuron sangat sensitif terhadap toksisitas lipid, dan akumulasi LD yang tidak dapat dihilangkan secara tepat waktu menyebabkan percepatan peroksidasi LD dan dapat menimbulkan neurodegenerasi [17].

Akumulasi lipid pada neuron hiperaktif bersifat toksik bukan hanya karena kerentanan lipid ini terhadap peroksidasi. Selain itu, kandungan LD yang berlebih dapat memasuki jalur metabolisme nonoksidatif, memicu produksi ceramide yang berlebihan, yang bersifat toksik bagi sel [39]. Studi terbaru juga menunjukkan bahwa dalam sel yang rusak LD, FA dapat diubah menjadi asilkarnitin, yang kemudian menyebabkan disfungsi mitokondria dan produksi ROS [40]. Proses-proses ini cenderung memiliki konsekuensi spesifik dan mendalam pada neuron hiperaktif karena mitokondria yang disfungsional membahayakan kapasitas konsumsi FA, dan produksi mtROS selanjutnya menyebabkan peroksidasi lipid membran.

Dengan demikian, homeostasis LD harus dikontrol dengan baik di neuron, yang sangat penting untuk menghindari toksisitas dan pada akhirnya menjaga kesehatan otak. Dalam penelitian ini, kami telah menemukan bahwa molekul alami kecil Ka menghambat toksisitas LD neuronal yang bermanifestasi sebagai peningkatan akumulasi LD, peningkatan peroksidasi lipid, dan peningkatan ekspresi gen terkait toksisitas lipid dalam sel SH-SY5Y yang dihina MPP#. Lebih penting lagi, kami juga telah menunjukkan bahwa pengobatan Ka mengurangi 45]. Dalam penelitian ini, kami mengamati autophagy/lipophagy yang rusak pada sel saraf yang cedera MPPt, termasuk penurunan level LC3-II dan peningkatan ekspresi p62, dan peningkatan jumlah puncta LC3B yang disimpan dalam sel. Lipofagi yang rusak pada sel SH-SY5Y yang terluka dibalikkan dengan pengobatan dengan Ka. Akibatnya, Ka menurunkan akumulasi LD teroksidasi, mitokondria yang rusak, dan generasi mtROS dalam sel SH-SY5Y yang diobati dengan MPP #. Yang penting, penghambatan autophagy oleh 3-MA menghapuskan eliminasi LD teroksidasi yang dimediasi Ka dan mitokondria yang rusak dan pengurangan cedera neuron DA in vitro. Selain itu, penghambatan autophagy oleh knockdown Atg5 in vivo membalikkan efek perlindungan degenerasi neuron Kaon DA dalam model tikus PD yang diinduksi MPTP. Secara kolektif, temuan ini menunjukkan bahwa Ka menghambat kerusakan mitokondria terkait toksisitas LD dengan mempromosikan autophagy dalam model PD eksperimental.

Mengumpulkan bukti menunjukkan bahwa peningkatan generasi mtROS adalah karakteristik utama dari neuron aktivitas tinggi dan telah diamati di banyak NDD, termasuk PD [46]. Laporan tentang apakah ROS merupakan penyebab atau konsekuensi dari pembentukan LD adalah kontradiktif [47,48]. Menariknya, hasil in vitro kami menunjukkan bahwa penghambatan farmakologis peroksidasi LD dengan o-tokoferol mencegah pembentukan mtROS dan kelainan potensial membran mitokondria dan mengurangi pengurangan mitokondria, sebagaimana dibuktikan oleh pewarnaan Tomm20 dalam sel SH-SY5Y, yang mendukung gagasan bahwa peroksidasi LD memainkan peran peran kausal dalam disfungsi mitokondria yang diinduksi MPP dan generasi mtROS. Namun, ada kemungkinan bahwa peningkatan ROS pada awalnya mempercepat pembentukan LD, dan selanjutnya, LDs menginduksi generasi ROS lebih lanjut dan memperburuk level ROS intraseluler dan mitokondria.

Dalam penelitian ini, kami menunjukkan bahwa tikus dengan PD yang diinduksi MPTP memiliki tingkat akumulasi LD yang tinggi, yang disertai dengan peningkatan hilangnya neuron DA, percepatan stres yang dimediasi ROS, dan defisit perilaku. Pengobatan Ka mencegah toksisitas LD secara in vitro dan memperbaiki kehilangan neuron DA dan defisit perilaku pada model tikus PD, dan efek ini bergantung pada autophagy. Oleh karena itu, masuk akal untuk menyimpulkan bahwa Ka mempromosikan autophagy, dan autophagy yang ditingkatkan ini mengurangi akumulasi LD yang teroksidasi, mengurangi produksi mtROS, dan mengurangi kerusakan mitokondria pada neuron DA, yang berkontribusi pada penghambatan toksisitas LD, sehingga melemahkan patologi PD (Gbr. .9).

Pendanaan

Penelitian ini didukung oleh hibah dari National Natural Science Foundation of China (No. 81903587), Proyek yang didanai oleh China Postdoctoral Science Foundation (No.2019M661807), Natural Science Foundation of Jiangsu Province (No. BK20190120), dan Proyek Terbuka Disiplin Kelas Satu Materia Medica Tiongkok dari Universitas Pengobatan Tiongkok Nanjing (No. 2020YLXK006), dan Proyek Utama Inovasi Obat (No.2018ZX09711001-003-007).

Artikel ini disarikan dari Redox Biology 41 (2001) 101911