Investigasi Toksisitas Ifosfamid Menginduksi Regulator Hulu Umum di Hati Dan Ginjal

Kontak: emily.li@wecistanche.com

Hyoung-Yun Han, dkk

Abstrak:

Ifosfamid adalah agen alkilasi, analog sintetis dari siklofosfamid, digunakan untuk mengobati berbagai kanker padat. Dalam penelitian ini, toksisitas ifosfamid dievaluasi menggunakan pemberian intraperitoneal dosis tunggal dan ganda pada tikus di bawah pedoman Praktik Laboratorium yang Baik, dan percobaan microarray tambahan diikuti untuk mendukung temuan toksikologi. Dosis tunggal ifosfamid (50 mg/kg) tidak menyebabkan perubahan patologis. Sementara itu, toksisitas ginjal yang parah diamati pada kelompok yang diberikan berturut-turut selama 7 dan 28 hari, dengan peningkatan yang signifikan pada kadar nitrogen urea darah dan kreatinin. Dalam analisis daftar tox, gen terkait sintesis kolesterol sebagian besar terpengaruh di hati dan gen terkait gagal ginjal terpengaruh diginjalsetelah pemberian ifosfamid. Selain itu, faktor pengatur interferon 7 dipilih sebagai regulator hulu utama yang berubah di keduahatidanginjal, dan ditemukan berinteraksi dengan gen target lainnya, seperti peptidase 18 spesifik ubiquitin, domain radikal S-adenosil metionin yang mengandung 2, dan gen 15 yang distimulasi interferon, yang selanjutnya dikonfirmasi oleh analisis RT-PCR waktu nyata. Kesimpulannya, toksisitas organ ifosfamid bias ginjal yang dikonfirmasi ulang dan mengidentifikasi gen yang diubah secara identik di keduahatidanginjal. Studi toksikogenomik komprehensif lebih lanjut diperlukan untuk mengungkapkan hubungan yang tepat antara gen yang diinduksi ifosfamid dan toksisitas organ.

Kata kunci:ifosfamid; hepatotoksisitas; nefrotoksisitas; toksisitas intraperitoneal

Cistanche baik untuk hati dan ginjal

1. Perkenalan

Ifosfamid adalah agen alkilasi, analog sintetis dari siklofosfamid, digunakan untuk mengobati berbagai kanker padat, termasuk sarkoma dan limfoma. Ifosfamid adalah obat antikanker nonspesifik siklus sel yang mengganggu replikasi DNA dan produksi RNA [1]. Meskipun ifosfamid relatif ditoleransi dengan baik dibandingkan dengan agen alkilasi toksik lainnya, diketahui terkait dengan banyak efek samping yang mengancam jiwa yang membatasi penggunaan klinisnya [2]. Efek samping utama ifosfamid termasuk cedera ginjal parah akibat spesies toksik reaktif dari ifosfamid, termasuk akutginjal cedera, nefritis interstisial, sistitis hemoragik, dan sindrom Fanconi [3]. Di klinik, toksisitas organ multipel yang parah dilaporkan pada pasien yang mengalami toksisitas ginjal dini dan kegagalan satu organ yang diinduksi ifosfamid dosis tinggi berulang yang menyebabkan kegagalan organ berikutnya [4,5].

Metabolit toksik ifosfamid, akrolein, dan kloroasetaldehida, merupakan faktor utama yang bertanggung jawab atas toksisitas organ ifosfamid. Studi sebelumnya terutama berfokus pada faktor-faktor yang mempengaruhi konversi ifosfamid menjadi metabolit toksik, terutama sitokrom P450 (CYP) [6]. CYP3A4 dan CYP3A5 yang relatif melimpah di ginjal menyebabkan perubahan toksik pada ifosfamid dan menginduksi nefrotoksisitas [7]. Akrolein merupakan aldehida yang sangat reaktif yang dapat mengaktifkan jalur gen oksidatif reaktif intraseluler dan merusak organel sel. Chloroacetaldehyde melaporkan penekanan aktivasi kompleks I dalam rantai pernapasan mitokondria yang dapat menyebabkan deplesi glutathione (GSH) intraseluler dan kematian sel [8].

Sebuah studi toksikologi organ ganda lebih membantu dalam memahami efek sistemik obat daripada menargetkan organ tertentu untuk studi toksisitas. Hati dan ginjal adalah organ utama yang berpartisipasi dalam metabolisme dan ekskresi obat, dan organ-organ utama ini cenderung mengalami reaksi obat yang merugikan; toksisitas organ sering mengikuti. Selain itu, evaluasi toksikologi integratif dapat menyajikan berbagai temuan patologis yang dapat membantu untuk memahami dan memprediksi toksisitas yang diinduksi obat dalam sistem.

Banyak penelitian telah menggunakan profil ekspresi gen untuk memprediksi potensi efek negatif bahan kimia. Namun, sebagian besar penelitian sebelumnya berfokus pada evaluasi toksisitas organ target tunggal, dengan hanya gejala patologis yang terbatas [9]. Selain itu, dikombinasikan dengan profil gen berbasis microarray, akan menghasilkan pemahaman tingkat sistem yang komprehensif tentang toksisitas yang dapat mencegah potensi toksisitas terkait obat [10]. Dalam hal ini, pendekatan toksikologi multi-organ integratif dengan profil ekspresi gen telah digunakan dalam studi model prediksi toksisitas untuk mengatasi data toksisitas yang berasal dari evaluasi toksisitas organ tunggal, yang tidak cukup untuk memahami mekanisme toksik obat dalam sistem [11].

Dalam penelitian ini, kami menggambarkan toksisitas ifosfamid dalamginjaldanhatisetelah paparan akut dan berulang pada tikus Sprague-Dawley (SD). Tes profil ekspresi gen yang mendukung dilakukan untuk mengungkapkan gen target umum yang diubah oleh ifosfamid di hati danginjal, menyarankan wawasan tentang toksisitas ifosfamid integratif.

2. Hasil

2.1. Studi Toksisitas Dosis Tunggal

Tidak ada toksisitas yang diamati pada kelompok ifosfamid 12,5, 25, dan 50 mg/kg—bukan kematian, gejala toksik, perubahan berat badan, atau temuan histopatologi.

Sementara itu, dalam studi hematologi, jumlah relatif retikulosit (RET) dan jumlah absolut neutrofil (NEUA) dan limfosit (LYMA) menurun secara tergantung dosis.

2.2. Studi Toksisitas Dosis Berulang Satu Minggu

Berat badan keseluruhan menurun setelah 1 minggu pemberian ifosfamid, dan nilai rata-rata penurunan berat badan pada kelompok 100 mg/kg lebih tinggi dibandingkan pada kelompok 75 mg/kg (Tabel 1). Sementara itu, berat organ relatif meningkat secara bertahap pada kelompok yang diberi ifosfamid (Tabel 2).

Satu minggu pemberian IP ifosfamid berturut-turut menekan indeks hematologi, termasuk RBC, HGB, HCT, MCV, dan PLT, dengan cara yang bergantung pada dosis (Tabel 3). Selain itu, BUN dan CREA meningkat 1,2 kali pada kelompok kontrol jika dibandingkan dengan kelompok ifosfamid (Tabel 4).Ginjalcederalebih lanjut didukung oleh studi histopatologi.

Tidak ada tanda-tanda histopatologi yang diamati pada hati tikus pada kelompok ifosfamid 75 dan 100 mg/kg (Gambar 1A). Sementara itu,ginjaldari kelompok ifosfamid 75 dan 100 mg/kg ditemukan memiliki tingkat perubahan patologis minimal hingga ringan, termasuk degenerasi/dilatasi tubulus (1 sedang dalam kelompok 100 mg/kg), nekrosis sel tunggal, hiperplasia urothelium, dan perdarahan fokal. /kemacetan (Tabel 5). Selain itu, peningkatan nyata dalam ekspresi KIM-1 di area tubulus ginjal diamati padaginjaldari kelompok 100 mg/kg (Gambar 1B).

2.3. Studi Toksisitas Dosis Berulang Empat Minggu

Kematian diamati pada 50 (5/10) dan 70 (10/10) kelompok yang diobati dengan mg/kg setelah 21 dan 10 hari pemberian berturut-turut. Selain itu, penurunan berat badan dengan peningkatan berat organ relatif,hati, danginjal, pada semua kelompok yang diobati dengan ifosfamid, mendukung toksisitas dosis berulang 4-minggu.

Analisis hematologi dan biokimia serum dilakukan pada subjek yang masih hidup. Beberapa parameter darah, termasuk RET, RBC, MONA, EOSA, dan LUCA, secara signifikan menurun setelah 4 minggu pemberian ifosfamid.

Dibandingkan dengan kelompok kontrol, analisis biokimia menunjukkan perbedaan statistik setelah 4 minggu pemberian ifosfamid. Misalnya, kadar AST dan CK meningkat secara signifikan, dan rasio A/G, GLU, dan GGT menurun (p < 0.01)="" pada="" kelompok="" perlakuan="" 50="" mg/kg,="" bila="" dibandingkan="" dengan="" kontrol.="">

2.4. Analisis Ekspresi Gen yang Diinduksi Ifosfamid

DEG yang diinduksi ifosfamid diidentifikasi di hati danginjaljaringan (Tabel 6). Untuk hati, gen yang diekspresikan secara berbeda termasuk 2672 gen pada 100 mg/kg BB/hari, 1283 gen diregulasi, dan 1389 gen diturunkan regulasi. Di ginjal, 401 gen diekspresikan secara berbeda pada 100 mg/kg BB/hari—149 gen diregulasi, dan 252 gen diturunkan regulasi. Di hati dan ginjal, jumlah gen yang diatur ke bawah lebih besar daripada jumlah gen yang diatur ke atas. Ini mungkin menunjukkan bahwa pengobatan ifosfamid tampaknya menghambat ekspresi gen.

Hasil analisis fungsi biologis tercantum dalam Tabel 7. Pemberian ifosfamid 1-minggu ditemukan mengubah gen yang terkait dengan perkembangan organ, sebagian besar di hati. Dalamginjal, dipastikan bahwa gen yang terkait dengan lokalisasi sel kekebalan sebagian besar terpengaruh.

Dalam analisis jalur kanonik DEG, perubahan dalam sintesis kolesterol dan gen terkait jalur presentasi antigen terbukti dalamhatidanginjaljaringan, masing-masing (Gambar 2). Selain itu, LXE / RXR dan pensinyalan respons fase akut adalah jalur kanonik yang paling banyak diatur dalamhatidanginjal, yang masing-masing terlibat dalam homeostasis lipid dan pensinyalan sitokin inflamasi.

Dalam analisis daftar racun hati, gen terkait sintesis kolesterol sebagian besar terpengaruh, diikuti oleh protein respons fase akut positif dan panel gagal ginjal akut (Tabel 8). Lebih lanjut, hasil daftar ginjal mengungkapkan bahwa gen terkait gagal ginjal umumnya dipengaruhi oleh ifosfamid, termasuk biomarker glomerulonefritis reversibel dan panel gagal ginjal akut.

Berdasarkan basis pengetahuan IPA, regulator hulu umum mengatur ekspresi gen di hati dan ginjal setelah pengobatan ifosfamid (Gambar 3). IRF7 adalah regulator utama yang berubah baik di hati dan ginjal dan ditemukan berinteraksi dengan gen target lain seperti USP18, RSAD2, dan ISG15. Selanjutnya, analisis RT-PCR real-time mengkonfirmasi ekspresi IRF7, USP18, RSAD2, dan ISG15. Meskipun tingkat perubahan pada setiap gen berbeda antara hati dan ginjal, ekspresi ditekan di jaringan hati dan ginjal setelah 1 minggu pemberian ifosfamid. RSAD2 dan USP18 sebagian besar telah mengubah gen dengan pengobatan ifosfamid di hati dan ginjal, masing-masing.

3. Diskusi

Dalam studi ini, toksisitas ifosfamid komprehensif di beberapa organ dieksplorasi dengan dosis dan istilah paparan yang berbeda melalui rute IP pada tikus di bawah standar GLP. Di klinik, ifosfamid dapat memberikan aksi antitumor bimodal dengan efek sitotoksik dan imunomodulator yang dikombinasikan dengan imunoterapi adopsi [12]. Ifosfamid diketahui terutama dieliminasi melalui rute ginjal dan sekitar 80 persen dari dosis dalam bentuk tidak berubah, nefrotoksisitas adalah efek samping yang umum diketahui dari ifosfamid, dan metabolit seperti kloroasetaldehida dan akrolein bertanggung jawab untuk penggunaan klinisnya [13, 14].

Dalam penelitian ini, studi toksisitas berulang 1-minggu cocok untuk mengeksplorasi toksisitas organ turunan ifosfamid. Satu minggu pemberian ifosfamid menekan indeks darah dengan cara yang bergantung pada dosis, yang mungkin mencerminkan myelosupresi turunan ifosfamid yang khas. Seiring dengan nefrotoksisitas, beberapa laporan telah menunjukkan bahwa mielosupresi adalah salah satu toksisitas ifosfamid pembatas dosis utama, dan leukopenia umumnya lebih parah daripada trombositopenia [15,16]. Nefrotoksisitas ifosfamid dapat menyebabkan sindrom Fanconi, di mana terjadi gangguan fungsi tubulus proksimal yang mengakibatkan kerusakan permanen, dan metabolit toksik akrolein memicu urotoksisitas dengan sistitis hemoragik [17]. Hal ini sesuai dengan hasil penelitian kali ini. Dalam studi histopatologi, ginjal dan hati diperiksa untuk mengeksplorasi perubahan patologis yang diturunkan dari ifosfamid. Pada kelompok yang diberi ifosfamid 75 dan 100 mg/kg, area degenerasi dan pelebaran tubulus yang luas terdeteksi dengan hiperplasia urothelium di area pelvis ginjal. Lebih lanjut, ekspresi KIM-1, molekul cedera tubulus proksimal ginjal, mendukung adanya nefrotoksisitas terkait ifosfamid. Sementara itu, hanya vakuolasi periportal minimal yang diamati di hati. Selain itu, meskipun nilai AST dan ALT menurun dengan cara yang bergantung pada dosis, perubahan tersebut berada dalam kisaran referensi [18]. Alasan yang lebih dalam untuk penurunan kadar enzim hati perlu dipelajari lebih lanjut. Secara umum diterima bahwa ifosfamid adalah agen alkilasi yang jarang dikaitkan dengan hepatotoksisitas, dan hanya beberapa kasus yang dilaporkan menyebabkan kerusakan hati, terutama bila dikombinasikan dengan obat kemoterapi lain seperti doksorubisin [19].

Baru-baru ini, kemajuan penting dalam data ekspresi gen dalam toksikologi dengan teknologi throughput tinggi telah menghasilkan kumpulan data yang cukup besar dalam studi toksisitas, dan banyak upaya telah dilakukan untuk menerapkan profil gen pada prediksi toksisitas kimia [10,20]. Dalam penelitian ini, analisis microarray dilakukan untuk menganalisis respons transkriptom yang diinduksi oleh pemberian ifosfamid, dan DEG dengan perubahan lipatan Lebih besar atau sama dengan 1,5 dipilih sebagai gen target dan fungsi biologis, jalur kanonik, dan analisis daftar Tox digunakan untuk memahami fungsi gen yang diinduksi ifosfamid. Analisis regulator hulu tambahan dilakukan untuk mengevaluasi kemungkinan toksisitas multi-organ di hati dan ginjal.

Dalam studi ini, DEG berubah 1,5-kali lipat dipilih, dan gen yang diregulasi sedikit lebih dominan daripada gen yang diregulasi di hati (52 persen ) dan ginjal (62 persen ). Hasil analisis fungsi biologis menunjukkan bahwa ifosfamid mengubah gen, dengan fungsi biologis terkait dengan perkembangan jaringan yang umumnya diamati baik di hati maupun ginjal.

Sebuah studi sebelumnya oleh Snouber et al. [21] melaporkan pengobatan ifosfamid ditemukan untuk menurunkan regulasi jalur respon oksidatif stres Nrf-2 yang dimediasi dalam kultur mikofluida [21]. Konsisten dengan penelitian sebelumnya, jalur respons stres oksidatif yang dimediasi oleh NRF2-secara signifikan dimodulasi oleh jaringan teratas, yang dikonfirmasi oleh jalur kanonik saat ini dan analisis daftar tox. Jalur respons oksidatif stres yang dimediasi Nrf-2 yang diubah saat ini mungkin terkait erat dengan metabolit toksik ifosfamid. Beberapa metabolit toksik ifosfamid dapat bereaksi dengan GSH, antioksidan kuat, untuk membentuk konjugat di lokasi yang berbeda di sepanjang jalur, dan penurunan tingkat GSH menyebabkan peningkatan toksisitas, yang menunjukkan implikasi stres oksidatif pada toksisitas organ ifosfamid [8,22 ]. Dalam hal ini, mesna dan N-acetylcysteine ​​​​digunakan untuk mengurangi toksisitas organ ifosfamid. Mesna berfungsi sebagai detoksifikasi regional dengan mengikat metabolit toksik ifosfamid, terutama terhadap akrolein, melalui penambahan Michael untuk membentuk zat yang kurang berbahaya [23]. Selain itu, N-acetylcysteine ​​​​dilaporkan memiliki aktivitas antioksidan dan meningkatkan penipisan GSH di bawah kondisi stres oksidatif [24]. Penelitian lebih lanjut diperlukan untuk menjelaskan hubungan yang tepat antara penangkal ifosfamid dan jalur yang diatur dalam kondisi nefrotoksik. Kita dapat berspekulasi bahwa perbaikan toksisitas ifosfamid oleh mesna atau N-acetylcysteine ​​mungkin diikuti oleh peningkatan jalur respons oksidatif stres yang dimediasi Nrf-2-.

Dalam penelitian ini, sinyal terkait peradangan umumnya diregulasi di hati dan ginjal, yang dapat dikenali dengan pensinyalan fase akut dalam analisis jalur kanonik. Hasil ini menunjukkan implikasi reaksi inflamasi pada patofisiologi toksisitas organ ifosfamid di kedua jaringan, yang selanjutnya didukung oleh analisis regulator hulu. Dalam analisis regulator hulu, gen terkait sinyal IRF7 dan interferon (IFN), termasuk USP18, RSAD2, dan ISG15, dipilih sebagai regulator hulu umum di hati dan ginjal. IRF7 adalah faktor spesifik limfoid, yang secara konstitutif diekspresikan dalam sitoplasma sel imun, dan juga dapat diinduksi oleh interferon tipe I, infeksi virus, dan rangsangan eksternal di berbagai sel [25]. Sebuah penelitian sebelumnya melaporkan sifat pro atau anti-onkogenik kontroversial dari IRF7 dalam sel tumor yang beragam, dan perubahan ekspresi IRF7 dikaitkan dengan kerusakan DNA [26-28].

Selain peran regulasi penting dalam IFN tipe I untuk fungsi antivirus, IRF7 dilaporkan menekan respons inflamasi melalui jalur pensinyalan TLR4 [29]. Selain itu, Stout-Delgado dkk. [30] melaporkan bahwa peningkatan oksidatif yang diinduksi penuaan merusak aktivitas IRF7, sedangkan pengurangan stres oleh agen antioksidan meningkatkan aktivitas IRF7. Dalam penelitian ini, pemberian ifosfamid menekan ekspresi regulator hulu, dan pola ekspresinya identik di hati dan ginjal. Perubahan ekspresi IRF7 saat ini mungkin berhubungan dengan reaksi inflamasi dan sifat agen alkilasi sitotoksik dari ifosfamid, yang mungkin menyarankan IRF7 sebagai target yang menjanjikan untuk toksisitas organ ifosfamid.

Dalam penelitian ini, kami menemukan gen yang secara identik dihambat baik di hati dan ginjal setelah pemberian ifosfamid, tetapi interpretasi signifikansi toksikologinya hanya difokuskan pada ginjal, yang membatasi penemuan saat ini. Selain itu, studi konfirmasi lebih lanjut terkait dengan efek penangkal ifosfamid yang tersedia secara komersial pada gen yang saat ini diubah mungkin mendukung temuan ini.

Kesimpulannya, studi toksisitas berulang (1 minggu) dari pemberian ifosfamid ditemukan memiliki bias nefrotoksisitas daripada hepatotoksisitas. Selain itu, hasil ini memberikan bukti untuk mekanisme hepatotoksisitas dan nefrotoksisitas yang diinduksi ifosfamid yang melibatkan penghambatan IRF-7. Studi toksikogenomik lebih lanjut dari organ terkait kekebalan diperlukan untuk menjelaskan mekanisme toksikologi sistemik ifosfamid, dan untuk mendukung hubungan antara toksisitas gen dan organ.

4. Bahan dan Metode

4.1. Studi Hewan

Tikus Sprague-Dawley (SD) bebas patogen spesifik jantan berumur delapan minggu (n=140) diperoleh dari Orient Bio Inc. (Seongnam, Korea). Hewan coba diperiksa dan diaklimatisasi dengan kondisi lingkungan laboratorium selama seminggu sebelum percobaan. Semua hewan ditempatkan di kandang plastik di bawah kondisi laboratorium yang terkendali (suhu,23 ± 3 C; kelembaban, 55 ± 10 persen ; dan 12/12-jam siklus terang/gelap) dengan chow laboratorium dan air ad libitum. Penelitian pada hewan telah disetujui oleh Institutional Animal Care and Use Committee dari Institut Toksikologi Korea (Daejeon, Korea), dan semua prosedur dilakukan sesuai dengan Pedoman Pengujian untuk Evaluasi Keamanan Obat dari Administrasi Makanan dan Obat Korea. Studi hewan dibagi menjadi tiga bagian: dosis tunggal (akut) dan dosis berulang (1 minggu dan 4 minggu) berturut-turut studi toksisitas administrasi. Empat puluh tikus secara acak dimasukkan ke dalam empat kelompok (kontrol, t1, t2, dan t3) menggunakan sistem Path/Tox (versi 4.2.2, Xybion Medical Systems Corporation, Lawrenceville, NJ, USA) dalam setiap studi toksisitas.

4.2. Eksperimen Toksisitas

Studi toksisitas dibagi menjadi tiga bagian: studi toksisitas dosis tunggal (akut) dan dua dosis berulang (dosis berturut-turut 1 minggu atau 4 minggu). Untuk setiap studi toksisitas, tikus secara acak ditugaskan ke kelompok yang memadai (kontrol, dosis 1, dosis 2, dan dosis 3 untuk studi toksisitas tunggal dan 4-minggu; kontrol, dosis 1, dan dosis 2 untuk 1- studi toksisitas minggu) dengan menggunakan sistem Path/Tox (versi 4.2.2, Xybion Medical Systems Corporation, Lawrenceville, NJ, USA). Dalam studi toksisitas, ifosfamid diberikan melalui rute intraperitoneal (IP), dan kelompok kontrol menerima air suling (DW). Dosis ifosfamid yang digunakan dalam studi toksisitas adalah sebagai berikut: studi toksisitas akut (12,5, 25, dan 50 mg/kg), 1-studi toksisitas minggu (75 dan 100 mg/kg BB/hari), dan {{19 }}studi toksisitas minggu (25, 50, dan 70 mg/kg BB/hari). Gejala klinis umum hewan, berat badan, dan kematian dicatat setiap hari selama pemberian, dan semua hewan dikorbankan 24 jam setelah pemberian ifosfamid terakhir. Sampel darah dikumpulkan dan ditempatkan ke dalam tabung mikrosentrifugasi dan tabung EDTA-K2 untuk biokimia serum dan analisis hematologi. Jaringan hati dan ginjal difiksasi dalam formaldehida dan dilakukan analisis histopatologi. Imunohistokimia tambahan, analisis microarray, dan RT-PCR real-time dilakukan pada jaringan hati dan ginjal dari studi toksisitas subakut (100 mg/kg BB/hari).

4.3. Analisis Hematologi dan Biokimia Serum

Tes hematologi standar dilakukan dengan menggunakan sistem hematologi ADVIA 120 (Bayer, Fernwald, Jerman). Indikator berikut digunakan: jumlah sel darah putih (WBC), jumlah sel darah merah (RBC), hematokrit (HCT), konsentrasi hemoglobin, mean corpuscular volume (MCV), mean corpuscular hemoglobin (MCH), jumlah trombosit (PLT), limfosit (LYM), monosit (MON), neutrofil (NEU), basofil (BAS), eosinofil (EOS), dan sel besar yang tidak diwarnai (LUC), dan jumlah retikulosit (RET).

Uji biokimia dilakukan dengan menggunakan penganalisis otomatis (TBA 120FRNEO; Toshiba Corp., Tokyo, Jepang) dengan serum yang disentrifugasi. Indikator biokimia utama adalah alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), alkaline phosphatase (ALP), nitrogen urin darah (BUN), kreatinin (CREA), glukosa (GLU), kolesterol total (TCHO), rasio albumin/globulin (A/G), trigliserida (TG), bilirubin total (TB), gamma-glutamil transferase (GGT), fosfolipid (PL), kalsium, klorida, natrium anorganik, fosfor, dan kalium.

4.4. Pemeriksaan Histopatologi dan Imunohistokimia

Jaringan yang tertanam parafin dipotong pada ketebalan 5-µm, diwarnai dengan hematoxylin dan eosin (H&E), dan diperiksa secara mikroskopis.

Jaringan ginjal menjadi sasaran imunohistokimia. Bagian yang dideparafinisasi dan dicuci dipreinkubasi dengan serum kambing 10 persen untuk memblokir pewarnaan nonspesifik. Slide kemudian diinkubasi semalaman dengan antibodi anti-KIM1 primer (1:750; Santa Cruz, CA, USA). Setelah penghapusan antibodi primer, bagian diproses dengan VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (Vector Laboratories, Peterborough, UK), dan ekspresi KIM1 diperiksa di bawah mikroskop cahaya.

4.5. Analisis Microarray dan Analisis Interaksi Protein-Protein (PPI)

Hati dan ginjal dari kelompok 1-minggu (100 mg/kg) dihomogenisasi, dan RNA total diekstraksi dengan kit mini RNase (Qiagen). Sintesis cDNA dicapai dengan menggunakan Kit Sintesis cDNA (Affymetrix, Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) dan menjadi sasaran analisis microarray dan PPI.

Analisis microarray dilakukan menggunakan Affymetrix GeneChip Rat {{0}}.0 dengan GeneChip Scanner 3000 (Affymetrix Santa Clara, CA, USA), dan hasilnya diproses menggunakan perangkat lunak analisis GeneSpring GX v13.0 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Gen yang diekspresikan secara berbeda (DEG), yang berubah lebih dari 1,5-kali lipat setelah pemberian ifosfamid, dipilih menggunakan analisis varians satu arah (ANOVA) dengan uji post hoc Tukey. Fungsi biologis dan jalur kanonik dari DEG terpilih dianalisis menggunakan perangkat lunak Analisis Jalur Ingenuitas (IPA, ver. 9.0; Ingenuity Systems, Redwood City, CA, USA), dan analisis regulator hulu dilakukan untuk mengidentifikasi regulator hulu yang mungkin bertanggung jawab atas DEG yang berasal dari toksisitas ifosfamid. Analisis jaringan interaksi protein-protein (PPI) tambahan dari DEG dilakukan menggunakan perangkat lunak STRING (versi 10), dan interaksi dikonfirmasi ketika skor kepercayaan sedang lebih dari 0,4. Interaksi protein adalah probabilitas perkiraan bahwa ada tautan yang diprediksi antara dua protein di jalur Ensiklopedia Kyoto Gen dan Genom.

4.6. Studi RT-PCR Waktu Nyata Kuantitatif

Ekspresi gen regulator umum dalam studi microarray dikonfirmasi menggunakan RT-PCR kuantitatif real-time. Primer spesifik gen diperoleh dari Bioneer (Daejeon, Korea). Urutan primernya adalah sebagai berikut: faktor pengatur interferon 7 (IRF7): maju, 5-TGCTTGTCTAGCACCAATAG-3 dan sebaliknya, 5-CACAAGGTCACTAGAGAGATG-3; ubiquitin spesifik peptidase 18 (USP18): maju, 5-CTGTAGTTTGTCTCCCAACA-3 dan mundur 5-GAACTGATTACCCCCCACTG-3; domain radikal S-adenosil metionin yang mengandung 2(RSAD2): maju, 5-ACCAATCATCAGAGGTTGAC-3 dan sebaliknya, 5-CTGCATGATTGTTCTTGGAC-3; gen terstimulasi interferon 15 (ISG15): maju, 5-AAGTTCCCCAAGACCAATTC-3dan sebaliknya, 5-CTACATTGGCTCTGGATAGG-30.

Total RNA ditranskripsi balik ke cDNA menggunakan SuperScript II (Invitrogen, Carls bad, CA, USA) dan primer oligo-dT, sesuai dengan instruksi pabrik. Tingkat ekspresi mRNA dari gen terkait regulasi hulu dianalisis menggunakan Sistem PCR Waktu Nyata StepOnePlus (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA) dengan master mix SYBR Green (Applied Biosystems), menurut protokol pabrikan. Primer RNA ribosom 18S digunakan sebagai kontrol internal, dan hasilnya dinyatakan sebagai perubahan lipatan relatif terhadap kelompok kontrol normal.

4.7. Analisis statistik

Data dianalisis secara statistik menggunakan metode perbandingan berganda. Ketika uji Bartlett menunjukkan tidak ada penyimpangan yang signifikan dari homogenitas varians, analisis varians (ANOVA) digunakan untuk menentukan apakah salah satu kelompok berarti berbeda pada tingkat signifikansi p < {{0}}.05.="" selain="" itu,="" uji="" dunnett="" digunakan="" untuk="" menentukan="" perbedaan="" data="" antara="" kelompok="" kontrol="" dan="" perlakuan="" ketika="" data="" ditemukan="" signifikan="" dari="" uji="" anova.="" selanjutnya,="" ketika="" penyimpangan="" yang="" signifikan="" dari="" homogenitas="" varians="" diamati="" dari="" uji="" bartlett,="" uji="" perbandingan="" non-parametrik,="" uji="" kruskal-wallis="" (h),="" dilakukan="" untuk="" menentukan="" apakah="" salah="" satu="" kelompok="" berarti="" berbeda="" pada="" p=""><0,05. ketika="" perbedaan="" yang="" signifikan="" diamati="" pada="" uji="" kruskal-wallis="" (h),="" subtest="" dunn's="" rank="" dilakukan="" untuk="" mengukur="" pasangan="" spesifik="" data="" kelompok="" yang="" berbeda="" secara="" signifikan="" dari="" rata-rata.="" uji="" eksak="" fisher="" dilakukan="" untuk="" membandingkan="" pasangan="" data="" (termasuk="" prevalensi="" dan="" persentase).="" tingkat="" kemungkinan="" ditetapkan="" menjadi="" 1="" atau="" 5="" persen.="" analisis="" statistik="" dilakukan="" dengan="" membandingkan="" data="" dari="" kelompok="" perlakuan="" yang="" berbeda="" dengan="" kelompok="" kontrol="" menggunakan="" path/tox="" (versi="" 4.2.2,="" xybion="" medical="" systems="" corporation,="" lawrenceville,="" nj,="">

Pernyataan Ketersediaan Data:

Data terkandung dalam artikel atau Materi Tambahan.

Konflik kepentingan:

Para penulis menyatakan bahwa mereka tidak memiliki kepentingan yang bersaing.

Referensi

1. Palmerini, E.; Setola, E.; Grignani, G.; D'Ambrosio, L.; Komandon, A.; Rigi, A.; Longhi, A.; Cesari, M.; Paioli, A.; Hakim, R.; dkk. Ifosfamid dosis tinggi pada pasien osteosarcoma derajat tinggi yang kambuh dan tidak dapat dioperasi: Serangkaian retrospektif. Sel 2020, 9, 2389. [CrossRef]
2. Klastersky, J. Efek samping ifosfamid. Onkologi 2003, 65, 7-10. [CrossRef]
3. Sprangers, B.; Lapman, S. Rasa sakit yang berkembang dari ifosfamide. klinik Ginjal J. 2020, 13, 500–503. [CrossRef]
4. Elias, AD; Ayash, LJ; Wheeler, C.; Schwartz, G.; Tepler, saya.; McCauley, M.; Mazanet, R.; Schnipper, L.; Frei, E., 3; Antman, KH Ifosfamide/carboplatin/etoposide dosis tinggi dengan dukungan sel induk hematopoietik autologus: Keamanan dan arah masa depan. mani. Onkol. 1994, 21, 83–85. [PubMed]
5. Mollenkopf, A.; Du Bois, A.; Meerpohl, HG Sequential course dan manajemen prospektif toksisitas multi-organ yang diinduksi ifosfamid. Geburtshilfe Frauenheilkd. 1996, 56, 525–528. [CrossRef]
6. Alexa, K.; Matsell, D.; Krausz, K.; Gelboin, H.; Ito, S.; Koren, G. Cytochrome P450 3A dan 2B6 pada ginjal yang sedang berkembang: Implikasi untuk nefrotoksisitas ifosfamid. anak Nefrol. 2005, 20, 872–885. [CrossRef] [PubMed]
7. Lowenberg, D.; Duri, CF; Desta, Z.; Flockhart, DA; Altman, RB; Klein, TE PharmGKB ringkasan: Jalur ifosfamid, farmakokinetik dan farmakodinamik. Farmakogen. Genom. 2014, 24, 133. [CrossRef] [PubMed]
8. MacAllister, SL; Martin-Brisac, N.; Lau, V.; Yang, K; O'Brien, PJ Acrolein dan chloroacetaldehyde: Pemeriksaan biomarker toksisitas sel dan bebas sel. Kimia Biol. Berinteraksi. 2013, 202, 259–266. [CrossRef]
9. Kim, J.; Shin, M. Model integratif prediksi toksisitas yang diinduksi obat multi-organ menggunakan data ekspresi gen. Bioinform BMC. 2014, 15, S2. [CrossRef]
10. Alexander-Dann, B.; Pruteanu, LL; Oerton, E.; Sharma, N.; Berindan-Neagoe, I.; Modos, D.; Bender, A. Perkembangan toksikogenomik: Memahami dan memprediksi toksisitas yang diinduksi senyawa dari data ekspresi gen. mol. Omics 2018, 14, 218–236. [CrossRef]
11. An, YR; Kim, JY; Kim, YS Konstruksi model prediktif untuk mengevaluasi toksisitas organ multipel. mol. Toksikol Sel. 2016, 12, 1–6. [CrossRef]
12. Binotto, G.; Trentin, L.; Semenzato, G. Ifosfamide dan cyclophosphamide: Efek pada immunosurveillance. Onkologi 2003, 65, 17-20. [CrossRef]
13. Schwerdt, G.; Gordjani, N.; Benesik, A.; Freudinger, R.; Wolny, B.; Kirchhoff, A.; Gekle, M. Chloroacetaldehyde- dan akrolein menginduksi kematian sel tubulus proksimal manusia. anak Nefrol. 2006, 21, 60–67. [CrossRef]
14. Ensergueix, G.; Palet, N.; Joli, D.; Levi, C.; Chauvet, S.; Trivin, C.; Augusto, JF; Boudet, R.; Abudagga, H.; Touchard, G.; dkk. Nefrotoksisitas ifosfamid pada pasien dewasa. klinik Ginjal J. 2020, 13, 660–665. [CrossRef]
15. Dechant, KL; Brogden, RN; Pilkington, T.; Kesalahan, D. Ifosfamid/mesna. Tinjauan aktivitas antineoplastik, sifat farmakokinetik, dan kemanjuran terapeutik pada kanker. Narkoba 1991, 42, 428–467. [CrossRef]
16. Pronk, LC; Schrijvers, D.; Schellens, JHM; De Bruijn, EA; Penanaman, A.; Locci-Tonelli, D.; Groult, V.; Verweij, J.; Van Oosterom, AT Studi Tahap I tentang docetaxel dan ifosfamid pada pasien dengan tumor padat stadium lanjut. sdr. J.Kanker. 1998, 77, 153-158. [CrossRef] [PubMed]
17. Skinner, R. Nefrotoksisitas ifosfamid kronis pada anak-anak. Med. Anak Oncol. 2003, 41, 190-197. [CrossRef]
18. Tajam, P.; Vilano, JS Tikus Laboratorium; CRC Press: Boca Raton, FL, AS, 2012.
19. Cheung, MC; Jones, RL; Judson, I. Toksisitas hati akut dengan ifosfamide dalam pengobatan sarkoma: Sebuah laporan kasus. J. Med. Perwakilan Kasus 2011, 5, 180. [CrossRef]
20. Cui, Y.; Paules, RS Penggunaan transkriptomik dalam memahami mekanisme toksisitas yang diinduksi obat. Farmakogenomik 2010, 11, 573–585. [CrossRef]
21. Snouber, LC; Jacques, S.; Monge, M.; Legallais, C.; Leclerc, analisis E. Transcriptomic dari efek ifosfamide pada sel MDCK yang dibudidayakan dalam biochip mikofluida. Genomik 2012, 100, 27-34. [CrossRef] [PubMed]
22. Dirven, HA; Megens, L.; Oudshoorn, MJ; Dingemanse, MA; van Ommen, B.; Van Bladeren, PJ Glutathione konjugasi obat sitostatik ifosfamid dan peran glutathione S-transferases manusia. Kimia Res. racun. 1995, 8, 979–986. [CrossRef]
23. Jeelani, R.; Jahanbakhsh, S.; Kohan-Ghadr, HR; Thakur, M.; Khan, S.; Aldhaheri, SR; Yang, Z.; Andreana, P.; Morris, R.; Abu-Soud, HM Mesna (2-mercaptoethane sodium sulfonate) berfungsi sebagai pengatur myeloperoxidase. Radikal Bebas. Biol. Med. 2017, 110, 54–62. [CrossRef]

24. Alnahdi, A.; Yohanes, A.; Raza, H. N-asetil sistein melemahkan stres oksidatif dan ketidakseimbangan redoks yang bergantung pada glutathione yang disebabkan oleh pengobatan glukosa/asam palmitat tinggi dalam sel Rin-5F pankreas. PLoS ONE 2019, 14, e0226696. [CrossRef]

25. Zhang, L.; Pagano, JS IRF-7, faktor regulasi interferon baru yang terkait dengan latensi virus Epstein–Barr. mol. Biol Sel. 1997, 17, 5748–5757. [CrossRef]
26. Pagano, JS Virus dan limfoma. N. Inggris. J. Med. 2002, 347, 78–79. [CrossRef]
27. Romieu-Mourez, R.; Solis, M.; Nardin, A.; Goubau, D.; Baron-Bodo, V.; Lin, R.; Massie, B.; Salcedo, M.; Hiscott, J. Peran yang berbeda untuk faktor regulasi IFN (IRF)-3 dan IRF-7 dalam aktivasi sifat antitumor makrofag manusia. Kanker Res. 2006, 66, 10576–10585. [CrossRef]
28. Ning, S.; Pagano, JS; Barber, GN IRF7: Aktivasi, regulasi, modifikasi, dan fungsi. Kekebalan Gen. 2011, 12, 399–414. [CrossRef]
29. Chen, PG; Guan, YJ; Zha, GM; Jiao, XQ; Zhu, HS; Zhang, CY; Wang, YY; Li, HP Swine IRF3/IRF7 melemahkan respons inflamasi melalui jalur pensinyalan TLR4. Oncotarget 2017, 8, 61958. [CrossRef]
30. Stout-Delgado, HW; Yang, X.; Walker, KAMI; Tesar, BM; Goldstein, DR Penuaan merusak regulasi IFN faktor 7 up-regulasi dalam sel dendritik plasmacytoid selama aktivasi TLR9. J. Imun. Res. 2008, 181, 6747–6756. [CrossRef]