Analisis Integratif Omics Mengungkap Jalur Terkait Peradangan Mikrovaskular di Biopsi Allograft Ginjal

{0}}

Dalam transplantasi organ padat, microRNAs (miRNAs) telah muncul sebagai pemain kunci dalam regulasi fungsi sel allograft sebagai respons terhadap cedera. Untuk mendapatkan wawasan tentang peran miRNA dalam penolakan yang dimediasi antibodi, fenotipe penolakan yang secara histologis ditentukan oleh peradangan mikrovaskular,ginjal biopsi allograft menjadi sasaran miRNA tetapi juga profil messenger RNA (mRNA). Menggunakan proses seleksi multilangkah yang unik khusus untuk studi BIOMARGIN (kohor penemuan, N=86; kelompok seleksi, N=99; kelompok validasi, N=298), enam miRNA yang diekspresikan secara berbeda diidentifikasi secara konsisten: miR-139-5p (turun) dan miR-142-3p/150-5p/155-5p/{ {7}}p/223-3p (naik). Tingkat ekspresi mereka secara bertahap berkorelasi dengan intensitas peradangan mikrovaskular. Spesifisitas sel dari gen target miRNA diselidiki dengan mengintegrasikan target mRNA in vivo mereka dengan sekuensing RNA sel tunggal dari kohort biopsi allograft independen. Ekspresi miR-139-5p turunan endotel berkorelasi negatif dengan ekspresi gen terkait MHC. Sebaliknya, ekspresi berlebih miR-222-3p yang diturunkan dari epitel sangat terkait dengan homeostasis elektrolit ginjal yang terdegradasi dan jalur terkait kekebalan yang ditekan. Dalam sel imun, miR-150-5p mengatur aktivasi NF-kB dalam limfosit T sedangkan miR-155-5p mengatur penyambungan mRNA dalam sel penyaji antigen. Secara keseluruhan, omics terintegrasi memungkinkan kami untuk mengungkap jalur baru yang terlibat dalam peradangan mikrovaskular dan menyarankan bahwa modifikasi metabolisme dalam sel epitel tubulus terjadi sebagai konsekuensi penolakan yang dimediasi antibodi, di luar kompartemen endotel terdekat.

Kata kunci:transplantasi ginjal, microRNA, multi-omics, peradangan mikrovaskular, penolakan yang dimediasi antibodi

CISTANCHE AKAN MENINGKATKAN PENYAKIT GINJAL / GINJAL

PENGANTARDitransplantasi ginjal(KT), cedera aloimun biasanya dikotomi menjadi dua jenis penolakan alograf sesuai dengan distribusi spasial infiltrasi imun dan informasi tentang ada tidaknya antibodi anti-HLA spesifik donor. Diagnosis bergantung pada biopsi allograft dengan grading lesi histologis menurut klasifikasi Banff International Consensus(1). Tubulitis (lesi "t") dan peradangan interstisial (lesi "I") adalah ciri histologis dari penolakan yang dimediasi sel T (TCMR) dan terkait dengan sitotoksisitas langsung ke kompartemen tubulointerstisial. Penolakan yang dimediasi antibodi (ABMR) paling sering dikaitkan dengan antibodi anti-HLA yang bersirkulasi dengan peradangan yang menargetkan kompartemen mikrovaskular. Lesi histologis ABMR aktif termasuk adanya sel mononuklear di kapiler glomerulus (lesi "g") dan di kapiler peritubular (lesi "ptc"), yang secara gabungan disebut sebagai "peradangan mikrovaskular" (MVI). Pada ABMR aktif kronis, cedera jaringan kronis seperti glomerulopati transplantasi atau fibrosis intima arteri menambah lesi akut ini (1). Menggunakan agen imunosupresif bertarget sel T saat ini, TCMR dianggap memiliki dampak prognostik yang terbatas, sementara ABMR adalah penyebab utama kegagalan cangkok, yang berkaitan dengan kurangnya pendekatan terapeutik yang efektif (2).

Untuk menemukan terapi yang lebih baik untuk MVI dan ABMR, diperlukan pemahaman yang lebih baik tentang mekanisme biologis yang mendasari proses cedera ini. Teknologi omics throughput tinggi tampaknya sesuai untuk tujuan tersebut karena memungkinkan penyaringan yang tepat dan simultan dari ribuan gen, protein, dan metabolit (3). Interogasi transkriptome utuh dariginjalbiopsi allograft telah menunjukkan perubahan ekspresi gen mRNA yang mendalam pada sel residen yang terluka atau dalam populasi sel yang menginfiltrasi selama ABMR (4). Sementara itu, microRNAs (miRNAs) telah muncul sebagai pemain kunci dalam metabolisme sel, dengan mengatur messenger RNA (mRNA) pada tingkat pascatranskripsi. Faktanya, miRNA merevolusi pemahaman kita tentang penyetelan proses fisiologis tubuh yang terlibat dalam proliferasi, apoptosis, diferensiasi, dan perkembangan (5). Tidak mengherankan, ekspresi miRNA yang tidak teratur menghasilkan perkembangan banyak patologi termasukpenyakit ginjal(6). Karena profil ekspresi miRNA berbeda antara keadaan sakit dan sehat, banyak penelitian telah menganalisis miRNA baik sendiri atau dalam kombinasi dengan penanda lain yang lebih tradisional, tidak hanya untuk mendiagnosis penyakit dan memperkirakan perkembangan penyakit tetapi juga untuk merancang aplikasi terapeutik potensial (7).

Dalam konteks transplantasi organ padat, miRNA mungkin terlibat dalam penolakan melalui perannya dalam regulasi fungsi sel imun dan dalam respons sel residen allograft terhadap cedera (6,8). Beberapa penelitian telah menyelidiki miRNA allograft sebagai biomarker dan/atau efektor dalam pengaturan TCMR (8,9), tetapi sejauh ini tidak ada yang berfokus pada MVI dan ABMR.ginjalbiopsi allograft, untuk mendapatkan wawasan tentang peran miRNA dalam fenotipe penolakan yang merusak ini.

BAHAN DAN METODE Desain StudiStudi ini adalah bagian dari FP7-BIOMArkers dariginjalProgram penelitian Graft INjuries (BIOMARGIN, https://cordis.europa.eu/project/id/305499, ClinicalTrials.goy, nomor NCT02832661), dipimpin oleh konsorsium penelitian Eropa untuk mencari biomarker lesi imun allograft ditransplantasi ginjalpenerima, dengan nilai diagnostik dan/atau prognostik. BIOMARGIN adalah studi multisenter, prospektif, multifase, dilakukan pada empattransplantasi ginjalpusat di Eropa (Necker Hospital, Paris, Prancis; University Hospitals, Leuven, Belgia; Hannover Medical School, Hannover, Jerman; dan University Hospital, Limoges, Prancis). Sampel dikumpulkan secara prospektif pada saat skrining dan biopsi indikasi antara April 2013 dan Juni 2015 (Gambar IA). Semua transplantasi dilakukan dengan pencocokan silang sitotoksisitas yang bergantung pada komplemen negatif. Di empat pusat klinis ini, biopsi protokol dilakukan pada 3,12, dan kadang-kadang pada 24 bulan setelah transplantasi, menurut praktik pusat lokal, selain biopsi indikasi. Dewan peninjau institusional di setiap lokasi menyetujui penelitian, dan semua pasien memberikan persetujuan tertulis.

Kelompok StudiPenelitian ini dibagi menjadi tiga fase (Gambar 1A). Dalam fase penemuan kasus-kontrol pertama, sampel biopsi N=88 digunakan untuk analisis ekspresi miRNA global (N=754 miRNA, tidak termasuk miRNA normalisasi potensial) . Kami memilih sampel berdasarkan ketersediaan dan kriteria histologis (tidak termasuk kasus dengan diagnosis glomerulonefritis atau nefropati terkait poliomavirus dan kasus dengan diagnosis yang tidak jelas). Berdasarkan pembacaan biopsi lokal, seleksi pertama dibuat, yang selanjutnya disempurnakan melalui pembacaan sentral oleh sekelompok ahli patologi, independen dari pusat aslinya. Analisis statistik (lihat pemilihan miRNA) digunakan untuk memilih daftar miRNA yang diperluas, yang paling berbeda diekspresikan antara fenotipe histologis, yang kemudian dikuantifikasi pada fase ke-2.

Desain studi kasus-kontrol yang serupa digunakan untuk fase kedua (seleksi), di mana analisis ekspresi miRNA yang ditargetkan (N=143) dilakukan pada sampel biopsi N=99. Pipa statistik yang sama diterapkan untuk memilih daftar miRNA yang lebih terbatas, untuk selanjutnya diukur pada fase ke-3. Akhirnya, pada kohort ketiga (validasi), semua sampel dikumpulkan secara prospektif dan berurutan sesuai dengan protokol BIOMARGIN antara 24 Juni 2014, dan 2 Juli 2015, dan dengan cukupginjalkualitas biopsi allograft, dinilai untuk 38 miRNA yang dipilih sebagai hasil dari fase seleksi kedua. Dalam kelompok pengaturan kehidupan nyata ini, tidak ada seleksi yang dibuat berdasarkan histologi, demografi, waktu atau faktor apa pun selain ketersediaan sampel dan kriteria kontrol kualitas (kecukupan biopsi dan hasil RNA).

Seleksi miRNASebuah pipa statistik yang kuat secara khusus dikembangkan untuk studi BIOMARGIN di R(R Core Team(10), versi 1.0.44), sebagai perpanjangan dari paket biosignal R(1l). Secara singkat, dalam fase penemuan, kami melakukan strategi pemilihan fitur termasuk pendekatan univariat dan multivariat. Untuk seleksi univariat, kami menggunakan uji nonparametrik (uji Wilcoxon-Mann-Whitney) dan uji parametrik (Uji-t Siswa), dan kohort Discovery (BIOS-03-0023, BIOS-06-0238). Skor prediksi setiap transkrip miRNA di setiap model multivariat diintegrasikan untuk menghasilkan "skor multivariat". Dengan menggabungkan hasil analisis univariat dan multivariat ini, kami dapat memberi peringkat dan memilih subset kandidat miRNA untuk menjadi bagian dari daftar tambahan yang akan diukur selama fase berikutnya.Untuk analisis posthoc ini yang berfokus pada jalur VMI, ekspresi normal median dari setiap miRNA dibandingkan antara kasus dan kontrol menggunakan uji Wilcoxon di ketiga kohort. Kami mengontrol beberapa pengujian menggunakan metode tingkat penemuan palsu (FDR) Benjamini & Hochberg.

Penilaian KlinikopatologiSkor lesi histologis individu dinilai secara semi-kuantitatif sesuai dengan kriteria Banff 2019 (16). Istilah "peradangan mikrovaskular" (MVI) digunakan untuk merujuk pada tingkat kombinasi glomerulitis (g) dan/atau kapilaritis peritubular (ptc). Semua kasus ABMR memenuhi 2 kriteria pertama dari klasifikasi Banf 2015 atau Banff 2017 (histologis bukti cedera jaringan akut dan bukti interaksi antibodi saat ini/baru-baru ini dengan endotel vaskular), tetapi tidak semua memenuhi kriteria ketiga [bukti serologi antibodi spesifik donor (DSA) dan/atau pewarnaan CAd]. DSA setelah transplantasi ditentukan per praktik pusat lokal, dengan DSA positif didefinisikan sebagai antibodi anti-HLA serum spesifik donor yang dapat dideteksi dengan nilai intensitas fluoresensi rata-rata (MFI) 500 pada saat biopsi atau kapan pun sebelumnya.

Ekstraksi RNA Dari Sampel Biopsi untuk Profiling mRNA dan miRNAInti dua jarum diambil di masing-masingginjalbiopsi alograf. Satu digunakan untuk penilaian histologis konvensional dan setidaknya setengah dari yang lain segera disimpan dalam Reagen Jaringan Allprotect (Qiagen Benelux BV, Venlo, Belanda). Tabung Allprotect disimpan pada suhu 4C (minimal 24 jam hingga maksimum 72 jam) , dan kemudian disimpan pada-20 derajat derajat hingga ekstraksi RNA. Total RNA diisolasi dariginjalspesimen biopsi allograft menggunakan Allprep DNA/RNA/miRNA Universal Kit (Qiagen Benelux BV) pada instrumen QIAcube (Qiagen Benelux BV). Kuantitas (absorbansi pada 26{{20}} nm) dan kemurnian (rasio absorbansi pada 230,260, dan 280 nm) RNA yang diisolasi diukur menggunakan spektrofotometer NanoDrop ND-1000 (Thermo Fisher Scientific/Life Technologies Europe BV, Ghent, Belgia). Nomor integritas RNA (RIN) dievaluasi dengan Eukaryote nano/pico RNA Kit (Agilent Technologies Belgium NV, Diegem, Belgia) pada instrumen Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies BelgiumNV). Indeks kontrol kualitas tidak berbeda secara signifikan antara VMI dan No Grup MVI [RIN(rata-rata±SD):5.6±1.96vs5.4±1.97,P=0.66;260/280 rasio (rata-rata±SD)::1.87±0.06 vs 1.87±0.1l,P{{26 }}.40]. Untuk sampel RNA dengan RIN rendah (<6.5), we="" excluded="" samples="" with="" a="" 260/280=""><1.6. the="" extracted="" rna="" was="" subsequently="" split="" and="" stored="" at="" -80℃℃.half="" of="" the="" rna="" extract="" was="" used="" for="" mirna="" profiling="" and="" the="" other="" half="" for="" mrna="" transcriptomic="" analysis.="" the="" associated="" data="" are="" available="" from="" the="" gene="" expression="">

CISTANCHE AKAN MENINGKATKAN GINJAL / RENAL DIALYSIS

Profil miRNASpecific reverse transcription of 150ngof total RNA was performed using Megaplex"RT Primers Human Pool A v2.1(Step 1)or Custom RT Primers Human Pool (Step 2 and 3)(Thermo Fisher Scientific, Les Ulis, France), on a Veriti Thermal Cycler (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific). No complementary(c)DNA preamplification was required. miRNA expression was assessed by qPCR, using TaqManArray Cards (Applied Biosystems", Thermo Fisher Scientific), where the primers and probe of each miRNA were spottedanddried in duplicate wells of a microfluidic card. We used TaqMan"Array Human MicroRNA A +B Card Sets v3.0 for the discovery cohort(a two-card set enabling quantitation of 754 unselected human miRNAs)and Custom TaqManArray MicroRNA Cards for the selection and validation cohorts. Data analysis was performed by using Expression Suite software version 1.0.3. Assays with a cycle threshold(CT) values >35 dianggap tidak diungkapkan. RNU44 dan RNU48 menunjukkan ekspresi yang konsisten di semua sampel rata-rata (RNU44 plus RNU48) koefisien variasi adalah 3,73 persen di Kartu Array A dan 3,79 persen di Kartu Array B] dan digunakan sebagai gen rumah tangga untuk normalisasi data di semua sub-studi.

Analisis Transkriptomik mRNAAnalisis transkriptomik dilakukan dengan microarray seperti yang telah dijelaskan (17). Secara singkat, total RNA yang diekstraksi dari sampel biopsi pertama kali diamplifikasi dan dibiotinilasi menjadi RNA komplementer (cRNA) menggunakan Kit Reagen GeneChip 39 IVT PLUS (Affymetrix) dan dihibridisasi ke Affymetrix GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 Array( Affymetrix), yang terdiri dari 54.675 set probe yang mencakup seluruh genom. Kami menggunakan normalisasi Robust Multichip Average (RMA). Ekspresi normal median dari setiap mRNA dibandingkan antara kasus dan kontrol menggunakan uji Wilcoxon. Kami mengendalikan inflasi alfa risiko karena beberapa pengujian dengan menerapkan metode tingkat penemuan palsu (FDR) Benjamini & Hochberg. Data microarray ditangani sesuai dengan pedoman Minimum Information About Microarray Experiment.

Dalam Analisis SilikoPerangkat lunak Biological Interpretation Of Multiomics EXperiments (BIOMEX) digunakan untuk analisis diferensial data transkriptomik, menggunakan anotasi Ensembl ID (18). Analisis Jalur Kecerdikan (IPA, Build: 478438M Versi konten: 44691306, Qiagen) dan OMICSnet(19) digunakan untuk menentukan set gen yang diatur oleh miRNA yang dipilih. OMICSnet digunakan untuk melakukan analisis Gene Ontology dengan database jalur Reactome, menggunakan jalur lengkap (20). Pembangunan jaringan gen sepenuhnya tanpa pengawasan dan mengandalkan jumlah interaksi molekuler yang dilaporkan dari setiap gen tunggal dengan semua gen lain dalam jaringan. Gen yang menunjukkan jumlah interaksi tertinggi secara otomatis diposisikan di tengah jaringan, sedangkan gen dengan jumlah interaksi yang lebih rendah tersebar ke pinggiran. Asal seluler miRNA terpilih diselidiki menggunakan proyek Fantom5 (21), yang menyediakan analisis tutup ekspresi gen dalam sel dan jaringan manusia. Untuk analisis ekspresi miRNA, kami mempertimbangkan semuaginjal-sel struktural terkait dan semua sel hematopoietik yang bersirkulasi, tanpa seleksi lebih lanjut.

Analisis Data Sekuensing RNA Sel TunggalData sekuensing RNA sel tunggal manusia (siRNA-seq) yang diterbitkan sebelumnya dari dua biopsi ABMR dan empat referensi sehat yang sesuai dengan biopsi pengawasan transplantasi digunakan. Jumlah atau matriks mentah terkait diunduh masing-masing dari GEO(GSE145927, https://www.ncbi.nlm. nihgov/geo)(22)danGinjalProyek Pengobatan Presisi (KPMP, https://atlas.kpmp.org/repository). Matriks ekspresi gen mentah yang dihasilkan per sampel digabungkan dan dianalisis menggunakan paket Seurat V4 (23). Parameter yang diterapkan untuk membuat dan memfilter objek Seurat adalah sebagai berikut: penyertaan sel yang mengekspresikan antara 500 dan 10.000 gen yang terdeteksi dan kurang dari 25 persen transkrip mitokondria. Setelah difilter, semua objek diintegrasikan menggunakan alur kerja integrasi SCTransform di Seurat (24). Secara singkat, 3000 fitur digunakan untuk integrasi menggunakan fungsi PrepSCTIntegration, dan fungsi FindIntegrationAnchors digunakan untuk membatasi efek batch. Kumpulan data Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) lengkap dibuat menggunakan fungsi DimPlot dan 16 komponen utama teratas. Cluster dibangun menggunakan fungsi FindNeighbors dan FindClusters dengan resolusi 0,6. Identifikasi cluster dilakukan dengan menggunakan fungsi FeaturePlot dengan mengevaluasi ekspresi penanda tertentu di setiap cluster. Plot titik dihasilkan menggunakan fungsi plot DotPlot dan FeaturePlot, dengan jumlah yang dinormalisasi dalam uji RNA sebagai data input.

CISTANCHE AKAN MENINGKATKAN INFEKSI GINJAL/GINJAL

Analisis statistikKarakteristik pasien dan donor digambarkan dengan angka, persentase, dan frekuensi untuk variabel kategori. Kami melaporkan variabel kontinu menggunakan mean dan standar deviasi (SD) jika terdistribusi normal, median dan rentang interkuartil (IQR) untuk variabel dengan distribusi miring. Kami membandingkan karakteristik mereka menggunakan uji Fisher atau Wilcoxon bila perlu. Kami menggunakan uji Kruskal-Wallis untuk membandingkan median ekspresi miRNA menurut intensitas MVI, dan uji Spearman untuk analisis korelasi. Kami menganggap signifikansi statistik untuk nilai-P kurang dari 0.05. Kami menggunakan GraphPad Prism(versi 8; GraphPad Software, San Diego, CA) dan RStudio (versi 4.0.3)untuk analisis statistik dan penyajian data. Paket R berikut digunakan: peta panas3 (peta panas3_1.1.9)untuk analisis peta panas, paket fmsb(fmsb_0.7.0)dan skala (skala_1.1.1) untuk plot radar, ggplot2 (ggplot2_3.3.5)untuk grafik batang, dan complot(corrplot_0.90)untuk analisis matriks korelasi.

HASIL

Identifikasi Multilangkah miRNA terkait MVIBetween April 2013 and July 2015,646 patients enrolled in the BIOMARGIN study provided 716 indication or surveillance biopsies. Inadequate biopsies (N=49), biopsies with no paired sample for research use(N=135)or samples not passing molecular biology QC(N=49) were excluded, leaving 483 samples from 441 individuals available for this study (Figure 1A). Baseline and clinical characteristics of the study groups are provided in Supplementary Tables S1-3, and the histological characteristics of the biopsies are provided in Supplementary Tables S4-6. In the discovery cohort, a total of 27 patients met the MVI composite endpoint(MVI+), defined as clinical ABMR diagnosis and/or any level of MVI(g and/or ptc>{}). 59 pasien lainnya (MVI-) menunjukkan berbagai diagnosis yang terdiri dari penolakan yang dimediasi sel-T (TCMR, N=8), fibrosis interstisial dan atrofi tubulus (IFIA,N=20), dan biopsi normal (N{{6). }}), tetapi tidak MVI. Dari 754 kandidat miRNA, 18 miRNA diekspresikan secara berbeda antara grup MVI plus dan MVI- (Gambar 1B). Dalam kelompok seleksi, daftar terbatas 143 miRNA dihitung dalam 99 sampel. Dalam kohort seleksi ini, 14 miRNA diekspresikan secara berbeda antara kasus dengan (N=28) dan tanpa (N=71)ABMR (Gambar 1C). Akhirnya, dalam kohort trans-sectional terbesar, 38 miRNA dikuantifikasi dalam 298 sampel, di mana 12 miRNA diekspresikan secara berbeda antara ABMR(N=29)vs tanpa biopsi ABMR (N=269) (Gambar 1D ).

Identifikasi Konsisten dari 6 MiRNA Terkait MVI dan Korelasi dengan HistologiSelanjutnya, kami memotong 3 daftar miRNA yang diekspresikan secara berbeda dan mengidentifikasi 6 miRNA yang secara konsisten dikaitkan dengan MVI atau ABMR di 3 kohort independen (Gambar 2A). miR-142-3p,miR-150-5p,miR -155-5p, miR-222-3p dan miR-223-3p diekspresikan secara berlebihan dalam MVI/ABMR, sementara ekspresi miR-139-5p diturunkan. Plot radar (Gambar 2B) menampilkan untuk setiap langkah ekspresi diferensial antara kasus dan kontrol dari 6 miRNA dan mendukung kekokohan profil miRNA di tiga kohort independen. Selanjutnya, kami mempelajari bagaimana ekspresi 6 miRNA dikaitkan dengan lesi histologis individu di semua 483 biopsi allograft yang diambil bersama. Ekspresi 5 miRNA yang diatur ke atas secara bertahap meningkat dengan intensitas lesi MVI, sedangkan ekspresi miR-139-5p berkorelasi negatif (Gambar 2C).MiR-139-5p/142-3p/ 150-5p/155-5p/223-3p tidak hanya sangat terkait dengan fitur terkait ABMR (g, ptc, deposisi C4d), tetapi juga dengan lesi terkait TCMR (i, t ) dan lesi IFTA (ct, ci), menunjukkan keterlibatan mereka dalam proses inflamasi dan jaringan parut yang umum, non-ABMR-spesifik. Bergantian, beberapa kolinearitas intrinsik mungkin secara alami ada di antara lesi, mengakibatkan ketidakmampuan kami untuk mengidentifikasi spesifisitas sebenarnya untuk satu lesi. MiR-222-3p tidak berkorelasi dengan lesi histologis TCMR atau IFTA (Gambar 2D).

Integrasi Multi-Omic: Interaksi mRNA-miRNA di MVSelanjutnya, kami mengevaluasi gen yang diekspresikan secara berbeda antara kasus MVI plus dan MVI-, dalam set penemuan yang diterbitkan sebelumnya (25). Dari 54.675 probe, total 2755 gen yang diekspresikan secara berbeda (DEG) diidentifikasi antara MVI plus dan MVI-

kelompok, terdiri dari 1085 gen yang diatur ke bawah dan 1670 gen yang diatur ke atas (Gambar 3A). MRNA yang paling berbeda diekspresikan dalam sampel MVI plus adalah CXCL9 dan CXCL10, sejalan dengan laporan sebelumnya (17,26) bahwa gen ini paling banyak diekspresikan dalam ABMR. Selanjutnya, kami menggunakan IPA dan OMICSnet untuk mengidentifikasi in silico gen target yang diduga untuk setiap miRNA. Sebanyak 4504 mRNA diprediksi akan ditargetkan oleh setidaknya satu dari 6 miRNA. Kemudian, kami mengintegrasikan 4504 target yang diprediksi ini dengan DEG dalam biopsi allograft. Analisis miRNA/mRNA terintegrasi mengidentifikasi 61 DEG yang ditargetkan oleh miR-139-5p yang meningkat secara signifikan pada MVI plus biopsi. Itu juga mengidentifikasi 28, 58,52,43 dan 27 DEG menurun secara signifikan pada MVI plus biopsi yang masing-masing ditargetkan oleh miR-142-3p, miR-150-5p, miR-155-5p, miR{ {22}}p, dan miR-223-3p (Gambar 3B).

Asal Seluler dari miRNA Terkait MVAsal seluler dari enam miRNA dicirikan dalam berbagaiginjalsubtipe sel dan sel hematopoietik menggunakan atlas miRNA tersedia online [database Fantom (27)]. Pengelompokan tanpa pengawasan didiskriminasiginjalmiRNA turunan sel dari miRNA turunan sel imun (Gambar 4A). Ini juga mengungkapkan satu atau dua tipe sel dominan untuk setiap miRNA. MiR-139-5p tampaknya terutama diekspresikan oleh sel endotel glomerulus (EC). MiR-222-3p, meskipun ekspresinya tidak berkorelasi dengan peradangan tubular (lesi Banff "t", Gambar 2D), terutama terkait denganginjalsel epitel. Empat miRNA yang tersisa terutama diekspresikan dalam sel mononuklear darah perifer (PBMC) atau granulosit, dengan miR-142-3p diperkaya dalam sel NK dan monosit, miR-150-5p dalam sel CD4 plus dan CD8 plus T,miR -155-5p di CD19 plus sel B dan makrofag, dan miR-223-3p di neutrofil.

Sekuensing RNA Sel Tunggal Mengidentifikasi Semua Sel Ginjal dan Sel Kekebalan Infiltrasi Untuk mengkarakterisasi peran potensial dari setiap miRNA terkait MVI, kami menganalisis data sc-RNAseq yang tersedia untuk umum dari duaginjalbiopsi allograft dengan ABMR dan skor MVI tinggi (g2, ptc3) (22). Kumpulan data ini diintegrasikan dengan 4 biopsi referensi sehat tanpa MVI. Setelah kontrol kualitas dan penyaringan, 31545 sel terdeteksi dan pengelompokan tanpa pengawasan mengungkapkan 12 kluster (Gambar 4B). Kami menggunakan penanda yang mapan (28) untuk mengidentifikasi semua subtipe sel residen dan infiltrasi utama dan memberi label pada mereka (Gambar Tambahan S2). Selanjutnya, kami fokus pada populasi sel dari mana enam miRNA kami dianggap berasal. Dalam tujuan ini, kami mengelompokkan sel menjadi 4 kelompok utama yang sesuai dengan endotelium, epitel, limfosit, dan APC (Gambar 4C). Sejalan dengan analisis sebelumnya dari data ini (22), baik populasi sel neutrofilik maupun NK tidak terdeteksi dalam set data sc-RNASeg.

miR-139-5p Mengontrol Aktivasi EC dan Jalur Presentasi Antigen Selama MVIMiR-139-5p adalah satu-satunya miRNA yang diturunkan regulasi dalam penelitian kami dalam kasus dengan MVI/ABMR (Gambar 2A) dan ditemukan terutama berasal dari EC glomerulus (Gambar4A). Enam puluh satu dari gen targetnya dikonfirmasi untuk diregulasi dalam microarray massal dari kasus MVI plus (Gambar 3B) dan ekspresinya diselidiki lebih lanjut pada resolusi sel tunggal dalam 3 subkluster EC yang diidentifikasi sebelumnya (Gambar 4B, C). Seperti yang digambarkan pada Gambar 5A, ECcluster yang diaktifkan hanya dapat dideteksi dalam sampel MVI plus. Selain itu, setengah dari 61 gen (N=30) secara konsisten meningkat pada sc-RNAseq MVI plus biopsi, terlepas dari tiga subkluster EC. Di antara mereka, GBP5 adalah gen yang paling meningkat. Selanjutnya, analisis ontologi gen menggunakan 30 transkrip turunan endotel ini mengidentifikasi UBE2D1 dan YWHAG sebagai pemain sentral dalam jaringan gen (Gambar 5B). Lebih khusus lagi, jalur terkait kekebalan dan jalur pemrosesan dan presentasi antigen yang dimediasi histokompatibilitas utama (MHC) diperkaya (Gambar 5C). Analisis pseudotime dilakukan untuk mengkarakterisasi perubahan ekspresi gen dengan lebih baik selama aktivasi EC, Lintasan keadaan lintas sel (Gambar 5D, E), UBE2D1, YWHAG, dan GBP5 terus meningkat selama aktivasi endotel terkait MVI. Lintasan yang sangat mirip ditemukan untuk gen terkait MHC HLA-A,-B dan -DRA tetapi juga untuk aktivasi endotel bonafide dan penanda peradangan seperti VCAM1, CXCL9, dan CXCL10, menunjukkan bahwa semua gen ini secara bersamaan diekspresikan selama aktivasi endotel. Secara keseluruhan, hasil ini menunjukkan bahwa miR-139-5p menurun selama lesi MV dan tidak lagi menekan jalur presentasi antigen MHC pada EC yang diaktifkan.

miR-222-3p Merusak KeduanyaginjalJalur Fisiologis dan Terkait Imun dalam Sel Epitel Selama MVI Selanjutnya, kami berfokus pada miR-222-3p, miRNA yang diregulasi dalam sampel MVI denganginjalasal sel epitel dan korelasi yang lebih eksklusif dengan lesi histologis terkait ABMR (Gambar 2A, D,4A). Dalam jaringan allograft massal, ekspresi 43 gen targetnya diturunkan regulasinya (Gambar 3B), dan selanjutnya dievaluasi pada satu- resolusi sel dalam perbedaanginjalpopulasi epitel yang kami identifikasi sebelumnya (Gambar 4B, C). Penurunan besar-besaran 41 dari 43 (95 persen) gen ini di semua yang diidentifikasiginjalkluster sel epitel menunjukkan pembungkaman gen

profil di VMI (Gambar 6A). Menariknya, 4 gen yang terlibat dalamginjaljalur fisiologis (ERBB4, ATPIB1, TIMM50, dan KIF3B), tetapi juga gen terkait kekebalan (TRAPI dan PEBPI) diidentifikasi sebagai gen sentral dalam jaringan (Gambar 6B). Ontologi gen dari 43 gen mengungkapkan pengayaan dalam jalur pensinyalan ErbB tetapi juga dalam jalur terkait kekebalan dan respons sitokin (Gambar 6C) dan ekspresi ERBB4 lebih lanjut dikonfirmasi di semuaginjalsel (Gambar 6D). Secara keseluruhan, hasil ini menunjukkan bahwa selama VMI, tingkat tinggi-222-3p inginjalsel epitel dikaitkan dengan represi kuat gen yang terlibat baik dalamginjaljalur homeostasis elektrolit dan jalur terkait imun di epitel.

miR-150-5p Mengatur Aktivasi NF-kB dalam Limfosit T Selama MVI Demikian pula, kami menyelidiki peran pengaturan (meningkatkan) miR-150-5p selama MVI di kluster sel-T, di mana ia paling dominan diekspresikan (Gambar 4A). Kami memplot 58 penurunan DEG terkait MVI yang diidentifikasi dalam sampel biopsi allograft massal (Gambar 3B) dan kami menghadapinya dengan ekspresi gen dalam kluster sel T sc-RNAseq (Gambar 7A). Proporsi gen yang ditargetkan oleh miR150-5p dan secara khusus diekspresikan dalam sel-T selama MVI ternyata sangat rendah (15/58,25,9 persen ) yang menunjukkan bahwa penurunan global gen-gen ini in vivo tidak semata-mata karena kompartemen limfosit T. Namun demikian, dari daftar 15 gen yang sangat dipilih ini dan menggunakan platform OMICSnet, kami membangun jaringan gen (Gambar 7B) dan melakukan analisis ontologi gen (Gambar 7C). Kami mengamati bahwa ekspresi berlebih miR-150-5p dikaitkan dengan NF Regulasi -KB dalam limfosit T selama MVI.

miR-155-5p Mengatur Penyambungan mRNA di APC Selama MV Akhirnya, strategi yang sama persis diterapkan untuk gen target 52miR-155-5p, yang diekspresikan selama MVI (Gambar 3B). Berbeda dengan miR-150-5p dalam limfosit T, kami mengamati bahwa hampir dua pertiga dari gen target miR-155-5p secara konsisten menurun dalam cluster APC sc-RNAseq (31/52,59,6 persen, Gambar 8A). Analisis jaringan gen mengungkapkan bahwa AIFMI dan CIAO1 adalah gen sentral (Gambar 8B). Selain itu, ontologi gen mengungkapkan pengayaan yang kuat dalam jalur yang terkait dengan penyambungan mRNA (Gambar 8C).

DISKUSIDengan desainnya yang unik, studi BIOMARGIN adalah kerangka kerja khas untuk integrasi data multi-omik. Memang, saluran pipa yang sangat kuat digunakan dalam kelompok penemuan, seleksi, dan validasi yang mencakup sejumlah besar pasien dari pusat transplantasi yang berbeda. Dalam tiga kohort independen, kami secara bersamaan mengamati dan mengkonfirmasi profil ekspresi aneh 6 miRNA selama MVI: miR-139-5p menurun sedangkan miR-142-3p/150-5p/{{5} }p/222-3p dan miR-223-3p ditingkatkan. Yang penting, tingkat masing-masing 6 miRNA ini berkorelasi dengan keparahan MVI, menunjukkan mekanisme regulasi yang bergantung pada dosis. Kami selanjutnya menggunakan platform silikon untuk menyelidiki setiap asal seluler miRNA. Yang mengejutkan, dua kelompok miRNA yang berbeda diamati: yang pertama berasal dari sel imun yang menginfiltrasi dan yang kedua lebih spesifik untuk residen.ginjalsel. Kemudian, baik miRNA dan mRNA diukur dalam kumpulan sampel biopsi yang sama, memungkinkan analisis terintegrasi dari mRNA/miRNA yang diekspresikan secara in vivo dan divalidasi secara berbeda yang terkait dengan MVI. Akhirnya, setelah menjelaskan asosiasi mRNA / miRNA pada resolusi jaringan massal, kami mengkonfirmasi interaksi mRNA / miRNA pada resolusi sel tunggal untuk empat dari 6 miRNA yang diidentifikasi.

Menariknya, miR-139-5p adalah satu-satunya miRNA yang berkorelasi negatif dengan lesi MVI. Ini berasal terutama dari EC dan telah dilaporkan mengatur gen terkait MHC. Di antara gen targetnya, UBE2D1 sangat diregulasi selama aktivasi endotel yang terkait dengan MVI. Keluarga UBE2D adalah keluarga enzim pengkonjugasi ubiquitin E2 dalam sistem ubiquitin-proteasome (29, 30) dan UBeD1 terbukti meningkatkan ubiquitinasi Maret-I, yang mengarah pada peningkatan regulasi protein MHC kelas II (31). Selain itu, GBP5 adalah EC terinaktivasi gen yang paling terwakili selama MVI, yang sejalan dengan laporan terbaru kami yang menunjukkan bahwa GBP5 sangat diregulasi dalam biopsi ABMR (17) tetapi juga dalam sampel darah (32). Menariknya, ekspresi GBP5 terbukti dapat diinduksi oleh interferon tipe II dalam sel endotel mikrovaskuler rahim manusia, bersama dengan CXCL9 dan CXCL10(33). Peran awal kedua kemokin proinflamasi ini dalam proses penolakan akut telah didokumentasikan dengan baik dan kadarnya dalam urin diusulkan untuk memantau risiko penolakan akut dalam pengawasan rutin penerima transplantasi ginjal (34). Target miR-139-5p lainnya adalah kode YWHAG.YWHAG untuk keluarga protein HLA-F dan telah dijelaskan sebagai diekspresikan secara berbeda selama proses profibrotik aktif pada nefropati diabetik (35). Kemungkinan peran miR-139-5p dalam fibrosis, jalur umum terakhir setelah peradangan, semakin relevan bahwa IFTA baru-baru ini dimasukkan dalam skor komposit untuk memprediksi kelangsungan hidup allograft ginjal setelah ABMR(36). Secara keseluruhan, hasil ini menunjukkan bahwa miR-139-5p tidak lagi menekan ekspresi antigen MCH pada permukaan Anethum selama MVI dan dapat berpartisipasi dalam proses kemoattraksi dan fibrosis, tetapi mekanisme ini tetap merupakan ekspresi yang dikonfirmasi secara eksperimental pada permukaan endotelium selama MVI dan dapat berpartisipasi dalam proses kemoattraksi dan fibrosis, tetapi mekanisme ini masih harus dikonfirmasi secara eksperimental.

Keduaginjal-miRNA turunan yang kami identifikasi adalah miR-222- 3p, yang ekspresinya ditemukan lebih spesifik pada lesi MVI: ini terkait dengan skor g dan PTC serta deposisi C4d, tetapi tidak dengan lesi i atau t. Namun, itu terutama berasal dari sel epitel. Setelah integrasi multi-omik pada resolusi sel, kami menentukan bahwa miR-222-3p terutama menekan pensinyalan ErbB yang sangat penting untuk fungsi seluler mendasar, seperti proliferasi, migrasi, pertumbuhan, dan diferensiasi (37). Dalam biologi manusia, pensinyalan ErbB fisiologis diperlukan untukginjalhomeostasis elektrolit dan pemeliharaan integritas ginjal (38). Hasil kami juga mengidentifikasi ADAM22, NRG1, ZNF91 sebagai gen terkait pensinyalan ErbB yang terutama ditekan dalam epitel selama MVI. Gen lain yang penting untuk fisiologi ginjal seperti ATP1B1 dan KIF3B juga ditekan di epitel ginjal oleh miR-222-3p selama MVI. Sebelumnya, Baker et al. menunjukkan bahwa ATP1B1 (subunit b1 dari Na plus /K plus -ATPase) mendorongginjalreabsorbsi natrium di tubulus (39). Selain itu, Aguado-Fraile et al. telah mengidentifikasi Kinesin Family Member 3B (KIF3B) sebagai terlibat dalam perdagangan sel dalam sel tubulus proksimal tikus. KIF3B muncul sebagai mediator kunci dari respon sel tubulus epitel proksimal terhadap iskemia/reperfusi dengan aplikasi potensial padaginjalmanajemen kerusakan iskemik (40). Dengan demikian kita dapat berspekulasi bahwa miR-222-3p menekan jalur fisiologis penting selama MVI di epitel. Selain itu, jalur terkait kekebalan juga diatur oleh ekspresi berlebih miR-222-3p: gen penting seperti TRAP1 dan PEBP1 dihambat secara total dalam sampel dengan MVI yang kuat. Menariknya, TRAP1 terbukti memperbaikiginjalfifibrosis tubulointerstitial pada tikus dengan obstruksi ureter unilateral dengan melindungiginjalmitokondria sel epitel tubulus (41). Selanjutnya, PEBP1 memberikan efek anti-inflamasi melalui penghambatan jalur MAPK dan NF-kB di bawah kondisi homeostatik/basal (42). Diginjalepitel, sebuah studi oleh Marko et al. elegan menunjukkan bahwa aktivasi NF-kB pasca-iskemik memperburuk cedera tubular dan memperburuk peradangan (43). Di tangan kami, PEBP1 sepenuhnya ditekan oleh miR-222-3p, menunjukkan bahwa jalur NF kB dilepaskan selama MVI. Secara keseluruhan, hasil ini menunjukkan bahwa biologi epitel terganggu selama MVI danginjalsel epitel secara aktif merespon cedera MVI sementara keterlibatan jaringan ini dalam MVI jarang ditangani. Temuan molekuler ini mungkin memberi penerangan baru pada lesi cedera tubular akut, kriteria ABMR yang mapan, namun lama diabaikan. Selain itu, telah ditunjukkan bahwa sel epitel dapat mensekresi miR-222-3p eksosom dan menginduksi fenotipe M2 dalam makrofag (44). Sementara itu, Li et al. baru-baru ini melaporkan bahwa makrofag M2 mengekspresikan miR-155 secara berlebihan dan mengirimkan miRNA ini di lingkungan mikro, juga melalui sekresi eksosom. Pada transplantasi ginjal, miR-155 meningkat pada berbagai kondisi (IFTA, rejeksi akut dan TCMR) dan dalam cairan atau jaringan tubuh (45). Menariknya, miR- 155 dapat mempromosikan transisi epitel-mesenkimal melalui penargetan RASSF4 dalam sel epitel (46). Crosstalk berbasis miRNA ini antara makrofag danginjalsel epitel masih harus dinilai dalamtransplantasi ginjaldan lebih khusus lagi dalam konteks MVI. Sejalan dengan temuan ini, kami mengamati bahwa miR-155-5p terutama diekspresikan oleh APC yang mencakup monosit dan makrofag. Dalam subset khusus ini, ontologi gen target-miR- 155-5p mengungkapkan pengayaan dalam jalur penyambungan premRNA. Menariknya, Janssen et al. melaporkan bahwa peradangan paru-paru menginduksi jalur penyambungan pra-mRNA dalam makrofag alveolar. Selain itu, aktivasi penyambungan pra-mRNA berbeda pada makrofag residen jaringan dibandingkan dengan makrofag turunan monosit (direkrut darah). Perubahan metabolisme inti dalam makrofag yang direkrut dilaporkan, dengan peningkatan penghabisan melalui glikolisis dan penurunan penghabisan melalui siklus asam trikarboksilat (siklus TCA, yaitu siklus Krebs) (47). Mengenai miR-150-5p, kami menemukan bahwa ekspresi berlebihnya selama MVI dikaitkan dengan jalur NF-kB dalam kluster limfosit yang mencakup sel NKT bawaan dan sel T adaptif. Menariknya, miR-150-5p sangat penting untuk menghasilkan sel NK yang matang dan fungsional (48) dan sel CD8 plus T yang kekurangan miR-150-5p dilaporkan kurang sitotoksik (49). Selain itu, sel T CD8 juga dapat mensekresi miR-150-5p dalam eksosom (50) yang pada gilirannya dapat meningkatkan aktivasi fibroblas dalam sel epitel tubulus dan selanjutnyaginjalfifibrosis seperti yang disarankan oleh laporan terbaru (51, 52).

CISTANCHE AKAN MENINGKATKAN FUNGSI GINJAL/GINjal

Penelitian kami memiliki beberapa keterbatasan. Kami memfokuskan penelitian kami pada 6 miRNA, yang secara konsisten diidentifikasi di seluruh desain multilangkah kami. Namun, kami melanjutkan dengan pemilihan miRNA langkah demi langkah, dengan hanya sebagian kecil dari semua miRNA yang diketahui yang dihitung dalam kelompok validasi. Jalur statistik untuk pemilihan miRNA bergantung pada desain awal BIOMARGIN, cocok untuk mengidentifikasi biomarker diagnostik untuk beberapa titik akhir (ABMR, tetapi juga TCMR dan IFTA). Oleh karena itu, meskipun meningkat secara signifikan dalam kelompok penemuan dan pemilihan (Gambar 2A), miR-146a tidak dihitung dalam kelompok validasi. Dengan demikian, miR-146a secara de facto dikeluarkan dari proses seleksi kami, meskipun literatur menunjukkan peran dalam iskemia/reperfusi dalam transplantasi ginjal (53) dan dalam kontrol respons alloimun yang dimediasi Treg (54). Selain itu, kami tidak dapat mengecualikan bahwa ukuran sampel yang lebih kuat akan menghasilkan lebih banyak miRNA, seperti miR-138 (turun) dan miR-511 (naik) yang diekspresikan secara berbeda dalam kasus ABMR dari kohort seleksi dan menunjukkan tren ke arah yang sama dalam kelompok penemuan. Selain itu, kami tidak melakukan analisis sc-RNAseq pada sampel biopsi kami sendiri tetapi menggunakan dataset sc-RNAseq yang tersedia online. Pada saat desain studi dan pengumpulan sampel biopsi, teknologi scRNAseq memang belum tersedia, dan kebutuhan sampel yang baru dikumpulkan tidak memungkinkan penggunaan retrospektif sampel beku atau sampel parafin. Demikian pula, profil mRNA dilakukan menggunakan microarrays, teknologi benchmark pada saat itu yang kini telah mengungguli RNA-seq generasi berikutnya. Penggunaan dataset sc-RNAseq yang tersedia secara online membatasi kemampuan kami untuk melaporkan karakteristik demografis dasar pasien. Informasi yang hilang ini dapat menimbulkan kekhawatiran mengenai keterwakilan kelompok populasi. Selain itu, kami tidak mengontrol aspek teknis apa pun dari pengurutan. Oleh karena itu pada resolusi yang dipilih, analisis sc-RNAseq kami tidak mendeteksi klaster neutrofil atau sel NK dalam sampel ini. Oleh karena itu, analisis hilir miR-142-3p dan miR-223-3p kami terbatas untuk membangun jaringan dan ontologi gen target masing-masing (Gambar Tambahan S2) dan tidak memungkinkan eksplorasi resolusi sel tunggal. Namun, jaringan gen dan ontologi dari 27 gen target miR-223-3p mengungkapkan pengayaan siklus TCA (Gambar Tambahan S2) bersama dengan pensinyalan ERBB. Dengan demikian kita dapat berspekulasi bahwa baik miR-155-5p dalam monosit dan miR-223-3p dalam neutrofil berperan dalam metabolisme dan respons inflamasi yang dilakukan oleh sel-sel ini selama MVI. Selain itu, miR-142-3p telah terbukti meningkat pada penolakan allograft ginjal (9, 55, 56), tetapi sejauh ini tidak secara khusus dikaitkan dengan ABMR. Keterbatasan lain dari penelitian kami adalah bahwa perubahan ekspresi gen spesifik dalam sel infiltrasi langka mungkin tertutup dalam analisis ekspresi gen massal. Studi lebih lanjut termasuk lebih banyak sampel dengan demikian diperlukan untuk memungkinkan penyelidikan yang tepat dari semua, bahkan subtipe sel yang langka, tetapi saat ini dibatasi oleh biaya teknik yang relatif tinggi.

Sebagai kesimpulan, kami menyelidiki di sini jalur molekuler yang terkait dengan MVI, cedera histologis utama yang terkait dengan ABMR. Pendekatan omics terintegrasi yang digunakan memungkinkan kami untuk mengungkap jalur baru yang terlibat dalam MVI dan menunjukkan bahwa modifikasi metabolisme epitel tubular terjadi sebagai konsekuensi dari ABMR, di luar kompartemen endotel terdekat. Studi kami menggambarkan potensi besar multi-omics untuk mengungkap mekanisme penyakit dan membuka jalan bagi penyelidikan baru untuk lebih menjelaskan pembicaraan silang antaraginjalsubset sel residen dan allograft-infiltrating.