Respon Kekebalan Terhadap Transplantasi Binokuler Berurutan Sel Progenitor Retina Alogenik Ke Rongga Vitreous pada Tikus

Abstrak:

Transplantasi sel progenitor retina manusia (RPC) alogenik intravitreal menjanjikan sebagai pengobatan untuk degenerasi retina yang membutakan. Penelitian sebelumnya telah menunjukkan bahwa nenek moyang saraf dapat ditoleransi dengan baik sebagai allograft setelah suntikan tunggal; namun, pengiriman sel alogenik secara berurutan meningkatkan potensi risiko sensitisasi inang yang diikuti dengan penolakan imun terhadap cangkokan. Penelitian saat ini dirancang untuk menilai apakah respons imun akan diinduksi oleh transplantasi RPC alogenik intravitreal berulang kali menggunakan model hewan tikus. Kami menyuntikkan sel progenitor retina murine (gmRPCs), yang awalnya berasal dari donor dengan latar belakang genetik C57BL/6, ke tikus penerima BALB/c untuk memberikan data keamanan mengenai apa yang mungkin diharapkan setelah perawatan berulang pada pasien dengan produk sel manusia alogenik. . Respon imun terhadap gmRPC bersifat ringan, terdiri dari sel T, sel B, neutrofil, dan sel pembunuh alami, dengan makrofag yang jelas mendominasi. Hewan yang diobati dengan gmRPC dosis berulang tidak menunjukkan bukti sensitisasi, juga tidak ada kerusakan cangkok yang dimediasi oleh kekebalan. Meskipun tidak ada pengobatan imunosupresif, cangkokan gmRPC alogenik bertahan setelah pemberian dosis berulang, sehingga memberikan dukungan untuk pengamatan awal bahwa injeksi berulang RPC alogenik ke rongga vitreus dapat ditoleransi pada pasien dengan retinitis pigmentosa.

tanaman cistanche meningkatkan sistem kekebalan tubuh

Klik di sini untuk melihat produk Cistanche Meningkatkan Imunitas

【Minta lebih lanjut】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Aplikasi WhatsApp: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Kata kunci: sel induk; toleransi kekebalan; hak istimewa kekebalan; penolakan korupsi; injeksi intravitreal

1. Perkenalan

Retinitis pigmentosa (RP) mencakup kelas degenerasi batang-kerucut genetik dan mengakibatkan gangguan penglihatan progresif dan akhirnya kebutaan. Pada sebagian besar kasus, tidak ada tindakan terapeutik yang terbukti dapat mempertahankan atau memulihkan penglihatan; namun, salah satu strategi untuk mengatasi kebutuhan medis yang belum terpenuhi ini adalah transplantasi sel induk. Kelompok penelitian kami telah mengeksplorasi injeksi sel progenitor retina manusia (RPC) intravitreal sebagai cara untuk mengintervensi RP dengan tujuan terapeutik untuk menstabilkan perkembangan atau mungkin membalikkan perjalanan penyakit. RPG dapat diperoleh dari retina yang belum matang melalui sumbangan jaringan atau, yang lebih baru, dari garis sel berpotensi majemuk. Studi pada model hewan menunjukkan bahwa sel-sel ini mampu menyelamatkan fotoreseptor dari degenerasi setelah injeksi ke mata dan juga mampu berdiferensiasi menjadi fotoreseptor batang di mata inang. Terdapat beberapa bukti dari penelitian pada hewan yang menunjukkan bahwa hRPC yang disuntikkan dapat menjadi fotoreseptor yang fungsional dan terintegrasi sehingga berpotensi menstabilkan retina dengan secara langsung menggantikan sel-sel yang mati. Dengan demikian, hRPC yang disuntikkan mungkin mengobati RP baik secara neurotropik maupun melalui mekanisme penggantian sel. Apa pun yang terjadi, pendekatan berbasis sel ini menawarkan strategi rasional untuk pengobatan pasien yang menderita RP dan, kemungkinan besar, penyakit retina lainnya.

Atribut lain yang menguntungkan dari RPC, dan mungkin nenek moyang saraf secara umum, adalah toleransi relatif yang diberikan sel-sel ini setelah transplantasi sebagai allograft, terutama ketika dikirim ke lokasi yang menunjukkan hak imun seperti retina [1,2]. Meskipun demikian, tinjauan terbaru terhadap uji klinis yang dilakukan di bidang pengobatan regeneratif terus melaporkan tantangan yang luas dan signifikan terkait peradangan dan penolakan imun [3,4], termasuk untuk intervensi yang menargetkan mata seperti terapi gen retina [5], sebagai serta beberapa tetapi tidak semua terapi sel [6]. Meskipun merupakan tipe sel lokal, sel epitel pigmen retina (RPE) tidak dikecualikan dari masalah penolakan [7-9]; oleh karena itu, penekanan kekebalan pada penerima saat ini merupakan praktik standar [10,11]. RPC manusia, di sisi lain, nampaknya dapat ditoleransi dengan baik sebagai allografts [6,12-16], meskipun hal ini tidak mencakup penggunaannya sebagai xenografts, yang memerlukan penekanan kekebalan tubuh [17]. Dasar kelangsungan hidup RPC alogenik di mata kemungkinan besar melibatkan sejumlah faktor yang terkait dengan sel yang digunakan dan lokasi penerima [1,8,18,19]. Dalam penelitian sebelumnya yang menggunakan flow cytometry, kami telah menunjukkan bahwa nenek moyang saraf manusia, baik yang diturunkan dari otak maupun yang diturunkan dari retina, mengekspresikan antigen histokompatibilitas mayor (MHC) kelas I, tetapi tidak kelas II [20,21]. Mekanisme klasik penolakan cangkok melibatkan pengenalan nonspesifik molekul MHC kelas II asing oleh limfosit inang CD4+ [20-25]. Dengan cara ini, tidak adanya molekul kelas II memungkinkan sel progenitor yang dicangkokkan menghindari penolakan imun yang dimediasi melalui mekanisme ini. Namun, status "keistimewaan kekebalan" dari hRPC yang disuntikkan secara intravitre belum tentu mutlak. Meskipun nenek moyang sistem saraf pusat (SSP) murine tidak mengekspresikan molekul MHC kelas I atau kelas II yang dapat dideteksi pada awal dan menunjukkan hak imunitas yang jelas seperti allograft [1,2,20], sel-sel ini dapat mengalami penolakan imun dalam keadaan tertentu. Penelitian telah menunjukkan bahwa antigen MHC dapat diinduksi melalui stimulasi progenitor SSP dengan interferon-gamma (IFN ) [1,26]. Nenek moyang SSP dapat ditolak setelah sensitisasi dari inang yang telah dicangkokkan sebelumnya. Oleh karena itu, sel-sel progenitor SSP (termasuk RPC) mengekspresikan aloantigen yang terdeteksi oleh sistem kekebalan tubuh inang. Secara keseluruhan, hal ini menunjukkan bahwa status imunitas istimewa dari sel-sel progenitor yang dicangkokkan bersifat sementara dan tunduk pada modulasi, misalnya, oleh sitokin yang ada di lingkungan mikro lokal, dan yang dapat mengalami perubahan selama proses degenerasi seperti RP. Karena semua alasan ini, respon imun terhadap beberapa suntikan RPC intravitreal sulit diprediksi dan harus diperiksa secara spesifik.

cistanche tubulosa-meningkatkan sistem kekebalan tubuh

Jika pengobatan RPC terbukti berhasil secara klinis pada RP, akan ada insentif yang kuat untuk pengobatan kedua mata pada penyakit kebutaan bilateral ini. Setidaknya untuk alasan keamanan, perawatan binokular biasanya dilakukan secara berurutan, dengan jeda waktu yang signifikan antara kedua suntikan. Sebagai catatan, pengiriman sel-sel alogenik yang berurutan ini mungkin mengakibatkan sensitisasi inang sebagai respons terhadap suntikan pertama, yang berpotensi memicu penolakan imun sebagai respons terhadap suntikan kedua. Hal ini dapat mengakibatkan hilangnya cangkok pada kedua mata. Laporan sebelumnya yang meneliti dosis subretinal tunggal dengan hRPC di RP [27] atau dosis ulang dengan progenitor saraf manusia pada hewan [28,29] memasukkan penekanan kekebalan. Oleh karena itu, penelitian berikut ini dirancang sebagai penyelidikan translasi RPC murine sebagai allograft sekuensial pada strain tikus yang memiliki kompetensi imun dengan latar belakang genetik yang berbeda. Meskipun tidak termasuk produk RPC manusia, penelitian ini dilakukan sebagai bagian dari penelitian yang mendukung IND untuk memberikan data pada hewan mengenai keamanan, yaitu apakah penekanan kekebalan diperlukan untuk pasien yang menerima perawatan allograft RPC berulang dalam uji coba yang terdaftar di FDA.

2. Hasil

Untuk mempelajari konsekuensi imunologis dari injeksi RPC bilateral pada tikus alogenik, gmRPCs (latar belakang genetik C57BL/6) disuntikkan secara intravitreal ke satu mata penerima BALB/c dan dosis kedua RPC disuntikkan ke mata lainnya 2 minggu kemudian. Interval waktu 2-minggu dipilih agar cukup untuk memungkinkan cangkok pertama menginduksi respons imun bawaan dan adaptif. Tak satu pun dari hewan percobaan menerima pengobatan obat penekan kekebalan sehingga respon imun fisiologis alami dapat diamati.

2.1.Observasi Klinis dan Pemeriksaan Mata Tidak Ada Kelainan

Bobot hewan percobaan diukur pada setiap kali penyuntikan gmRPC. Semua hewan percobaan menunjukkan kenaikan berat badan antara suntikan pertama dan kedua, konsisten dengan kesehatan yang baik secara keseluruhan. Hewan yang dihentikan pada hari ke 14 dan hari ke 28 ± 1 setelah injeksi gmRPC kedua diperiksa melalui mikroskop bedah. Segmen anterior dan posterior dari sebagian besar mata yang diperiksa dinilai “dalam batas normal” (WNL). Tidak ada tanda-tanda peradangan atau kelainan lain yang terlihat pada kelompok yang tidak diobati, diobati secara palsu, dan diobati dengan gmRPC, yang menunjukkan bahwa injeksi intravitreal gmRPC tidak menyebabkan respons inflamasi atau kerusakan jaringan fisik yang terdeteksi melalui metode ini. Kelompok sel yang terdiri dari cangkok terlihat dalam cairan vitreus pada hari ke 14 dan hari ke 28 ± 1 setelah injeksi gmRPC kedua (Gambar 1). Suntikan gmRPC yang berulang tidak menyebabkan perubahan nyata dalam ukuran kelompok sel, konsisten dengan kelangsungan hidup sel donor yang berkelanjutan. Patologi kasar juga dievaluasi pada titik akhir terminal dan tidak ada pembesaran bola mata (yang mengindikasikan pembentukan tumor) atau kelainan lain yang dicatat.

Gambar 1. GmRPC yang ditransplantasikan divisualisasikan secara in vivo melalui fotografi fundus melalui mikroskop bedah (semua=mata kiri, OS). (A, B), hewan yang diperlakukan secara palsu (palsu/palsu, S/S); (C, D), hewan kontrol dengan mata kanan yang diberi perlakuan palsu diikuti oleh mata kiri yang diberi perlakuan gmRPC (palsu/sel, S/C), dan hewan dengan kedua mata yang dirawat secara berurutan dengan gmRPC (sel/sel, C/C) adalah diamati dan dicitrakan melalui mikroskop bedah. Panel atas (A, C, E) menunjukkan gambar OS yang diambil pada Hari ke 14 pasca injeksi kedua; panel bawah (B, D, F) menunjukkan gambar OS yang diambil pada Hari ke 28 pasca injeksi kedua. Allograft terlihat sebagai gumpalan sel berwarna pucat (panah) yang terlihat pada cairan vitreus mata kiri yang disuntik sel (S/C, C/C) pada kedua titik waktu (Hari 14: (C, D); dan Hari 28: ( E, F)). Selain cangkok, tidak ada peradangan yang jelas atau kelainan tambahan yang terlihat pada segmen anterior dan posterior, jika dilihat secara aksial dengan cara ini.

2.2. Pelabelan Imunofluoresen Menunjukkan Sel Kekebalan Tubuh di Vitreous

Pelabelan imunofluoresen untuk lima tipe sel imun utama (makrofag, neutrofil, sel pembunuh alami, sel T, dan sel B) dilakukan pada cryosection mata dan menunjukkan infiltrasi sel imun positif pada mata setelah injeksi gmRPC (Gambar 2A – F). Sel T (CD3), sel B (CD45R), neutrofil (Ly-6G), dan sel pembunuh alami (CD49b) menunjukkan keberadaan terbatas pada mata yang disuntik dengan gmRPC, sedangkan makrofag teraktivasi (Iba-1 ) adalah sel kekebalan utama yang merespons cangkok intravitreal. Jaringan serupa dari hewan yang tidak diobati dan diobati secara palsu tidak menunjukkan sel kekebalan pada cryosection mata, menunjukkan bahwa infiltrasi sel kekebalan yang terlihat merupakan respons terhadap cangkok gmRPC. Konsisten dengan pengamatan ini, sel-sel kekebalan terletak di daerah sekitar cangkok gmRPC atau di dalam kelompok gmRPC itu sendiri.

Gambar 2. Pelabelan imuno pada sel imun yang diinfiltrasi berdasarkan kelompok perlakuan. Gambar imunofluoresen dari (A) bagian kontrol (antibodi sekunder saja), (B) anti-Iba-1 (penanda makrofag dan mikroglia teraktivasi), (C) anti-Ly-6G (penanda neutrofil), (D) anti-CD49b (penanda sel pembunuh alami), (E) antibodi anti-CD3 (penanda sel T), dan (F) anti-CD45R (penanda sel B) ditampilkan pada gambar. Sinyal merah terbatas menunjukkan pelabelan antibodi positif untuk penanda leukosit, sinyal hijau menunjukkan cangkok gmRPC dan sinyal biru menunjukkan pelabelan nuklir DAPI. Kuning adalah sinyal yang tumpang tindih nonspesifik, paling jelas terlihat pada segmen luar fotoreseptor yang menunjukkan autofluoresensi. Kelompok perlakuan: tidak diobati (UT), kedua mata tidak diobati; S/S, kedua matanya dipalsukan (berurutan) dengan kendaraan; S/C, mata kanan disuntik dengan kendaraan diikuti mata kiri dengan 50,000 gmRPCs dan; C/C, kedua mata disuntik dengan 50,000 gmRPC (berurutan) per jadwal di Bagian 4

Jumlah puncak setiap sel imun di mata bervariasi berdasarkan jenis sel (Gambar 3A–E). Sebaliknya, ANOVA dua arah menunjukkan tidak ada perbedaan dalam infiltrasi sel imun ketika membandingkan hewan yang menerima suntikan gmRPC tunggal (palsu/sel) dengan hewan yang menerima suntikan bilateral (sel/sel). Hal ini terjadi pada infiltrasi makrofag (pewarnaan anti-Iba-1) (Gambar 3A), neutrofil (pewarnaan anti-Ly-6G) (Gambar 3B), sel pembunuh alami (pewarnaan CD49b) ( Gambar 3C), sel T (pewarnaan CD3) (Gambar 3D), dan sel B (pewarnaan CD45R) (Gambar 3E).

2.3. ELISPOT Tidak Menunjukkan Respon Penarikan Antigen

ELISPOT adalah cara untuk menguji aktivasi sel T penghasil IFN spesifik antigen. Pengobatan phorbol 12-myristate 13-asetat (PMA) adalah kontrol positif yang meniru pembawa pesan kedua, DAG, untuk mengaktifkan jalur reseptor sel T dan, pada gilirannya, menyebabkan aktivasi sel T. Pada Gambar 4A–D, kelompok yang diobati dengan PMA menunjukkan jumlah titik IFN yang jauh lebih tinggi dibandingkan dengan kelompok kontrol yang hanya memiliki sel responden (yaitu, limfosit dari CLN, splenosit dari limpa). Ketika sel-sel responden dikultur bersama dengan splenosit C57BL/6 (B6 SPL), sampel hari ke-14 sebanding dengan kelompok sel responden saja, dengan hanya jumlah titik IFN yang sedikit lebih tinggi, yang menunjukkan kurangnya aktivasi sel T (Gambar 4A, B).

Gambar 3. Kuantifikasi infiltrasi sel imun setelah transplantasi gmRPC. Sel imun yang diinfiltrasi divisualisasikan sebagai sinyal fluoresen merah dalam bidang pencitraan setelah injeksi gmRPC untuk setiap kondisi eksperimental, dihitung menggunakan ImageJ, dan diplot dalam grafik batang. Data dari Iba-1 (penanda makrofag dan mikroglia teraktivasi) (A), anti-Ly-6G (penanda neutrofil) (B), anti-CD49b (penanda sel pembunuh alami) (C), antibodi anti-CD3 (penanda sel T) (D), dan anti CD45R (penanda sel B) (E) ditampilkan pada gambar. Tes ANOVA dua arah digunakan untuk menguji signifikansi antara kelompok palsu/sel dan sel/sel; nilai p adalah: (A) p < {{10}}.4492, (B) p < 0.9376, (C) p < 0.119{{18 }}, (D) p <0,6411, dan (E) p <0,7201 (tidak ada yang signifikan).

Saat menguji sel donor alogenik menggunakan uji ini, sel responden dari hewan yang disuntik secara intraperitoneal dengan gmRPCs (kelompok IP) tidak memiliki respons penarikan antigen karena sampel tidak menunjukkan lebih banyak aktivasi sel T berdasarkan jumlah titik IFN dibandingkan dengan hewan palsu yang tidak pernah terpapar. ke gmRPC (palsu/palsu). Hewan yang disuntik gmRPC secara intravitre, baik sekali (palsu/sel) atau berulang kali (sel/sel) tidak menunjukkan respons penarikan antigen. Dalam satu kasus, tanggapan terhadap pemberian dosis gmRPC berulang tampak lebih tidak terdengar (Gambar 4B). Bersama-sama, hasil ini menunjukkan bahwa gmRPC menunjukkan antigenisitas yang sangat rendah. Perhatikan bahwa splenosit C57BL/6 dicocokkan dengan latar belakang genetik gmRPC. Tanpa diduga, sel stimulator alternatif, gmRPCs, meningkatkan jumlah titik IFN di semua kelompok eksperimen dibandingkan dengan kelompok kontrol negatif (Gambar 4A – D). Penjelasan potensial mungkin adalah gmRPC yang menyebabkan latar belakang yang tinggi dalam pengujian ini. Yang penting, tidak ada perbedaan antara kelompok injeksi gmRPC tunggal yang tidak diobati, diobati secara palsu, dan kelompok injeksi gmRPC berulang, yang sekali lagi menunjukkan tidak adanya respons penarikan antigen.

Gambar 4. Kuantifikasi ELISPOT setelah transplantasi gmRPC. Uji ELISPOT ditetapkan sebagai kelompok berikut: kontrol, sel responden saja (limfosit atau splenosit yang mengandung sel T yang diisolasi dari kelenjar getah bening serviks (CLNs) atau limpa (SPL) hewan percobaan; PMA, sel responden yang diobati dengan phorbol {{1} }myristate 13-asetat (PMA) dan ionofor Ca; B6 SPL, sel responden dicampur dengan splenosit yang diisolasi dari hewan C57BL/6; gmRPC, sel responden yang sama dicampur dengan gmRPC. (A), Sel responden adalah splenosit dari hewan coba yang dikorbankan pada hari ke 14 setelah penyuntikan gmRPCs kedua.(B) Sel responden merupakan limfosit dari CLNs hewan coba yang dikorbankan pada hari ke 14 setelah penyuntikan gmRPCs kedua.(C) Sel responden adalah splenosit hewan coba yang dikorbankan pada hari ke 29 setelah penyuntikan gmRPCs kedua.(D) Sel responden adalah limfosit dari CLNs hewan percobaan yang dikorbankan pada hari ke 29 setelah penyuntikan gmRPCs kedua. Uji ANOVA dua arah digunakan untuk menguji signifikansi (*) antara kelompok palsu/sel dan sel/sel; nilai p adalah: (A) p < 0.5332, (B) p < 0.0001 (signifikan), (C) p < 0.0207 ( signifikan), dan (D) p < 0,3355.

3. Diskusi 

Ada minat yang besar terhadap teknologi sel induk sebagai cara untuk mengobati penyakit degeneratif retina dan kelompok kami telah mengeksplorasi penggunaan hRPC alogenik dalam RP. Untuk mengumpulkan data yang mengatasi potensi konsekuensi kekebalan ketika lebih dari satu dosis produk RPC manusia alogenik diberikan melalui injeksi intravitreal, kami melakukan penelitian pada hewan menggunakan gmRPC dari latar belakang C57BL/6 sebagai cangkok dan tikus BALB/c sebagai inang. Latar belakang genetik yang berbeda ini digunakan untuk memodelkan pengobatan berurutan dengan hRPC alogenik dan memberikan data keamanan awal sebelum pengujian pada manusia.

Untuk mengevaluasi tanggapan sepenuhnya, hewan inang tidak menerima pengobatan imunosupresif apa pun. Kami membandingkan respon imun yang dihasilkan oleh injeksi gmRPC tunggal dengan dosis bilateral berurutan sesuai dengan jadwal injeksi yang dijelaskan. Pemeriksaan oftalmik tidak menunjukkan peradangan atau perbedaan penting lainnya antara kelompok hewan yang menerima 1 dosis gmRPC atau 2 dosis gmRPC, menunjukkan bahwa penerima tidak peka terhadap pengobatan gmRPC awal, atau sensitisasinya tidak kentara. Hasil imunolabeling menunjukkan bahwa kelima jenis sel imun yang diperiksa yaitu sel T (CD3), sel B (CD45R), makrofag (Iba-1), neutrofil (Ly-6G), dan sel pembunuh alami ( CD49b), telah menyusup ke dalam mata dan menargetkan cangkok RPC pasca transplantasi. Namun demikian, infiltrasi ini relatif sedang dan, meskipun jenis sel lain dapat dideteksi, infiltrasi ini sebagian besar terdiri dari makrofag Iba-1 positif. Jumlah sel T, sel B, neutrofil, dan sel pembunuh alami yang ada sangat terbatas. Menariknya, kelangsungan hidup yang ditunjukkan oleh pencangkokan RPC tunggal dan berulang adalah setara, tanpa kehilangan pencangkokan pada kedua kasus, meskipun terdapat makrofag. Secara keseluruhan, hal ini menunjukkan bahwa respons imun bawaan dan adaptif terhadap RPC yang berbeda secara genetik adalah moderat, meskipun penekanan imun tidak dilakukan. Selain itu, hasil uji ELISPOT menunjukkan tidak adanya respons penarikan antigen pada kelompok yang diobati dengan gmRPC, konsisten dengan anggapan bahwa sel T tidak memainkan peran penting dalam penolakan cangkok gmRPC dari tikus C57BL/6. Sekali lagi, infiltrasi makrofag pada cangkok gmRPC diamati, meskipun hal ini tidak terkait dengan kerusakan cangkok yang signifikan seperti yang terkait dengan penolakan imun klasik [22-24].

manfaat cistanche untuk pria-memperkuat sistem kekebalan tubuh

Bersama-sama, pengamatan ini mengungkapkan situasi yang jelas berbeda dari mekanisme penolakan transplantasi alogenik yang dimediasi sel T dan B yang diketahui secara luas yang terlihat pada jaringan lain. Berbagai faktor dapat menyebabkan situasi ini. Di satu sisi, ada anggapan bahwa mata adalah tempat yang memiliki "keistimewaan imun", meskipun sejauh mana cairan vitreus memiliki karakteristik yang sama dengan kornea dan retina masih kurang diteliti dan mungkin lebih diperdebatkan. Di sisi lain, RPC sendiri tampaknya menunjukkan penurunan imunogenisitas sebagai allograft, dibandingkan dengan tipe sel yang lebih sering dipelajari. Seperti yang telah kami tunjukkan sebelumnya, RPC murine tidak memiliki ekspresi awal antigen MHC kelas I dan kelas II, meskipun hal ini dapat diinduksi melalui stimulasi sitokin. Tidak adanya ekspresi MHC mungkin berkontribusi terhadap kelangsungan hidup sel-sel ini setelah transplantasi. Namun demikian, keberadaan sel imun pada cangkokan mendukung konsep bahwa toleransi cangkok pada keadaan ini tidak bersifat pasif dan merupakan hasil dari fenomena imunoregulatori yang aktif. Di sini, harus ditekankan bahwa jenis infiltrasi sel imun yang sama sudah terjadi setelah suntikan tunggal dan tidak diperburuk dengan pemberian dosis berulang, sehingga menggarisbawahi kesimpulan kami bahwa infiltrasi sel imun pada cangkokan, khususnya oleh makrofag, bukanlah hasil dari suntikan sebelumnya. sensitisasi tuan rumah. Dalam parameter percobaan ini, pemberian dosis berulang tampaknya tidak mengurangi viabilitas cangkok secara keseluruhan, yang konsisten dengan kemungkinan kemanjuran berkelanjutan dalam konteks terapeutik. Parameter alternatif, seperti interval antar suntikan yang berbeda, dapat meningkatkan atau mengurangi aktivitas sel kekebalan hingga tingkat yang relevan dengan aplikasi klinis. Apakah konstituen seluler dari infiltrat, termasuk dominasi makrofag, juga berlaku pada manusia masih belum jelas. Selain itu, kelangsungan hidup allograft ini mungkin tidak bergantung pada retina normal dengan penghalang darah-retina yang sehat. Penerima BALB/c yang digunakan di sini adalah albino dan rentan terhadap kerusakan ringan [30]. Selain itu, kelangsungan hidup yang berkelanjutan telah terlihat berulang kali dalam penelitian sebelumnya dengan berbagai model degenerasi retina (misalnya, [31]).

Dibandingkan dengan kelangsungan hidup cangkok, kelangsungan hidup sel dalam cangkokan menghadirkan situasi yang lebih kompleks. Diketahui adanya hilangnya sel progenitor SSP yang terjadi dengan cepat pasca transplantasi, kemungkinan besar disebabkan oleh berbagai faktor termasuk penghentian faktor pertumbuhan secara tiba-tiba. Setelah menetap di dalam mata, sel-sel yang terdisosiasi menyatu menjadi agregat seperti bola, yang pusatnya tampaknya menyediakan lingkungan mikro yang kurang optimal untuk pertumbuhan, mungkin karena kurangnya vaskularisasi dan tantangan terhadap difusi nutrisi. Tropisme makrofag yang tampak pada cangkokan RPC bisa jadi merupakan respons nonspesifik terhadap keberadaan sel-sel yang tidak dapat hidup ini di bagian dalam cangkokan, dengan makrofag berfungsi sebagai pemulung puing-puing seluler. Sebagai alternatif, RPC yang dapat hidup secara penuh mungkin secara aktif menarik makrofag, misalnya, melalui ekspresi sitokin yang menarik kemo, dimana sel inang akan bertemu dengan sisa-sisa dari sel donor yang tidak dapat hidup. Yang penting, tingkat infiltrasi makrofag yang terlihat pada pengaturan khusus ini tampaknya tidak memiliki konsekuensi negatif terhadap cangkok atau retina inang, berbeda dengan respons terhadap allograft seluler di tempat-tempat istimewa yang tidak memiliki kekebalan [4]. Yang terakhir, perlu disebutkan bahwa hasil yang dilaporkan di sini, meskipun terbatas pada model tikus, mungkin mempunyai implikasi pada pekerjaan pada manusia. Berbeda dengan tikus, kita tahu bahwa RPC manusia yang dikultur memang mengekspresikan antigen MHC kelas I dalam tingkat yang kuat pada awal; oleh karena itu, perbandingan tersebut memang bersifat tentatif. Namun demikian, menarik untuk dicatat bahwa uji klinis cangkok hRPC subretinal oleh sebuah kelompok di Tiongkok [13], serta transplantasi hRPC intravitreal oleh kelompok kami, kemudian menunjukkan kelangsungan hidup yang berkelanjutan dari allografts pada pasien non-imunosupresi dengan RP (JC). -01, [32], data tidak dipublikasikan). Hal ini juga terjadi setelah injeksi berurutan pada kedua mata (Ekstensi JC-01, data tidak dipublikasikan), serupa dengan karya yang disajikan di sini. Selain itu, kelangsungan hidup graft terlihat dalam penelitian lanjutan pada JC-02 [33], di mana dosis berulang berurutan diberikan pada mata yang sama [34]. Secara keseluruhan, temuan ini menunjukkan bahwa penekanan kekebalan tidak selalu diperlukan dalam konteks transplantasi progenitor saraf, khususnya pada mata, meskipun batasan fenomena ini dan mekanisme pengaturan yang mendasarinya masih harus dijelaskan.

4. Bahan dan Metode

4.1. Budaya sel

GmRPC yang sebelumnya dikarakterisasi [31] dipilih sebagai sel donor untuk penelitian alogenik ini. Awalnya, gmRPC diisolasi dari tikus C57BL/6 transgenik GFP yang dimodifikasi secara genetik untuk mengekspresikan protein fluoresen hijau (GFP) yang ditingkatkan. Ekspresi protein GFP dalam gmRPCs menarik karena memungkinkan visualisasi cangkokan setelah injeksi tanpa memerlukan pelabelan tambahan. Untuk penelitian saat ini, gmRPC dikultur dalam DMEM/F12 Lanjutan yang dilengkapi dengan Suplemen N-2 (1:100, Life Technology, Carlsbad, CA, USA), Glutamax-1 (1:100, Life Technology , Carlsbad, CA, USA), dan EGF (20 ng/mL, rekombinan, Human, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) dan diinkubasi pada suhu 37 ◦C dan 5% CO2. Sel-sel dipertahankan dalam suspensi campuran/koloni yang melekat secara longgar dalam labu kultur jaringan yang tidak dilapisi. Sel-sel dilewatkan melalui trypsinization dengan TrypLE Select CTS (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) yang diencerkan 1:5 dalam PBS selama satu menit dan dinetralkan dengan 10 kali volume trypsin yang ditambahkan. Campuran sel-tripsin disentrifugasi pada 140 g selama 2 menit pada suhu kamar, supernatan dihilangkan, dan pelet sel diresuspensi dalam media segar sebelum disemai ke labu kultur jaringan pada konsentrasi yang diinginkan. Konsentrasi dan viabilitas sel ditentukan melalui pewarnaan trypan blue; penghitungan dilakukan oleh Countess (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) dan hemocytometer.

Untuk injeksi intravitreal, pelet sel diresuspensi pada 50K sel/µL dalam BSS PLUS®. Konsentrasi dan viabilitas sel dievaluasi sebelum dan sesudah injeksi. Dosis yang disuntikkan adalah 50,000 sel per mata per injeksi. Dosis dan pembawa dipilih berdasarkan penelitian kami sebelumnya.

4.2. Hewan Eksperimental

Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menyelidiki potensi respons imun alogenik yang diinduksi melalui injeksi RPC alogenik intravitreal berulang. Hewan penerima adalah tikus BALB/c, yang secara genetik berbeda dari tikus C57BL/6 tempat gmRPC diisolasi. Penggunaan setidaknya tiga hewan per kelompok eksperimen yang diberi perlakuan untuk setiap titik waktu dianggap diperlukan untuk memungkinkan evaluasi signifikansi statistik antar kelompok sehubungan dengan variabel hasil dan potensi kehilangan hewan selama periode eksperimen. Selain itu, mengingat banyaknya faktor tambahan yang berpotensi mempengaruhi hasil percobaan, seperti prosedur injeksi sel yang gagal atau potensi penyusutan akibat perkelahian dengan hewan, prosedur injeksi dilakukan pada lima hewan per kelompok untuk lebih memastikan terpenuhinya jumlah minimum yang diperlukan untuk analisis statistik.

cistanche tubulosa-meningkatkan sistem kekebalan tubuh

Tabel 1 menunjukkan empat kelompok hewan yang dipersiapkan untuk masing-masing empat titik waktu (4, 7, 14, dan 28 hari) di mana evaluasi histopatologi, termasuk imunofluoresensi, akan dilakukan. Dua kelompok hewan tambahan yang disuntik dengan 10ˆ6 gmRPC secara intraperitoneal disiapkan sebagai kontrol positif untuk masing-masing dari dua titik waktu evaluasi ELISPOT (14 dan 28 hari). Tabel 2 merangkum evaluasi yang dijadwalkan untuk setiap kelompok.

Tabel 1. Kelompok eksperimen.

Tabel 2. Poin waktu evaluasi.

4.3. Injeksi Intravitreal

GmRPC diberikan melalui injeksi intravitreal. Setelah dibius, Mydriacyl (larutan mata Tropicamide 1%) dan Phenylephrine (larutan mata 2,5%) dioleskan pada kedua mata hewan yang akan disuntikkan. Ketika midriasis yang memadai telah tercapai, hewan tersebut ditahan secara manual dan kepala hewan diputar untuk menyelaraskan sumbu okular mata untuk disuntik dengan optik mikroskop bedah sehingga dapat memvisualisasikan segmen posterior okular (yaitu vitreous dan retina). . Mata dimasukkan dengan lembut secara manual melalui tekanan pada kelopak mata dan jarum 31G pada jarum suntik insulin digunakan untuk menusuk dengan lembut sklera yang berdekatan dengan limbus di kuadran hidung inferior. Ujung mikropipet kaca yang dipoles berisi sel donor (atau kendali kendaraan) dimasukkan melalui sayatan ke dalam rongga vitreous di bawah visualisasi langsung. Perhatian diberikan agar tidak mengganggu integritas lensa atau struktur segmen posterior. Sel atau wahananya saja disuntikkan dalam volume 1 mikroliter. Setelah beberapa saat jeda untuk memungkinkan keseimbangan tekanan intraokular, ujung pipet secara bertahap dikeluarkan dari mata, semuanya di bawah visualisasi langsung. Setiap perdarahan intraokular dicatat, beserta lokasinya. Setelah penyuntikan, hewan tersebut ditempatkan dalam kandang bersih yang dilapisi dengan bantalan sekali pakai baru yang diorientasikan dengan sisi penyerap menghadap ke atas/sisi plastik ke bawah, untuk pemulihan. Pemulihan difasilitasi dengan menggunakan bantalan pemanas dan diverifikasi oleh kemampuan hewan untuk ambulasi. Setelah bangun tidur, hewan dipindahkan ke kandang pasca operasi dengan akses air ad libitum. Hewan dipantau secara visual setiap hari pasca operasi. Minimal atau tidak ada tanda-tanda yang berhubungan dengan injeksi intraokular yang diamati.

Setelah prosedur, hewan-hewan tersebut diamati karena adanya gesekan pada mata yang dioperasi, bulu yang acak-acakan, atau kelesuan yang berkelanjutan, yang semuanya menjadi alasan untuk segera dilakukan euthanasia. Ada dua hewan yang dimusnahkan akibat luka yang diderita dalam perkelahian. Semua hewan lainnya dimusnahkan pada titik akhir yang direncanakan. Eutanasia dilakukan melalui inhalasi CO2.

4.4. Pemeriksaan Mata

A Leica Ultimate Red Reflex Surgical Microscope was used for ophthalmic examination and photography of experimental mice. Sedation was performed with a Ketamine Hydrochloride/Xylazine Hydrochloride mixture (50–100 mg/mL Ketamine, 5–10 mg/mL Xylazine) administered by intraperitoneal injection. After sedation, topical mydriatics (Tropicamide, Phenylephrine) were applied to the eye(s) to be imaged in 5 min intervals until adequate mydriasis was achieved, as determined via pupil diameter (>2,5 mm) dan respon terhadap rangsangan cahaya. Sebagai kompensasi atas hilangnya kedipan, larutan hypromellose (Gonak) dioleskan sesuai kebutuhan pada kedua mata untuk mencegah pengeringan kornea. Untuk prosedur pencitraan, hewan yang dianestesi ditempatkan pada bantalan pemanas dan diposisikan dalam posisi berbaring telentang. Pada akhir prosedur, pembalikan sebagian anestesi dicapai dengan pemberian Atipamezole (0.1–1 mg/kg) melalui injeksi intraperitoneal.

4.5. Histopatologi

Respon imun pada hewan yang menerima dua cangkok berurutan (satu di setiap mata) dievaluasi melalui histopatologi kedua mata pada hari ke 4, hari ke 7, hari ke 14, dan hari ke 28 ± 1 setelah injeksi mata kedua. Tikus yang diberi perlakuan sesuai Tabel 1 dihentikan berdasarkan jadwal yang tercantum pada Tabel 2. Hewan di-eutanasia dengan menggunakan inhalasi karbon dioksida. Perfusi jantung dilakukan pada hewan percobaan dengan 2% paraformaldehyde (PFA) dalam phosphate-buffered saline (PBS). Kemudian, semua bola mata dikumpulkan dan direndam dalam PFA/PBS 2% selama 48 jam pada suhu 4◦C. Bola mata cekat diproses melalui gradien sukrosa (10% sukrosa dalam PBS selama 1 jam pada suhu kamar, 20% sukrosa dalam PBS selama 1 jam pada suhu kamar, dan 30% sukrosa dalam PBS pada suhu 4 ◦C semalam) sebelum ditanamkan ke dalam Media OCT untuk cryosectioning. Cryosections (10 µm) mata diwarnai dengan Harrison hematoxylin dan eosin (H&E) untuk memvisualisasikan mikroanatomi retina dan menemukan lokasi sel donor yang disuntikkan.

Untuk kelompok yang diobati dengan gmRPC, cryosection dievaluasi menggunakan imunofluoresensi untuk sel GFP+ (donor). Identifikasi jenis sel imun spesifik yang ada di mata dilakukan melalui pelabelan dengan antibodi primer spesifik sebagai berikut: CD3 (penanda limfosit T) [35], CD45R (penanda limfosit B) [36], Iba-1 (penanda makrofag dan mikroglia teraktivasi) [37], Ly-6G (penanda neutrofil) [38], dan CD49b (penanda sel pembunuh alami) [39]. Cryosection dicuci dalam PBS tiga kali pada suhu kamar dan diblokir dengan 0.03% Triton X-100 dan 10% serum kambing normal dalam PBS (NGS; Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA) untuk 1 jam pada suhu kamar. CD3 anti tikus tikus (pengenceran 1:100, BD Biosciences, San Jose, CA, USA), CD45R anti tikus tikus (1:100, BD Biosciences, San Jose, CA, USA), Iba anti tikus kelinci{{ 26}} (pengenceran 1:400, Wako Chemicals, Richmond, VA, USA), anti tikus Ly-6G (pengenceran 1:100, BD Biosciences, San Jose, CA, USA), dan anti tikus -mouse CD49b (pengenceran 1:100, BD Biosciences, San Jose, CA, USA) diaplikasikan pada sampel dan diinkubasi semalaman pada suhu 4 derajat. Sampel dicuci kembali dalam PBS sebanyak 3 kali pada suhu kamar. Antibodi sekunder terkonjugasi Alexa-Fluor (Alexa-Flour anti-tikus kambing-568 dan Alexa-Flour anti-kelinci kambing-568, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) diterapkan pada sampel selama 1 jam pada suhu kamar. Semua sampel kemudian dicuci dalam PBS tiga kali lagi pada suhu kamar. Kaca penutup dipasang menggunakan DAPI Fluoromount-G (Southern Biotech, Birmingham, AL, USA), dan slide dibiarkan kering semalaman pada suhu kamar.

4.6. Tes ELISPOT dan MLR

Sel T memori spesifik RPC dipantau pada 2 dan 4 minggu setelah penempatan cangkok pertama melalui uji enzim-linked immunosorbent spot (ELISPOT). Kelompok eksperimen dibentuk seperti yang ditunjukkan pada Tabel 1 dan 2 untuk setiap titik waktu. Uji ELISPOT menangkap protein yang disekresikan pada lempeng mikro berlapis antibodi spesifik dan dapat digunakan untuk menentukan aktivasi sel T memori dengan mendeteksi sekresi IFN sel T. Pembacaan eksperimental adalah jumlah titik IFN pada lempeng mikro. Jumlah bintik IFN yang ada menunjukkan jumlah sel T yang diaktifkan. Frekuensi sel T aloreaktif dinilai dengan melakukan reaksi leukosit campuran (MLR) selama 48 jam pada pelat Multiscreen-IP 96-well (Millipore, Burlington, MA, USA). Sel responden adalah limfosit/splenosit yang mengandung sel T yang dimurnikan dari kelenjar getah bening serviks (CLNs) dan limpa hewan percobaan, dan sel stimulator adalah gmRPC yang awalnya berasal dari tikus C57BL/6. Tes ELISPOT dilakukan berdasarkan protokol standar. 96-pelat Multiscreen-IP dengan baik telah dibasahi terlebih dahulu dengan 15 µL etanol 35% per sumur dalam kondisi steril. Pelat dicuci dengan PBS steril tiga kali sebelum 100 µL antibodi penangkap IFN (klon AN-18, eBioscience, San Diego, CA, USA) yang diencerkan dalam PBS (2 µg/mL) diaplikasikan pada pelat. Pelat diinkubasi semalaman pada suhu 4 derajat sebelum pengujian MLR dilakukan pada pelat. Pelat yang dilapisi antibodi penangkap dicuci tiga kali dengan PBS dan kemudian diblokir dengan RPMI1640 selama 2 jam pada suhu 37 ◦C.

Masing-masing pelat pengujian mencakup kontrol berikut: sumur yang tidak mengandung sel, sumur yang berisi sel tanpa rangsangan, dan sumur yang berisi sel dengan perlakuan phorbol {{0}}myristate 13-asetat (PMA) dan ionofor Ca sebagai kontrol positif. Pengobatan PMA berfungsi sebagai kontrol positif dengan meniru pembawa pesan kedua, DAG, untuk mengaktifkan jalur reseptor sel T dan pada gilirannya menyebabkan aktivasi sel T, dengan ionofor Ca memfasilitasi masuknya ion kalsium ke dalam sel. Pelat diinkubasi selama 36 jam pada suhu 37 ◦C sebelum reaksi warna. Pelat dicuci dengan PBS yang mengandung {{10}}.01% Tween 20 enam kali dan kemudian 100 μL antibodi pendeteksi (klon R64A2, eBioscience, San Diego, CA, USA), diencerkan dalam PBS (0,5 µg/mL) diterapkan pada setiap sumur. Pelat diinkubasi pada suhu 37 ◦C selama 2 jam tambahan. Pelat dicuci lagi dengan 0,01% Tween 20 dalam PBS. 100 μL Streptavidin-AP (pengenceran 1:1000, Invitrogen) diterapkan per sumur dan pelat diinkubasi selama 45 menit pada suhu kamar. Semua pelat dicuci tiga kali lagi dengan 0,01% Tween 20 dalam PBS dan PBS saja sebanyak tiga kali. Terakhir, 100 µL BCIP/NBT (Sigma Aldrich, Munich, Jerman) ditambahkan ke masing-masing sumur untuk pewarnaan. Semua pelat dicuci secara ekstensif dengan air keran dan dikeringkan sebelum analisis data.

cistanche tubulosa-meningkatkan sistem kekebalan tubuh

5. Kesimpulan

Studi ini menunjukkan bahwa cangkokan binokular berurutan dari RPC alogenik ke rongga vitreous tidak memicu penolakan imun klasik pada tikus. Meskipun diketahui bahwa studi histologis alogenik ini tidak dapat dilakukan dengan produk klinis RPC manusia, data tersebut tampak konsisten dengan hasil studi keamanan klinis (jCyte, JC-01E, data tidak dipublikasikan) pada pasien dengan retinitis pigmentosa menerima suntikan bilateral non-kontemporer tanpa pengobatan imunosupresif. Meskipun sulit untuk membandingkan kedua penelitian secara langsung, patut dicatat bahwa hasil keseluruhan dari keduanya menunjukkan kesamaan dalam hal kelangsungan hidup allograft.

Referensi

1. Hori, J.; Ng, TF; Shatos, M.; Klassen, H.; Streilein, JW; Muda, sel progenitor saraf MJ kurang imunogenisitas dan tahan terhadap kerusakan seperti allograft. Sel Induk 2003, 21, 405–416. [Ref Silang] [PubMed]

2. Klassen, H.; Schwartz, PH; Ziaeian, B.; Nethercott, H.; Muda, MJ; Bragadottir, R.; Tullis, GE; Warfvinge, K.; Narfstrom, K. Prekursor saraf yang diisolasi dari otak kucing yang sedang berkembang menunjukkan integrasi retina setelah transplantasi ke retina kucing distrofi. Dokter hewan. Oftalmol. 2007, 10, 245–253. [Ref Silang] [PubMed]

3. Salado-Manzano, C.; Perpina, U.; Straksia, M.; Molina-Ruiz, FJ; Cozzi, E.; Rosser, AE; Canals, JM Apakah Respon Imunologis Merupakan Hambatan Terapi Sel pada Penyakit Neurodegeneratif? Depan. Ilmu Neuro Sel. 2020, 14, 250. [Referensi Silang]

4. Petrus-Reurer, S.; Romano, M.; Howlett, S.; Jones, JL; Lombardi, G.; Saeb-Parsy, K. Pertimbangan dan tantangan imunologis untuk terapi seluler regeneratif. Komunitas. biologi. 2021, 4, 798. [Referensi Silang]

5. Bucher, K.; Rodriguez-Bocanegra, E.; Dauletbekov, D.; Fischer, MD Respon imun terhadap terapi gen retina menggunakan vektor virus yang tidak terkait - Implikasinya terhadap keberhasilan dan keamanan pengobatan. Prog. Retin. Resolusi Mata. 2021, 83, 100915. [Referensi Silang]

6. Singh, MS; Taman, SS; Albini, TA; Canto-Soler, MV; Klassen, H.; MacLaren, RE; Takahashi, M.; Nagiel, A.; Schwartz, SD; Bharti, K. Transplantasi sel induk retina: Menyeimbangkan keamanan dan potensi. Prog. Retin. Resolusi Mata. 2020, 75, 100779. [Referensi Silang]

7. Kamao, H.; Mandai, M.; Okamoto, S.; Sakai, N.; Suga, A.; Sugita, S.; Kiryu, J.; Takahashi, M. Karakterisasi lembaran sel epitel pigmen retina yang diturunkan dari sel induk berpotensi majemuk yang diinduksi manusia yang bertujuan untuk aplikasi klinis. Rep Sel Induk 2014, 2, 205–218. [Referensi Silang]

8. Sugita, S.; Kamao, H.; Iwasaki, Y.; Okamoto, S.; Hashiguchi, T.; Iseki, K.; Hayashi, N.; Mandai, M.; Takahashi, M. Penghambatan aktivasi sel T oleh sel epitel pigmen retina yang berasal dari sel induk berpotensi majemuk yang diinduksi. Selidiki. Oftalmol. Vis. Sains. 2015, 56, 1051–1062. [Referensi Silang]

9. McGill, TJ; Stoddard, J.; Renner, LM; Messaoudi, saya.; Bharti, K.; Mitalipov, S.; Lauer, A.; Wilson, DJ; Neuringer, M. Kegagalan Cangkok Sel RPE Berasal iPSC Alogenik Setelah Transplantasi Ke Ruang Subretinal pada Primata Bukan Manusia. Selidiki. Oftalmol. Vis. Sains. 2018, 59, 1374–1383. [Referensi Silang]

10. Sugita, S.; Mandai, M.; Kamao, H.; Takahashi, M. Aspek imunologi transplantasi sel RPE. Prog. Retin. Resolusi Mata. 2021, 84, 100950. [Referensi Silang]

11. Nair, DSR; Thomas, BB Strategi Pengobatan Berbasis Stem Cell untuk Penyakit Degeneratif Retina. Saat ini. Res Sel Induk. Ada. 2022, 17, 214–225. [Ref Silang] [PubMed]

12. Martinez Velasquez, LA; Ballios, BG Generasi Berikutnya Terapi Molekuler dan Seluler untuk Penyakit Retina yang Diwarisi. Int. J.Mol. Sains. 2021, 22, 11542. [Referensi Silang]

13. Liu, Y.; Chen, SJ; Li, SY; Qu, LH; Meng, XH; Wang, Y.; Xu, HW; Liang, ZQ; Yin, ZQ Keamanan jangka panjang transplantasi sel progenitor retina manusia pada pasien retinitis pigmentosa. Res Sel Induk. Ada. 2017, 8, 209. [Referensi Silang] [PubMed]

14. Wang, Y.; Tang, Z.; Gu, P. Transplantasi berbasis sel induk/progenitor untuk degenerasi retina: Tinjauan uji klinis. Kematian Sel Dis. 2020, 11, 793. [Ref Silang] [PubMed]

15. Jerman, OL; Vallese-Maurizi, H.; Soto, TBC; Rotstein, NP; Politi, sel induk LE Retina, harapan dan hambatan. Sel Punca J. Dunia 2021, 13, 1446–1479. [Referensi Silang]

16. Karamali, F.; Behtaj, S.; Babaei-Abraki, S.; Hadady, H.; Atefi, A.; Savoj, S.; Soroushzadeh, S.; Najafian, S.; Nasr Esfahani, MH; Klassen, H. Strategi terapi potensial untuk degenerasi fotoreseptor: Jalan untuk memulihkan penglihatan. J.Terjemahan. medis. 2022, 20, 572. [Referensi Silang]

17. Semo, M.; Haamedi, N.; Stevanato, L.; Carter, D.; Brooke, G.; Muda, M.; Kopi, P.; Sinden, J.; Patel, S.; Vugler, A. Khasiat dan Keamanan Sel Progenitor Retina Manusia. Terjemahan. Vis. Sains. Teknologi. 2016, 5, 6. [Referensi Silang]

18. Mochizuki, M.; Sugita, S.; Kamoi, K. Homeostasis imunologis mata. Prog. Retin. Resolusi Mata. 2013, 33, 10–27. [Referensi Silang]

19. Yamasaki, S.; Sugita, S.; Horiuchi, M.; Masuda, T.; Fujii, S.; Makabe, K.; Kawasaki, A.; Hayashi, T.; Kuwahara, A.; Kishino, A.; dkk. Imunogenisitas Rendah dan Sifat Imunosupresif Retina Berasal ESC dan iPSC Manusia. Perwakilan Sel Induk 2021, 16, 851–867. [Referensi Silang]

20. Klassen, H.; Schwartz, BAPAK; Bailey, AH; Muda, penanda Permukaan MJ yang diekspresikan oleh sel progenitor saraf manusia dan tikus multipoten termasuk tetraspanin dan epitop non-protein. ilmu saraf. Biarkan. 2001, 312, 180–182. [Referensi Silang]

21. Klassen, H.; Ziaeian, B.; Kirov, II; Muda, MJ; Schwartz, PH Isolasi sel progenitor retina dari jaringan manusia post-mortem dan perbandingan dengan progenitor otak autologus. J. Ilmu Saraf. Res. 2004, 77, 334–343. [Referensi Silang]

22. Ingulli, E. Mekanisme penolakan sel dalam transplantasi. dokter anak. Nefrol. 2010, 25, 61–74. [Referensi Silang]

23. Issa, F.; Schiopu, A.; Wood, KJ Peran sel T dalam penolakan cangkok dan toleransi transplantasi. Pakar Pendeta Clin. imunol. 2010, 6, 155–169. [Ref Silang] [PubMed]

24. Nasr, M.; Sigdel, T.; Sarwal, M. Kemajuan dalam diagnostik penolakan transplantasi. Pakar Pdt. Mol. Diagnosis. 2016, 16, 1121–1132. [Ref Silang] [PubMed]

25. Klassen, H.; Imfeld, Kuala Lumpur; Sinar, J.; Muda, MJ; Gage, FH; Berman, MA Sifat imunologi sel progenitor hipokampus dewasa. Vis. Res. 2003, 43, 947–956. [Ref Silang] [PubMed]

26. Weinger, JG; Barat, BM; Anyaman, WC; Klaus, SM; Walsh, CM; Lane, ketidakcocokan TE MHC menyebabkan penolakan sel progenitor saraf setelah transplantasi sumsum tulang belakang dalam model demielinasi yang disebabkan oleh virus. Sel Induk 2012, 30, 2584–2595. [Ref Silang] [PubMed]

27. ReNeuron, L. First-in-Human Fase I/IIa, Label Terbuka, Studi Prospektif tentang Keamanan dan Tolerabilitas Sel Progenitor Retina Manusia (hRPC) yang Ditransplantasikan Secara Subretinal pada Pasien dengan Retinitis Pigmentosa (RP). Uji Klinis#NCT02464436. Tersedia online: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02464436 (diakses pada 27 Februari 2023).

28. Lu, B.; Lin, Y.; Tsai, Y.; Giman, S.; Adamus, G.; Jones, MK; Shelley, B.; Svendsen, CN; Wang, S. Transplantasi Progenitor Syaraf Manusia Selanjutnya ke Retina yang Degenerasi Tidak Mengganggu Kelangsungan Hidup Cangkok Awal atau Kemanjuran Terapi. Terjemahan. Vis. Sains. Teknologi. 2015, 4, 7. [Referensi Silang] [PubMed]

29. Jones, MK; Lu, B.; Giman, S.; Wang, S. Strategi terapi berbasis sel untuk penggantian dan pelestarian penyakit degeneratif retina. Prog. Retin. Resolusi Mata. 2017, 58, 1–27. [Ref Silang] [PubMed]

30. Lonceng, BA; Kaul, C.; Bonilha, VL; Rayborn, AKU; Sadrakh, K.; Hollyfield, JG Tikus BALB/c: Pengaruh pencahayaan vivarium standar pada patologi retina selama penuaan. Contoh. Resolusi Mata. 2015, 135, 192–205. [Referensi Silang]

31. Klassen, HJ; Ng, TF; Kurimoto, Y.; Kirov, saya.; Shatos, M.; Kopi, P.; Muda, nenek moyang retina multipoten MJ mengekspresikan penanda perkembangan, berdiferensiasi menjadi neuron retina, dan mempertahankan perilaku yang dimediasi cahaya. Selidiki. Oftalmol. Vis. Sains. 2004, 45, 4167–4173. [Referensi Silang]

32. jCyte, Inc. Keamanan Injeksi Intravitreal Tunggal Sel Progenitor Retina Manusia (jCell) pada Retinitis Pigmentosa. Uji Klinis#NCT02320812. Tersedia online: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02320812 (diakses pada 24 Februari 2023).

33. jCyte, Inc. Keamanan dan Kemanjuran Injeksi Intravitreal Sel Progenitor Retina Manusia pada Orang Dewasa dengan Retinitis Pigmentosa. Uji Klinis# NCT03073733. Tersedia online: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03073733 (diakses pada 24 Februari 2023).

34. jCyte, Inc. Keamanan Pengulangan Injeksi Intravitreal Sel Progenitor Retina Manusia (sel) pada Subjek Dewasa dengan Retinitis Pigmentosa. Uji Klinis#NCT04604899. Tersedia online: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT04604899 (diakses pada 24 Februari 2023).

35. Oudejans, JJ; van der Valk, P. Klasifikasi imunohistokimia neoplasma sel T dan sel NK. J.Klin. jalan. 2002, 55, 892. [Ref Silang] [PubMed]

36. Tostanoski, LH; Chiu, YC; Gammon, JM; Simon, T.; Andorko, JI; Bromberg, JS; Jewell, CM Memprogram Ulang Lingkungan Mikro Kelenjar Getah Bening Lokal Meningkatkan Toleransi yang Bersifat Sistemik dan Spesifik Antigen. Perwakilan Sel 2016, 16, 2940–2952. [Ref Silang] [PubMed]

37. Jurga, AM; Paleczna, M.; Kuter, KZ Tinjauan Umum dan Penanda Diskriminatif Fenotipe Mikroglia Diferensial. Depan. Ilmu Neuro Sel. 2020, 14, 198. [Ref Silang] [PubMed]

38. Li, JC; Zou, XM; Yang, SF; Jin, JQ; Zhu, L.; Li, CJ; Yang, H.; Zhang, AG; Zhao, TQ; Chen, CY Perangkap ekstraseluler neutrofil berpartisipasi dalam perkembangan trombosis terkait kanker pada pasien dengan kanker lambung. Dunia J. Gastroenterol. 2022, 28, 3132–3149. [Referensi Silang]

39. Kee, BL Pengembangan Sel Pembunuh Alami dan ILC1. Ensiklus. imunobiol. 2016, 1, 140–148.