Bagaimana Polisakarida Cistanche Mengurangi Melanogenesis Dan Mengurangi Stres Oksidatif?

Untuk informasi lebih lanjut silahkan hubungi:{0}}

Cistanche deserticola Polisakarida Menginduksi Melanogenesis di Melanosit Dan Mengurangi Stres Oksidatif

1Department of Dermatology, Third Xiangya Hospital, Central South University, Changsha, China

2Department of Urology, Third Xiangya Hospital, Central South University, Changsha, China

3Pusat Eksperimen Kedokteran, Rumah Sakit Xiangya Ketiga, Universitas Selatan Pusat, Changsha, Cina

Bentengdeserticolamemiliki banyak efek, klik di sini untuk tahu lebih banyak

Abstrak: Sebagai bagian utama dari gangguan pigmentasi, penyakit depigmentasi kulit seperti vitiligo dan achromic naevus sangat umum dan mendapatkan perhatian lebih sekarang. Patogenesis depigmentasi meliputi disfungsi dan kehilangan melanosit, yang kemungkinan disebabkan oleh faktor keturunan, autoimunitas, dan stres oksidatif. Diantara mereka,stres oksidatifmemainkan peran kunci; namun, beberapa perawatan klinis dapat mengatasi stres oksidatif. Sebagaimana dilaporkan,Bentengdeserticola polisakarida(CDP) adalah antioksidan yang efektif; berdasarkan itu, kami mengevaluasi perannya dalam melanosit dan selanjutnya mengungkapkan mekanismenya. Dalam penelitian ini, kami menemukan bahwa CDP dapat mempromosikan melanogenesis pada melanosit epidermal manusia (HEM) dan sel melanoma tikus B16F10, juga menginduksi pigmentasi pada ikan zebra. Selanjutnya, CDP dapat mengaktifkan jalur sinyal mitogen-activated protein kinase (MAPK), kemudian mengatur ekspresi microphthalmia-associated transcription factor (MITF) dan downstream gen TYR, TRP1, TRP2, dan RAB27A. Jika tidak, kami menemukan bahwa CDP dapat melemahkan sitotoksisitas dan apoptosis yang diinduksi H2O2-dalam melanosit. Bukti lebih lanjut mengungkapkan bahwa CDP dapat meningkatkan jalur antioksidan NRF2/HO-1 dan mengais ROS intraseluler. Singkatnya, CDP dapat mempromosikan melanogenesis dan mencegah melanosit dari cedera stres oksidatif, menunjukkan bahwa CDP membantu mempertahankan status normal melanosit. Dengan demikian, CDP dapat menjadi obat baru untuk pengobatan penyakit depigmentasi.

KATA KUNCI:

Deserticola Cistanche polisakarida, penyakit depigmentasi, melanosit, melanogenesis, NRF2,stres oksidatif

1. PERKENALAN

Penyakit depigmentasi kulit, seperti vitiligo dan achromic naevus, ditandai dengan depigmentasi kulit yang tidak merata atau ekstensif.1 Meskipun lesi kulit jarang menyebabkan cedera fisik yang parah, penyakit ini mempengaruhi penampilan pasien dan menimbulkan beban psikologis yang parah, bahkan gangguan kesehatan mental.2 Perubahan patologis utama dalam depigmentasi termasuk disfungsi dan kehilangan melanosit, yang sangat mempengaruhi sintesis dan transportasi melanin,3 sehingga menyebabkan akumulasi melanin yang tidak mencukupi di kulit.

Mekanisme yang terlibat dalam depigmentasi saat ini tidak diketahui, tetapi penelitian telah mengidentifikasi beberapa faktor terkait. Di satu sisi, fungsi melanosit sebagian bergantung pada faktor transkripsi terkait mikroftalmia (MITF), yang terkenal untuk mempromosikan ekspresi gen terkait melanogenesis termasuk tirosinase (TYR), protein terkait tirosinase 1 (TRP1), terkait tirosinase protein 2 (TRP2), protein terkait ras Rab-27a (RAB27A) dan protein pengikat aktin fascin 1 (FSCN1).4 Di antara gen-gen ini, TYR memainkan peran kunci dalam sintesis melanin melalui oksidasi l-dopa menjadi dopaquinone.5 Di sisi lain, penelitian menunjukkan kombinasi beberapa faktor yang mungkin bertanggung jawab atas hilangnya melanosit, termasuk keturunan, lingkungan, autoimunitas, dan stres oksidatif.6-9 Di antara faktor-faktor ini, stres oksidatif dianggap yang paling penting .

Mekanisme daristres oksidatifmenyebabkan depigmentasi sebagian telah terungkap; kelebihan spesies oksigen reaktif (ROS) adalah salah satu faktor kunci.10 Kelebihan ROS dalam depigmentasi melibatkan ketidakseimbangan antara sistem pro-dan antioksidan.11 Salah satu elemen yang berpartisipasi dalam ketidakseimbangan ini adalah faktor nuklir eritroid 2-terkait faktor 2/antioksidan response element (NRF2/ARE) gangguan jalur anti-oksidan.12 Jalur ini terdiri dari NRF2 dan enzim antioksidan seperti heme oksigenase-1 (HMOX-1, HO-1) , catalase (CAT), glutathione peroxidase 1 (GPX1), dan NAD(P)H quinone dehydrogenase 1 (NQO1).13 Ketika melanosit terpapar ROS berlebihan, NRF2 dapat bertranslokasi ke dalam nukleus dan berikatan dengan ARE yang dikonservasi, kemudian mempromosikan ekspresi enzim antioksidan. Namun, pada beberapa penyakit depigmentasi, seperti vitiligo, jalur antioksidan NRF2/ARE yang terganggu tidak dapat secara efektif mengais ROS.14 Terapi klinis yang biasa digunakan dalam depigmentasi termasuk kortikosteroid topikal atau sistemik, inhibitor kalsineurin, ultraviolet B pita sempit (NBUVB; 311 nm) , 308-nm excimer light, transplantasi epidermal autologus, dan terapi pengobatan tradisional Tiongkok (TCM). Kortikosteroid dan inhibitor kalsineurin dapat mengurangi aktivasi imun abnormal,15 sementara fototerapi digunakan sebagai pengobatan lini pertama; khususnya, NBUVB merangsang proliferasi melanosit dan penghancuran sel T,16 sementara cahaya excimer 308-nm menginduksi apoptosis sel T.17 Selain itu, efek terapi TCM terkait dengan mempromosikan melanogenesis.18 Sampai batas tertentu, metode ini membantu untuk memperbaiki depigmentasi, tetapi mengendalikan perkembangan penyakit tetap menantang. Perlu untuk mengembangkan terapi baru, terutama untuk stres oksidatif, yang sebelumnya diabaikan.

Deserticola Cistanchedikenal sebagai 'ginseng gurun'.19 Komponennya berguna dalam cedera hati akibat etanol dan hiperplasia inflamasi usus; itu juga dapat digunakan sebagai reagen anti-kelelahan, anti-inflamasi, dan anti-tumor.20-22 Baru-baru ini, Guo et al melaporkan bahwaDeserticola Cistanche polisakarida(CDP), salah satu komponen utamanya, memiliki aktivitas antioksidan dan hepatoprotektif20; dua penelitian lainnya mengidentifikasi perannya dalam melindungi sel dari cedera pada kondisi kekurangan/reperfusi oksigen-glukosa dan osteoporosis.23,24 Namun, peran CDP dalam penyakit depigmentasi belum dijelaskan. Di sini, kami bertujuan untuk mengkonfirmasi apakah CDP cstres oksidatifdapat mempengaruhi melanogenesis dan melindungi melanosit dari stres oksidatif.

2.|BAHAN DAN METODE

2.1|Bahan kimia dan antibodi

Deserticola Cistanchepolisakarida(CDP) dan l-dopa dibeli dari Yuanye Biotec (kemurnian Lebih dari atau sama dengan 98 persen; Shanghai, Cina). Hidrogen peroksida (H2O2), dimetil sulfoksida (DMSO), NaOH, Triton X-100, 4,5-dimetiltiazol-2-il-2,5-difeniltetrazolium bromida ( MTT), dan Kit Deteksi Apoptosis Annexin V-FITC dibeli dari Sigma-Aldrich. 4 persen paraformaldehida netral dibeli dari Biosharp (Hefei, Cina); dan Kit Pewarnaan Imunofluoresensi (Alexa Fluor 488) dan 2,7-dichlorofluorescein-diacetate (DCFH-DA) dibeli dari Beyotime Biotec (Shanghai, Cina). Kit Pewarna Fontana-Masson dan Kit Ekstraksi Protein Nukleoplasma dibeli dari Sloarbio (Beijing, Cina). Suplemen pertumbuhan melanosit manusia (HMGS), medium Eagle yang dimodifikasi Dulbecco (DMEM), dan medium 254 dibeli dari Gibco. Fetal bovine serum (FBS) dibeli dari BI (Kibbutz Beit-Haemek, Israel). Antibodi primer untuk -aktin, TYR, TRP2, RAB27A, FSCN1, ERK, p-ERK, JNK, p-JNK,

p38, p-p38, NRF2, dan HO-1 dibeli dari Cell Signaling Technology, antibodi primer untuk MITF dibeli dari St John's Laboratory, antibodi primer untuk p-MITF dibeli dari Affinity Biosciences, antibodi primer untuk GAPDH dibeli dari Bioworld, dan antibodi primer untuk TRP1 dibeli dari Merck Millipore.

2.2| Kultur dan pengobatan sel

Sel melanoma tikus B16F10 dikultur dalam medium DMEM yang dilengkapi dengan 10 persen FBS dan 1 persen campuran antibiotik penisilin-streptomisin. Melanosit epidermal manusia (HEM) dipisahkan dari kulup manusia (lihat penelitian kami sebelumnya25) dan dibiakkan dalam medium 254 yang dilengkapi dengan HMGS, 5 persen FBS, dan 1 persen campuran antibiotik penisilin-streptomisin. Semua sel dikultur dalam inkubator basah pada suhu 37 derajat dengan 5 persen CO2. CDP dilarutkan dalam DMSO dan diencerkan

dengan media sebelum digunakan, konsentrasi akhir DMSO lebih rendah dari 0.1 persen . H2O2 diencerkan dengan medium sebelum digunakan.

2.3|Budidaya dan perawatan ikan zebra

Embrio dan media ikan zebra dibeli dari EzeRinka Biotech. Protokol eksperimental telah disetujui oleh Komite Etik Central South University. Ikan zebra dibiakkan di 12-piring sumur pada 37 derajat dari cahaya dan diperlakukan dengan konsentrasi CDP yang berbeda. Mikroskop terbalik digunakan untuk mengamati dan merekam melanin di kepala dan ekor ikan zebra setiap hari. Setelah observasi, kami mengubah media dan menambahkan kembali CDP. Kepadatan melanin di ekor ikan zebra diukur dengan Gambar J, dan nilainya disajikan sebagai kepadatan optik terintegrasi (IOD).

2.4| Viabilitas sel

Viabilitas sel diukur menggunakan uji MTT. Untuk menyelidiki sitotoksisitas CDP, sel-sel HEM dan B16F10 ditanamkan ke dalam 96-piring sumur dengan kepadatan 2 × 1{{30}}3 sel/sumur dan dikultur sampai sel-sel itu melekat pada piring. Sel-sel kemudian diperlakukan dengan konsentrasi yang berbeda (0, 2.5, 5, 10, 20, 40, 80, 160 dan 320 ug/mL) CDP selama 24, 48 atau 72 jam. Sebelum pengukuran, 20 L MTT ditambahkan ke setiap sumur dan pelat diinkubasi pada suhu 37 derajat selama 4 jam. Setelah itu, kami membuang supernatan dan menambahkan 160 L DMSO ke setiap sumur untuk melarutkan kristal formazan. Nilai absorbansi pada 490 nm diukur dengan pembaca pelat multimode (PerkinElmer). Untuk menyelidiki efek CDP dalam kondisi sitotoksisitas yang diinduksi H2O2-, sel-sel HEM, dan B16F10 dilapisi dalam pelat sumur 96-pada kepadatan 4 × 103 sel/sumur. Sel-sel diperlakukan dengan konsentrasi CDP yang berbeda (0, 20, 40, atau 80 ug/mL) selama 24 jam, di mana kami menambahkan H2O2 (konsentrasi akhir: 500 m untuk HEM ​​dan 1,0 mm untuk sel B16F10) ke setiap sumur dan menginkubasi sel selama 24 jam. Kami membentuk kelompok yang diobati dengan CDP dan kontrol negatif (NC). Langkah-langkah deteksi sama seperti yang dijelaskan sebelumnya.

2.5|Uji NaOH kandungan melanin

Sel-sel dikultur dalam cawan Petri {{0}}mm dan diperlakukan dengan CDP pada konsentrasi yang berbeda (0, 20, 40, dan 80 ug/mL) selama 48 jam, kemudian dicerna dengan tripsin dan dikumpulkan dalam 1. 5-tabung mL. Kami mencuci sel dua kali dengan air suling ganda, mensuspensikannya kembali dalam 1 mL etanol, dan mengaduknya untuk melepaskan melanin. Kami kemudian disentrifugasi (200 g, 5 menit) campuran dan membuang supernatan, menambahkan 1 mL 10 persen DMSO (diencerkan dengan larutan NaOH 1 mm) ke dalam setiap tabung, dan menangguhkan sedimen. Kami menginkubasi suspensi dalam penangas air pada 80 derajat selama 1 jam untuk melarutkan melanin. Akhirnya, kami memindahkan 200 L cairan ke pelat sumur 96-dan menggunakan pembaca pelat multimode untuk mengukur nilai absorbansi pada 470 nm.

2.6|Pengukuran aktivitas tirosinase

Sel-sel dikultur dalam cawan Petri {{0}}mm dan diperlakukan dengan CDP sebelum pengukuran, dicerna dengan tripsin dan dikumpulkan dalam tabung 1,5-mL, dan dicuci dua kali dengan saline buffer fosfat (PBS ). Kami memindahkan 106 sel dari setiap sampel ke tabung baru dan membuang supernatan setelah sentrifugasi, kemudian menambahkan 1 ml 00,5 persen Triton X-100 ke pelet sel dan menyimpannya campuran pada 0 derajat selama 15 menit. Setelah itu, kami menambahkan 1 mL l-dopa (1 mm, diencerkan dengan 0,1 M buffer fosfat) sebagai substrat dan mencampur larutan, memindahkan 200 L campuran ke piring sumur 96- segera, dan diukur nilai absorbansinya (A0) pada 475 nm menggunakan multimode plate reader, ulangi pengukuran pada 10 menit (A10). Aktivitas tirosinase dihitung dengan (A10-A0)/105, dan hasilnya dinyatakan sebagai persentase ( persen ) versus kontrol negatif.

2.7| Pewarnaan melanin Fontana-Masson

Sel-sel dikultur dalam 12-pelat sumur sampai mencapai kepadatan 50 persen. Setelah perawatan, sel-sel difiksasi dengan paraformaldehida netral 4 persen selama 30 menit dan dicuci dengan air suling. Kami kemudian menambahkan 500 L larutan Fontana amonia-perak ke setiap sumur dan menyimpan pelat dalam gelap selama 16 jam untuk mewarnai melanin. Selanjutnya, kami mencuci sel dengan air suling lima kali (setiap kali 1 menit) dan merendamnya dalam 500 L hiposulfit selama 5 menit; akhirnya, kami menghilangkan hiposulfit dan membilas sel lagi dengan air suling selama 1 menit. Kami kemudian menggunakan mikroskop terbalik untuk mengamati dan merekam melanin.

2.8|Ekstraksi RNA dan reaksi berantai transkripsi-polimerase terbalik kuantitatif

Sel-sel dikultur di 6-piring sumur. Setelah pengobatan, sel-sel dicerna dengan tripsin dan dikumpulkan dalam tabung 1.5-mL. Kami mencuci sel dua kali dengan PBS, kemudian menambahkan 1 mL buffer lisis, mengaduk campuran, dan menempatkan tabung di atas es selama 5 menit untuk melisiskan sel sepenuhnya. RNA diekstraksi menggunakan Total RNA Kit (Omega Bio-Tek) dan ditranskripsi balik (RT) menggunakan ReverTra Ace qPCR RT Master Mix (TOYOBO). Reaksi berantai transkripsi-polimerase terbalik kuantitatif (PCR) dilakukan menggunakan KODSYBR qPCR Mix (TOYOBO). Volume reaksi campuran RT adalah 20 L, sedangkan volume reaksi campuran PCR adalah 20 L (cDNA 1-8 L, MIX 10 L, primer F 1 L, primer R 1 L, tambahkan DEPC H2O hingga 20 L ). Eksperimen dilakukan sesuai protokol. Urutan primer tercantum dalam Tabel S1.

2.9|Ekstraksi protein dan Western blotting/imunofluoresensi

Sel-sel dikultur dalam cawan Petri 100-mm. Setelah pengobatan, sel-sel dicerna dengan tripsin dan dikumpulkan dalam tabung 1.5-mL. Kami mencuci sel dua kali dengan PBS, kemudian menambahkan 500 L buffer lisis RIPA (Thermo Fisher) yang dilengkapi dengan 1 mm fenilmetilsulfonil fluorida (Thermo Fisher) dan koktail penghambat fosfatase 1:100 yang diencerkan (Roche). Protein inti dan sitoplasma diekstraksi menggunakan Kit Ekstraksi Protein Nukleoplasma sesuai dengan protokol pabrikan. Kami menempatkan tabung di atas es selama 30 menit dan mengaduknya setiap 5 menit untuk melisiskan sel sepenuhnya. Kami mensentrifugasi sel (200 g, 4 derajat, 15 menit), memindahkan supernatan ke tabung baru, dan mengukur konsentrasi protein total menggunakan alat uji protein BCA (KeyGEN Biotec). Kami merebus protein dengan buffer pemuatan 5× (Beyotime Biotec, China) pada suhu 100 derajat selama 10 menit, lalu menyimpannya pada suhu 80 derajat . Metode elektroforesis gel poliakrilamida (PAGE) digunakan dalam Western blotting, dan 20 ug protein dari masing-masing kelompok dipisahkan dan dipindahkan ke membran polivinilidena fluorida. Setelah antigen blocking, membran diinkubasi dalam antibodi primer encer 1:1000 selama 16 jam pada suhu 4 derajat, kemudian membran dicuci dengan PBST dan diinkubasi dalam antibodi sekunder fluoresen 1:10 000 selama 1 jam pada suhu 37 derajat . Intensitas fluoresensi dideteksi menggunakan Odyssey CLx Imaging System (LI-COR). Imunofluoresensi dilakukan menggunakan Kit Pewarnaan Imunofluoresensi (Alexa Fluor

488) dengan pengenceran antibodi primer 1:100.

2.10|Pengukuran apoptosis sel

Sel-sel dikultur dalam cawan Petri {{0}}mm dan diperlakukan dengan konsentrasi yang berbeda (0, 20, 40, dan 80 ug/mL) CDP selama 24 jam, dan ditambahkan H2O2 ( konsentrasi akhir: 500 m untuk HEM, 1,0 mm untuk sel B16F10) ke setiap sumur dan diinkubasi selama 24 jam lagi. Kami juga membentuk grup CDP-treated dan NC. Setelah perawatan, kami mencerna sel dengan tripsin bebas EDTA dan mengumpulkannya dalam tabung, kemudian mencuci sel dua kali dengan PBS dan mensuspensikannya kembali dalam 100 L PBS. Sel-sel diwarnai dengan Kit Deteksi Apoptosis Annexin V-FITC menurut protokol dan dideteksi dengan flow cytometry (FCM). Perangkat lunak FlowJo digunakan untuk menganalisis laju apoptosis.

2.11| Pengukuran ROS intraseluler

Sel-sel dikultur di {{0}}piring sumur dan diperlakukan dengan konsentrasi berbeda (0, 20, 40, dan 80 ug/mL) CDP selama 24 jam, yang kami tambahkan H2O2 (konsentrasi akhir: 500 m untuk HEM,

1.0 mm untuk sel B16F10) ke masing-masing sumur, inkubasi untuk yang lain

24 jam dan mengatur grup CDP-treated dan NC. Setelah perawatan, kami mencuci sel dua kali dengan PBS untuk menghilangkan semua media dan FBS, kemudian mengencerkan probe DCFH-DA menjadi 1:1000 dengan media dan menambahkannya ke setiap sumur. Kami menginkubasi sel pada suhu 37 derajat selama 30 menit dan mencucinya tiga kali dengan media bebas serum. Kami menggunakan

mikroskop fluoresensi terbalik untuk mengamati dan merekam fluoresensi, kemudian menggunakan ImageJ untuk mengukur intensitas fluoresensi.

2.12|Statistik dan analisis

Data dalam karya ini disajikan sebagai mean ± standar deviasi (SD), dan analisis statistik dilakukan dengan menggunakan GraphPad Prism (versi 7.0) atau SPSS (versi 22.0), dan Student's t-test atau analisis satu arah varians (ANOVA) digunakan untuk beberapa kelompok perbandingan. Nilai abu-abu pita protein WB distandarisasi dengan GAPDH atau -aktin. Nilai P < 0,05="" dianggap="" signifikan.="" semua="" percobaan="" diulang="" setidaknya="" tiga="">

3|HASIL

3.1|CDP menginduksi melanogenesis dalam sel HEM dan B16F10

Sebelum kami mulai, kami menggunakan uji MTT untuk menyelidiki potensi sitotoksisitas CDP pada sel HEM dan melanoma tikus B16F10. Sel-sel diperlakukan dengan CDP pada konsentrasi yang berbeda selama 24, 48, atau 72 jam. Pengujian viabilitas HEM menunjukkan bahwa ketika konsentrasi lebih rendah dari 320 ug/mL, CDP tidak berpengaruh pada viabilitas sel; namun, viabilitas menurun secara signifikan ketika konsentrasi mencapai 320 ug/mL pada 24, 48, dan 72 jam (P <.05; gambar="" 1a).="" viabilitas="" sel="" b16f10="" juga="" menurun="" pada="" 48="" dan="" 72="" jam="" ketika="" cdp="" mencapai="" 320="" ug/ml="" (p="">< 0,01)="" tetapi="" tidak="" ada="" perubahan="" yang="" terlihat="" pada="" konsentrasi="" yang="" lebih="" rendah="" (gambar="" 1b).="" kami="" kemudian="" menjelajahi="" peran="" cdp="" dalam="" melanogenesis="" dan="" membandingkan="" efeknya="" dengan="" efek="" -melanocyte-stimulating="" hormone="" (-msh;="" konsentrasi:="" 20,="" 100,="" dan="" 400="" nm)="" dan="" dmso="" (0,1="" persen)="" di="" hem.="" hasil="" pewarnaan="" melanin,="" aktivitas="" tirosinase,="" dan="" uji="" kandungan="" melanin="" menunjukkan="" bahwa="" cdp="" sebanding="" dengan="" -msh="" untuk="" mempromosikan="" melanogenesis,="" sementara="" 0,1="" persen="" pengobatan="" dmso="" tidak="" membuat="" perbedaan="" (gambar="">

Kami selanjutnya menyempurnakan eksplorasi kami. HEM diperlakukan dengan CDP pada konsentrasi yang berbeda (20, 40, dan 80 ug/mL) selama 48 jam; pewarnaan melanin, kandungan melanin, dan uji aktivitas tirosinase dilakukan, dan semuanya menunjukkan peningkatan yang signifikan setelah pengobatan CDP dengan cara yang bergantung pada konsentrasi yang memuncak pada kelompok 80 ug/mL (P <.05, gambar="" 2a-c)="" .="" kami="" kemudian="" mengukur="" tingkat="" mrna="" dan="" protein="" gen="" terkait="" melanogenesis="" (mitf,="" tyr,="" trp1,="" trp2,="" rab27a,="" dan="" fscn1).="" cdp="" secara="" signifikan="" meningkatkan="" tingkat="" mrna="" gen-gen="" di="" hem="" (p=""><.05; gambar="" s2a).="" selain="" itu,="" kadar="" protein="" mitf,="" tyr,="" trp1,="" dan="" rab27a="" meningkat,="" demikian="" pula="" rasio="" mitf="" terfosforilasi="" terhadap="" mitf="" total="" (p="">< 0,05),="" sedangkan="" trp2="" dan="" fscn1="" tidak="" menunjukkan="" perbedaan="" (gambar="" 2d,="" e).="" hasilnya="" menunjukkan="" bahwa="" cdp="" dapat="" mempromosikan="" melanogenesis="" dan="" mengatur="" ekspresi="" gen="" terkait="" melanogenesis="" dalam="" melanosit="">

Selanjutnya, kami memverifikasi ulang efek CDP lagi dengan sel B16F10 dan menemukan bahwa kandungan melanin sel B16F10 meningkat secara signifikan (P <0,01; gambar="" s2b).="" selain="" itu,="" cdp="" secara="">

3.2|CDP mempromosikan melanogenesis pada ikan zebra

Untuk menyelidiki apakah CDP dapat mempromosikanmelanogenesisin vivo, kami menggunakan embrio ikan zebra. Embrio ikan zebra dibagi menjadi empat kelompok dan diperlakukan secara terus menerus dengan medium saja (NC) atau CDP pada konsentrasi yang berbeda (20, 40 dan 80 ug/mL); Kepadatan dan distribusi butiran melanin diamati dan dicatat setiap hari. Saat embrio ikan zebra tumbuh, kami menemukan bahwa kepadatan melanin secara bertahap meningkat di kepala dan ekor. Pada hari ke-3, perbedaan antarkelompok dapat dibedakan, dan perbedaan tersebut terus meningkat hingga kami mengakhiri percobaan pada hari ke-6 (Gambar 3A). Kami menggunakan Gambar J untuk mengukur kepadatan melanin di ekor ikan zebra; kepadatan melanin pada kelompok yang diobati dengan CDP secara signifikan lebih tinggi daripada kelompok kontrol (P <0,05; gambar="">

3.3|Jalur sinyal MAPK yang diaktifkan CDP dalam sel HEM dan B16F10

Untuk mengungkapkan mekanisme yang dipromosikan CDPmelanogenesis, kami memperlakukan HEM dengan CDP pada konsentrasi yang berbeda (20, 40 dan

80 ug/mL) selama 48 jam dan kemudian menyelidiki tingkat fosforilasi dan total protein ERK, JNK, dan p38 dalam jalur pensinyalan MAPK. Seperti yang diukur dengan Western blotting, kadar p-ERK, p-JNK, dan p-p38 meningkat setelah pengobatan CDP (P <0,05), sedangkan="" kadar="" totalnya="" tidak="" berubah="" (gambar="" 4a,="" b).="" percobaan="" diulangi="" dengan="" sel="" b16f10="" dan="" tingkat="" fosforilasi="" protein="" erk,="" jnk,="" dan="" p38="" meningkat="" (p=""><.05), tetapi="" tingkat="" mapk="" total="" tidak="" berubah="" (gambar="" 4c,="" d),="" konsisten="" dengan="" hasil="" dalam="" hem="">

3.4|H2O yang dilemahkan oleh CDP2-diinduksi

sitotoksisitas dan apoptosis pada sel HEM dan B16F10

Kami menggunakan H2O2 untuk mensimulasikanstres oksidatiflingkungan dan mengeksplorasi lebih lanjut peran CDP dalam melanosit di bawahstres oksidatif. Konsentrasi akhir H2O2 yang digunakan dalam HEM adalah 500 m, sedangkan pada sel B16F10 adalah 1,0 mm. Untuk menyelidiki efek CDP pada sitotoksisitas yang diinduksi H2O2-, kami melakukan pra-perawatan sel HEM dan B16F10 dengan CDP pada konsentrasi yang berbeda (20, 40, dan 80 ug/mL) selama 24 jam, kemudian menambahkan H2O2 dan terus merawatnya selama 24 jam sebelum dilakukan pengamatan dan uji MTT.

H2O2 menyebabkan blebbing membran yang jelas dan penyusutan sel pada HEM, pada kelompok yang diberi perlakuan CDP, situasinya berkurang. Pengobatan dengan CDP saja tidak berpengaruh (Gambar 5A). Uji MTT menunjukkan hasil yang serupa bahwa perlakuan H2O2 menurunkan viabilitas HEM, sedangkan CDP secara signifikan memperbaiki dampak berbahaya ini.

3.5|CDP memulung H2O2-menginduksi ROS intraseluler dalam sel HEM dan B16F10

Untuk menyelidiki mekanisme CDP untuk mengurangi sitotoksisitas dan apoptosis yang diinduksi H2O2-, kami selanjutnya mendeteksi ROS intraseluler dalam sel HEM dan B16F10 menggunakan fluoresensi DCFH-DA

4|DISKUSI DAN KESIMPULAN

Dalam penelitian ini, kami menyelidiki peran CDP dalam sel HEM dan B16F10. Untuk pertama kalinya, kami menemukan bahwa CDP dapat mempromosikanmelanogenesisdalam melanosit dan meningkatkan pigmentasi pada ikan zebra. Eksperimen selanjutnya menunjukkan bahwa jalur pensinyalan MAPK diaktifkan di bawah perawatan CDP. Kami menyelidiki lebih lanjut perannya dalamstres oksidatifdan menemukan bahwa CDP dapat melemahkan sitotoksisitas yang diinduksi H2O2- dan apoptosis pada melanosit; sementara itu, CDP dapat mengaktifkan jalur antioksidan NRF2/HO-1 dan mengais ROS intraseluler di bawahstres oksidatifkondisi.

Protein kinase yang diaktifkan mitogen adalah jalur vital yang terlibat dalam regulasi MITF, faktor transkripsi kunci yang mendorong ekspresimelanogenesisgen terkait dan selanjutnya mempengaruhi sintesis dan transportasi melanin.26,27 Dalam penelitian kami, aktivasi ERK, JNK, dan p38 dalam melanosit meningkat secara signifikan setelah pengobatan CDP; sementara itu, ekspresi MITF/p-MITF dan MITF-driven TYR, TRP1, TRP2 dan RAB27A

diatur sesuai dengan itu. Dengan demikian, kami menyarankan agar CDP dapat

memajukanmelanogenesismelalui pengaktifan jalur MAPK, tetapi bagaimana CDP mengaktifkan MAPK masih belum diketahui. Menurut penelitian terbaru, reseptor seperti tol 4 (TLR4) sangat diekspresikan dalam melanosit dan terlibat dalam melanogenesis.28,29 TLR4 adalah protein transmembran penting yang secara khusus dapat mengikat lipopolisakarida (LPS)30; penelitian melaporkan bahwa LPS dapat menginduksi melanogenesis.29 Menariknya, beberapapolisakaridadiekstraksi dari tanaman atau jamur dilaporkan mengaktifkan TLR dan jalur pensinyalan hilir seperti MAPK dan faktor nuklir kappa beta (NF-κB).31,32 Oleh karena itu, kami menduga bahwa CDP dapat dikenali dan diikat oleh TLR, kemudian mengaktifkan sinyal MAPK hilir- ling jalur dan mempromosikanmelanogenesis. Lebih lanjut, nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors (NLRs) diketahui mengenali ligan intraseluler dan mendorong aktivasi jalur sinyal MAPK dan NF-kB.33,34 Seperti yang dilaporkan, polisakarida yang diekstraksi dari Ganoderma lucidum dan Astragalus dapat memasuki sel dan mempengaruhi NLRs.35,36 Dengan demikian, ada kemungkinan bahwa CDP dapat memasuki melanosit dan mengatur jalur pensinyalan MAPK melalui NLRs. Namun, penelitian lebih lanjut diperlukan untuk memverifikasi hipotesis ini.

Beberapa penelitian sampai saat ini melaporkan penerapan herbalpolisakaridadalam melanogenesis untuk menghambat produksi melanin.37,38 Namun, dalam penelitian ini, CDP mempromosikan melanogenesis dalam

melanosit, dan efek ini dikonfirmasi lebih lanjut setelah dibandingkan dengan -MSH. CDP juga semacampolisakaridadiekstraksi dari tumbuhan, kami menduga bahwa efek sebaliknya dari CDP mungkin terkait dengan perbedaan struktural antara CDP dan lainnyapolisakarida. Polisakarida dibentuk oleh polimerisasi monosakarida tetapi bervariasi dalam jenis monosakarida, komposisi monosakarida, ikatan glikosidik, struktur rantai samping, dan berat molekul39,40; faktor-faktor ini dianggap menentukan fungsi biologisnya.41 Studi yang ada telah mengusulkan struktur CDP dan menyarankan bahwa struktur CDP selanjutnya mempengaruhi fungsinya.42 Jadi, lebih banyak bukti diperlukan untuk memahami CDP sepenuhnya dan mengkonfirmasi hipotesis kami.

Melanogenesis adalah mekanisme perlindungan penting untuk melawan

kerusakan ultraviolet dan mempertahankan homeostasis tubuh43; pada saat yang sama

waktu, melanosit mudah terkena lingkungan yang tidak menguntungkan seperti kelebihan ROS.11 Diketahui bahwa ROS berpartisipasi dalam mempromosikanmelanogenesis, salah satu mekanismenya adalah mengaktifkan MAPKs.44 Tetapi penelitian juga mengungkapkan bahwa efek ini hanya ada dalam tingkat ROS tertentu, sementara kelebihan ROS merusak melanogenesis secara signifikan.45 Hubungan antara ROS, MAPK, dan melanogenesis bervariasi dalam kondisi yang berbeda, dengan demikian, keseimbangan antara sistem pro-dan anti-oksidan jelas penting. Pada penyakit depigmentasi seperti vitiligo, sistem antioksidan yang tidak seimbang dan kelebihan ROS yang tidak terkendali akan merusak melanosit dan menurunkan viabilitas sel.11,46 Dalam penelitian ini, kami menggunakan konsentrasi H2O2 yang berbeda untuk mensimulasikan kelebihan ROS dalam sel, dan HEM menunjukkan toleransi yang lebih buruk terhadap H2O2 dari sel B16F10. Ketika melanosit menjadi sasaran pengobatan H2O2, kelangsungan hidup dan tingkat apoptosis mereka menjadi lebih buruk, tetapi

Pretreatment CDP sebagian dapat membalikkan tren. Pada saat yang sama, ROS diambil. Seperti yang dilaporkan, aktivasi jalur antioksidasi NRF2/ARE adalah metode utama pemulungan ROS dalam sel kulit.14 Dalam percobaan kami, kadar protein NRF2 dan H2O-1 dalam melanosit diregulasi ke atas setelah pengobatan H2O2 tanpa CDP; ini berarti bahwa H2O2-diinduksistres oksidatifdapat mengaktifkan jalur NRF2/HO-1, tetapi tidak cukup untuk mempertahankan keseimbangan redoks dan melindungi sel dari cedera. Namun, pretreatment CDP meningkatkan jalur antioksidan NRF2/HO-1 dan mengembalikan keseimbangan. Dengan demikian, kami menyarankan bahwa CDP dapat melindungi melanosit dari cedera stres oksidatif melalui pengaktifan jalur antioksidan NRF2/HO-1 dan mengais ROS.

Kami menemukan bahwa pengobatan CDP saja tidak berpengaruh pada ROS atau NRF2/HO-1 dalam melanosit. Hasil ini menunjukkan bahwa CDP dapat mempengaruhi keseimbangan redoks di bawah stres oksidatif, tetapi tidak pada kondisi normal. Selain itu, jalur antioksidasi NRF2/HO-1 dilaporkan diatur oleh jalur pensinyalan PI3K, NF-κB, dan MAPK.47,48 Dalam penelitian kami, CDP mampu mengaktifkan jalur pensinyalan MAPK. Ada kemungkinan bahwa CDP dapat mengaktifkan jalur NRF2/HO-1 melalui MAPK yang mengatur naik. Seperti yang dilaporkan Slominski, melanosit adalah sensor stres yang terlibat dalam jaringan pengatur, dan fungsinya dapat berubah dengan cepat sebagai respons terhadap lingkungan.49 Kami menyarankan bahwa peran CDP dipengaruhi oleh status melanosit, ia dapat mendorong melanogenesis tanpa memengaruhi antioksidan sistem dalam kondisi normal tetapi mengembalikan keseimbangan redoks di bawahstres oksidatifkondisi. Oleh karena itu, fungsi dan kelangsungan hidup melanosit dapat dipertahankan dengan dua cara berbeda oleh CDP. CDP membantu melanosit mempertahankan homeostasis, yang juga merupakan fungsi penting dari melanogenesis.50,51

Kesimpulannya, CDP dapat mempromosikanmelanogenesismelanosit

melalui pengaktifan jalur pensinyalan MAPK. CDP dapat meningkatkan kelangsungan hidup melanosit melalui pengaktifan jalur antioksidan NRF2/HO-1 dan mengais ROS intraseluler dalam kondisi stres oksidatif. Temuan kami bermakna karena menunjukkan bahwa CDP dapat mempromosikanmelanogenesisdan melindungi melanosit daristres oksidatifcedera, yang mungkin bertanggung jawab atas disfungsi dan kehilangan melanosit. Temuan penelitian ini menunjukkan bahwa CDP bisa menjadi obat baru dalam pengobatan penyakit depigmentasi.

UCAPAN TERIMA KASIH

Pekerjaan ini didukung oleh Yayasan Ilmu Pengetahuan Alam Nasional Tiongkok (No. 81703101), Proyek Bakat Xiangya Baru dari Rumah Sakit Xiangya Ketiga Universitas Pusat Selatan (No. JY201623 dan No. 20170301), Yayasan Ilmu Pengetahuan Alam Provinsi Hunan ( No. 2018JJ3788 dan No. 2018JJ3793) dan Komisi kesehatan Proyek Hunan (No. C2019173). Dr. Yibo Hu melakukan bagian utama penelitian dan menulis naskah; Profesor Jing Chen dan Qinghai Zeng merancang penelitian dan membimbing penulisan naskah; Profesor Jinhua Huang, Lihua Huang, dan Hong Xiang memberikan dukungan teknis dan menganalisis data; Yixiao Li, Ling Jiang, Yujie Ouyang, Yumeng Li, Lun Yang, dan Xiaojiao Zhao berkontribusi dalam sebagian eksperimen.

KONFLIK KEPENTINGAN

Para penulis mengkonfirmasi bahwa tidak ada konflik kepentingan.

PERNYATAAN KETERSEDIAAN DATA

Data yang mendukung temuan penelitian ini tersedia dari penulis terkait atas permintaan yang wajar.

REFERENSI

1. Bleuel R, Eberlein B. Manajemen terapeutik vitiligo. J Dtsch Dermatol Ges. 2018;16:1309-1313.

2. Taieb A, Meurant JM. Haruskah kita memprioritaskan intervensi psikologis dalam pengelolaan vitiligo? J Eur Acad Dermatol Venereol. 2018;32:2053-2054.

3. Picardo M, Dell'Anna ML, Ezzedine K, dkk. Vitiligo. Nat Rev Dis Primer. 2015; 1:15011.

4. Slominski A, Tobin DJ, Shibahara S, Wortsman J. Pigmentasi melanin pada kulit mamalia dan regulasi hormonalnya. Physiol Rev. 2004;84:1155-1228.

5. Slominski A, Zmijewski MA, Pawelek J. L-tirosin dan L-dihidroksifenilalanin sebagai pengatur fungsi melanosit seperti hormon. Pigmen Sel Melanoma Res. 2012;25:14-27.

6. Semprot RA. Berbagi hubungan genetik yang mendasari vitiligo umum dan penyakit tiroid autoimun. Tiroid. 2010;20:745-754.

7. Lin X, Tang LY, Fu WW, Kang KF. Vitiligo masa kanak-kanak di Cina: profil klinis dan temuan imunologis pada 620 kasus. Am J Clin Dermatol. 2011;12:277-281.

8. Boehncke WH, Brembilla NC. Limfosit T Autoreaktif pada Penyakit Kulit Peradangan. Imunol Depan. 2019;10:1198.

9. Iannella G, Greco A, Didona D, dkk. Vitiligo: Patogenesis, varian klinis, dan pendekatan pengobatan. Autoimun Rev. 2016;15:335-343.

10. Forrester SJ, Kikuchi DS, Hernandes MS, dkk. Spesies oksigen reaktif dalam pensinyalan metabolik dan inflamasi. Lingkaran Res. 2018;122:877-902.

11. Denat L, Kadekaro AL, Marrot L, dkk. Melanosit sebagai pemicu dan korban stres oksidatif. J Investasikan Dermatol. 2014;134:1512-1518.

12. Qiu L, Song Z, Setaluri V. Stres oksidatif dan vitiligo: Nrf2-ADALAH

koneksi sinyal. J Investasikan Dermatol. 2014;134:2074-2076.

13. Hayes JD, Dinkova-Kostova AT. Jaringan regulasi Nrf2 menyediakan antarmuka antara redoks dan metabolisme perantara. Tren Biokimia Sci. 2014;39:199-218.

14. Marrot L, Jones C, Perez P, Meunier JR. Pentingnya Nrf2

jalur di (foto)-respon stres oksidatif dalam melanosit dan keratinosit epidermis manusia. Pigmen Sel Melanoma Res. 2008;21:79-88.

15. van Geel N, Speeckaert R, Mollet I, dkk. Model induksi dan terapi vitiligo in vivo: uji klinis acak tersamar ganda. Pigmen Sel Melanoma Res. 2012;25:57-65.

16. Nicolaidou E, Antoniou C, Stratigos A, Katsambas AD. Fototerapi ultraviolet B sempit dan laser excimer 308-nm dalam pengobatan vitiligo: ulasan. J Am Acad Dermatol. 2009;60:470-477.

17. Novak Z, Bonis B, Baltas E, dkk. Xenon klorida ultraviolet B laser

lebih efektif dalam mengobati psoriasis dan dalam menginduksi apoptosis sel T daripada pita sempit ultraviolet B. J Photochem Photobiol B Biol. 2002;67:32-38.

18. Xu P, Su S, Tan C, dkk. Efek ekstrak air dari Eclipse herba, Polygoni multiflora radix preparator, dan Rehmanniae radix preparator pada melanogenesis dan migrasi melanosit manusia. J. Etnofarmaka. 2017;195:89-95.

19. Wang T, Zhang X, Xie W.Deserticola CistancheYC Ma, "Desertginseng": ulasan. Am J Chin Med. 2012;40:1123-1141.

20. Guo Y, Cao L, Zhao Q, dkk. Karakterisasi awal, aktivitas antioksidan dan hepatoprotektif daripolisakaridadariDeserticola Cistanche. Int J Biol Makromol. 2016;93:678-685.

21. Cai RL, Yang MH, Shi Y, dkk. Aktivitas antikelelahan ekstrak kaya fenilethanoid dariDeserticola Cistanche. Phytother Res. 2010;24:313-315.

22. Zhang H, Xiang Z, Duan X, dkk. Efek antitumor dan anti-inflamasi oligosakarida dariDeserticola Cistancheekstrak pada cedera tulang belakang. Int J Biol Makromol. 2019;124:360-367.

23. Liu Y, Wang H, Yang M, dkk.Deserticola Cistanche polisakaridamelindungi sel PC12 terhadap cedera yang diinduksi OGD / RP. Farmakoter Bioma. 2018;99:671-680.

24. Lagu D, Cao Z, Liu Z, dkk.Deserticola Cistanche polisakaridamelemahkan osteoklastogenesis dan resorpsi tulang melalui penghambatan pensinyalan RANKL dan produksi spesies oksigen reaktif. Fisiol Sel J. 2018;233:9674-9684.

25. Fu C, Chen J, Lu J, dkk. Downregulation TUG1 mempromosikan melanogenesis dan melanogenesis yang diinduksi UVB Exp Dermatol. 2019;28:730-733.

26. Johannessen CM, Johnson LA, Piccioni F, dkk. Program garis keturunan melanosit memberikan resistensi terhadap penghambatan jalur MAP kinase. Alam. 2013;504:138-142.

27. Vachtenheim J, Borovansky J. "Fisiologi transkripsi" pembentukan pigmen dalam melanosit: peran sentral MITF. Exp Dermatol. 2010;19:617-627.

28. Yu N, Zhang S, Zuo F, dkk. Kultur melanosit manusia mengekspresikan reseptor fungsional seperti tol 2–4, 7 dan 9. J Dermatol Sci. 2009;56:113-120.

29. Ahn JH, Park TJ, Jin SH, Kang HY. Melanosit manusia mengekspresikan reseptor fungsional seperti Toll 4. Exp Dermatol. 2008;17:412-417.

30. Reed SG, Carter D, Casper C, dkk. Korelasi aktivitas ajuvan keluarga GLA. Semin Imunol. 2018;39:22-29.

31. Guo MZ, Meng M, Feng CC, dkk. Sebuah novelpolisakaridadiperoleh dari Craterellus cornucopioides meningkatkan aktivitas imunomodulator pada model tikus imunosupresif melalui regulasi jalur TLR4-NF-kappaB. Fungsi Makanan. 2019;10(8):4792-4801.

32. Wei W, Xiao HT, Bao WR, dkk. TLR-4 dapat memediasi jalur pensinyalan AstragaluspolisakaridaRAP menginduksi ekspresi sitokin dari sel RAW264.7. J. Etnofarmaka. 2016;179:243-252.

33. Chen H, Yang D, Han F, dkk. Efektor T6SS bakteri EvpPmencegah aktivasi inflamasisome NLRP3 dengan menghambat jalur MAPK-Jnk yang bergantung pada Ca(2 plus ). Mikroba Host Sel. 2017;21:47-58.

34. Levy M, Shapiro H, Thaiss CA, Elinav E. NLRP6: sensor kekebalan bawaan multifaset. Tren Imunol. 2017;38:248-260.

35. Chen YS, Chen QZ, Wang ZJ, Hua C. Efek anti-inflamasi dan hepatoprotektif dari Ganoderma lucidumpolisakaridaterhadap cedera hati yang diinduksi karbon tetraklorida pada tikus Kunming. Farmakologi. 2019;103:143-150.

36. Tian Z, Liu Y, Yang B, dkk. Astragaluspolisakaridamelemahkan kolitis murine melalui penghambatan inflammasome NLRP3. Planta Med. 2017;83:70-77.

37. Jiang L, Huang J, Lu J, dkk. Ganoderma lucidumpolisakaridamengurangi melanogenesis dengan menghambat efek parakrin dari keratinosit dan fibroblas melalui jalur IL-6/STAT3/FGF2. Fisiol Sel J. 2019;234:22799-22808.

38. Cai ZN, Li W, Mehmood S, dkk. Efek daripolisakaridaFMP-1 dari Morchella esculenta pada melanogenesis dalam sel B16F10 dan ikan zebra. Fungsi Makanan. 2018;9:5007-5015.

39. Zhang C, Li Z, Zhang CY, dkk. Karakteristik molekul, dan bioaktivitas daripolisakaridadari alfalfa (Medicago sativa L.). Nutrisi. 2019;11:1181.

40. Coconi Linares N, Di Falco M, Benoit-Gelber I, dkk. Kehadiran komponen jejak secara signifikan memperluas respons molekuler Aspergillus niger terhadap guar gum. Bioteknologi Baru. 2019;51:57-66.

41. Ma H, Zhang K, Jiang Q, dkk. Karakterisasi tanamanpolisakaridadari Dendrobium officinale dengan beberapa teknik kromatografi dan spektrometri massa. J Chromatogr A. 2018;1547:29-36.

42. Dong Q, Yao J, Fang JN, Ding K. Karakterisasi struktural dan aktivitas imunologi dari dua ekstrak air dinginpolisakaridadariDeserticola CistancheYC Ma. Karbohidrat Res. 2007;342:1343-1349.

43. Slominski AT, Zmijewski MA, Plonka PM, dkk. Bagaimana sinar UV menyentuh otak dan sistem endokrin melalui kulit, dan mengapa. Endokrinologi. 2018;159:1992-2007.

44. Schalke S. Data baru tentang gangguan hiperpigmentasi. J Eur Acad Dermatol Venereol. 2017;31(Suppl 5):18-21.

45. Tukang Kaca SJ. Vitiligo, spesies oksigen reaktif, dan sel T. Klin Sci. 2011;120:99-120.

46. ​​Ristow M. Mengungkap kebenaran tentang antioksidan: mitohormesis menjelaskan manfaat kesehatan yang diinduksi ROS. Nat Med. 2014;20:709-711.

47. Balogun E, Hoque M, Gong P, dkk. Kurkumin mengaktifkan gen hem oksigenase-1 melalui regulasi Nrf2 dan elemen responsif antioksidan. Biochem J. 2003;371:887-895.

48. Paine A, Eiz-Vesper B, Blasczyk R, Immenschuh S. Memberi isyarat kepada

heme oksigenase-1 dan potensi terapeutik anti-inflamasinya.

Biokimia Farmakol. 2010;80:1895-1903.

49. Slominski A, Paus R, Schadendorf D. Melanosit sebagai sel "sensorik" dan pengatur di epidermis. J Theor Biol. 1993;164:103-120.

50. Slominski RM, Zmijewski MA, Slominski AT. Peran pigmen melanin dalam melanoma. Exp Dermatol. 2015;24:258-259.

51. Slominski A, Kim TK, Brozyna AA, dkk. Peran melanogenesis dalam regulasi perilaku melanoma: melanogenesis mengarah pada stimulasi ekspresi alfa-1HIF dan jalur petugas yang bergantung pada HIF. Arch Biochem Biophys. 2014;563:79-93.