Hypoxic Mesenchymal Stem Cell-derived Extracellular Vesicles Memperbaiki Fbrosis Ginjal Setelah Iskemia-reperfusi Cedera Dengan Mengembalikan Oksidasi Asam Lemak yang Dimediasi CPT1A

Abstrak

1. Latar Belakang

Fibrosis ginjal adalah proses patologis umum penyakit ginjal kronis yang disebabkan oleh banyak faktor. Pretreatment hipoksia sel punca mesenchymal dapat meningkatkan kemanjuran secreted extracellular vesicles (MSC-EVs) pada berbagai penyakit, tetapi tidak jelas apakah mereka dapat meningkatkan fibrosis ginjal dengan lebih baik. Penelitian terbaru menunjukkan bahwa pemulihan oksidasi asam lemak (FAO) dapat mengurangi fibrosis ginjal. Dalam penelitian ini, kami bertujuan untuk menguji apakah pretreatment hipoksia dengan vesikel ekstraseluler MSC (Hypo-EVs) dapat meningkatkan FAO untuk memulihkan fibrosis ginjal dan menyelidiki mekanisme yang mendasarinya.

2. Metode

Hypo-EVs diisolasi dari MSC (hP-MSC) yang diturunkan dari plasenta manusia yang mengalami hipoksia, dan Norm-EVs diisolasi dari hP-MSC yang dikultur dalam kondisi normal. Kami menggunakan model fibrosis ginjal yang diinduksi iskemia-reperfusi (I/R) secara in vivo. Tikus disuntik dengan PBS, Hypo-EVs, atau Norm-EVs segera setelah operasi dan hari pertama pasca operasi. Fungsi ginjal, patologi ginjal, dan fibrosis ginjal dinilai untuk evaluasi kerusakan ginjal. Untuk eksplorasi mekanistik, oksidasi asam lemak (FAO), perubahan morfologi mitokondria, produksi ATP, dan protein massa mitokondria terdeteksi secara in vivo. Potensi membran mitokondria dan produksi spesies oksigen reaktif (ROS) diselidiki secara in vitro.

3. Hasil

Kami menemukan bahwa Hypo-EVs memberikan efek terapeutik yang unggul pada pemulihan kerusakan struktur ginjal, pemulihan fungsi ginjal, dan pengurangan fibrosis ginjal. Sementara itu, Hypo-EVs meningkatkan FAO mitokondria di ginjal dengan mengembalikan ekspresi enzim pembatas laju kunci FAO carnitine palmitoyl-transferase 1A (CPT1A). Secara mekanis, peningkatan homeostasis mitokondria, yang ditandai dengan struktur mitokondria yang diperbaiki, pemulihan massa mitokondria dan produksi ATP, penghambatan stres oksidatif, dan peningkatan potensi membran mitokondria, sebagian menjelaskan efek Hypo-EVs pada peningkatan FAO mitokondria dan dengan demikian melemahkan I / kerusakan R.

4. Kesimpulan

Hypo-EVs menekan fibrosis ginjal dengan memulihkan FAO mitokondria yang dimediasi CPT1A, yang efeknya dapat dicapai melalui regulasi homeostasis mitokondria. Temuan kami memberikan dukungan mekanisme lebih lanjut untuk pengembangan terapi bebas sel untuk fibrosis ginjal.

5. Kata kunci

Sel punca mesenkimal, Hipoksik, Vesikel ekstraseluler, Mitokondria, Oksidasi asam lemak, Fibrosis ginjal.

Klik di sini untuk membeli suplemen Cistanche

Perkenalan

Penyakit ginjal kronis (CKD) adalah penyakit parah yang mengancam kesehatan manusia dan juga merupakan masalah publik global yang penting. Insiden global, prevalensi, dan kematian CKD signifikan, dan meningkat, dan prevalensinya sekitar 10 persen di antara orang dewasa di seluruh dunia [1, 2]. Cedera iskemia-reperfusi ginjal (I/R) berhubungan dengan fibrosis ginjal dan CKD progresif [3, 4]. Fibrosis ginjal dianggap sebagai proses patologis umum yang mengarah ke CKD dan penyakit ginjal stadium akhir. Namun, saat ini tidak ada terapi efektif yang berhasil mencegah atau membalikkan fibrosis [5].

Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles (MSC-EVs) telah dilaporkan memainkan peran regeneratif dan antifibrotik dalam beberapa model praklinis CKD [6-9]. Namun, rendahnya hasil MSC-EVs merupakan faktor pembatas untuk produksi skala besar terapi bebas sel [10]. Prekondisi hipoksia merangsang aktivitas parakrin MSC dan meningkatkan fungsi dan produksi EV dan dianggap sebagai pendekatan rekayasa untuk meningkatkan potensi terapeutik EV [11, 12]. Sebuah studi baru-baru ini menunjukkan bahwa MSC yang diprakondisikan dengan hipoksia lebih signifikan daripada MSC yang tidak diobati dalam mencegah fibrosis dan peradangan ginjal [13]. Namun, peran EV turunan MSC hipoksia dalam fibrosis ginjal belum ditetapkan.

Mekanisme patologis fibrosis ginjal telah ditinjau dalam banyak penelitian terbaru [14-16], khususnya di bidang regulasi metabolik [17]. Telah diketahui bahwa sel tubular proksimal (PTC) adalah sel yang paling membutuhkan energi di ginjal dan memainkan peran sentral dalam perkembangan fibrosis tubulointerstitial [18, 19]. Oksidasi asam lemak (FAO) adalah sumber energi utama PTC [19, 20]. Hasil studi transkriptom seluruh genom menunjukkan bahwa ekspresi enzim metabolik kunci terkait FAO dan regulator transkripsi secara nyata menurun pada model manusia dan tikus dengan fibrosis tubulointerstitial [20]. Selain itu, pemulihan metabolisme asam lemak dapat melindungi mencit dari tubulointerstitial fibrosis [17, 20]. Sebuah studi baru-baru ini menegaskan bahwa overekspresi dari key rate-limiting enzyme carnitine palmitoyl-transferase 1A (CPT1A) dapat meningkatkan FAO dalam sel epitel tubulus ginjal, mengurangi ekspresi mediator inflamasi, dan menyebabkan pengentasan fibrosis yang signifikan dalam tiga model eksperimental [21 ]. Oleh karena itu, terapi bertarget FAO mungkin merupakan strategi terapi yang berpotensi efektif untuk pengurangan fibrosis.

Mitokondria memainkan peran yang sangat diperlukan dalam mengatur FAO. Sebuah studi sebelumnya menunjukkan bahwa astragaloside IV dapat meningkatkan FAO dengan mengatur aktivitas mitokondria selama penuaan [22]. Penghancuran homeostasis mitokondria memainkan peran penting dalam cedera awal penyakit ginjal, perbaikan abnormal setelah cedera, dan patogenesis CKD [23, 24]. Dalam kondisi fisiologis dan patologis, berbagai mekanisme berkoordinasi untuk mempertahankan homeostasis mitokondria, termasuk pertahanan antioksidan, perbaikan DNA mitokondria, fusi dan fisi mitokondria, autofag mitokondria, dan biogenesis mitokondria [25]. Beberapa penelitian telah menunjukkan bahwa MSC-EVs dapat menipiskan kerusakan mitokondria dengan menstabilkan DNA mitokondria [26], menghambat fisi mitokondria, dan menstimulasi pertahanan antioksidan mitokondria dan produksi adenosin trifosfat (ATP) pada model cedera ginjal akut (AKI) [27, 28] . Studi sebelumnya menunjukkan bahwa pengobatan Hypo-EVs memiliki efek yang lebih baik dalam mempromosikan angiogenesis, proliferasi, dan migrasi, serta menghambat peradangan dan apoptosis daripada pengobatan Norm-EVs [29-31]. Namun demikian, para peneliti belum menentukan secara pasti apakah hasil terapi Hypo-EVs pada fibrosis bergantung pada homeostasis mitokondria.

Tujuan dari penelitian ini adalah (1) untuk mengeksplorasi apakah pra-perawatan hipoksia dari vesikel ekstraseluler turunan MSC (Hypo-EVs) memiliki efek anti-fibrosis yang lebih baik; (2) untuk menentukan apakah Hypo-EV meringankan fibrosis yang diinduksi reperfusi iskemia dengan meningkatkan FAO yang dimediasi CPT1A; (3) untuk menguji apakah efek perlindungan Hypo-EVs pada FAO terkait dengan pengaturan homeostasis mitokondria.

bubuk cistanche

Metode

1. Kultur sel dan prakondisi hipoksia

MSC yang berasal dari plasenta manusia (hP-MSC) disediakan oleh Institute of Foundation, Chinese Academy of Medical Sciences dan dibiakkan dalam media Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12, Gibco) dengan 10 persen serum janin sapi (FBS, Corning) ditambah dengan 100 U/mL penicillin−streptomycin (Gibco) dan dipertahankan pada suhu 37 derajat dalam atmosfer CO2 5 persen yang dilembabkan. Setelah hP-MSC mencapai pertemuan 60 persen –70 persen, media kultur diganti dengan FBS yang terkuras eksosom (SBI, 50A-1) dan dikultur pada 37 derajat , 5 persen CO2, 21 persen O2 atau pada 1 persen O2, 94 persen N2, dan 5 persen CO2 selama 48 jam tambahan. Media kemudian dikumpulkan untuk isolasi EVs, dan EVs yang dikumpulkan dari pretreatment hipoksia MSC (1 persen O2) disebut Hypo-EVs, dan MSC normal (21 persen O2) disebut Norm-EVs. Hanya hP-MSC dari bagian 6-10 yang digunakan untuk percobaan lebih lanjut.

2. Kultur sel dan pengobatan

Sel-sel epitel tubulus proksimal ginjal manusia (HK-2, ATCC, USA) dikultur dalam DMEM/F12 dengan 10 persen FBS dan ditambah dengan 100 U/mL penicillin−streptomycin. Sel-sel dipertahankan pada 37 derajat dalam suasana lembab yang mengandung 5 persen CO2. Kami menggunakan dua pendekatan untuk meniru CKD in vitro. Model sel hipoksia/reoksigenasi (H/R) dilakukan seperti yang dilaporkan sebelumnya [32]. Singkatnya, sel-sel HK-2 dipaparkan pada kondisi hipoksia (37 derajat , 1 persen O2, 94 persen N2, dan 5 persen CO2) selama 12 jam dalam media bebas glukosa dan serum untuk menginduksi cedera hipoksia. Selanjutnya, media diganti, dan sel ditempatkan pada kondisi normal (21 persen O2) untuk reoksigenasi 24 jam. Kelompok kontrol dikulturkan pada kondisi normal (21 persen O2) sesuai dengan rancangan percobaan. Metode lain adalah menginkubasi sel HK-2 dengan transforming growth factor beta-1 (TGF- 1) pada konsentrasi akhir 10 ng/mL selama 48 jam seperti yang dilaporkan sebelumnya [13]. Selama reoksigenasi atau TGF- 1- waktu terstimulasi Norm-EVs atau Hypo-EVs (100 ug/mL media nutrisi) ditambahkan ke dalam sel.

3. Isolasi dan identifikasi MSC‑EVs

EV turunan MSC diisolasi menggunakan metode ultrasentrifugasi diferensial. Secara singkat, media kultur disentrifugasi pada 4 derajat sebagai berikut: 500×g selama 10 menit, pada 2,000×g selama 20 menit, dan 10,000×g selama 30 menit. Media disaring melalui filter 0,22-μm sebelum ultrasentrifugasi pada 100,000×g selama 2 jam. Akhirnya, pelet EV disuspensikan kembali dalam PBS dan ultrasentrifugasi selama 2 jam tambahan untuk membuang protein yang mencemari, dan kemudian EV yang dimurnikan dipanen dalam PBS dan disimpan pada suhu -80 derajat untuk digunakan lebih lanjut. Konsentrasi protein Norm-EVs dan Hypo-EVs diperiksa menggunakan uji protein asam bicinchoninic (BCA, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Struktur membran bilayer berbentuk bola yang khas dari EV diamati menggunakan mikroskop elektron transmisi (TEM). Western blotting digunakan untuk menguji kualitas EV, dan distribusi ukuran EV diperiksa dengan hamburan cahaya dinamis (DLS).

Cistanche tubulosa

4. Eksperimen hewan

Tikus C57BL / 6 SPF jantan (berusia 7-9 minggu) dipasok oleh Ilmu dan Teknologi Hewan Eksperimental Sibeifu (Beijing, China) dan diberi makan secara adaptif selama 4 hari di pusat hewan di Rumah Sakit Umum PLA China sebelum percobaan. Tikus-tikus itu secara acak dibagi menjadi empat kelompok: kelompok kontrol, phosphate-buffered saline (PBS), Norm-EVs, dan Hypo-EVs. Tikus kelompok PBS, Norm-EVs, dan Hypo-EVs menjadi sasaran reperfusi iskemia ginjal seperti yang dijelaskan sebelumnya [33, 34]. Secara singkat, tikus dibius dengan pentobarbital (50 mg/kg) melalui injeksi intraperitoneal. Rambut dorsal di atas ginjal tikus dibersihkan dan kemudian pembuluh pedikel ginjal bilateral terlihat. Untuk menginduksi iskemia ginjal, arteri ginjal kiri dijepit dengan penjepit vaskular nontraumatik selama 30 menit dan ginjal kanan diangkat secara bersamaan. Setelah itu, reperfusi dimulai dengan melepaskan klem. Ginjal diamati selama 5 menit untuk memastikan reperfusi setelah klem dilepas. Meja operasi dan suhu ruangan dipertahankan pada 37 derajat selama operasi. Dalam model perawatan, 100 ug Norm-EVs atau Hypo-EVs dalam 0,15 mL pelarut PBS diberikan dengan injeksi vena ekor segera setelah operasi dan hari (D) 1 pasca operasi pada kelompok Norm-EVs dan Hypo-EVs. Volume PBS yang sama diberikan dengan injeksi vena ekor pada kelompok PBS. Tikus dibunuh pada D 2, D 7, dan D 14 setelah operasi (Gbr. 1a).

5. Internalisasi MSC‑EVs

Untuk memverifikasi apakah EV dapat diinternalisasi oleh ginjal yang terluka. Pewarnaan fluoresen Dil (Yeasen) dilakukan untuk memberi label pada EV. Te Norm-EVs atau Hypo-EVs (200 ug) yang dilarutkan dalam 100 μL PBS diinkubasi dengan 4 μM Dil pada suhu 37 derajat selama 1 jam. Pewarna yang tidak terikat kemudian dihilangkan menggunakan kolom putaran eksosom (Invitrogen). Di/Norm-EVs dan Dil/Hypo-EVs ditangguhkan di PBS untuk penggunaan selanjutnya. Dil / Norm-EVs atau Dil / HypoEVs (100 ug) disuntikkan secara intravena ke tikus model cedera iskemia-reperfusi (I / R) melalui vena ekor segera setelah operasi dan pada D 1 pasca operasi seperti yang disebutkan di atas. Pada hari ke 1, 3, 5, dan 7, mencit langsung dicitrakan menggunakan Living Image Software 4.4 (PerkinElmer). Selain itu, ginjal dikumpulkan dan diamati pada sistem pencitraan optik pada D 7. Semua sinyal pencitraan bioluminesensi (BLI) diukur dengan pancaran rata-rata dari wilayah yang diminati (ROI).

6. Mikroskop elektron transmisi (TEM)

Sebanyak 1 mm3 jaringan ginjal difiksasi dalam 2,5 persen glutaraldehid (pH 7,4) pada suhu 4 derajat selama 24 jam. Kemudian, jaringan difiksasi dengan asam osmium 1 persen selama 2-3 jam, didehidrasi dengan aseton dan etanol, dan disematkan dengan resin epoksi. Setelah itu, ultramicrotome digunakan untuk membuat bagian ultrathin dengan ketebalan 60 nm, yang kemudian diwarnai dengan uranil asetat 3 persen dan timbal sitrat. Akhirnya, bagian tersebut diamati di bawah TEM (Jepang).

7. Analisis fungsi ginjal

Sampel darah diambil dari vena ekor pada D3, dan kadar nitrogen urea darah (BUN) pada mencit diuji menggunakan kit yang sesuai (Bioassay).

8. Penilaian histopatologi ginjal

Jaringan ginjal difiksasi dalam formalin 10 persen selama 48 jam, disematkan dalam parafin, dipotong dengan ketebalan 3 μm, diwarnai dengan reagen pewarnaan Masson dengan protokol standar, dan diamati menggunakan mikroskop (Olympus, Tokyo, Jepang). Persentase area pengendapan kolagen dihitung menggunakan perangkat lunak ImageJ. Setidaknya ada 10 bidang acak yang tidak tumpang tindih per hewan untuk penilaian.

9. Imunohistokimia

Bagian ginjal yang tertanam parafin diberi perlakuan awal menggunakan pengambilan antigen yang dimediasi panas dengan buffer natrium sitrat (pH 6, larutan pengambilan epitop 1) selama 20 menit, diikuti dengan inkubasi dengan antibodi primer semalaman pada suhu 4 derajat . Bagian kemudian diinkubasi dengan antibodi sekunder terbiotinilasi, dan 3,3'-diaminobenzidine (DAB) digunakan sebagai kromogen. Bagian-bagian tersebut kemudian diimbangi dengan hematoxylin dan diamati dengan mikroskop optik. Antibodi primer yang digunakan adalah sebagai berikut: CPT1A (ab128568, Abcam), dan Vimentin (ab92547, Abcam).

10. Imunofluoresensi

Sel atau jaringan di permeabilisasi dengan 0.2 persen Triton X-100 selama 5 menit, diblokir dengan serum domba selama 30 menit, dan diinkubasi dengan -smooth muscle actin ( -SMA, 1:200, 55135, Proteintech) atau antibodi kolagen I (1:100, ab270993, Abcam) selama 16-18 jam pada suhu 4 derajat , diikuti dengan inkubasi dengan antibodi sekunder terkonjugasi Cy3 (merah) pada suhu kamar selama 1 jam. Nuclei diimbangi dengan DAPI. Pewarnaan fluoresen pada bagian jaringan dicitrakan dengan mikroskop fluoresensi confocal.

11. Analisis blotting Barat

Ginjal, sel, atau pelet EV dilisiskan dalam buffer lisis RadioImmune Precipitation Assay (RIPA) yang mengandung phenylmethylsulphonyl fluoride (PMSF), dan suspensi supernatan yang diperoleh setelah sentrifugasi diukur menggunakan alat uji protein BCA (Thermo Fisher Scientific). Sampel protein dengan kualitas yang sama (20 ug/ jalur) ditambahkan ke 10 persen atau 12 persen sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel (SDS-PAGE) dan kemudian dipindahkan dari gel SDS-PAGE ke membran. Membran diblokir selama 2 jam pada suhu kamar dengan larutan kasein 1X dan kemudian diinkubasi dengan antibodi primer pada 4 derajat terhadap protein berikut: -SMA (ab7817, Abcam), vimentin (ab92547, Abcam), gliseraldehida 3- fosfat dehidrogenase (GAPDH, 60004-1- Ig, Proteintech), aktin (20536-1-AP, Proteintech), PGC1 (ab191838, Abcam), CPT1A (ab128568, Abcam), suksinat dehidrogenase kompleks besi sulfur subunit B (SDHB , 10620-1-AP, Proteintech), sitokrom c oksidase subunit IV (COXIV, ab202554, Abcam), dan ATPB (17247-1-AP, Proteintech). Membran kemudian diinkubasi dengan antibodi sekunder yang sesuai selama 1,5 jam pada suhu kamar dan dicuci tiga kali. Gambar dianalisis menggunakan perangkat lunak ImageJ.

12. Reaksi berantai polimerase real-time kuantitatif (RT‑qPCR)

Pertama, RNA diekstraksi dari sel lisis atau jaringan ginjal menggunakan reagen Trizol (Invitrogen), dan kemudian RNA disintesis menjadi cDNA sesuai dengan instruksi pabrik menggunakan kit ReverTra Ace qPCR RT (Toyobo). Reaksi rantai polimerase real-time kuantitatif dilakukan menggunakan SYBR Select Master Mix (Life Technologies) dan sistem deteksi RT-qPCR (ABI). Primer untuk gen berikut disintesis: PPAR maju TTTGCCAAGGCTATCCCAGG, mundur GTCACAGAACGGCTTCCTCA,

PGC1 meneruskan AATGCAGCGGTCTTAGCACT, membalikkan CTGAGCAGGGACGTCTTTGT, ACOX2 TCATCCAACGTGACCCAGTG, membalikkan CAG CAAGGACTCTGTCAGCA, CPT2 meneruskan CATCGT ACCCACCATGCACT, membalikkan CTCCTTCCCAATGCC GTCT, 18S AGCTATCAATCTGTCAATCCT GTC, membalikkan GCTTAATTTGACTCAACACGGGA , dan ekspresi setiap gen target dinormalisasi oleh gen 18S dan dihitung dengan 2−ΔΔCT metode.

13. Pengukuran potensial membran mitokondria

Potensi membran mitokondria (MMP) dideteksi menggunakan JC-1 (Beyotime). Pertama, larutan kerja pewarnaan JC-1 diperoleh dengan menambahkan 8 mL air ultra murni untuk setiap 50 μL JC-1 (200X), yang divorteks keras hingga larut sepenuhnya, dan kemudian 2 mL JC{{ 7}} buffer pewarnaan (5X) telah ditambahkan. Kedua, sel dalam pelat enam pori dicuci dua kali dalam PBS, lalu ditambahkan 1 mL larutan kerja pewarnaan JC-1 dan dibiarkan selama 20 menit pada suhu 37 derajat C. Terakhir, sel dicuci dengan PBS lagi , dan 2 mL larutan kultur sel ditambahkan. Gambar yang divisualisasikan diperoleh dengan menggunakan mikroskop fluoresensi.

Kapsul cistanche

14. Deteksi spesies oksigen reaktif mitokondria (ROS).

Generasi ROS mitokondria diukur dengan mikroskop fluoresensi menggunakan Mito-SOX Red (Thermo Fisher Scientific). Larutan kerja reagen MitoSOX (2.0 mL, 5 μM) ditambahkan untuk menutupi sel dalam pelat enam pori, diikuti dengan pewarnaan dengan MitoSOX Red selama 10 menit pada suhu 37 derajat . Kemudian, sel-sel dicuci dengan PBS tiga kali, dan gambar yang divisualisasikan diperoleh dengan menggunakan mikroskop fluoresensi.

15. Deteksi ATP

Produksi ATP ditentukan melalui Enhanced ATP Assay Kit (Beyotime, China, Cat. No: S0027) menurut protokol pabrikan.

16. Analisis statistik

Kuantifikasi dan grafik dianalisis menggunakan GraphPad Prism 7 (La Jolla, CA, USA) dan disajikan sebagai mean±standard error dari mean. Perbedaan antara beberapa kelompok dianalisis menggunakan analisis varians (ANOVA), dan signifikansi statistik ditetapkan pada P < 0.05.

Diskusi

Dalam studi ini, kami fokus pada FAO pada fibrosis ginjal, dan kami mengidentifikasi enzim metabolik (CPT1A) dan regulator transkripsi (PGC1 , PPAR ) dari FAO, yang menunjukkan bahwa Hypo-EVs dapat membalikkan gangguan metabolisme asam lemak pada ginjal fibrotik yang disebabkan oleh I /R. Selain itu, kami menemukan bahwa Hypo-EV memberikan efek mendalam pada FAO yang dimediasi CPT1A, yang sebagian dikaitkan dengan regulasi homeostasis mitokondria.

Dalam beberapa tahun terakhir, semakin banyak penelitian telah melaporkan efek perlindungan ginjal MSC-EVs dalam model CKD in vivo dan sejumlah kecil data yang tersedia menunjukkan bahwa EVs lebih unggul atau sama efektifnya dalam renoproteksi dibandingkan dengan MSC induknya [43] . Perawatan MSC-EVs pada CKD masih dalam tahap awal, dan mekanisme kompleksnya belum sepenuhnya ditunjukkan. AKI adalah salah satu faktor utama CKD, yang mengarah ke penyakit ginjal stadium akhir [44], dan cedera I/R ginjal merupakan faktor utama untuk AKI, jadi kami memilih model fibrosis yang diinduksi I/R untuk mengungkap mekanisme molekuler potensial yang bagaimana MSC-EVs mencegah fibrosis ginjal.

Rendahnya hasil MSC-EVs merupakan faktor pembatas untuk produksi skala besar terapi bebas sel. Dengan demikian, berbagai pendekatan potensial untuk meningkatkan hasil EV telah dipelajari, termasuk optimalisasi kondisi kultur MSC, perancah berbasis matriks ekstraseluler tiga dimensi, dan regulasi biogenesis EV [10]. Diantaranya, pengkondisian hipoksia MSC adalah metode yang valid untuk menambah efek pengobatan EV pada berbagai penyakit, seperti penyembuhan patah tulang [30], penyembuhan luka diabetik [29], dan perbaikan miokard [45]. Studi kami memberikan bukti untuk aksi EV yang ditingkatkan hipoksia yang dikeluarkan oleh MSC. Selain itu, kami juga menunjukkan bahwa EV turunan MSC hipoksia memiliki efek anti-fibrosis dan perlindungan ginjal yang lebih besar daripada Norm-EV pada CKD yang diinduksi oleh I/R. Data tentang miRNA di Hypo-EV dibandingkan dengan Norm-EV telah dilaporkan dengan baik. Sejumlah penelitian telah melaporkan bahwa konten miRNA bertanggung jawab atas efek menguntungkan dari Hypo-EVs pada banyak penyakit [30, 46]. Dibandingkan dengan Norm-EVs, 215 miRNA diregulasi dan 369 miRNA diregulasi ke bawah dalam Hypo-EVs turunan adiposa, yang terutama mengatur metabolisme sel, diferensiasi, dan fungsi TGF- [29]. Namun, mekanisme pengaturan fungsi metabolisme Hypo-EVs masih kurang dipahami pada CKD. Sejumlah besar literatur menunjukkan bahwa FAO berkurang pada fibrosis ginjal dan berkontribusi pada patogenesisnya [47]. Konsisten dengan laporan, penelitian kami menunjukkan bahwa ekspresi gen dari enzim metabolik kunci terkait FAO (CPT1A, CPT2, dan ACOX2) dan faktor pengatur transkripsi FAO (PPAR dan PGC1 ) secara nyata menurun pada fibrosis ginjal yang diinduksi oleh I/R.

Selain itu, pemulihan metabolisme lipid merupakan strategi potensial untuk mengobati fibrosis ginjal [48]. Ekspresi CPT1A yang berlebihan pada tubulus ginjal merupakan kontributor yang signifikan terhadap perolehan fungsi FAO dan menghasilkan perlindungan fungsi ginjal dan fibrosis dengan mencegah disfungsi mitokondria, diferensiasi TEC, dan peradangan pada model hewan CKD [21]. Data kami menunjukkan bahwa Hypo-EVs dapat membalikkan FAO yang rusak pada fibrosis yang diinduksi I / R, yang menunjukkan bahwa efek terapeutik Hypo-EVs pada fibrosis ginjal sebagian merupakan hasil pemulihan FAO.

Gangguan pensinyalan PPAR ginjal menurunkan aktivitas jalur FAO dan memperburuk perkembangan fibrosis ginjal [49]. Pemberian fenofibrate, agonis PPAR, mengembalikan defek oksidasi lemak dan fibrosis tubulointerstitial pada CKD [50, 51]. PGC-1 adalah koaktivator PPAR dalam kontrol transkripsi kapasitas FAO mitokondria [39]. Kami menyelidiki apakah HypoEV dapat meningkatkan pensinyalan PPAR dan memulihkan FAO pada cedera I/R. Hasil kami menunjukkan bahwa tidak ada perbedaan nyata dalam ekspresi PGC-1 dan PPRa antara Norm-EV dan Hypo-EV. Oleh karena itu, harus ada faktor lain yang mendorong terjadinya proses ini. Mitokondria adalah pembangkit tenaga bagi FAO untuk menghasilkan energi bagi sel [52]. Disfungsi mitokondria sangat penting dalam patogenesis fibrosis ginjal [53]. Pemulihan homeostasis mitokondria telah muncul sebagai strategi terapi yang menjanjikan untuk mencegah cedera ginjal dan mempercepat perbaikan ginjal [25]. Studi terbaru menunjukkan bahwa MSC-EVs memiliki efek perlindungan pada kerusakan mitokondria yang disebabkan oleh AKI, yang melindungi TECs terhadap gangguan dengan mengurangi fragmentasi mitokondria, menormalkan potensi membran mitokondria, dan membalikkan penghapusan mtDNA dan cacat OXPHOS mitokondria [26, 27]. Hasil kami menunjukkan bahwa pengobatan Hypo-EV memulihkan pergeseran morfologi mitokondria yang abnormal, meningkatkan massa mitokondria, dan meningkatkan fungsi mitokondria pada ginjal fibrotik. Temuan kami menunjukkan bahwa efek Hypo-EVs pada FAO dapat dicapai dengan mengatur homeostasis mitokondria.

Ada beberapa keterbatasan dalam penelitian kami. Sebagai contoh, data kami menunjukkan bahwa Hypo-EVs memiliki efek antifibrotik yang lebih baik pada tikus cedera I/R daripada Norm-EVs. Namun, kami tidak menentukan perbedaan ekspresi konten antara Norm-EVs dan Hypo-EVs dan juga tidak mengevaluasi cara spesifik Hypo-EVs mempengaruhi homeostasis mitokondria dalam penelitian ini.

Manfaat Cistanche

Kesimpulan

Singkatnya, data kami menunjukkan bahwa Hypo-EVs secara signifikan menghambat fibrosis ginjal dengan memulihkan CPT1Amediated FAO, dan efek ini dapat dicapai dengan mengatur homeostasis mitokondria. Temuan kami memberikan dukungan mekanis lebih lanjut untuk pengembangan terapi bebas sel untuk fibrosis ginjal.

Referensi

1. Kalantar-Zadeh K, Jafar TH, Nitsch D, Neuen BL, Perkovic V. Penyakit ginjal kronis. Lanset. 2021;398(10302):786–802.

2. Xie Y, Bowe B, Mokdad AH, Xian H, Yan Y, Li T, Maddukuri G, Tsai CY, Floyd T, Al-Aly Z. Analisis studi Global Burden of Disease menyoroti global, regional, dan nasional tren epidemiologi penyakit ginjal kronis dari tahun 1990 hingga 2016. Kidney Int. 2018;94(3):567–81.

3. Ronco C, Bellomo R, Kellum JA. Cedera ginjal akut. Lanset. 2019;394(10212):1949–64.

4. Zheng Z, Li C, Shao G, Li J, Xu K, Zhao Z, Zhang Z, Liu J, Wu H. Hippo-YAP/ MCP-1 perbaikan maladaptif tubular yang dimediasi meningkatkan peradangan pada pemulihan gagal ginjal setelah AKI iskemik. Kematian Sel Dis. 2021;12(8):754.

5. Yan H, Xu J, Xu Z, Yang B, Luo P, He Q. Menentukan target terapi untuk fibrosis ginjal: mengeksploitasi biologi patogenesis. Apoteker Biomed. 2021;143:112115.

6. Shi Z, Wang Q, Zhang Y, Jiang D. Vesikel ekstraseluler yang diproduksi oleh sel punca mesenkimal sumsum tulang menipiskan fibrosis ginjal, sebagian dengan menghambat jalur RhoA/ROCK, dalam model tikus UUO. Stem Cell Res Ada. 2020;11(1):253.

7. Kholia S, Herrera Sanchez MB, Cedrino M, Papadimitriou E, Tapparo M, Deregibus MC, Bruno S, Antico F, Brizzi MF, Quesenberry PJ, Camussi G. Vesikel ekstraseluler turunan sel mesenkimal memperbaiki cedera ginjal pada nefropati asam aristolochic . Biol Pengembang Sel Depan. 2020;8:188.

8. Birtwistle L, Chen XM, Pollock C. Vesikel ekstraseluler turunan sel punca mesenkimal untuk menyelamatkan cedera ginjal. Int J Mol Sci. 2021;22(12):6596.

9. Huang Y, Yang L. Sel induk mesenchymal dan vesikel ekstraseluler dalam terapi melawan penyakit ginjal. Stem Cell Res Ada. 2021;12(1):219.

10. Phan J, Kumar P, Hao D, Gao K, Petani D, Wang A. Merekayasa sel punca mesenchymal untuk meningkatkan kemanjuran dan hasil exosome mereka untuk terapi bebas sel. Vesikel Ekstrasel J. 2018;7(1):1522236.

11. Bister N, Pistono C, Huremagic B, Jolkkonen J, Giugno R, Malm T. Hipoksia dan vesikel ekstraseluler: tinjauan metode, muatan vesikular, dan fungsi. Vesikel Ekstrasel J. 2020;10(1): e12002.

12. Yang Y, Lee EH, Yang Z. Hipoksia mengkondisikan sel punca mesenchymal dalam aplikasi regenerasi jaringan. Tissue Eng Part B Rev 2021.

13. Ishiuchi N, Nakashima A, Doi S, Yoshida K, Maeda S, Kanai R, Yamada Y, Ike T, Doi T, Kato Y, Masaki T. Sel induk mesenkimal yang dikondisikan hipoksia mencegah fibrosis ginjal dan pembengkakan pada reperfusi iskemia tikus. Stem Cell Res Ada. 2020;11(1):130.

14. Panizo S, Martinez-Arias L, Alonso-Montes C, Cannata P, Martin-Carro B, Fernandez-Martin JL, Naves-Diaz M, Carrillo-Lopez N, Cannata-Andia JB. Fibrosis pada penyakit ginjal kronis: patogenesis dan konsekuensi. Int J Mol Sci. 2021;22(1):408.

15.Humphreys BD. Mekanisme fibrosis ginjal. Annu Rev Physiol. 2018;80:309–26.

16. Nastase MV, Zeng-Brouwers J, Wygrecka M, Schaefer L. Menargetkan fibrosis ginjal: mekanisme dan sistem pengiriman obat. Adv Drug Deliv Rev. 2018;129:295–307.

17. Zhao X, Kwan JYY, Yip K, Liu PP, Liu FF. Menargetkan disregulasi metabolik untuk terapi fibrosis. Nat Rev Obat Discov. 2020;19(1):57–75.

18. Qi R, Yang C. Sel epitel tubulus ginjal: mediator fibrosis tubulointerstitial yang diabaikan setelah cedera. Kematian Sel Dis. 2018;9(11):1126.

19. Gewin LS. Fibrosis ginjal: keunggulan tubulus proksimal. Matriks Biol. 2018;68:248–62.

20. Kang HM, Ahn SH, Choi P, Ko YA, Han SH, Chinga F, Park AS, Tao J, Sharma K, Pullman J, Bottinger EP, Goldberg IJ, Susztak K. Oksidasi asam lemak yang rusak pada sel epitel tubulus ginjal memiliki peran kunci dalam perkembangan fibrosis ginjal. Nat Med. 2015;21(1):37–46.

21. Miguel V, Tituana J, Herrero JI, Herrero L, Serra D, Cuevas P, Barbas C, Puyol DR, Marquez-Exposito L, Ruiz-Ortega M, Castillo C, Sheng X, Susztak K, Ruiz-Canela M, Salas-Salvado J, Gonzalez MAM, Ortega S, Ramos R, Lamas S. Renal tubule Cpt1a overexpression melindungi dari fibrosis ginjal dengan memulihkan homeostasis mitokondria. Investasi J Clin. 2021;131(5):e140695.

22. Luo Z, Wang Y, Xue M, Xia F, Zhu L, Li Y, Jia D, Chen S, Xu G, Lei Y. Astragaloside IV memperbaiki metabolisme lemak di hati tikus yang menua melalui penargetan aktivitas mitokondria. J Sel Mol Med. 2021;25(18):8863–76.

23. Bhargava P, Schnellmann RG. Energi mitokondria di ginjal. Nat Rev Nephrol. 2017;13(10):629–46.

24. Jiang M, Bai M, Lei J, Xie Y, Xu S, Jia Z, Zhang A. Disfungsi mitokondria dan transisi AKI ke CKD. Am J Physiol Ginjal Physiol. 2020;319(6): F1105–16.

25. Tang C, Cai J, Yin XM, Weinberg JM, Venkatachalam MA, Dong Z. Kontrol kualitas mitokondria pada cedera dan perbaikan ginjal. Nat Rev Nephrol. 2021;17(5):299–318.

26. Zhao M, Liu S, Wang C, Wang Y, Wan M, Liu F, Gong M, Yuan Y, Chen Y, Cheng J, Lu Y, Liu J. Vesikel ekstraseluler yang diturunkan dari sel punca mesenkimal mengurangi kerusakan dan peradangan mitokondria dengan menstabilkan DNA mitokondria. ACS nano. 2021;15(1):1519–38.

27. Cao H, Cheng Y, Gao H, Zhuang J, Zhang W, Bian Q, Wang F, Du Y, Li Z, Kong D, Ding D, Wang Y. Pelacakan in vivo dari vesikel ekstraseluler yang berasal dari sel punca mesenkimal membaik fungsi mitokondria pada cedera iskemia-reperfusi ginjal. ACS nano. 2020;14(4):4014–26.

28. Gu D, Zou X, Ju G, Zhang G, Bao E, Zhu Y. Sel stroma mesenchymal berasal vesikel ekstraseluler memperbaiki cedera reperfusi iskemia ginjal akut dengan menghambat fisi mitokondria melalui miR-30. Sel Punca Int. 2016;2016:2093940.

29. Wang J, Wu H, Peng Y, Zhao Y, Qin Y, Zhang Y, Xiao Z. Eksosom turunan sel adiposa hipoksia mempromosikan penyembuhan luka diabetes berkualitas tinggi melibatkan aktivasi jalur PI3K / Akt. J Nanobioteknologi. 2021;19(1):202.

30. Liu W, Li L, Rong Y, Qian D, Chen J, Zhou Z, Luo Y, Jiang D, Cheng L, Zhao S, Kong F, Wang J, Zhou Z, Xu T, Gong F, Huang Y, Gu C, Zhao X, Bai J, Wang F, Zhao W, Zhang L, Li X, Yin G, Fan J, Cai W. Eksosom turunan sel punca mesenkimal hipoksik meningkatkan penyembuhan patah tulang dengan transfer miR{{2} }. Biomater Akta. 2020;103:196–212.

31. Rong Y, Zhang J, Jiang D, Ji C, Liu W, Wang J, Ge X, Tang P, Yu S, Cui W, Cai W. Pretreatment hipoksia dari vesikel ekstraseluler kecil memediasi perbaikan tulang rawan pada osteoarthritis dengan mengirimkan miR{ {1}}a-5p. Biomater Akta. 2021;122:325–42.

32. Yang C, Chen Z, Yu H, Liu X. Penghambatan Pengganggu Pembungkaman Telomer 1-Seperti Iskemia Ginjal yang Diringankan dan Fibrosis yang Diinduksi Cedera Reperfusi dengan Memblokir Stres Oksidatif yang Dimediasi PI3K/AKT. Obat Des Devel Ada. 2019;13:4375–87.

33. Qian Y, Qian C, Xie K, Fan Q, Yan Y, Lu R, Wang L, Zhang M, Wang Q, Mou S, Dai H, Ni Z, Pang H, Gu L. Pensinyalan reseptor P2X7 meningkatkan peradangan pada sel parenkim ginjal yang menderita cedera iskemia-reperfusi. Kematian Sel Dis. 2021;12(1):132.

34. Hu MC, Shi M, Gillings N, Flores B, Takahashi M, Kuro OM, Moe OW. Alfa-Klotho rekombinan dapat bersifat profilaksis dan terapeutik untuk perkembangan penyakit ginjal akut hingga kronis dan kardiomiopati uremik. Ginjal Int. 2017;91(5):1104–14.

35. Dubois V, Eeckhoute J, Lefebvre P, Staels B. Kontribusi isotipe PPAR yang berbeda tetapi saling melengkapi untuk homeostasis energi. Investigasi J Clinic. 2017;127(4):1202–14.

36. Desvergne B, Wahli W. Reseptor yang diaktifkan proliferator peroksisom: kontrol nuklir metabolisme. Endocr Rev. 1999;20(5):649–88.

37. Libby AE, Jones B, Lopez-Santiago I, Rowland E, Levi M. Reseptor nuklir di ginjal selama kesehatan dan penyakit. Aspek Mol Med. 2021;78:100935.

38. Bougarne N, Weyers B, Desmet SJ, Deckers J, Ray DW, Staels B, De Bosscher K. Tindakan molekuler PPARalpha dalam metabolisme lipid dan peradangan. Endocr Rev. 2018;39(5):760–802.

39. Vega RB, Huss JM, Kelly DP. Koaktivator PGC-1 bekerja sama dengan reseptor alfa yang diaktifkan proliferator peroksisom dalam kontrol transkripsi gen nuklir yang mengkode enzim oksidasi asam lemak mitokondria. Bio Sel Mol. 2000;20(5):1868–76.

40. Li SY, Susztak K. Peran peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1alpha (PGC-1alpha) pada penyakit ginjal. Semin Nephrol. 2018;38(2):121–6.

41. Fransen M, Lismont C, Walton P. Koneksi peroksisom-mitokondria: Bagaimana dan mengapa? Int J Mol Sci. 2017;18(6):1126.

42. Aparicio-Trejo OE, Avila-Rojas SH, Tapia E, Rojas-Morales P, Leon-Contreras JC, Martinez-Klimova E, Hernandez-Pando R, Sanchez-Lozada LG, PedrazaChaverri J. Gangguan kronis bioenergi mitokondria dan beta -oksidasi mempromosikan transisi AKI-ke-CKD eksperimental yang diinduksi oleh asam folat. Free Radic Biol Med. 2020;154:18–32.

43. Eirin A, Lerman LO. Vesikel ekstraseluler yang berasal dari batang mesenkim / sel stroma untuk penyakit ginjal kronis: Apakah Kita sudah sampai? Hipertensi. 2021;78(2):261–9.

44. Kurzhagen JT, Dellepiane S, Cantaluppi V, Rabb H. AKI: faktor risiko yang semakin dikenal untuk perkembangan dan perkembangan CKD. J Nephrol. 2020;33(6):1171–87.

45. Zhu J, Lu K, Zhang N, Zhao Y, Ma Q, Shen J, Lin Y, Xiang P, Tang Y, Hu X, Chen J, Zhu W, Webster KA, Wang J, Yu H. Fungsi reparatif miokard eksosom dari sel induk mesenkim ditingkatkan dengan pengobatan hipoksia sel melalui transfer microRNA-210 dengan cara yang bergantung pada nSMase2-. Artif Cells Nanomed Biotechnol. 2018;46(8):1659–70.

46. ​​Zhu LP, Tian T, Wang JY, He JN, Chen T, Pan M, Xu L, Zhang HX, Qiu XT, Li CC, Wang KK, Shen H, Zhang GG, Bai YP. Eksosom turunan sel punca mesenkimal yang ditimbulkan oleh hipoksia memfasilitasi perbaikan jantung melalui pencegahan kematian sel yang dimediasi miR-125b pada infark miokard. Theranostika. 2018;8(22):6163–77.

47. Xie YH, Xiao Y, Huang Q, Hu XF, Gong ZC, Du J. Peran jalur CTRP6/AMPK dalam fibrosis ginjal melalui promosi oksidasi asam lemak. Eur J Pharmacol. 2021;892:173755.

48. Chen YY, Chen XG, Zhang S. Druggability modulasi metabolisme lipid terhadap fibrosis ginjal. Acta Pharmacol Dosa. 2021.

49. Chung KW, Lee EK, Lee MK, Oh GT, Yu BP, Chung HY. Penurunan PPARalpha dan jalur oksidasi asam lemak memperburuk fibrosis ginjal selama penuaan. J Am Soc Nephrol. 2018;29(4):1223–37.

50. Han SH, Malaga-Dieguez L, Chinga F, Kang HM, Tao J, Reidy K, Susztak K. Penghapusan Lkb1 dalam sel epitel tubulus ginjal menyebabkan CKD dengan mengubah metabolisme. J Am Soc Nephrol. 2016;27(2):439–53.

51. Jao TM, Nangaku M, Wu CH, Sugahara M, Saito H, Maekawa H, Ishimoto Y, Aoe M, Inoue T, Tanaka T, Staels B, Mori K, Inagi R. ATF6alpha downregulation dari PPARalpha mempromosikan tubulointerstitial yang diinduksi lipotoksisitas fibros. Ginjal Int. 2019;95(3):577–89.

52. Spinelli JB, Haigis MC. Kontribusi multifaset mitokondria untuk metabolisme sel. Bio Sel Nat. 2018;20(7):745–54.

53. Chung KW, Dhillon P, Huang S, Sheng X, Shrestha R, Qiu C, Kaufman BA, Park J, Pei L, Baur J, Palmer M, Susztak K. Kerusakan mitokondria dan aktivasi jalur STING menyebabkan peradangan ginjal dan fibrosis. Metabolisme Sel. 2019;30(4):784–99.

Zhumei Gao1,2, Chuyue Zhang1,3, Fei Peng1 , Qianqian Chen1 , Yinghua Zhao4 , Liangmei Chen5 , Xu Wang1 and Xiangmei Chen1,2

1 Departemen Nefrologi, Pusat Medis Pertama Rumah Sakit Umum PLA Tiongkok, Institut Nefrologi Tentara Pembebasan Rakyat Tiongkok, Laboratorium Utama Penyakit Ginjal Negara, Pusat Penelitian Klinis Nasional untuk Penyakit Ginjal, Laboratorium Utama Penelitian Penyakit Ginjal Beijing, Beijing, Tiongkok.

2 Departemen Nefropati, Rumah Sakit Kedua Universitas Jilin, Changchun, China.

3 Institut Penelitian Ginjal, Pusat Penelitian Klinis Nasional untuk Geriatri dan Divisi Nefrologi, Rumah Sakit Cina Barat Universitas Sichuan, Chengdu, Cina.

4 Sekolah Kedokteran Klinis, Universitas Tsinghua, Beijing, Cina.

5 Departemen Nefrologi, Rumah Sakit Afiliasi Pertama Universitas Jinan, Guangzhou, China.