Interaksi Antara Antioksidan Polifenol Quercetin Dan Naringenin Mendikte Perilaku Kimia Dan Biologis Terkait Redoks Yang Khas Dari Campurannya Bagian 3

Mohon hubungi{0}}untuk informasi lebih lanjut

Aktivitas antioksidan dengan uji DPPH.

Penentuan aktivitas antioksidan dari antioksidan yang diselidiki dan campurannya dilakukan denganspektrofotometriuji menggunakan radikal DPPH seperti yang dijelaskan sebelumnya l3,55. Pertama, larutan stok radikal DPPH diencerkan dengan metanol sampai absorbansinya sebesar 0.9±0.05 pada 515 nm. Kedua, antioksidan dan campurannya diencerkan dengan tepat dengan etanol 70 persen untuk mencapai konsentrasi yang berada dalam kisaran linier pengujian355. Kemudian, larutan DPPH (1 mL) dicampur dengan sampel yang diencerkan （30 L） dan absorbansinya diukur pada 515 nm setelah 10 menit pada suhu 37 derajat C. Semua reaksi dilakukan di pelat sumur 48-. Pengukuran absorbansi dilakukan dengan bantuan spektrofotometer TECAN Infinite M200 (Tecan Group Ltd., Swiss). Aktivitas antioksidan sampel dihitung ulang ke koefisien stoikiometri ng seperti yang dijelaskan sebelumnya, dengan modifikasi5. Secara singkat, jumlah radikal yang ditangkap oleh sampel yang diuji dihitung berdasarkan hukum Beer-Lambert dan koefisien kepunahan molar DPPH setelah pengukuran yang dilakukan setelah 10 menit reaksi antara larutan antioksidan dan radikal55. Nilai n dihitung sebagai tangen dari hubungan linier antara jumlah mol DPPH yang diserap oleh 1 mLantioksidanlarutan dalam rentang konsentrasi, di mana larutan "stok" memiliki konsentrasi "100 persen" dan konsentrasi lainnya adalah pecahan 100 persen seperti yang ditentukan oleh faktor pengenceran.

Silakan klik di sini untuk tahu lebih banyak

Aktivitas antioksidan dengan titrasi potensiometri dan voltametri pulsa diferensial.

Potensi reduksi standar (E) untuk Q dan R diukur dengan titrasi potensiometri (PT) seperti yang dijelaskan di tempat lain5. Singkatnya, senyawa yang dipelajari dan titran(K,[Fe(CN)]) dilarutkan dalam PBS. Konsentrasi senyawa yang dimurnikan adalah 0.3 mg/mL, Campuran mengandung 0.3 mg/mL dari masing-masing senyawa. Pengukuran dilakukan menggunakan JENCO 6230 N ORP-146C Micro Oxidation-Reduction equipment (USA) dengan bantuan elektroda referensi AglaAgCl (RE) dan elektroda pengukur platinum. PTs dilakukan pada 37±0.01 derajat yang terutama dipertahankan oleh Ultra Thermostat (PolvScience, USA). Volume titran yang sama ditambahkan ke analit dan potensial stabil dibaca. Hasilnya, kurva titrasi, E=f(V..), dianalisis dengan bantuan perangkat lunak SigmaPlot Versi 13.0 (Systat Software Inc., UK) dengan menyesuaikan parameter matematis sigmoidal,5- model ke data eksperimen35. Potensi pada titik ekivalen (EP vs. RE) dibaca langsung dari model ini berdasarkan parameter a. Ini sama dengan volume titran yang ditambahkan pada titik belok. Akhirnya, nilai EP versus SHE (potensial reduksi standar, EO) dihitung. Istilah koreksi dari potensi RE(c) ditetapkan dengan titrasi pasangan redoks, FeCl.6H, O, dan Na,S, O3.5H,O, ditandai dengan potensial reduksi standar yang diketahui.

Pada gilirannya, kekuatan antioksidan (AOP) dari senyawa yang dipelajari dan campurannya diukur dengan voltametri pulsa diferensial (DPV) seperti yang ditunjukkan sebelumnya dengan modifikasi. Secara singkat, pengukuran dilakukan dengan menggunakan potensiostat Gamry Reference 60{{10}} (Gamry Instruments, USA) yang berisi sistem tiga elektroda. Elektroda karbon kaca (diameter GC,1,6 mm), kawat platina, dan elektroda AgAgCl (Hydromet SC, Polandia) digunakan masing-masing sebagai elektroda kerja (WE), pembantu (AE), dan elektroda referensi (RE),13. Sebelum percobaan, permukaan WE dipoles menggunakan suspensi alumina 0.0Partikel 5 m, Buehler, USA）pada bantalan kain mikro(MF-1040, BASi, USA) dan kemudian dibersihkan dengan air suling dan metanol. Senyawa yang dipelajari diencerkan dalam DMSO dan buffer natrium fosfat (pH=7.4±0.1), sehingga konsentrasi akhir buffer fosfat adalah {{30}}.1 M dalam sampel. Buffer berfungsi sebagai elektrolit pendukung. Konsentrasi senyawa yang dimurnikan adalah 3 mM. Campuran mengandung 3 mM masing-masing senyawa. Untuk menghilangkan oksigen reaktif secara elektrokimia, larutan yang dipelajari dideoksidasi dengan perkolasi argon sebelum pengukuran. Voltammogram DPV untuk N-.N plus , dan campuran: ON-dan RN plus dicatat dalam rentang-0.2 hingga plus 1,3 V, sedangkan untuk Q dan R dalam rentang-0.2 hingga ditambah 0,6 V vs.RE. Tingkat pemindaian potensial 0,1 V.s', tinggi pulsa 0,05 V, dan waktu pulsa 0,1 detik pada 25±0,01 derajat ditetapkan.

Voltammogram DPV dianalisis dengan perangkat lunak SigmaPlot Versi 13.0 (Systat Software Inc., UK). Nilai AOP dihitung dalam dua langkah. Perhitungan dianggap tidak hanya potensial puncak anodik dan arus (E,; I,), tetapi juga potensial yang ditetapkan dan arus terukur pada setiap titik kurva voltametri. Ini memungkinkan nilai yang lebih tepat untuk diperoleh daripada yang dilaporkan dalam pekerjaan kami sebelumnya3. Pertama, parameter energi antioksidan (AOE) dihitung menurut Persamaan. 1:

di mana AwE adalah luas permukaan WE (sama dengan {{0}}.162±0.004 cm' dalam penelitian kami), E adalah potensial himpunan versus RE [V], adalah faktor koreksi dengan mempertimbangkan keberadaan sambungan cair antara WE dan RE (di sini 0,103 V), I adalah arus yang diukur versus arus latar belakang [A],itu—adalah waktu pengambilan sampel potensial [dt=0 .5 detik].

Kedua, AOP yang dinyatakan dalam satuan W cm² dihitung berdasarkan Persamaan.2∶

di mana tt;—adalah selisih antara waktu awal puncak oksidasi (t) dan akhir (t).

Untuk menentukan Awp, dilakukan voltametri siklik untuk larutan 1.10-3MK,[Fe(CN).] dalam 0.1 M KCl. Nilai ini dihitung berdasarkan persamaan Randles-Sevcik82 dari kemiringan arus puncak anodik sebagai fungsi akar kuadrat dari laju pemindaian, I, =f(pi/2). Anda diukur dengan cara yang sama seperti pada titrasi potensiometri. Selain itu, dalam karya ini, parameter termodinamika dari proses oksidasi adalah potensial puncak anodik yang dikoreksi oleh sambungan cair antara WE dan RE (E.,=E.. plus e), sedangkan parameter kinetik mencakup muatan yang ditransfer ( Q) dan arus anodik (I,).

Cistanche dapat meningkatkan kekebalan

Budaya sel. Dalam penelitian yang disajikan, garis sel HT29 (usus besar manusia)adenokarsinoma) dari ATCC digunakan sebagai model usus manusia, Sel-sel dipertahankan dalam medium McCoy yang dilengkapi denganantibiotik(100 U/mL streptomisin dan 100 g/L penisilin) ​​dan serum janin sapi (100 mL/L)13. Garis sel HT29 dipertahankan pada 37C di bawah 5 persen CO, atmosfer dalam inkubator sel (Heal Force)3. Garis sel digunakan antara bagian 6 dan l1. Sel yang dikultur diuji untuk kontaminasi mikoplasma menggunakan Universal Mycoplasma Detection Kit dari ATCC (USA).

Penilaian sitotoksisitas. Untuk menentukan dampak pemurnianantioksidan(Q, N plus , R, N-) dan campurannya (QN-, RN plus ) pada pertumbuhan sel HT29, uji MTT diterapkan seperti yang dijelaskan sebelumnya3,5. Secara singkat, sel-sel yang tumbuh secara eksponensial diunggulkan dalam 96-pelat kultur jaringan sumur (5 × 10 sel per sumur dalam 0.18 mL medium) dan dibiarkan mengendap selama 24 jam pada 37 derajat di bawah 5 persen CO, Kemudian, sel-sel diperlakukan selama 6,24 atau 72 jam dengan 0.02 ml konsentrasi yang berbeda dari antioksidan murni atau campurannya3,5. Antioksidan dan campurannya dilarutkan dalam etanol (naringenin, naringin dan campurannya—30 persen (v/v), kuersetin-40 persen (v/v), rutin—20 persen (v/v )). Konsentrasi akhir senyawa murni berkisar dari 10 nM sampai 100 uM. Campuran tersebut mengandung konsentrasi ekivalen dari masing-masing senyawa（10 nM-100 M）. Konsentrasi akhir etanol dalam media kultur adalah 2 persen (v/v) untuk rutin, 3 persen (v/v)naringenin, naringin, dan campuran serta 4 persen (v/v)quercetin. Setelah paparan 6 dan 24 jam, media disedot dari sumur dan diganti dengan 0,2 mL media segar. Sel diinkubasi pada suhu 37 derajat sampai 72 jam dari total waktu inkubasi 13,55. Setelah 72 jam inkubasi, ke semua sumur 0,05 mL larutan MTT (4 g/L) ditambahkan dan sel dipertahankan selama 4 jam lebih lanjut pada 37 derajat C13,5. Kemudian, media diaspirasi dari sumur dan kristal formazan dilarutkan dalam 0,05 mL DMSO. Penyerapan larutan yang diperoleh diukur pada 540 nm dengan bantuan pembaca pelat TECAN Infinite M200 (Tecan Group Ltd, Swiss)15. Perlakuan dilakukan sebanyak empat ulangan teknis. Tiga pengulangan independen dari setiap perlakuan dilakukan. Dampak dari sampel yang diselidiki pada pertumbuhan sel HT29 dinyatakan sebagai persen penghambatan pertumbuhan sel yang terpapar antioksidan individu dan campurannya dibandingkan dengan sel kontrol yang diberi pelarut saja, yang pertumbuhannya dianggap 100 persen 13,55

CAA (aktivitas antioksidan seluler). Uji CAA (The OxiSelect Cell Biolabs, Inc. USA) digunakan untuk mengevaluasi aktivitas antioksidan seluler dari senyawa saja (O, N plus, R, N-) dan campuran (ON-, RN plus) dalam sel HT29 seperti yang dijelaskan sebelumnya35. Sel-sel yang tumbuh secara eksponensial diunggulkan dalam 96-pelat hitam kultur jaringan sumur dengan dasar transparan untuk pengukuran fluoresensi (3 × 104 sel per sumur dalam 0.2 ml media) dan dibiarkan menetap selama 24 jam pada 37 derajat di bawah 5 persen CO,i3.55. Semua antioksidan dilarutkan dalam 10 persen etanol. Sel-sel tersebut kemudian diperlakukan dengan 50{{50}} kali larutan encer 2',7'-dichlorofluorescein diacetate (0.05 mL) disediakan dengan kit, dan volume yang sama dari konsentrasi sampel antioksidan yang berbeda selama 1, 3, atau 6 jam. Konsentrasi akhir senyawa yang dimurnikan berkisar antara 1 hingga 100 uM. Campuran tersebut mengandung konsentrasi ekivalen dari masing-masing senyawa (1-100uM). Sel kontrol diperlakukan dengan 10 persen etanol saja (v/v). Konsentrasi akhir etanol dalam media kultur adalah 5 persen (v/v). Semua perlakuan dilakukan dalam tiga ulangan teknis dan tiga percobaan independen dilakukan. Langkah selanjutnya dilakukan sesuai dengan rekomendasi pabrikan (https://www.cellbiolabs.com). Perhitungan dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya, efek Genotoksik. Untuk menentukan efek genotoksik yang ditunjukkan oleh antioksidan individu (O, N plus, RN-) dan campurannya (ON-, RN plus) dalam sel HT29, prosedur uji komet diterapkan seperti yang dijelaskan sebelumnya. Sel-sel HT29 yang tumbuh secara eksponensial diunggulkan di 24-pelat kultur jaringan sumur (10 sel derajat per sumur dalam 1,8 mL medium) dan dibiarkan mengendap selama 24 jam pada 37 derajat di bawah 5 persen CO, 55, Kemudian, sel-sel diperlakukan selama 24 jam dengan 0,2 mL konsentrasi yang berbeda dari antioksidan sendiri atau dalam campuran. Konsentrasi akhir senyawa yang dimurnikan berkisar antara 1 sampai 100 uM. Campuran tersebut mengandung konsentrasi ekivalen dari masing-masing senyawa (1-100 uM). Konsentrasi etanol akhir dalam media kultur adalah 3 persen (v/v). Sel-sel yang digunakan sebagai kontrol negatif diperlakukan dengan pelarut saja. Setelah waktu perawatan, media disedot dari sumur dan sel dicuci dengan 0,5 mL PBS. Sel-sel kemudian dipisahkan menggunakan 0,2 mL larutan tripsin (0,5 g/L)55 Aktivitas tripsin dihentikan dengan menambahkan 1,8 mL media pertumbuhan lengkap ke setiap sumur. Sel-sel disuspensikan kembali, dihitung, dan dimasukkan ke dalam tabung 1,5 mL 30 × 103 sel per tabung）. Suspensi sel disentrifugasi (100 × g, 5 menit, 4 derajat). Pelet sel dicuci dengan l mL PBS dan disentrifugasi lagi (100 × g, 5 menit, 4 derajat -5. Kemudian, PBS dibuang dan sel-sel disuspensikan kembali dalam 150 L 0,5 persen LMP agarose dalam air pra- dihangatkan hingga 42 derajat C dan 40 L campuran ini ditempatkan sebagai dua titik pada slide mikroskop yang telah dilapisi dengan agarosa titik leleh normal 1 persen (NMP agarose). Slide ditutup dengan kaca penutup. Agarosa dibiarkan diatur oleh menempatkan slide mikroskop pada nampan dingin selama minimal 5 menit 5 Tiga slide dengan dua pengulangan masing-masing disiapkan untuk setiap konsentrasi zat yang diuji Setelah lisis semalam dalam buffer alkali garam tinggi (2,5 M NaCl, 0,1 M EDTA ,0,01 M Tris,1 persen Triton X100,pH10), slide ditampung ke dalam platform elektroforesis Bio-Rad Sub-Cell GT (UK), ditutupi dengan buffer elektroforesis dingin (0,3 M NaOH, 1 mM EDTA, pH 13) dan kromatin dibiarkan terlepas selama 25 menit sebelum elektroforesis.Elektroforesis dilakukan pada 26 V dan 300 mA (0,75 V/cm) selama 30 menit dalam kegelapan pada 4-8 derajat . Setelah langkah ini, slide dicuci terlebih dahulu menggunakan PBS dan kemudian air. Selanjutnya, DNA diwarnai dengan SybrGreen dalam buffer TE (0,1 M Trizma-Base, 1 mM EDTA, pH 7,5) selama 20 menit~. Setelah pewarnaan, slide dicuci dengan air suling selama 5 menit. DNA "komet" dianalisis di bawah mikroskop fluoresensi (Zeiss ImagerZ2, USA) digabungkan dengan sistem pemindaian slide terkomputerisasi (Metafer4, Jerman). Analisis komet melibatkan penghitungan 200 inti berturut-turut per sampel5. Genotoksisitas sampel yang dianalisis dinyatakan sebagai persen DNA di ekor komet. Tiga ulangan independen dari setiap perlakuan dilakukan.

Cistanche dapat meningkatkan kekebalan

Metilasi DNA global.

For the determination of global methylation of DNA, a modified comet assay procedure was developed. Methylation sensitive comet assay was performed according to Wentzel's procedure with significant modifications. The cells were seeded in 6-well tissue culture plates(4×105 cells per well in 3.6 mL of medium) and were allowed to settle for 24 h at 37°C under 5%CO,Then, the cells were treated with 0.4 mL, of different concentrations of the tested antioxidants or their mixtures for 24 h at 37C. The final concentrations of individual compounds and solvents were the same as used for genotoxic effect assessment. After incubation time, the medium was aspirated from the wells and the cells were washed with 2 mL of PBS. The cells were detached using 0.4 mL of trypsin solution (0.5 g/L). Then,3.6 mL of medium was added to each well. The cells were re-suspended, counted, and aliquoted into 1.5 mL tubes(30×10 cells per tube). The cell suspension was centrifuged (100×g,5 min, 4°C). The cell pellets were washed with 1 mL of PBS and centrifuged again(100×g 5 min,4℃C）.PBS was discarded and the cell pellet was re-suspended in 100μL of 1%LMP agarose in water pre-warmed to 45 °C. Then,40 μL of this mixture was placed as two spots on a microscope slide pre-coated with 1%normal melting point agarose(NMP agarose)5. The slides were then covered with coverslips and left to set on an ice-cold tray for at least 5 min to solidify agarose5. Each treatment embraced a set of 3 microscope slides. After overnight lysis in a high salt alkaline buffer(2.5 M NaCl, 0.1 M EDTA, 0.01 M Tris,1% Triton X100, pH 10), the slides were washed twice with water>5. Kromatin yang terbungkus rapat dilepaskan dengan memperlakukan inti dengan larutan proteinase K 1,5 mM (0.2 mL per slide)3. Slide ditutup dengan parafilm, ditempatkan ke dalam wadah plastik yang dilapisi dengan tisu basah, dibiarkan selama 10 menit pada suhu 37 derajat, kemudian dicuci dengan air3. Dengan cara ini, nukleoid disiapkan untuk pencernaan dengan restriksi endonuklease (Hall dan MspI). Kedua enzim mengenali urutan restriksi yang sama (5'-CCGG-3') tetapi menunjukkan sensitivitas yang berbeda terhadap sitosin termetilasi. HpalI dianggap hanya mencerna urutan non-metilasi. MspI dapat membelah sekuens yang tidak termetilasi serta sekuens yang sepenuhnya termetilasi. Dengan demikian, tingkat relatif metilasi DNA dari urutan CpG tercermin sebagai perbedaan antara jumlah global DNA dalam ekor komet yang diamati dengan pencernaan MspI dan nukleoid yang dicerna HpalI. Untuk menciptakan kondisi yang sesuai untuk pencernaan enzimatik.{{20}}.2 mL buffer Tango yang diencerkan dengan air tingkat molekuler dengan perbandingan 1:9(v/v) diaplikasikan ke setiap slide di set. Slide ditutup dengan parafilm, ditampung ke dalam wadah plastik yang dilapisi dengan tisu basah, dan dibiarkan selama 10 menit pada suhu 37 derajat Ce. Kemudian, kelebihan buffer dihilangkan. Masing-masing dari tiga slide di set diperlakukan berbeda. Pada slide pertama (kontrol), hanya 0.15 mL buffer Tango encer yang diaplikasikan. Inti agarosa tertanam pada slide kedua diperlakukan dengan 0,15 mL enzim Hall 0,37 unit）, sedangkan ke slide ketiga volume MspI yang sama ditambahkan 0,26 unit）. Larutan enzim disiapkan menggunakan buffer Tango yang diencerkan. Slide ditutup dengan parafilm dan ditampung dalam wadah plastik lembab. Pencernaan enzimatik dilakukan selama 45 menit pada suhu 37 derajat . Setelah pencernaan, slide dicuci dua kali dengan air. Langkah lebih lanjut dari uji komet, seperti elektroforesis dan pewarnaan DNA, dilakukan seperti yang dijelaskan di bagian "Metilasi DNA global". DNA "komet" dianalisis di bawah mikroskop fluoresensi (Zeiss ImagerZ2, USA) digabungkan dengan sistem pemindaian slide terkomputerisasi (Metafer4, Jerman). Analisis komet dilakukan dengan bantuan perangkat lunak skor Comet (USA) dan melibatkan penghitungan 100 inti per sampel. Rata-rata persen DNA di ekor komet adalah ukuran fragmentasi DNA. Untuk menghitung DNA globalmetilasi( persen metilasi CpG), persamaan berikut digunakan: persen metilasi CpG=100—Hpal/MspI×100, di mana Hpal/MspI adalah rasio persentase DNA dalam ekor komet nukleoid yang dicerna dengan HpalII dan DNA persentase di ekor komet nukleoid dicerna dengan Mspl85. Artefak kerusakan DNA diperhitungkan dengan mengurangi persentase DNA di ekor sampel kontrol dari nilai yang diperoleh untuk sampel yang dicerna dengan enzim restriksi. Tiga pengulangan independen dari setiap percobaan dilakukan.

Analisis mikroarray.

Analisis genom telah dilakukan seperti yang ditunjukkan sebelum355, sel HT29 diunggulkan dalam 24-piring kultur jaringan sumur (105 sel per sumur dalam 1,8 mL medium) dan dibiarkan mengendap selama 24 jam pada suhu 37 derajat di bawah 5 persen CO, Kemudian, sel-sel diperlakukan selama 24 jam dengan 0,2 mL konsentrasi antioksidan yang berbeda saja (Q, N-) atau dalam campuran (QN-). Konsentrasi akhir senyawa diselidiki berkisar dari 1 sampai 10 uM. Campuran tersebut mengandung konsentrasi ekivalen dari masing-masing senyawa. Sel-sel yang digunakan sebagai kontrol negatif diperlakukan dengan pelarut saja. Konsentrasi akhir etanol dalam media kultur adalah 3 persen (v/y). Isolasi RNA. transkripsi balik dan PCR real-time dari array yang terdiri dari 84 gen yang terlibat dalam respons antioksidan serta analisis data dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya. Tiga pengulangan independen dari setiap perlakuan sel dilakukan.

Analisis statistik.

Semua nilai dinyatakan sebagai mean±SD dari tiga percobaan independen kecuali dinyatakan lain. Signifikansi statistik penentuan aktivitas antioksidan dalam sistem bebas sel menggunakan uji DPV dan DPPH serta dalam model seluler yang diperoleh dengan uji CAA diperiksa dengan uji Tukey tidak berpasangan (p Kurang dari atau sama dengan 0.{{ 6}}5). Hasil genotoksisitas dan metilasi DNA global dianalisis dengan uji komet diperiksa dengan ANOVA satu arah dengan uji post-hoc Dunnett. Analisis statistik ini dilakukan dengan menggunakan paket perangkat lunak Prism 4.0 (GraphPad Software, Inc., USA). Signifikansi statistik dari perubahan ekspresi gen antara sampel dan kontrol juga dievaluasi dengan uji-t Student tidak berpasangan untuk setiap gen yang diinginkan menggunakan Pusat Analisis Data GenGlobe (Qiagen, USA). Tingkat signifikansi statistik ditetapkan pada kurang dari atau sama dengan 0,05.

Artikel ini diambil dariwww.nature.com/scientificreports