Interaksi Antara Antioksidan Polifenol Quercetin Dan Naringenin Mendikte Perilaku Kimia Dan Biologis Terkait Redoks Yang Khas Dari Campurannya Bagian 1

Mohon hubungi{0}}untuk informasi lebih lanjut

Penelitian yang dilakukan selama dua dekade terakhir berdasarkan molekuler penyakit kronis tidak menular seperti:aterosklerosis, hipertensi, diabetes, dan terutama kanker yang menarik perhatian utama telah mengungkapkan bahwa semua penyakit ini memiliki faktor risiko yang sama, yaitu gangguan homeostasis redoks yang sering disebut sebagai stres oksidatif12. Ini muncul sebagai akibat dari peningkatan tingkat endogen spesies oksigen reaktif (ROS) karena penghalang antioksidan tubuh gagal dan diyakini mendorong perkembangan semua penyakit ini.3. Dengan demikian, asumsi mengikuti bahwa faktor eksogen yang mampu menetralkan ROS, misalnya antioksidan tanaman, dapat melawan atau memperlambat perkembangan penyakit kronis dan mendukung pengobatannya. Verifikasi hipotesis ini memulai studi terperinci tentang antioksidan yang ada dalam bahan makanan yang mungkin menunjukkan potensi pencegahan4. Memang, beberapa penelitian yang dirangkum dalam meta-analisis yang membandingkan konsumsi makanan dan penyakit kronis terkait diet mengungkapkan penurunan risiko dalam kasus diet kaya buah-buahan dan sayuran, sereal gandum serta minuman seperti anggur, kopi, dan teh, maka produk kaya fitokimia antioksidan. Tidak mengherankan, diduga bahwa zat-zat ini setelah diisolasi dari sumber alaminya, dimurnikan, dan kemudian dikonsumsi dalam bentuk suplemen makanan yang mengandung dosis lebih tinggi daripada yang dapat dicapai dalam makanan dapat menjadi agen kemopreventif yang kuat. Asumsi ini dikonfirmasi oleh sejumlah besar bukti yang berasal dari penelitian yang mengeksploitasi berbagai model eksperimental in vitro dan in vivo penyakit kronis, termasuk kanker. 7. Yang mengecewakan, baru-baru ini ditunjukkan dalam penelitian pada manusia bahwa suplemen antioksidan tidak menunjukkan aktivitas yang menjanjikan seperti itu. . Misalnya, dua meta-analisis dari kohort manusia dan investigasi kasus-kontrol dengan vitamin E8 atau preparat mikronutrien" menyimpulkan bahwa tingkat antioksidan yang rendah tidak berpengaruh, sementara dosis tinggi dapat meningkatkan insiden dan mortalitas kanker dan penyakit kardiovaskular. Namun, ketika suplemen didasarkan pada tanaman nyata, seperti campuran spesifik makanan kaya polifenol terkonsentrasi (delima, teh hijau, brokoli, dan kunyit), efek perlindungan yang signifikan pada pria dengan kanker prostat diamati1.

Silakan klik di sini untuk tahu lebih banyak

Efek yang menjanjikan dari makanan utuh berbeda dengan senyawa terisolasi sejalan dengan konsep sinergi makanan, yang didefinisikan sebagai aditif atau lebih dari pengaruh aditif kombinasi bahan makanan yang berbeda pada kesehatan manusia. Studi kami sebelumnya memverifikasi konsep ini dengan membandingkan bioaktivitas makanan nyata dengan antioksidan utama mereka yang terisolasi. Hal ini menunjukkan bahwa efek biologis dari ekstrak buah berry sangat berbeda dari yang ditunjukkan oleh antosianin sianidin-3-O-glukosida. Beberapa laporan lain juga menunjukkan pentingnya interaksi antara senyawa bioaktif yang berbeda dan komponen matriks makanan yang ternyata merupakan faktor yang bekerja sama, yang menentukan bioaktivitas akhir makanan3-1. Penyelidikan mekanistik kami baru-baru ini yang melibatkan rekonstitusi bertahap dari komposisi bioaktif kakao juga mendukung gagasan sinergi makanan tetapi menunjukkan bahwa efek biologis sampel dengan komposisi kompleks bukan hanya kombinasi aktivitas yang ditampilkan oleh komponen individual'3. Semua pengamatan ini menyarankan bahwa ketika mempertimbangkan bioaktivitas terkait redoks dari antioksidan terisolasi versus campurannya, interaksi antar komponen harus diperhitungkan. Kompleksitas yang berkembang dari campuranfitokimiasepertinya Buat yang baruzat aktif redoksdaripada memperkaya campuran dengan karakteristik aktivitas baru dari senyawa yang ditambahkan, yang disimpulkan oleh konsep sinergi makanan.

Cistanche dapat meningkatkan kekebalan tubuh

Dalam penelitian saat ini, kami menyederhanakan sistem eksperimental dengan membatasi hanya pada dua struktur inti untuk mempelajari detail interaksi mereka dalam konteks struktur kimia, reaktivitas redoks, dan bioaktivitas terkait redoks, sehingga untuk memungkinkan pemahaman yang lebih baik dan prediksi potensi kemopreventif antioksidan.'Fitokimia yang digunakan untuk tujuan ini adalah antioksidan umum hadir dalam berbagai herbal, sayuran, dan buah-buahan, terutama dalam buah jeruk, yaitu: flavonol diwakili oleh quercetin (O) dan rhamno-side-rutin ( R) dan flavanon oleh naringenin (N-) danneohesperidosidanaringin (N plus ) serta dua campuran senyawa ini (QN-, RN plus ). Komposisi kimia dari penelitian ini mencakup penentuan yang memberikan beberapa wawasan tentang termodinamika dan kinetika proses oksidatif, uji ieDPPH, titrasi potensiometri, dan voltametri pulsa diferensial (DPV). Tes biologis meneliti dampak sampel yang dipelajari pada pertumbuhan sel (uji MTT), aktivitas antioksidan seluler (uji CAA), genotoksisitas (uji komet), tingkat metilasi DNA global (versi epigenetik uji komet), dan ekspresi 84 redoks -gen terkait (teknologi berbasis array PCR real-time). Eksperimen biologis dilakukan dengan menggunakan garis sel HT29 adenokarsinoma usus besar yang direkomendasikan untuk studi nutrisi sebagai model epitel usus yang mungkin terpapar pada konsentrasi antioksidan yang tertelan relatif tinggi.

Hasil

Penyelidikan kami sebelumnya yang membandingkan sifat terkait redoks dari bubuk kakao dan konstituen utamanya menunjukkan pentingnya interaksi antara komponen polifenol campuran pada aktivitas antioksidan secara keseluruhan. Dalam penelitian saat ini, kami menyederhanakan sistem eksperimental untuk memeriksa interaksi semacam itu secara lebih rinci untuk sepasang flavonoid yang merupakan komponen makanan umum. Dua flavonoid dipilih, baik dalam bentuk aglikon dan glikosida. Flavonol diwakili oleh quercetin (Q) danrhamnoside-rutin(R) danflavanonoleh naringenin(N-) dan neohesperidoside naringin (N plus ). Polifenol ini berbeda dalam jumlah dan lokasi gugus hidroksil redoks-aktif serta kemampuan untuk membentuk ikatan H intramolekul, yaitu, tiga fitur struktural yang dapat mengganggu pengurangan sifat senyawa antioksidan. Seperti ditunjukkan pada Gambar. 1, radikal semikuinon intermediet terbentuk pada langkah pertama oksidasi bagian katekol di cincin B

dari Q atau R dapat distabilkan dalam dua carai8,19. Cara pertama adalah konjugasi kedua struktur inti pada cincin B dan C dan pembentukan ikatan-H kedua dengan gugus OH vicinal atau substituen pada cincin C,Terutama pada R. Adanya gugus hidroksil pada substituen gula pada posisi 3 cincin C dapat lebih meningkatkan efek stabilisasi ini karena lebih banyak kemungkinan pembentukan ikatan-H (langsung atau melalui molekul air), Sebaliknya, radikal fenoksil antara dalam N plus atau N-tidak distabilkan baik oleh ikatan rangkap terkonjugasi yang melibatkan juga cincin ikatan C atau H dengan substituen tetangga. Selain itu, pada N plus , bagian gula melekat pada cincin A dan dengan demikian terlalu jauh untuk membentuk ikatan-H dengan radikal pada cincin B. Seseorang dapat mengharapkan fitur struktural ini mempengaruhi aktivitas redoks dari flavonoid yang dipelajari.

Aktivitas antioksidan dengan uji kimia.

Penentuan sifat pereduksi untuk polifenol yang dipelajari dan campurannya dilakukan dengan dua uji kimia pada 37 derajat C agar sesuai dengan kondisi seluler proses redoks. Metode pertama adalah uji DPPH spektrofotometri batch yang umum digunakan; hasil untuk masing-masing flavonoid dan campurannya disajikan pada Gambar. 2A. Mereka dinyatakan sebagai nilai stoikiometri n di mana angka 10 mengacu pada durasi reaksi—10 menit. Dengan memasukkan parameter waktu ke dalam pengukuran, aspek kinetik dimasukkan ke dalam penilaian aktivitas antioksidan seperti yang telah dijelaskan sebelumnya13. Dalam penentuan ini, kedua aglikon menunjukkan sifat pereduksi yang lebih kuat daripada glikosida yang sesuai seperti yang sebelumnya juga telah ditunjukkan dengan tes ini2021, sementara flavonol lebih aktif daripada flavanon. O adalah senyawa yang paling efisien dalam mengais DPPHradikal dan diikuti oleh R. Meskipun reaktivitas diabaikan terhadap DPPH, kedua flavanon, termasuk N yang dengan sendirinya tidak menunjukkan sifat redoks dalam periode 10 menit reaksi, secara signifikan meningkatkan aktivitas antioksidan total dari campuran, dalam kasus kedua aglikon ON-dan glikosida RN plus .

Metode kedua melibatkan titrasi potensiometri (PT) yang memungkinkan pengukuran potensial reduksi standar (E), dan dengan demikian mengevaluasi kemampuan termodinamika senyawa murni untuk mendapatkan elektron. Nilai yang ditentukan dari Dikonfirmasi bahwa Q dan R adalah senyawa pereduksi kuat (Gbr. 2B). Namun, di PT, R menerima elektron donor lebih rela daripada Q. Penentuan E untuk N- dan N plus tidak dimungkinkan karena transfer elektron yang sangat lambat selama proses oksidasi (lebih lambat untuk N plus ). PT mengukur perbedaan potensial antara elektroda referensi dan elektroda pengukur setelah menambahkan setiap bagian titran. Potensi stabil berarti hasil bagi reaksi (Q) antara titran dan analit stabil (Q= konstan). Jika laju transfer muatan selama reaksi rendah (arus rendah dalam voltametri), maka dibutuhkan waktu lama untuk menstabilkan Q di PT. Akibatnya, untuk reaksi yang sangat lambat, kurva titrasi potensiometri sulit diperoleh dan dengan demikian, nilai E" yang ditemukan kurang dapat diandalkan.

Aktivitas Antioksidan dengan voltametri pulsa diferensial,

Uji kimia yang digunakan menunjukkan bahwa penjelasan tindakan antioksidan polifenol harus mempertimbangkan aspek kinetik, di mana stabilitas radikal perantara dapat berperan. Seperti diilustrasikan pada Gambar 1, radikal semikuinon yang terbentuk pada tahap pertama oksidasi flavanol jauh lebih stabil daripada radikal fenoksil yang muncul pada oksidasi flavanon. Hubungan ini diilustrasikan pada Gambar 1 dan dapat mempengaruhi laju proses redoks. Oleh karena itu, sifat reduksi-oksidasi dari antioksidan murni yang dipelajari dan campurannya dianalisis lebih lanjut dengan bantuan voltametri pulsa diferensial (DPV). Karena teknik ini memungkinkan pemantauan aspek termodinamika dan kinetik dari reaksi oksidasi, keduanya akhirnya digabungkan dalam parameter yang disebut kekuatan antioksidan (AOP)15.

Pengamatan yang dilakukan dengan pengukuran DPV (Gbr.2B-F) bertentangan dengan yang diperoleh dengan tes DPPH (Gbr.2A). Anehnya, DPV mengungkapkan bahwa Q dijelaskan dalam literatur sebagai reduktor yang sangat baik, ketika mempertimbangkan aspek termodinamika saja (potensi puncak anodik, E.), terbukti antioksidan terlemah (Gbr.2B, C). Secara termodinamika, R adalah antioksidan yang sedikit lebih kuat. Menariknya, N-dan N plus dianggap dalam literatur sebagai antioksidan lemah, menunjukkan nilai E tertinggi secara termodinamika yang berarti bahwa mereka adalah agen pereduksi yang sangat kuat. Untuk kedua kelas flavonoid, bagian glikosida meningkatkan aktivitas antioksidan aglikon. Namun, parameter terkait kinetika (Gbr.2E, F), yaitu, arus anodik (I,.) dan kerapatan muatan (Q), mengungkapkan bahwa oksidasi N plus adalah proses yang lebih lambat dibandingkan dengan oksidasi Q dan R. Demikian pula , arus anodik (I) lebih rendah untuk N daripada untuk Q dan R, tetapi transfer muatan untuk senyawa ini mencapai nilai tertinggi.

Dalam kasus campuran, dua puncak anodik (1 dan 2) pada kurva voltametri terdeteksi seperti yang diharapkan untuk campuran dua komponen. Nilai potensial puncak anodik (E.) yang ditentukan menunjukkan bahwa puncak pertama yang diamati mencerminkan oksidasi flavonol, sedangkan puncak 2"d oksidasi flavanon (Bahan Tambahan-Gbr. S1). Dalam kebanyakan kasus, keberadaan komponen lain dalam suatu campuran mempengaruhi termodinamika dan/atau kinetika proses redoks dibandingkan dengan oksidasi senyawa murni.Misalnya, untuk QN-, nilai E., untuk puncak oksidasi pertama sama dengan potensial puncak anodik Q oksidasi. Namun, puncak anodik 2" yang sesuai dengan oksidasi-N dan potensi transisi ini lebih tinggi daripada potensi anodik N- murni (Gbr.2C). Situasi sebaliknya diamati untuk kinetika reaksi ini. I, dan Q dari 1s puncak anodik QN dekat dengan parameter kinetik oksidasi komponen murni (Gbr. 2E, F), sedangkan muatan yang ditukar selama langkah 2n ON-oksidasi jauh lebih rendah daripada untuk N-oksidasi (Gbr.2F). Efek termodinamika dan kinetik gabungan ini menghasilkan peningkatan AOP (Gbr. 2D) dari campuran ini, yang sesuai dengan hasil uji DPPH.

Penilaian sitotoksisitas.

Dampak dari aglikon flavonoid dipelajari (Q, N-), glikosida (R, N plus), dan campurannya (QN-, RN plus) pada pertumbuhan sel usus dinilai dengan uji MTT. Garis sel adenokarsinoma HT29 usus manusia dipilih sebagai model epitel saluran pencernaan, yaitu jaringan yang kontak langsung dengan bahan makanan yang tertelan seperti polifenol. Sel-sel diperlakukan dengan flavonoid individu dan campurannya pada konsentrasi fisiologis yang berpotensi terjadi dalam darah (0.01-1 uM)22-2 atau konsentrasi yang dapat dicapai dalam saluran pencernaan (10-100 uM) setelah konsumsi makanan25-27. Kurva dosis-respon untuk perawatan 6,24 dan 72 jam disajikan pada Gbr.3.

Senyawa individu tidak secara signifikan mempengaruhi pertumbuhan sel pada salah satu konsentrasi yang diselidiki, baik untuk pengobatan jangka pendek maupun jangka panjang. Pengecualian adalah konsentrasi tertinggi N-yang setelah 72 jam menghambat pertumbuhan sel hingga 75 persen dibandingkan dengan kontrol. Sebaliknya, campuran yang diselidiki (QN-, RN plus ) secara signifikan merangsang pertumbuhan sel dengan cara yang bergantung pada konsentrasi untuk semua waktu paparan yang diuji. Efek ini diamati pada konsentrasi rendah (0.01-1 uM) yang dapat dicapai dalam aliran darah dan bahkan lebih kuat pada konsentrasi yang lebih tinggi (10-100 uM) di mana sel epitel saluran pencernaan mungkin terkena. Hanya dalam kasus konsentrasi tertinggi QN-, setelah 72 jam pengobatan, stimulasi berhenti, mungkin karena efek penghambatan diamati dalam kondisi seperti itu untuk N-. Aktivitas antioksidan seluler. Efisiensi flavonoid murni dan campurannya dalam mendukung penghalang antioksidan endogen sel HT29 diverifikasi dengan bantuan uji CAA, Metode ini bergantung pada kemampuan sampel yang mengandung senyawa aktif redoks untuk menghambat atau meningkatkan oksidasi probe yang diserap. oleh sel menjadi bentuk fluoresennya. Atenuasi oksidasi probe, diamati sebagai pendinginan fluoresensi, adalah ukuran kapasitas reduksi antioksidan dalam sel (nilai CAA positif), sedangkan peningkatan oksidasi probe menunjukkan aktivitas pro-oksidatifnya (nilai CAA negatif)28 . Penentuan dilakukan untuk aglikon dan glikosida pada konsentrasi yang mencerminkan baik fisiologis — endogen — dan makanan yang diturunkan — eksogen — eksposur usus. Inkubasi dengan flavonoid dipelajari dilakukan untuk jangka waktu standar yang direkomendasikan 1 jam 18 untuk aglikon dan glikosida. Perlakuan berkepanjangan (3 dan 6 jam) yang ditujukan untuk memantau kinetika respons redoks dalam model seluler yang diterapkan hanya digunakan dalam kasus aglikon, karena dampaknya yang lebih menonjol pada aktivitas antioksidan seluler.

Flavanon yang diselidiki dan flavonol berbeda dalam dampaknya terhadap status redoks sel HT29. Dalam kasus aglikon individu, respons tergantung konsentrasi yang ditentukan diamati setelah paparan 1 jam. Namun, aktivitas antioksidan flavonol-Q meningkat dengan konsentrasi yang diterapkan, sementara dalam kasus flavanon-N-peningkatan bertahap dari efek pro-oksidatif diamati (Gbr. 4A). Ketergantungan dosis glikosida individu kurang jelas; hanya R pada konsentrasi tertinggi yang secara meyakinkan meningkatkan aktivitas antioksidan seluler (Gbr. 4A). Menariknya, kedua campuran menunjukkan aktivitas antioksidan yang ditingkatkan, tampaknya tidak dipengaruhi oleh efek pro-oksidatif yang terlihat untuk senyawa individu.

Gambar 4B menyajikan kinetika perubahan nilai CAA yang ditentukan setelah l,3 dan 6 jam pengobatan sel HT29 dengan aglikon. Untuk konsentrasi terendah 1 M）, pencocokan eksposur fisiologis, ketergantungan waktu tidak diamati baik untuk aglikon individu atau campurannya. Namun, pengaruh konsentrasi yang lebih tinggi pada nilai CAA jelas bergantung pada waktu. Paparan yang berkepanjangan menurunkan efek pro-oksidatif N- serta aktivitas antioksidan Q dan QN-.

Aglikon yang diselidiki menunjukkan aktivitas nutrigenomik yang berbeda, selain itu dimodifikasi oleh konsentrasi yang diterapkan pada sel.

Flavanon N-pada l M secara signifikan menurunkan ekspresi CCL5, CYGB, GTF2I, MT3 (p<0.05) as="" well="" as="" showing="" some="" tendency="" to="" down-regulate="" alox12="" and="" ucp2="" transcription=""><><0.09). the="" increased="" expression="" caused="" by="" n-was="" observed="" for="" the="" ncf2="" gene="" only=""><0.05). these="" genes,="" though="" in="" one="" or="" another="" way,="" related="" to="" cellular="" redox="" status,="" do="" not="" fall="" into="" any="" specific="" common="" pathway="" nor="" are="" involved="" in="" any="" coordinated="" process.="" the="" protein="" encoded="" by="" ccl5="" belongs="" to="" a="" group="" of="" inflammation-relevant="" genes,="" while="" the="" cytoglobin="" gene(cygb)functions="" as="" a="" tumor="" suppressor="" gene2930.="" gtf2i="" protein="" acts="" as="" a="" general="" transcription="" factor="" and="" is="" involved="" in="" the="" coordination="" of="" cell="" growth="" and="" division31.="" so,="" the="" other="" gene="" down-regulated="" by="" the="" n-at="" l="" um="" gene—mt3—may="" cooperate="" with="" it,="" because="" although="" it="" plays="" a="" role="" in="" zinc="" and="" copper="" homeostasis,="" it="" is="" also="" known="" as="" growth="" inhibition="" factor2.="" the="" enzyme="" encoded="" by="" alox12="" acts="" on="" different="" polyunsaturated="" fatty="" acid="" substrates="" to="" generate="" bioactive="" lipid="" mediators3.="" the="" protein="" coded="" by="" ucp2="" has="" been="" described="" as="" a="" mitochondrial="" scavenger="" of="" ros.="" the="" only="" up-regulated="" gene="" by="" n-at="" 1="" um="" was="" ncf2="" which="" encodes="" a="" cytosolic="" protein="" required="" for="" the="" activation="" of="" the="" nadph="" oxidase="" system="" responsible="" for="" superoxide="">

Flavanon ini diterapkan pada sel HT29 pada 10 uM mempengaruhi ekspresi 5 gen, yang juga diregulasi oleh dosis yang lebih rendah, yaitu: CCL5, CYGB.MT3(p<0.05)as well="" as="" gtf2i="" and=""><><0.09).additionally,in contrast="" to="" lower="" dose,="" n-at="" 10="" um="" showed="" tendency="" to="" decrease="" expression="" of=""><><0.09). the="" latter="" gene="" codes="" for="" a="" protein="" with="" superoxide="" dismutase="" activity,i.e.,="" the="" antioxidant="" enzyme="" catalyzing="">

dismutasi radikal superoksida menjadi hidrogen peroksida dan oksigen6. Sedikit peningkatan ekspresi yang disebabkan oleh N-pada 10uM hanya diamati untuk gen VIMP (0,05<><0.09)that is="" involved="" in="" the="" degradation="" process="" of="" misfolded="" endoplasmic="" reticulum(er)luminal="">

Artikel ini diambil dari www.nature.com/scientificreports