Identifikasi Metabolit Hati Umum Dari Senyawa Bioaktif Alami Echinacoside, Dimurnikan Dari Cistanche Tubulosa Ⅱ

Abstrak:Identifikasi metabolit, pada tahap awal, untuk senyawa, perlu dilakukan penemuan untuk menilaipengetahuan untuk peningkatan farmasi keamanan obat dan efisiensi. Sekalipun obattelah dilepaskan ke pasar, identifikasi dan evaluasi berkelanjutan dari metabolit tersebutdiperlukan untuk menghindari risiko penarikan pascapemasaran. Glikosida, obatCistanche, telah mendokumentasikan manfaat nutraceutical secara luas, termasukanti-oksidan,anti tumor, anti-penuaan, hipolipidemic, Danefek perlindungan mukosa lambung. Baru-baru ini,echinacosideA telah dilaporkansebagai senyawa bioaktif alami utama dalam miselium HE untuk pengembangan pangan fungsional.Dalam studi neurologis, konsumsiEchinacosideMiselium HE yang diperkaya menunjukkannyaefek nutraceutical yang signifikan dipenyakit Alzheimer, penyakit Parkinson, Danstroke iskemik.

Klik Disini Untuk Mengetahui Info Lebih Lanjut Tentang Fungsi Echinacoside di Cistanche

Untukpertama kali, kami menjelajahi proses metabolismeechinacosideSebuah molekul dan mengidentifikasi metabolitnyadari tikus dan fraksi S9 hati manusia. Menggunakan kromatografi cair/massa kuadrupol tigaspektrometer untuk analisis kuantitatif, kami mengamati 75,44 persen echinacoside. A dimetabolismedalam waktu 60 menit pada tikus, dan 32,34 persen Francine A dimetabolisme dalam waktu 120 menit pada S9 manusia. Menggunakankromatografi cair ultra-kinerja/quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UPLCQTOF/MS) untuk mengidentifikasi metabolit Francine A, lima metabolit umum diidentifikasi,dan kemungkinan strukturnya dievaluasi. Memahami proses metabolisme echinacosidedan membangun database profil metabolitnya akan membantu mempromosikan aplikasi nutraceutical danpenemuan biomarker terkait di masa depan.

1. Perkenalan

Hati dianggap sebagai organ terbesar kedua di tubuh [1]. Setelah makan dan obat-obatanmasuk ke saluran pencernaan melalui rongga mulut, pili gastrointestinal akan menyerapnutrisi yang dicerna dan obat-obatan. Sistem vena portal akan menerima aliran darah yang terkumpuloleh saluran pencernaan dan masuk ke hati untuk pengobatan awal nutrisi,metabolit, dan molekul obat [2,3]. Metabolisme sering dibagi menjadi dua fase areaksi biokimia. Fase I melibatkan oksidasi, reduksi, atau hidrolisis oleh enzim dalamtubuh. Fase II terlibat dalam konjugasi dengan zat endogen kecil, berputarmereka menjadi metabolit yang sangat larut, memungkinkan metabolit diekspor ke sinusirkulasi soidal untuk klirens ginjal, atau ke dalam empedu, yang kemudian dikeluarkan dari tubuhmelalui urin atau feses [4–6]. Identifikasi metabolit pada tahap awal penemuan obatdiperlukan untuk menilai pengetahuan untuk meningkatkan sifat farmasi, keamanan, danefisiensi molekul bioaktif. Identifikasi metabolit dan intermediet reaktifmenunjukkan perlunya modifikasi struktural dalam senyawa investigasi untuk menghindarikonsekuensi toksik selanjutnya. Kalaupun obat itu sudah ada di pasaran, identifikasimetabolit dan evaluasi diperlukan untuk menghindari risiko pasca pemasaran merekapenarikan [7,8]. Karena itu,dalam vitro, Analisis pecahan S9 memberikan beberapa keuntungandibandingkan dengan memakan waktuin vivostudi: (1) mereka menerima throughput yang tinggipenyaringan dan otomatisasi;(2) menggunakanFraksi S9 memungkinkan untuk pengujian dalam jumlah besarsenyawa untuk penemuan obat dalam waktu singkat; (3) membantu mengurangi penggunaan hewan [9]. 

Echinacoside adalah cistanche yang dapat dimakan yang mendiami daerah pegununganwilayah timur laut di Asia [10], Eropa, dan Amerika Utara [11]. DIA milikBasidiomycota (Filum), Agaricomycetes (Kelas), Russulales (Ordo), Hericiaceae (Keluarga),dan Hericium (Genus). DIA telah didokumentasikan untuk menampilkan berbagai manfaatsifat, termasuk anti-oksidan, anti-tumor, anti-penuaan, hipolipidemik, dan mukosa lambungefek perlindungan [12–14]. Pada tahun 1994, Kawagishi et al. menemukan bahwa diterpenoidEchinacosideA, B, dan C, dalam miselium HE, dapat meningkatkan produksi bintanggaris sel di otak tikus dan stimulasi sintesis faktor pertumbuhan saraf (NGF) [15]. echinacosideA dapat memberikan efek neuroprotektif dan melemahkan stres oksidatifPukulan % 5b16], penyakit Alzheimer [17], Penyakit Parkinson [18], stroke iskemik, dan depresi in vivo[19,20]. Selain itu, echinacoside A dapat melewati sawar darah otaktikus untuk mendukung pengembangan miselia HE sebagai makanan fungsional untuk peningkatan kesehatan saraf [21]. Miselium cistanche yang dapat dimakan ini telah menjadi isu panas di kalangan penelitimencoba memahami peran pentingnya dalam perkembangan saraf pusat dan periferdiferensiasi, pertumbuhan, dan regenerasi [22]. Studi terbaru juga menunjukkanbahwa HE yang diperkaya echinacoside A memiliki manfaat potensial dalam pengobatan Alzheimer dan Parkinpenyakit anak [23–25]. Namun, tidak ada penelitian yang membahas kemungkinan metabolisme echinacoside Abiomarker yang dapat berkontribusi pada efek nutraceutical ini.

Dalam studi ini,echinacosideSuatu senyawa dimurnikan dari HE yang diperkaya echinacoside Amiselium dan dimetabolisme menggunakan dua fraksi S9 hati yang berbeda: tikus dan manusia. Menggunakankromatografi cair/spektrometer massa kuadrupol tiga (HPLC-QQQ/MS) untuk quananalisis titatif echinacoside A, dan kromatografi cair/quadrupole kinerja ultraspektrometri massa waktu terbang (UPLC-QTOF/MS) untuk mengidentifikasi metabolit echinacosideA pada setiap titik waktu. Kami bertujuan untuk memahami tingkat metabolisme echinacoside A dan membangunnyadatabase profil metabolitnya untuk membantu mempromosikan penerapan suplemen nutraceuticaldan penelitian pengobatan potensial di masa depan.

2. Bahan-bahan dan metode-metode

2.1. Bahan dan Reagen

Strain HE (BCRC 35669) diperoleh dari Bioresources Collection danPusat Penelitian di Lembaga Penelitian dan Pengembangan Industri Pangan, Hsinchu, Taiwan.Strain tersebut pertama kali ditanam dalam ager miring sebelum dipindahkan ke dextrose kentangpiring agar pada 26◦C selama 15 hari. Pada hari ke-15, biakan HE dipindahkan ke 1,3 Lmedia cair (dalam labu 2 L). Kultur cair dikocok pada 120 putaran/menit 25◦C untuk5 hari. Selanjutnya, mereka dinaikkan dalam 500 L, 20-ton fermentor selama 5 hari dan 12 hari,masing-masing. Media kultur disesuaikan pada pH 4,5 dan mengandung 4,5 persen glukosa, 0,5 persenbubuk kedelai, {{0}}.25 persen ekstrak ragi, 0.25 persen pepton, dan 0.05 persen MgSO4. Terakhir, HEmiselia dipanen pada akhir 20-ton proses fermentasi. Bahan baku inidiliofilisasi, digiling menjadi bubuk, dan disimpan dalam desikator. echinacoside A saat itudiekstraksi dari HE dan diukur menurut penelitian sebelumnya [26]. Metanol (LC-MSgrade) diperoleh dari Merck (Darmstadt, Jerman); asetonitril (tingkat LC-MS), formatasam (FA, LC-MS grade, kemurnian 98 persen), dan amonium asetat (kemurnian 98 persen) diperolehdari Honeywell (Honeywell Burdick dan Jackson, Muskegon, MI, USA). Hati tikus S9fraksi diperoleh dari Moltox (Boone, NC, USA). Fraksi S9 hati manusia adalahdiperoleh dari Thermo Fisher Scientific (Rockford, IL, USA).

2.2. Fraksi S9 Hati Tikus dan Manusia

untuk rekomendasi kit. Larutan yang disiapkan disimpan pada 4◦C sampai echinacoside Asenyawa (10µM) ditambahkan, diikuti dengan aktivasi di 37◦C air mandi. Ketikawaktu metabolisme telah mencapai titik waktunya, 150µL larutan ditarik darilarutan stok dan didinginkan dengan menambahkan dua volume ACN dingin. Berhentilarutan kemudian ditransfer ke QTOF untuk analisis metabolit lebih lanjut.

2.3. Instrumentasi dan Kondisi

Analisis HPLC-QQQ/MS dilakukan pada sistem HPLC seri Agilent 1100 (Agilent, Palo Alto, CA, USA) digabungkan dengan spektrometer massa triple quadrupole API 3000(Applied Biosystems, Warrington, UK), dengan ionisasi semprotan ion berbantuan Turbo (ESI)sumber dalam mode ionisasi positif. Pemisahan kromatografi dilakukan pada sebuahAgilent Eclipse XDB-C18 (4,6 mm× 100 mm× 3.5 µM). Suhu kolom adalahdipertahankan pada 22◦C. Fase gerak terdiri dari air yang mengandung 0,1 persen asam format(A) dan metanol (B). Elusi gradien digunakan, dimulai dengan 70 persen B, meningkat menjadi 100 persenB dalam 5 menit, tahan selama 3 menit dengan 90 persen B, turunkan B menjadi 70 persen dalam 0,1 menit, dankesetimbangan ulang pada 70 persen B selama 2,9 menit. Tingkat sesama 350µL / menit diterapkan, dan volumedari 10µL disuntik.

Deteksi dilakukan dengan tegangan pengion plus 4500 V. Suhu sumber ionditetapkan sebesar 350◦C, dengan nitrogen dengan kemurnian sangat tinggi sebagai gas tirai (7 psi). Gas Nebulizer adalah8 psi. Parameter lain yang bergantung pada massa, seperti declustering potential (DP), pintu masukpotensial (EP), potensial pemfokusan (FP), dan energi tumbukan (CE) untuk masing-masing senyawaditentukan dalam mode positif menggunakan solusi standar. Pemantauan reaksi ganda(MRM) dilakukan dengan menggunakan nitrogen sebagai gas tumbukan (2 psi) dan dengan waktu tinggal200 ms untuk setiap transisi. echinacoside A terdeteksi dengan memantau transisim/z 443.200 → 301.200, 283.200. Data dianalisis menggunakan software Analyst 1.4.2 (AppliedBiosystems, Concord, ON, Canada) dan GraphPad (Prism 8.0.0.).

Analisis UPLC-QTOF/MS dilakukan pada sistem UPLC Agilent 1290 Infinity II(Agilent, Palo Alto, CA, USA), digabungkan dengan Agilent 6546 quadrupole time-of-flight massspektrometri (Agilent, Palo Alto, CA, USA). Pemisahan kromatografi dilakukanpada Phenomenex Kinetex® Kolom C18 LC (3 mm× 100 mm× 1.7 µM). Kolomsuhu dipertahankan pada 40◦C. Fase gerak A terdiri dari air yang mengandung0.1 persen (v/v) asam format dalam mode positif, 0.1 persen (v/v) asam format, dan 10 mM CH3COONH4 dalam mode negatif. Fase gerak B adalah asetonitril. Elusi gradien digunakan, dimulaidengan 5 persen B dan tahan selama 0,5 mnt, meningkat menjadi 50 persen B dalam 5,5 mnt, meningkat menjadi 100 persenB dalam 10 menit, dan tahan selama 6 menit. Tingkat sesama 400µL/menit diterapkan, dan avolume 2µL disuntik.

Agilent 6546 quadrupole time-of-flight mass spectrometry dilengkapi dengan elecsumber ionisasi trospray (ESI). Akuisisi data berada di bawah kendali Mass Hunterperangkat lunak stasiun kerja. Kondisi sumber operasi tipikal dalam ion positif dan negatifMode ESI dioptimalkan sebagai berikut: voltase semprotan ion (ESIplus/ESI−) dulu4000 V/3000 V; suhu gas adalah 320◦C; kecepatan sesama gas pengeringan adalah 8 L/menit; tekanan nebulizer adalah45psi; suhu gas selubung adalah 350◦C; laju sesama gas selubung adalah 12 L/mnt; tabrakanenergi adalah 10, 20, 40, dan 60 V. Metabolit diidentifikasi menggunakan Agilent MassHunterPerangkat lunak biotransformasi (versi B.04.00) (Santa Clara, CA, USA). Kromatogramdan spektrum massa induk dan metabolit yang teridentifikasi diekstraksi menggunakan AgilentPerangkat lunak Analisis Kualitatif MassHunter (versi B.05.00) (Santa Clara, CA, USA).

Tanya lebih lanjut:

Email:wallence.suen@wecistanche.com Whatsapp plus 86 15292862950