Metabolisme In Vitro Dan In Vivo Ekstrak Cistanche Tubulosa pada Tikus Depresi yang Diinduksi Stres Normal Dan Kronis yang Tidak Dapat Diprediksi

Kontak: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:{0}}

Yang Li, dkk

ABSTRAK

Cistanche tubulosa, salah satu spesies Cistanches Herba, baru-baru ini dipastikan memiliki khasiat antidepresan inchronic unpredictable stress (CUS) tikus dengan mengembalikan homeostasis mikrobiota usus. Dalam makalah ini, kami bertujuan untuk mengeksplorasi profil metabolisme C. tubulosa pada tikus model depresi normal dan yang diinduksi CUS secara in vitro dan in vivo. Menggunakan UPLC-Q-TOF-MS, metabolisme gastrointestinal in vitro dariEkstrak Cistanche tubulosa(CTE) dievaluasi pada tikus normal dan tikus CUS. Pada saat yang sama, metabolisme in vivo CTE(ekstrak Cistanche tubulosa)pada tikus normal dan tikus depresi juga diteliti pada urin dan feses tikus. Sebanyak 20 dan 26 metabolit dikarakterisasi dari in vitro dan in vivometabolisme pada tikus normal dan CUS, masing-masing. CTE(ekstrak Cistanche tubulosa)dimetabolisme menjadi aglikon dan produk degradasi glikosida fenilethanoid (PhGs) dan glikosida iridoid baik oleh mikrobiota usus tikus normal atau tertekan secara in vitro. Metabolit fase II dari aglikon dan produk degradasi PhGs dan glikosida iridoid adalah metabolit utama dalam urin dan feses tikus. Selain itu, kemampuan metabolisme untuk menghasilkan glikosida dan aglikon sekunder pada mikrobiota usus tikus yang depresi jauh lebih lemah daripada mikrobiota usus tikus normal, yang dikaitkan dengan hidrolase glikosida yang tidak teratur yang diproduksi oleh mikrobiota usus pada tikus yang tertekan CUS. Hasil penelitian ini meletakkan dasar untuk memahami proses metabolisme dan mekanisme terapeutik dari sifat antidepresan CTE.

Kata kunci: Cistanche tubulosa, Depresi Metabolisme, In vitro, In vivo, Mikrobiota usus

1. Perkenalan

Cistanches Herba secara resmi tercatat sebagai batang sukulen kering dari Cistanche deserticola (YC Ma) dan C. tubulosa (Schrenk), yang digunakan untuk mengobati defisiensi ginjal, impotensi, infertilitas wanita, morbidleucorrhea, metrorrhagia yang banyak, dan konstipasi senilis [1]. Studi farmakologi modern menunjukkan bahwa Cistanches Herba memiliki berbagai aktivitas biologis seperti anti-neurodegenerasi, imunoregulasi, dan anti-inflamasi [2,3]. Investigasi kami sebelumnya telah memverifikasi bahwaEkstrak Cistanche tubulosa(CTE), yang terdiri dari 48,6 persen glikosida fenilethanoid (PhGs), 6,9 persen glikosida iridoid, dan 20,0 persen total sakarida, dapat secara nyata mengurangi gejala depresi dari tikus depresi yang diinduksi stres kronis (CUS) oleh memulihkan homeostasis mikrobiota usus [4]. Studi terbaru menunjukkan bahwa perubahan komposisi mikrobiota usus dikaitkan dengan perkembangan dan perkembangan depresi [5,6]. Kelimpahan relatif dari genera mikroba sangat terganggu pada tikus model depresi CUS dibandingkan dengan kontrol normal [7]. Pada pasien depresi, keragaman dan kekayaan mikrobiota usus juga berubah secara signifikan [8]. Selain itu, berbagai senyawa termasuk glikosida fenilethanoid (PhGs) dan glikosida iridoid dianggap sebagai konstituen utama Cistanches Herba [2,3], yang mudah dimetabolisme menjadi glikosida sekunder dan aglikon termasuk hidroksitirosol (HT), 3,4-dihidroksifenetil glikosida, asam geniposidat terdeglikosilasi, dll. oleh mikrobiota usus manusia. Metabolit ini lebih mudah diserap melalui usus dan melakukan aktivitas biologis yang konsisten dengan komponen prototipe[9-11]. Dengan demikian, kami percaya bahwa selama terjadinya dan perkembangan depresi, gangguan struktur mikroflora usus pasti akan mempengaruhi metabolisme obat-obatan tradisional Cina (TCM) oral di saluran pencernaan, selain mempengaruhi keadaan fisiologis inang. Sebagian besar data metabolisme Cistanches Herba yang ada berasal dari studi metabolisme pada hewan sehat [12-15]. Oleh karena itu, akan lebih signifikan secara klinis untuk menyelidiki profil metabolik CTE(ekstrak Cistanche tubulosa)dalam keadaan patologis dalam menjelaskan komponen bioaktifnya dan memahami mekanisme aksi untuk kemanjuran anti-depresinya.

Dalam penelitian ini, kami bertujuan untuk mengkarakterisasi profil metabolik CTE(ekstrak Cistanche tubulosa)pada tikus model depresi yang sehat dan diinduksi CUS oleh spektrometri massa waktu terbang quadrupole kromatografi cair ultra-kinerja (UPLC-Q-TOF-MS). Jus lambung, cairan usus, dan mikrobiota tikus patologis normal dan depresi telah digunakan untuk mensimulasikan proses metabolisme CTE(ekstrak Cistanche tubulosa)dalam saluran pencernaan in vitro, secara independen dan berurutan. Metabolit in vivo juga dijelaskan setelah pemberian oral CTE(ekstrak Cistanche tubulosa)pada tikus normal dan CUS. Studi ini memberikan wawasan baru tentang metabolisme dan metabolit aktif CTE(ekstrak Cistanche tubulosa)untuk depresi.

2. Bahan dan metode

2.1. Bahan

Batang kering C. tubulosa dikumpulkan dari Kabupaten Hetian (Xinjiang, Cina). Sampel spesimen voucher diautentikasi oleh Prof. Xiaobo Li dan disimpan di herbarium School ofPharmacy, Shanghai Jiao Tong University (Shanghai, China). Metode ekstraksi digunakan sebagaimana ditentukan dalam publikasi kami sebelumnya [4]. ItuEkstrak Cistanche tubulosa(CTE) sampel disimpan pada suhu 4 derajat dan dilarutkan kembali dengan air steril sebelum digunakan. Solusi air steril dari CTE(ekstrak Cistanche tubulosa)sampel kemudian disaring melalui membran 0.22 m, dan filtratnya dikumpulkan dalam tabung steril.

Echincoside disediakan oleh laboratorium Dr. Pengfei Tu, Universitas Peking (Beijing, Cina). Acteoside, isoacteoside, 2′-acetylacteoside, dan cistanoside A dibeli dari Sichuan Weikeqi BiologicalTechnology Co., Ltd. (Chengdu, Cina). Hidroksitirosol, asam caffeic, 3,4-asam dihidroksibenzenapropionat, 3-asam hidroksifenilpropionat, dan 3-asam fenilpropionat dibeli dari Aladdin IndustrialInc. (Shanghai, Tiongkok). Kemurnian setiap komponen ditentukan menjadi > 95 persen dengan HPLC-UV. Asetonitril tingkat HPLC dibeli dari Merck (Darmstadt, Jerman). Air deionisasi dibuat dari air suling menggunakan sistem pemurnian air Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, USA). Semua reagen dan bahan kimia lain yang digunakan adalah kelas analitis.

2.2. Eksperimen hewan

Tikus Sprague-Dawley jantan (200 ± 20 g) diperoleh dari Perusahaan Teknologi Hewan Laboratorium Sungai Vital Beijing (Beijing, Cina), dan ditempatkan di Pusat Hewan Laboratorium Universitas JiaoTong Shanghai (Shanghai, Cina). Hewan-hewan itu ditempatkan dalam kelompok di bawah suhu kamar yang dikendalikan (25 ± 2 derajat, 55 ± 10 persen kelembaban relatif) dengan siklus terang-gelap 12:12 jam. Tikus diizinkan akses gratis ke makanan tikus laboratorium reguler dan air selama 1 minggu. Fasilitas dan protokol hewan telah disetujui oleh Komite Etika Hewan Universitas Shanghai Jiao Tong (Shanghai, Cina).

Setelah satu minggu aklimatisasi, dua belas tikus naif secara acak dibagi menjadi dua kelompok (n=6), kelompok kontrol dan kelompok stres tak terduga kronis (CUS). Tikus CUS dikembangkan seperti dalam laporan kami sebelumnya [4], yang mengalami berbagai stresor: whitenoise (100 dB) selama 1 jam, penerangan stroboskopik intensitas rendah semalam (120 kilatan/menit), kekurangan air selama 24 jam, kosong botol air selama 1 jam (setelah kekurangan air), kekurangan makanan selama 24 jam, pengekangan fisik (1−2 jam), renang paksa (5 menit), kandang kotor selama 24 jam (200 mL air dalam 100 g alas serbuk gergaji), jepit ekor ( 1 menit), kejut selama 30 menit, kemiringan kandang 45 derajat selama 24 jam, dan penerangan semalam (12 jam). Stresor diterapkan terus menerus dan acak selama 4 minggu, pengaturan rinci dijelaskan pada Tabel S1. Setelah 4 minggu stres, uji referensi sukrosa, uji lapangan terbuka, dan uji pemberian makan baru dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya [4]. Garis besar CUS dan tes perilaku ditunjukkan pada Gambar. S1. Setelah tes perilaku, setidaknya 4 fecalpellet diperoleh dari setiap tikus dan ditempatkan dalam tabung kerucut steril untuk analisis in vitro CTE(ekstrak Cistanche tubulosa)metabolisme.

2.3. Metabolisme gastrointestinal CTE(ekstrak Cistanche tubulosa)oleh tikus normal dan CUS in vitro

2.3.1. Metabolisme CTE(ekstrak Cistanche tubulosa)dalam simulasi jus lambung dan usus

Lima puluh miligram CTE(ekstrak Cistanche tubulosa)masing-masing ditambahkan ke 10 mL jus lambung dan jus usus yang disimulasikan. Kemudian CTE(ekstrak Cistanche tubulosa)diinkubasi pada 37 derajat selama 4 jam dalam jus lambung dan 6 jam dalam jus usus. Campuran kultur (1 mL) didinginkan dengan 3 mL n-butanol jenuh air segera pada 0 dan 4 jam dalam jus lambung, dan pada 0 dan 6 jam dalam jus usus. Metode pengolahan sampel yang digunakan adalah seperti yang telah dijelaskan sebelumnya [9].

2.3.2. Metabolisme CTE(ekstrak Cistanche tubulosa)oleh mikrobiota usus tikus normal dan CUS

Sampel feses tikus normal segar dan CUS dicampur terlebih dahulu dan dihomogenkan dengan 25 kali volume kaldu GAM. Sedimen dihilangkan dengan penyaringan melalui tiga potong kain kasa. Suspensi tersebut kemudian diinkubasi pada suhu 37 derajat dalam inkubator anaerobik dimana udara diganti dengan campuran gas (H2 5 persen, CO2 10 persen, N2 85 persen). Lima puluh miligram CTE ditambahkan ke 5 mL normal dan suspensi feses tikus CUS secara terpisah, dan suspensi diinkubasi pada 37 derajat selama 48 jam. Campuran yang dikultur dihilangkan dan diekstraksi dengan n butanol jenuh air pada 0, 12, 24, dan 48 jam. Metode pemrosesan sampel telah dijelaskan sebelumnya [9].

2.3.3. Metabolisme berurutan dari CTE(ekstrak Cistanche tubulosa)oleh jus lambung, jus usus, mikrobiota usus tikus normal dan CUS

Pertama, 100 mg CTE(ekstrak Cistanche tubulosa)ditambahkan ke 1{{10}} mL jus lambung simulasi dan diinkubasi pada 37 derajat selama 4 jam. Seluruh reaksi didinginkan dengan 3 kali volume n-butanol jenuh air, dan disentrifugasi pada 3000 rpm selama 15 menit, diikuti dengan penguapan supernatan di bawah aliran nitrogen gas pada 37 derajat. Kedua, residu dilarutkan kembali dalam 0,4 mL air steril, ditambahkan ke 8 mL jus usus yang disimulasikan, dan diinkubasi pada suhu 37 derajat selama 6 jam. Sampel dengan jus lambung telah disiapkan sebelumnya dengan cara yang sama. Akhirnya, residu dilarutkan kembali dalam 0,3 mL air steril, ditambahkan ke 6 mL suspensi feses tikus normal dan CUS masing-masing, dan diinkubasi pada suhu 37 derajat selama 48 jam dalam inkubator anaerobik. Satu mililiter reaksi dipadamkan dengan 3 mL n-butanol jenuh air segera pada 0 dan 4 jam dalam jus lambung, pada 0 dan 6 jam dalam jus usus, dan pada 0, 12, 24, dan 48 jam pada mikrobiota usus tikus. . Sampel diproses secara identik CTE(ekstrak Cistanche tubulosa)dalam jus lambung simulasi.

2.4. Metabolisme CTE(ekstrak Cistanche tubulosa)oleh tikus normal dan CUS in vivo

Setiap tikus dalam dua kelompok kemudian ditempatkan di kandang metabolisme individu. Setelah puasa semalam yang hanya memungkinkan akses gratis ke air, semua tikus diberikan secara oral dengan 2 mL air melalui tabung gastrik. Sampel urin dan feses kosong dikumpulkan dari semua tikus dari 0 jam sampai 12 jam. Selanjutnya, CTE(ekstrak Cistanche tubulosa)(400 mg/kg) diberikan dengan gavage. Sampel urin dan feses dikumpulkan dari 0 jam hingga 24 jam. Semua sampel urin dan tinja segera disimpan pada suhu -80 derajat.

Sampel urin dan feses dari tikus normal dan tikus CUS diberikan perlakuan awal seperti yang dijelaskan sebelumnya [12]. Semua sampel yang dihasilkan dianalisis dengan UPLC-Q-TOF-MS.

2.5. Metode analitis

UPLC dilakukan pada sistem Waters ACQUITY UPLC (WatersCorp., Milford, MA, USA) dengan kolom ACQUITY UPLC BEH C18 (100 mm × 2,1 mm id, 1,7 m, Waters Corp. , USA) dengan elusi gradien menggunakan {{10}}.1 persen asam format asetonitril (A) dan 0.1 persen asam format dalam air(B) pada laju aliran 0,4 mL/menit . Profil gradien adalah: 0–5 menit (A:5–20 persen ), 5-7,5 menit (A: 20-30 persen ), 7,5–10 menit (A: 30–70 persen ), 10–11 menit(A : 70-100 persen ), dan ditahan selama 1,5 menit. Gradien didaur ulang menjadi 5 persen dalam 0,5 menit dan ditahan selama 2,5 menit untuk putaran berikutnya. Volume injeksi adalah 3 L. Suhu oven kolom diatur ke 35 derajat.

Spektrometri massa dilakukan dengan menggunakan spektrometer massa Waters Vion IMS (Waters Corp., Milford, MA, USA). Ionisasi dilakukan dalam mode electrospray negatif (ESI−). Parameter MS adalah sebagai berikut: tegangan kapiler, 2.0 kV; tegangan kerucut, 20 V; sourcetemperature, 120 derajat ; suhu desolvasi, 500 derajat ; aliran gas kerucut dan desolvasi, masing-masing 50 dan 1000 L/jam. Untuk pengukuran massa yang akurat, leusin-enkefalin digunakan sebagai massa kunci untuk menghasilkan ion [M–H]− (m/z 554.2615). Eksperimen MSE (Mass SpectrometryElevatedEnergy) dalam dua fungsi pemindaian dilakukan sebagai berikut:fungsi 1 (energi rendah): m/z 50–1000, waktu pemindaian 0,25 detik, penundaan interscan 0,02 detik, energi tumbukan 6 eV; fungsi 2 (energi tinggi): m/z50–1000, waktu pemindaian 0,25 detik, penundaan antar-pemindaian 0,02 detik, energi benturan 20–45 eV.

2.6. Pengolahan data

Data diproses menggunakan perangkat lunak UNIFI 1.8.1 (Waters Corp., Milford, MA, USA) untuk identifikasi metabolit dalam data mentah pemindaian penuh massa akurat yang dikumpulkan melalui MSE. Senyawa diidentifikasi berdasarkan massa yang akurat, fragmen dalam spektrometri massa energi tinggi. Ambang intensitas ditetapkan sebagai 100,0 hitungan. Identifikasi target, toleransi kecocokan fragmen, dan parameter lainnya secara otomatis ditetapkan.

3. Hasil

3.1. Perubahan perilaku pada tikus depresi yang diinduksi CUS

Tikus-tikus dengan gejala depresi yang diinduksi CUS dinilai dengan tes perilaku termasuk tes preferensi sukrosa, uji lapangan terbuka, dan uji pemberian makan baru. Uji-t Student menunjukkan bahwa referensi sukrosa dalam uji preferensi sukrosa (p < .001),="" jarak="" total="" yang="" ditempuh="" dalam="" uji="" lapangan="" terbuka="" (p="">< .001),="" dan="" latensi="" makan="" dalam="" uji="" pemberian="" makan="" yang="" ditekan="" baru="" (p="">< .01)="" secara="" signifikan="" berbeda="" dibandingkan="" dengan="" kelompok="" kontrol="" setelah="" 4-minggu="" pengobatan="" cus="" (gbr.="" 1).="" temuan="" ini="" menunjukkan="" bahwa="" model="" stres="" kronis="" yang="" tidak="" dapat="" diprediksi="" berhasil="">

3.2. Karakterisasi kandungan kimia CTE(ekstrak Cistanche tubulosa)

Analisis komprehensif konstituen prototipe CTE(ekstrak Cistanche tubulosa)dilakukan oleh UPLC-Q-TOF-MS. Secara total, 27 konstituen dari CTE(ekstrak Cistanche tubulosa)dideteksi dan dikarakterisasi sementara, termasuk 20 PhG, 5 iridoid dan glikosida iridoid, dan 2 oligosakarida. Informasi terperinci termasuk waktu retensi, MS akurat, dan ion fragmen MS/MS tercantum dalam Informasi pendukung (Tabel S2) untuk memberikan wawasan tentang struktur konstituen kimia ini. UPLC-Q-TOF-MS total ionchromatogram (TIC) dari CTE ditunjukkan pada Gambar. S2.

3.3. Metabolisme gastrointestinal CTE(ekstrak Cistanche tubulosa)oleh tikus normal dan CUS in vitro

Dalam studi ini, metabolit potensial CTE(ekstrak Cistanche tubulosa)oleh normal dan CUSrats in vitro dideteksi dari TIC dan diidentifikasi dengan kombinasi komposisi unsur dan spektrum massa fragmen MS/MS setelah membandingkannya dengan sampel kontrol. Semua metabolit dari CTE(ekstrak Cistanche tubulosa)dalam jus lambung dan usus yang disimulasikan, mikrobiota usus tikus normal dan CUS tercantum dalam Tabel 1.

3.3.1. Metabolisme CTE(ekstrak Cistanche tubulosa)dalam simulasi jus lambung dan usus

Tujuh metabolit CTE(ekstrak Cistanche tubulosa)dalam jus lambung simulasi secara tentatif diidentifikasi oleh massa yang akurat dan informasi fragmen MSE: M1 (m/z315.1074, C14H20O8, 1,66 menit), M4 (m/z 459.1501, C20H28O12,2,36 menit), M5 (m/z 445.1715, C20H30O11, 2,60 mnt), M7 (m/z179.0338, C9H8O4, 2,85 mnt), M12 (m/z 785,2481, C35H46O20,4,77 mnt), M16 (m/z 827,2580, C37H48O21, 5,73 mnt), dan M18 (m/z623 .1968, C29H36O15, 5,81 menit). Deglikosilasi, dehidroksilasi, dehidrogenasi, dan isomerisasi dianggap sebagai jalur metabolisme utama untuk CTE dalam jus lambung. M4 dan M5 ditemukan memiliki berat molekul 2 Da dan 16 Da lebih rendah dari komponen prototipe mereka, decaffeoylacteoside, dan dengan demikian diidentifikasi sebagai produk terdehidrogenasi dan dehidroksilasi, masing-masing. M12 diidentifikasi sebagai isomer echinacoside, menghasilkan ion yang sama seperti echinacosida pada m/z 623.2178, 477.1601, 315.1055, 161.0237.

Metabolit yang sama terdeteksi setelah CTE(ekstrak Cistanche tubulosa)inkubasi dalam jus usus. Patut dicatat bahwa gugus caffeoyl pada posisi C-6′ dalam PhGs siap dimetabolisme oleh enzim pencernaan dalam jus usus untuk menghasilkan metabolit decaffeyl dan asam caffeic.

3.3.2. Metabolisme CTE(ekstrak Cistanche tubulosa)oleh mikrobiota usus tikus normal dan CUS

Sebanyak 20 metabolit bio-transformasi dari CTE(ekstrak Cistanche tubulosa)pada mikrobiota ratintestinal normal terdeteksi dan diidentifikasi (Gbr. 2). Dari hasil tersebut diketahui bahwa PhGs terdegradasi menjadi aglikon hidroksitirosol (HT) M2 (m/z 153.0550, C8H10O3, 1,78 menit), dan asam caffeic(CA) M7 (m/z 179,0338, C9H8O4, 2,85 menit), kemudian selanjutnya dimetabolisme menjadi M3 (m/z 163.0390, C9H8O3, 2,02 menit), M6 (m/z181.0501, C9H10O4, 2,76 menit), M10 (m/z 195,0655, C10H12O4,4,35 menit), dan M11 (m/z 165,0552 , C9H10O3, 4,36 menit) melalui dehidroksilasi, reduksi, dan metilasi. Selain itu, jalur metabolisme sentral yang menghasilkan metabolit langsung senyawa prototipe PhG dari CTE pada mikrobiota usus tikus normal adalah reduksi, metoksilasi, deglikosilasi, dekaffeoil, dehidrogenasi, dan isomerisasi.

Setelah inkubasi dalam mikrobiota usus tikus depresi yang diinduksi CUS, CTE(ekstrak Cistanche tubulosa)diubah menjadi 20 metabolit melalui jalur metabolisme yang sama seperti tikus normal.

3.3.3. Metabolisme berurutan CTE oleh jus lambung, jus usus, mikrobiota usus tikus normal dan CUS

Setelah inkubasi berurutan dalam jus lambung, jus usus, normal, dan mikrobiota usus tikus CUS, CTE(ekstrak Cistanche tubulosa)dimetabolisme menjadi 14 metabolit (termasuk 8 dengan jus lambung, 7 dengan jus usus, 11 dengan normal, dan 10 dengan mikrobiota usus tikus CUS). Di antaranya, M2(HT) dan M11 (3-asam hidroksifenilpropionat, 3-HPP) adalah metabolit akhir PhGs setelah inkubasi berurutan CTE(ekstrak Cistanche tubulosa)dalam jus lambung, jus usus, dan mikrobiota usus. Tidak ada perbedaan yang signifikan dalam metabolit antara tikus normal dan tikus CUS.

M8, M9, M14, M17, M19, dan M20 hanya terdeteksi dalam metabolisme independen CTE oleh mikrobiota usus tikus normal dan CUS. Metabolit ini sebagian besar merupakan zat antara metabolisme yang telah sepenuhnya dimetabolisme menjadi metabolit akhir dalam studi metabolisme berurutan CTE dan oleh karena itu sulit untuk dideteksi.

3.3.4. Perbedaan antara tingkat metabolisme CTE dengan mikrobiota ratintestinal normal dan CUS

Untuk menjelaskan perbedaan antara tingkat metabolisme CTE(ekstrak Cistanche tubulosa)oleh mikrobiota usus tikus normal dan CUS, kandungan relatif dari 27 senyawa prototipe dan 20 metabolit setelah inkubasi dengan jus lambung, jus usus, mikrobiota usus tikus normal dan CUS ditentukan secara terpisah dan berurutan (Tabel S3 dan S4). Hasil menunjukkan bahwa meskipun tidak ada perbedaan yang signifikan antara CTE(ekstrak Cistanche tubulosa)metabolit tikus normal dan depresi, perbedaan yang signifikan diamati pada tingkat metabolisme mereka. Misalnya, C2 dan C5 diidentifikasi sebagai 8-asam epiloganat atau isomernya. Mereka sepenuhnya dimetabolisme dalam sampel normal dalam inkubasi 12 jam. Namun, pada mikrobiota usus tikus yang tertekan secara patologis, mereka dimetabolisme secara menyeluruh setelah inkubasi 48 jam. Terbukti bahwa tingkat metabolisme pada tikus normal lebih cepat daripada tikus CUS. Hasil serupa ditemukan dari C18 (isoacteoside). Selain itu, perlu dicatat bahwa area puncak M12 (isomerisasi echinacoside) dan M16 (isomerisasi tubulosida A) dalam sampel normal jauh lebih besar daripada di sampel CUS, menunjukkan bahwa reaksi isomerisasi CTE(ekstrak Cistanche tubulosa)lebih umum pada mikrobiota usus tikus normal pada mikrobiota usus tikus depresi.

3.4. Metabolisme CTE oleh tikus normal dan CUS in vivo

Dengan membandingkan sampel biologis dari kelompok yang diberi perlakuan CTE dengan sampel blankbiologis, total 26 metabolit (senyawa 1–26) CTE(ekstrak Cistanche tubulosa)tikus tidak normal dan CUS terdeteksi (Tabel 2). Kromatogram UPLC khas sampel urin tikus normal dan CUS disajikan pada Gambar. 3.

3.4.1. Karakterisasi metabolit CTE pada raturine normal dan CUS

Sebanyak 18 metabolit in vivo CTE(ekstrak Cistanche tubulosa)dalam sampel urin tikus normal untuk sementara diidentifikasi. Metabolit degradasi PhGs termasukHT dan CA, dan sulfasi lebih lanjut mereka (senyawa 1, 2, 3, 5, 8, dan 16), metilasi (6, 21, 22, dan 24), dan metoksilasi (13 dan 14) metabolit adalah metabolit utama dalam urin tikus normal. Glikosida iridoid mudah dimetabolisme menjadi aglikon (23, 25, dan 26) melalui deglikosilasi. Perlu dicatat bahwa tidak ada komponen prototipe yang terdeteksi dalam sampel urin tikus normal.

Dalam sampel urin tikus yang depresi, 22 metabolit CTE(ekstrak Cistanche tubulosa)dideteksi dan dikarakterisasi. Satu senyawa prototipe, 8-asam epiloganat, terdeteksi dalam urin tikus patologis. Metabolit lain sesuai dengan yang ditemukan dalam urin tikus normal, termasuk metabolit sulfat (1, 2, 3, 8, 10, dan 16), metabolit termetilasi (6, 11, 19, dan 22), metabolit termetoksilasi (13 dan 14) HT dan CA, dan theaglikon dari glikosida iridoid (25 dan 26).

3.4.2. Karakterisasi metabolit CTE(ekstrak Cistanche tubulosa)di ratfeses normal dan CUS

Dalam penelitian ini, hanya satu metabolit (senyawa 20, 3-HPP) dari CTE(ekstrak Cistanche tubulosa)diidentifikasi dalam kotoran tikus normal. Sebagian besar PhG pertama kali terdegradasi menjadi CA dan akibatnya mengalami metabolisme lebih lanjut menjadi metabolit mikroba utamanya, 3-HPP. Dalam sampel tinja dari tikus CUS, 3 metabolit dicirikan secara tentatif, termasuk 3-HPP sulfat (senyawa 16), dan HT sulfat (senyawa 2 dan 3).

3.4.3. Perbedaan antara metabolit in vivo CTE pada tikus normal dan CUS

Setelah pemberian oral CTE(ekstrak Cistanche tubulosa), metabolit in vivo menunjukkan perbedaan yang jelas pada tikus model yang sehat dan depresi. 21 metabolit (senyawa 1-3, 5, 6, 8-14, 16, 17, dan 19-26) terdeteksi pada sampel tikus sehat dan CUS. Senyawa 23 (asam geniposidik terdeglikosilasi) diidentifikasi hanya pada sampel tikus sehat, sedangkan senyawa 4 (HT), 7 (8-asam epiloganat), 15 (3, 4-asam dihidroksibenzenapropionat), dan 18 ({{ 19}}konjugasi glukuronida HPP) hanya terdeteksi pada sampel tikus model CUS. Singkatnya, konstituen prototipe hanya terdeteksi pada tikus CUS, sedangkan metabolit fase II lebih banyak ditemukan pada tikus normal.

4. Diskusi

Dalam penelitian ini, tiga model inkubasi in vitro termasuk jus lambung, jus usus, mikrobiota usus tikus normal dan CUS digunakan secara independen dan berurutan untuk menyelidiki profil metabolisme gastrointestinal CTE.(ekstrak Cistanche tubulosa)in vitro. Ditemukan bahwa PhGsand glikosida iridoid di CTE(ekstrak Cistanche tubulosa)mudah dimetabolisme menjadi glikosida dan aglikon sekundernya oleh mikrobiota usus tikus depresi yang diinduksi CUS. Setelah itu, metabolisme in vivo CTE(ekstrak Cistanche tubulosa)pada tikus normal andCUS juga diverifikasi. Jalur metabolisme yang diusulkan untuk CTE(ekstrak Cistanche tubulosa)pada tikus depresi yang sehat dan diinduksi CUS ditunjukkan pada Gambar. 4. PhGs, seperti echinacosida dan akteosida, dimetabolisme menjadi HT dan CA, dan CA menjalani metabolisme lebih lanjut menjadi metabolit mikroba utamanya, 3-HPP. HT, CA, dan 3-HPP kemudian dimetabolisme menjadi metabolit sulfat, metilasi, dan metoksilatnya. Glikosida iridoid termasuk asam geniposidat, kankanosida A, dan kankanosida N dimetabolisme menjadi aglikonnya melalui deglikosilasi. Ini lebih lanjut menunjukkan bahwa PhG dan glikosida iridoid di CTE(ekstrak Cistanche tubulosa)mudah dimetabolisme menjadi glikosida dan aglikon sekunder pada tikus CUS. Metabolit ini biasanya menunjukkan penyerapan usus yang lebih baik dan bioavailabilitas untuk selanjutnya diserap ke dalam darah untuk mengerahkan aktivitas biologis [16-18]. Perlu dicatat bahwa isomerisasi lazim untuk PhG di saluran pencernaan, metabolit yang relevan diidentifikasi setelah dibandingkan dengan waktu retensi UPLC dari senyawa prototipe mereka berdasarkan profil gradien UPLC ideal yang dioptimalkan.

Asam caffeic adalah produk degradasi utama CTE(ekstrak Cistanche tubulosa)oleh mikrobiota usus tikus patologis depresi. Publikasi sebelumnya melaporkan bahwa asam caffeic menghasilkan efek seperti antidepresi dalam tes renang paksa pada tikus. Kedua tingkat mRNA faktor neurotropik yang diturunkan dari otak (BDNF) di korteks frontal dan tingkat mRNA TrkB di amigdala secara signifikan menurun setelah tes renang paksa, dan pengurangan sebelumnya secara signifikan dihambat oleh asam caffeic [19]. Hidroksitirosol adalah aglikon PhGs, yang melindungi neurogenesis dan fungsi kognitif dengan mencegah penurunan regulasi protein saraf BDNF yang diinduksi stres [20]. Dengan demikian, perlu untuk lebih memperhatikan beberapa metabolit bioaktif (yaitu, HT dan CA) yang diubah oleh mikrobiota usus setelah pemberian oral.

Selain itu, temuan ini memberikan bukti bahwa dalam mikrobiota usus yang tertekan, kemampuan metabolisme untuk menghasilkan glikosida dan aglikon sekunder secara nyata lebih lemah daripada mikrobiota usus tikus yang tidak normal. Alasannya mungkin disebabkan oleh perubahan struktural mikrobiota usus yang diinduksi oleh depresi, yang menyebabkan penurunan aktivitas enzim metabolik yang dihasilkan oleh mikrobiota usus [21]. Menariknya, penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa filum Bacteroidetes mengkodekan gen glikosida hidrolase dan polisakarida liase yang paling melimpah untuk hidrolisis glikosida dan pembelahan karbohidrat kompleks dengan mekanisme eliminasi [22]. Secara khusus, Bacteroides spp. termasuk B. caccae, B. dorei, B. finegoldii,B. fragilis, B. intestinalis, B. ovatus, B. thetaiotaomicron, B. uniformis, danB. xylanisolvens menunjukkan jumlah total gen yang dominan yang mengkode GH dan PL. Parabacteroides distasonis juga memiliki karakteristik yang sama [22]. Penelitian kami sebelumnya menegaskan bahwa 28-hari stimulasi stres kronis yang tidak dapat diprediksi menurunkan kelimpahan relatif genera Bacteroides, Parabacteroides, Butyricimonas, dan Weissella, sedangkan, meningkatkan Ruminococcus dan Deinococcus pada tikus [4]. Patut dicatat bahwa Bacteroides dan Parabacteroides adalah dua taksa mikroba paling melimpah yang menyumbang sekitar 20 persen kelimpahan relatif pada tikus normal. Setelah pengobatan CUS, kelimpahan relatif Bacteroides dan Parabacteroides turun tajam menjadi sekitar 5 persen pada tikus model depresi. Oleh karena itu, ini pasti akan menyebabkan pengurangan jumlah total enzim GH dan PL pada tikus CUS, dan selanjutnya mengganggu reaksi deglikosilasi oleh mikrobiota usus depresi CUS setelah pemberian CTE secara oral.(ekstrak Cistanche tubulosa)pada tikus model.

5. Kesimpulan

Dalam penelitian ini, teknik UPLC-Q-TOF-MS didirikan dan diterapkan untuk menyaring dan mengidentifikasi metabolitEkstrak Cistanche tubulosapada tikus depresi normal dan CUS in vitro dan in vivo. Hasilnya menunjukkan bahwa CTE(ekstrak Cistanche tubulosa)dimetabolisme menjadi aglikon dan produk degradasi PhGs dan glikosida iridoid oleh mikrobiota usus yang sehat dan tertekan. Setelah pemberian oral CTE(ekstrak Cistanche tubulosa), metabolit aglikon fase II dan produk degradasi PhGs dan iridoidglikosida sebagian besar ditemukan dalam urin tikus. Kemampuan metabolisme untuk menghasilkan glikosida dan aglikon sekunder dalam mikrobiota ratintestinal depresi jauh lebih lemah daripada mikrobiota usus tikus normal, yang dikaitkan dengan gangguan glikosidahidrolase yang diproduksi oleh mikrobiota usus pada tikus depresi CUS. pengembangan CTE(ekstrak Cistanche tubulosa)sebagai antidepresan potensial.

Ucapan Terima Kasih

Pekerjaan ini didukung oleh hibah dari National Key Research and Development Program of China (2017YFC1702400).

Lampiran A. Data tambahan

Data tambahan untuk artikel ini dapat ditemukan online di HTTPS://doi.org/10.1016/j.jchromb.2019.121728

Dari: ' Metabolisme in vitro dan in vivo dariEkstrak Cistanche tubulosapada tikus depresi yang diinduksi stres normal dan kronis yang tidak dapat diprediksi olehYang Li, dkk

--Jurnal Kromatografi B 1125 (2019) 121728

Referensi

[1] Komisi Farmakope China, The Pharmacopeia of the People's Republic of China, 2015 ed., China Medical Science Press, Beijing, China, 2015, hlm. 135 Bagian I.
[2] Y. Jiang, P.-F. Tu, Analisis konstituen kimia dalam spesies Cistanche, J. Chromatogr. 1216 (2009) 1970–1979.
[3] Z. Fu, X. Fan, X. Wang, X. Gao, Cistanches Herba: ikhtisar sifat kimia, farmakologi, dan farmakokinetiknya, J. Ethnopharmacol. (2017), https://doi.org/10.1016/j.jep.2017.10.015.
[4] Y. Li, Y. Peng, P. Ma, H. Yang, H. Xiong, M. Wang, C. Peng, P. Tu, X. Li, Efek seperti antidepresan dariEkstrak Cistanche tubulosapada tikus stres kronis yang tidak dapat diprediksi melalui pemulihan homeostasis mikrobiota usus, Front. farmasi. (2018), https://doi.org/10.3389/fphar.2018.00967.
[5] JA Foster, MV Neufeld, Gut-brain axis: bagaimana mikrobioma memengaruhi kecemasan dan depresi, Trends Neurosci. 36 (2013) 305–312.
[6] E. Sherwin, TG Dinan, JF Cryan, Perkembangan terkini dalam memahami peran mikrobiota usus dalam kesehatan dan penyakit otak, Ann. NY Acad. Sci. 12 (2017) e0177977.
[7] Y. Meng, H. Jia, Z. Chao, Y. Yong, Z. Yang, M. Yang, Z. Zou, Variasi dalam mikrobiota usus dan fenotipe metabolisme feses yang terkait dengan depresi oleh pengurutan gen 16S rRNA dan LC/ metabolomik berbasis MS, J. Pharm. Bioma. dubur. 138 (2017) 231–239.

[8] JR Kelly, Y. Borre, BC O', E. Patterson, AS El, J. Deane, PJ Kennedy, S. Beers, K. Scott, G. Moloney, Mentransfer blues: mikrobiota usus terkait depresi menginduksi perubahan neurobehavioural pada tikus, J. Psychiatr. Re.. 82 (2016) 109–118.
[9] L. Yang, P. Ying, M. Wang, P. Tu, X. Li, Metabolisme gastrointestinal manusia dari ekstrak air Cistanches Herba in vitro: penjelasan profil metabolisme berdasarkan identifikasi metabolit komprehensif dalam jus lambung, usus jus, bakteri usus manusia, dan mikrosom usus, J. Agric. Kimia Makanan. 65 (2017) 7447–7456.
[10] Y. Li, G. Zhou, S. Xing, P. Tu, X. Li, Identifikasi metabolit echinacosida yang diproduksi oleh bakteri usus manusia menggunakan kromatografi cair kinerja ultra/spektrometri massa waktu terbang quadrupole, J. pertanian. Kimia Makanan. 63 (2015) 6764–6771.
[11] Y. Li, G. Zhou, Y. Peng, P. Tu, X. Li, Penyaringan dan identifikasi tiga metabolit glikosida fenilethanoid khas dari Cistanches Herba oleh bakteri usus manusia menggunakan UPLC/Q-TOF-MS, J. Farmasi. Bioma. dubur. 118 (2016) 167–176.
[12] L. Yang, P. Ying, M. Wang, G. Zhou, Y. Zhang, X. Li, Skrining cepat dan identifikasi perbedaan antara metabolit Cistanche deserticola dan ekstrak air C. tubulosa pada tikus oleh UPLC- Analisis pengenalan pola gabungan Q-TOF-MS, J. Pharm. Bioma. dubur. 131 (2016) 364–372.
[13] C. Q, P. Y, B. X, Z. W, C. L, L. X, Secara sistematis mengkarakterisasi metabolit echinacoside dan acteoside dari Cistanche tubulosa dalam plasma tikus, empedu, urin, dan feses berdasarkan UPLC-ESI-Q-TOF-MS, Biomed. Kromatografi 30 (2016) 1406–1415.
[14] Y. Wang, H. Hao, G. Wang, P. Tu, Y. Jiang, Y. Liang, L. Dai, H. Yang, L. Lai, C. Zheng, Pendekatan untuk mengidentifikasi metabolit sekuensial dari glikosida fenilethanoid yang khas, echinacosida, berdasarkan waktu jebakan ion kromatografi cair
analisis spektrometri massa penerbangan, Talanta 80 (2009) 572–580.
[15] C. Jia, H. Shi, W. Jin, K. Zhang, Y. Jiang, M. Zhao, P. Tu, Metabolisme echinacosida, antioksidan yang baik, pada tikus: isolasi dan identifikasi metabolit biliernya, Metabolisme Obat. Dispos. 37 (2009) 431–438.
[16] J. Xu, HB Chen, SL Li, Memahami mekanisme molekuler dari interaksi antara obat-obatan herbal dan mikrobiota usus, Med. Res. Wahyu 37 (2017) 1140–1185.
[17] H. Liu, J. Yang, F. Du, X. Gao, X. Ma, Y. Huang, F. Xu, W. Niu, F. Wang, Y. Mao, Penyerapan dan disposisi ginsenosides setelah oral pemberian ekstrak Panax notoginseng pada tikus, Drug Metab. Dispos. 37 (2009) 2290–2298.
[18] JM Laparra, Y. Sanz, S. Schaffer, F. Visioli, Interaksi mikrobiota usus dengan komponen makanan fungsional dan nutraceuticals, Pharmacol. Res. 61 (2010) 219–225.
[19] H. Takeda, M. Tsuji, T. Yamada, J. Masuya, K. Matsushita, M. Tahara, M. Iimori, T. Matsumiya, Asam caffeic melemahkan penurunan ekspresi mRNA BDNF kortikal yang disebabkan oleh paparan paksa stres berenang pada tikus, Eur. J. Farmakol. 534 (2006) 115-121.
[20] A. Zheng, L. Hao, C. Ke, X. Jie, Z. Xuan, L. Yuan, C. Cong, J. Liu, Z. Feng, Pemberian hidroksitirosol ibu meningkatkan neurogenesis dan fungsi kognitif pada stres prenatal keturunan, J. Nutr. Biokimia. 26 (2015) 190–199.
[21] H. Li, J. He, W. Jia, Pengaruh mikrobiota usus pada metabolisme obat dan toksisitas, Pendapat Ahli. Metabolisme Obat. racun. 12 (2016) 31.
[22] KA El, F. Armougom, JI Gordon, D. Raoult, B. Henrissat, Kelimpahan dan berbagai enzim aktif karbohidrat dalam mikrobiota usus manusia, Nat. Pdt. Mikrobiol. 11 (2013) 497–504.