Ekspresi Berlebih GRP78 Memicu PINK1-Mitophagy Neuroprotektif yang Dimediasi IP3R Bagian 2

2.5. noda barat

Kami membius tikus secara mendalam dengan Dolethal (n=4) pada 7 dpi untuk mendapatkan segmen sumsum tulang belakang L4–L5 (panjang 5-mm) untuk analisis western blot. Kami membekukan sampel dalam nitrogen cair.

Dalam beberapa tahun terakhir, semakin banyak hasil penelitian yang menunjukkan bahwa ada hubungan erat antara protein blotting dan memori. Protein blotting adalah teknik analisis untuk mendeteksi ekspresi protein, yang telah banyak digunakan dalam penelitian ilmu saraf.

Koneksi antar neuron erat kaitannya dengan penyimpanan memori. Protein blotting dapat mendeteksi status koneksi antara neuron dan ekspresi protein pra dan pasca sinaptik, yang selanjutnya mengungkap peran penting protein dalam pembentukan dan penyimpanan memori.

Penelitian telah menemukan bahwa ekspresi protein saraf prasinaps berkaitan erat dengan pembentukan dan penyimpanan memori. Misalnya, selama proses pembelajaran dan memori, neuron mengubah ekspresi protein prasinaps, dan perubahan ini terkait dengan pembentukan dan penyimpanan memori baru. Selain itu, beberapa penelitian juga menemukan bahwa perubahan ekspresi beberapa protein berkaitan dengan penyakit neurodegeneratif seperti penyakit Alzheimer.

Oleh karena itu, protein blotting dapat memberikan pemahaman mendalam tentang status koneksi antar neuron dan perubahan ekspresi protein terkait, sehingga mengungkap mekanisme molekuler neuron. Hal ini sangat penting untuk mempelajari mekanisme pembentukan memori dan penyakit neurodegeneratif.

Singkatnya, hubungan antara protein blotting dan memori menunjukkan peran protein dalam hubungan antara neuron dan penyimpanan memori. Hal ini memberikan ide dan arahan baru untuk mempelajari mekanisme pembentukan memori dan penyakit neurodegeneratif. Mari kita secara aktif mempromosikan penelitian ilmu saraf dan berkontribusi pada kesehatan dan umur panjang! Terlihat bahwa kita perlu meningkatkan daya ingat, dan Cistanche dapat meningkatkan daya ingat secara signifikan karena memiliki efek antioksidan, antiinflamasi, dan anti penuaan, yang dapat membantu mengurangi respons oksidatif dan inflamasi di otak, sehingga melindungi kesehatan saraf. sistem. Selain itu, Cistanche juga dapat mendorong pertumbuhan dan perbaikan sel saraf, sehingga meningkatkan konektivitas dan fungsi jaringan saraf. Efek tersebut dapat membantu meningkatkan daya ingat, kemampuan belajar dan kecepatan berpikir, serta dapat mencegah terjadinya disfungsi kognitif dan penyakit neurodegeneratif.

Klik tahu cara meningkatkan fungsi otak

Sampel disimpan atau diproses lebih lanjut dengan homogenisasi dalam buffer lisis (20 mM HEPES, pH 7,7, sukrosa 251 mM, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, dan campuran protease (Sigma-Aldrich) dan inhibitor fosfatase (Roche, Basel, Swiss) ) dengan homogenizer Potter di atas es.

Setelah sentrifugasi lisat pada 800× g selama 20 menit pada suhu 4◦C, kami mengumpulkan supernatan sebagai fraksi pasca-nuklir, dan mengukur protein dengan BCAassay (Pierce Chemical Co.).

Untuk western blotting, kami memuat 30 μg fraksi pasca-nuklir segmen L4-L5 dari masing-masing hewan ke dalam 12% gel SDS-poliakrilamida untuk melakukan pemisahan elektroforesis protein diikuti dengan transfer ke membran PVDF dalam sistem BioRadcuvette dalam 25 mM Tris, pH 8,4, 192 mM glisin, 20% (v/v) metanol.

Kami memblokir membran dengan 5% BSA dalam PBS ditambah 0.1% Tween-20 selama 1 jam pada suhu kamar dan kemudian diinkubasi pada suhu 4 ◦C semalaman dengan antibodi primer: anti- -aktin tikus ( 1:10000; SigmaAldrich), tikus anti-GRP78 (1:500, Sigma-Aldrich), tikus anti-CV (1:1000, Invitrogen), kelinci anti-HSP60 (1:500, Antibodi-online), anti-tikus NDUFA9 (1:1000, Invitrogen),mouse anti-OPA1 (1:1000, BD Biosciences), kelinci anti-Parkin (1:500, Abcam, Cambridge,UK), mouse anti-PINK1 (1:500, Abcam), kelinci anti-NRF2 (1:500, Abcam), anti-MNF2 (1:500, Abcam), kelinci anti-GRP75 (1:500, Abcam).

Setelah beberapa kali pencucian, membran diinkubasi selama 2 jam dengan antibodi sekunder yang sesuai yang terkonjugasi dengan horseradishperoxidase (1:5000, Vektor). Membran divisualisasikan menggunakan campuran chemiluminescent 1:1 (0,5 M luminol, 79,2 mM asam p-coumaric, 1 M Tris-HCl, pH 8,5) dan (8,8 M hidrogen peroksida, 1 M Tris-HCl; pH 8,5), dan gambar diambil dengan peralatan Gene Genome dan dianalisis dengan perangkat lunak Gene Snap dan Gene Tools (Syngene).

2.6. Model In Vitro

Sel NSC34 dikultur dalam medium glukosa tinggi Eagle yang dimodifikasi (DMEM, Biochrom, Cambridge, UK) yang ditambah dengan 10% serum janin sapi (Sigma-Aldrich), 100 unit/mLpenisilin, dan 0,5 X larutan penisilin/streptomisin (Sigma-Aldrich) dan dipelihara dalam inkubator yang dilembabkan pada suhu 37 ◦C di bawah 5% CO2, pada dasarnya seperti yang dijelaskan sebelumnya [26].

Setelah 4 hari kultur sel tanpa mengubah media, sel NSC34 memiliki fenotip mirip diferensiasi yang ditandai dengan adanya neurit panjang. Pada hari ke 4, obat ditambahkan ke sel. Larutan Tun (Sigma-Aldrich, Missouri, USA) dan EFV (Bristol-Myers Squibb, New York, USA) dibuat pada konsentrasi 10X dan dilarutkan dalam DMEM.

Setelah 24 jam, kami menilai viabilitas sel dengan menginkubasi sel dengan larutan MTT 4 mg/mL selama 3 jam. Kristal formazan biru yang terbentuk dilarutkan dalam DMSO, dan absorbansi pada 570 nm diukur dengan microplate reader (Elx800, Bio-tek, Winooski, VT, USA).

2.7. Nukleofeksi

Kami mentransfeksi satu juta sel dengan 2 μg plasmid untuk ekspresi GFP, GRP78, HAPARK, mouse sh-eGFP, mouse sh-PINK1 (ID 68943, Tebu-bio), mouse sh-Hspa5 (ID 14828, Tebu-bio), dan /atau mouse sh-IP3R (ID 16440, Tebu-bio) menggunakan Amaxa Nucleofector II TM (Lonza, Basel, Swiss) dan kit Nucleofactor V (Lonza) mengikuti rekomendasi pabrikan.

Untuk analisis sitometri statis, kami menyemai sel dalam wadah {{0}}yang dilapisi dengan kolagen 10%. Setelah kultur, kami memfiksasi sel dengan PFA 4%, membilasnya dua kali dengan PBS, dan menyimpan atau selanjutnya menambahkan buffer pemblokiran yang mengandung PBS 0,3% (v/v) Triton X-100 dan 10% serum janin sapi. Setelah 3 hari kultur sel, ditambahkan obat yang dilarutkan dalam DMEM.

Untuk eksperimen ini, kami menggunakan 1 µM Tun (Sigma-Aldrich), 10 µMCCCP (Sigma-Aldrich), 5 µM CsA (Sigma-Aldrich), atau 10 µM BAPTA-AM (Sigma -Aldrich).Setelah 5 jam setelah pengobatan, kami memperbaiki sel untuk imunositokimia dengan 4% PFA atau menghomogenkannya dalam buffer RIPA yang dimodifikasi (50 mM Tris-HCl, pH 7,5,150 mM NaCl, 1 mM EGTA , 1% NP-40, 0,5% natrium deoksikolat, 0,1% SDS, koktail protease dan fosfatase) untuk imunobloting. Imunohistokimia dilakukan dengan membilas sampel dua kali dengan PBS dan menginkubasi dengan buffer pemblokiran yang mengandung PBSplus 0,3% (v/v) Triton X-100 dan 10% serum janin sapi.

Kami diinkubasi dengan antibodi primer berikut: kelinci anti-IP3R (1:200, Abcam), tikus anti-HA (1:2000, Abcam), tikus anti-GRP78 (1:200, Sigma-Aldrich), dan kelinci anti-HSP60 (1:500, Antibodi-online). Untuk menilai kelayakan MTT seperti dijelaskan di atas, kami meninggalkan pengobatan selama 24 jam.

2.8. Pengukuran Produksi Superoksida Mitokondria dan ∆ψM

Sel diinkubasi dengan 2,5 µM MitoSOX untuk analisis superoksida atau dengan 2,5 µMTMRM untuk analisis ∆ψM, baik dari Molecular Probe, dan Invitrogen selama 30 menit terakhir pengobatan. Fluoresensi dideteksi dengan mikroskop Olympus IX81 dan diukur menggunakan perangkat lunak sitometri statis.

2.9. Pengukuran Elektrokimia Konsumsi Oksigen

Sel (1 × 106 per 1 mL dalam HBSS) diaduk dalam ruang kedap gas pada suhu 37 ◦C. Pengukuran dilakukan dengan elektroda O2 tipe Clark (Rank Brothers, Cambridge, UK) dan dicatat dengan data Dup.18 perangkat akuisisi (WPI) segera setelah 5-perlakuan dengan kendaraan atau Tun.

2.10. Fraksinasi Mitokondria dan Sitosol

Sel dihomogenisasi dalam buffer lisis (10 mM HEPES, pH 7,4, 1 mM EGTA, sukrosa 250mM, dan campuran protease (Sigma-Aldrich) dan inhibitor fosfatase (Roche)) dengan homogenizer Potter di atas es.

Setelah sentrifugasi lisat pada 2000× g selama 5 menit, supernatan disentrifugasi pada 10.000× g selama 12 menit. Supernatan dianggap sebagai fraksi terlarut (S2) dan mengandung protein sitosol dan mikrosom.

Pelet (P2) adalah fraksi mitokondria yang diperkaya, yang diresuspensi dalam bufferRIPA yang dimodifikasi (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EGTA, 1% NP{{8 }}, natriumdeoksikolat 0,5%, SDS 0,1%, koktail protease dan fosfatase) dan konsentrasi protein ditentukan dengan uji BCA. Sampel kemudian diproses untuk western blot.

2.11. Mikroskop Elektron Transmisi

Kami merendam segmen L{{0}}L5 sumsum tulang belakang (irisan 1-mm) dalam larutan fiksatif 2% (b/v) PFA dan 2,5% (v/v) glutaraldehid (tingkat EM) dalam 0.1 M PBS, pH 7,4 dan ditempatkan pada platform goyang selama 2 jam, kemudian difiksasi dalam 1% (b/v) PFA dan selanjutnya difiksasi dengan 1% (b/v) osmium tetroksida (TAAB Lab ) mengandung 0,08% (b/v) potassiumhexacyanoferrate (Sigma-Aldrich) dalam PBS selama 2 jam.

Kami melakukan empat kali pencucian dengan air deionisasi dan dehidrasi berurutan dalam aseton. Semua prosedur dilakukan pada suhu 4 ◦C, seperti yang dijelaskan sebelumnya [33]. Kami memasukkan sampel ke dalam resin EPON dan mempolimerisasi pada suhu 60 ◦C selama 48 jam.

Sampel diproses untuk mendapatkan bagian semi-tipis (1 µm) dengan mikrotom UCT Leicaultracut, diwarnai dengan larutan biru toluidin berair 1% (b/v), dan diperiksa dengan mikroskop cahaya untuk mengidentifikasi area tanduk ventral yang diperkaya dengan MNs.

Bagian ultra tipis (70 nm) dipotong dengan pisau berlian, ditempatkan pada kisi-kisi yang dilapisi, dan dikontraskan dengan uranil asetat konvensional dan larutan timbal sitrat Reynolds.

Akhirnya, kami mengamati bagian tersebut dengan mikroskop elektron transmisi (Jeol 1400) yang dilengkapi dengan Kamera GatanUltrascan ES1000CCD. Kami memilih tiga irisan per kondisi, menganalisis tiga MN per bagian, dan mengukur luas inti dibandingkan dengan total luas MN menggunakan alat ImageJ.

2.12. Bioinformatika dan Statistik

Kami menggunakan analisis varians (ANOVA) untuk membandingkan nilai antara kelompok eksperimen yang berbeda untuk data yang memenuhi asumsi normalitas. Perbedaan antar kelompok dianalisis menggunakan ANOVA satu arah, diikuti dengan uji jarak berganda post hoc Tukey, atau menggunakan uji-t Student. Semua analisis statistik dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak GraphPad Prism5 (n=3–5; p <0.05 untuk signifikansi).

3. Hasil

3.1. Teks

3.1.1. Analisis Proteomik Ekspresi Berlebih GRP78 Mengungkapkan Mitokondria sebagai Target Utama

Untuk mengidentifikasi mekanisme molekuler yang mengarah pada perlindungan saraf yang dimediasi oleh ekspresi berlebih GRP78, kami melakukan analisis proteomik bebas label komparatif untuk mengidentifikasi perbedaan kuantitatif dan kualitatif antara hewan yang terluka RA yang terinfeksi adenovirus untuk ekspresi berlebih dari GRP78 (Ad-GRP78), yang sebelumnya ditemukan bersifat neuroprotektif. MNs, atau beta-galaktosidase (Ad-ß-Gal) sebagai kontrol [20].

Tujuh hari pasca cedera (dpi) adalah titik waktu yang dipilih untuk analisis berdasarkan penelitian sebelumnya yang dilakukan di laboratorium kami [20,25]. Dalam perbandingan sebelumnya antara model regenerasi setelah aksotomi distal dan penjahitan saraf skiatik versus model RA degeneratif kami, kami mengamati bahwa kejadian pensinyalan serupa hingga 7 dpi, ketika kejadian pro-degeneratif yang berbeda muncul setelah RA [20,25].

Analisis bebas label LC-MS/MS terhadap fraksi pasca-nuklir dari segmen sumsum tulang belakang L4-L5 menghasilkan identifikasi 1420 protein, dengan setidaknya dua peptida per protein seperti yang dilaporkan sebelumnya untuk sampel dan penelitian lain [25] .

Sebanyak 566 dan 732 protein atau peptida diubah secara signifikan masing-masing karena ekspresi berlebih Ad-GRP78 atau Ad-ß-Gal, pada hewan yang terluka RA dibandingkan dengan hewan yang terluka RA yang tidak terinfeksi virus (p < 0 .05) (Tabel S1 dan S2).

Kami membandingkan kedua daftar dan menemukan bahwa 220 diubah secara unik karena ekspresi berlebih Ad-GRP78 (Tabel S3). Anotasi fungsional protein ini menggunakan alat Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery (DAVID) memungkinkan kami untuk mengidentifikasi fungsi biologis paling signifikan dalam kumpulan data (FDR <0,05) [34,35].

Ekspresi berlebih GRP78 mengakibatkan perbedaan kadar protein yang terlibat dalam proses, fungsi, dan komponen mitokondria (Tabel S4A – C, Gambar S1A – C). Istilah Gene Ontology (GO) dan analisis pengayaan jalur KEGG dari data ini mengungkapkan bahwa pada hewan yang terinfeksi Ad-GRP78 terdapat penurunan signifikan dalam kadar banyak protein dengan fungsi mitokondria, termasuk protein dari permukaan mitokondria bagian luar dan dalam, protein dari kompleks pernapasan, dan protein matriks.

Kami mengkonfirmasi perbedaan tingkat protein yang terungkap dalam daftar proteomik, seperti GRP75, yang diregulasi (p <0.05), dan subunit kompleks V (CV ), diturunkan regulasi (p=0.03) pada kelompok GRP78 seperti yang diharapkan (Gambar 1A).

Di seluruh daftar, yang paling banyak mengalami penurunan regulasi adalah OGC protein oxoglutarate/malatecarrier (SCL25A11), MT-ND3 (penekan tumor yang berpartisipasi dalam antar-jemput malat-aspartat dan meregenerasi kumpulan NADH dalam matriks mitokondria untuk memungkinkan terjadinya kompleks Fungsi I), subunit NADH dehidrogenase 3 dari kompleks I, asam gammaaminobutyric aminotransferase ABAT, dan subunit reduktase ubiquinol-sitokrom C dari kompleks III. Sebaliknya, sangat sedikit protein yang diregulasi (Gambar 1B).

Salah satu protein yang diregulasi adalah GRP78 seperti yang diharapkan, dan protein lain yang diregulasi adalah transporter asam amino EAAT2, yang terutama terletak di membran plasma dan kadang-kadang di mitokondria pada sinapsis rangsang, dan hidroksiasil-CoA dehidrogenase HADHA, yang mengkatalisis tiga langkah terakhir beta mitokondria. -oksidasi asam lemak rantai panjang.

Kami memperluas analisis untuk menyelidiki apakah protein lain dalam mitokondria atau protein yang berhubungan dengan fungsi mitokondria telah dimodifikasi dari daftar proteomik untuk mengkonfirmasi pengaruh fungsional mitokondria (Gambar 1C).

Kami mengamati bahwa atrofi optik GTPase 1 (OPA1) terkait dinamin yang dilestarikan mitokondria, yang terlibat dalam fusi [36], mengalami penurunan regulasi (p <0.1); LONP1, suatu protease yang bergantung pada ATP yang memediasi degradasi selektif polipeptida yang salah lipatan, menunjukkan kecenderungan untuk meningkat, namun tidak ada perbedaan yang diamati pada kadar ubiquinone NDUFA9, faktor transkripsi NRF2, yang mengatur gen yang mengandung elemen respons antioksidan, atau dinamin lainnya. GTPase terkait yang terlibat dalam infus, seperti mitofusin 2 (MFN2) [36].

Ringkasan komprehensif dari perubahan yang ditemukan dalam mitokondria ditunjukkan dalam skema pada Gambar 1D. Dinamika mitokondria penting untuk respon stres karena mitokondria yang rusak dapat menyatu untuk pertukaran material, dan fisi mitokondria memungkinkan pemisahan mitokondria yang rusak dan mitofag berikutnya [37].

Mempertimbangkan bahwa sebagian besar protein yang mengalami downregulasi terlokalisasi di mitokondria dan tidak ada perubahan nyata yang diamati mengenai aktivitas fusi mitokondria dengan menganalisis MFN2 dan rasio bentuk L/S OPA1 (Gambar 1C), kami menyelidiki penanda yang terkait dengan mitofag.

Secara klasik, degradasi mitokondria yang bergantung pada autophagy terjadi setelah depolarisasi, dan biasanya dipicu oleh peningkatan akumulasi putative kinase 1 (PINK1) yang diinduksi fosfatase dan tensinhomolog (PTEN) secara penuh di membran luar mitokondria.

Selanjutnya, ligase protein ubiquitin E3 di antara cincin Parkin direkrut untuk menandai protein membran luar mitokondria dari mitokondria yang terdepolarisasi dengan ubiquitylation [38-41]. Bagian atas Gambar 2A tidak menunjukkan perubahan pada level Parkin tetapi terdapat penurunan signifikan PINK1 full-length yang disebabkan oleh cedera RA pada segmen sumsum tulang belakang L4-L5 ipsilateral sehubungan dengan kontrol pada 7 dpi. Sebaliknya, ekspresi berlebih dari GRP78 mengurangi Parkin tetapi menggandakan kadar PINK1 setelah RA dibandingkan dengan ekspresi kontrol protein -Gal yang tidak terkait (Gambar 2A, bawah).

Peningkatan regulasi PINK1 panjang penuh konsisten dengan induksi mitofag (42), dan reduksi Parkin mungkin terkait dengan keadaan pembongkaran organel lanjut seperti yang diamati oleh protein mitokondria lainnya.

Kami selanjutnya menyelidiki co-lokalisasi mitokondria dan protein terkait mikrotubulus 1A/1B rantai cahaya 3 (LC3)-positif puncta, komponen kunci dari mesin makroautofag inti dan diperlukan untuk proses mitofag [43].

Dengan menggunakan mikroskop confocal, kami mengamati peningkatan yang signifikan dalam ko-lokalisasi mitokondria, diberi label menggunakan anti-COX IV, dengan puncta positif LC3- setelah RA hanya pada MN yang rusak yang mengekspresi GRP78 secara berlebihan pada 7 dpi (Gambar 2B).

Kami mengkonfirmasi keberadaan mitofag pada MN yang avulsi hanya ketika GRP78 diekspresikan secara berlebihan dengan analisis sampel menggunakan mikroskop elektronik transmisi.

Kami mengamati banyak vakuola dengan engulfedmitokondria, ciri khas mitofag [37], menyerupai mitofagosom, dan beberapa ERcisternae yang berhubungan erat dengan mitokondria dalam MN dari hewan Ad-GRP78, tetapi kami tidak mendeteksinya pada Ad- -Gal RA yang terluka sampel tikus pada 5 dpi (Gambar 2C).

Gambar 1. Ekspresi berlebih GRP78 pada hewan yang terluka RA menargetkan protein mitokondria. (A) Immunoblot dan grafik batang menunjukkan perubahan lipatan rata-rata (± SEM) pada kadar protein GRP78, GRP75, dan CV pada segmen sumsum tulang belakang L4-L5 pada GRP78 vs.

-Gal mengekspresi tikus yang terluka RA sebanyak 7 dpi. Level dinormalisasi ke nilai aktin (n=4; * p < 0.05 vs.Ad- -Gal, uji-t Student). (B) Histogram perubahan lipatan protein mitokondria diperoleh dengan analisis proteomik segmen sumsum tulang belakang L4-L5 dari hewan yang terluka RA yang mengekspresi GRP78 secara berlebihan dibandingkan dengan kelompok Ad- -Gal sebesar 7 dpi. (C)Immunoblot dan grafik batang menunjukkan perubahan lipatan rata-rata (± SEM) NDUFA9, LONP1, NRF2, MFN2, OPA-1 yang dinormalisasi menjadi aktin. (Tidak ada perbedaan yang signifikan antar kelompok. Uji-t siswa). (D) Skema mitokondria dengan protein yang diubah oleh ekspresi berlebih GRP78 di segmen sumsum tulang belakang L4-L5 dari hewan yang terluka RA disorot dengan warna kuning (menurun) atau biru (meningkat) pada 7dpi.

Gambar 2. Mitophagy dimodulasi in vivo setelah RA pada tikus yang mengekspresi GRP78 secara berlebihan. (A) Immunoblot dan grafik batang yang sesuai untuk analisis perubahan lipatan PINK1 dan PARK pada tingkat protein (rata-rata ± SEM) dinormalisasi ke tingkat aktin, pada segmen sumsum tulang belakang L4-L5 dari tikus yang terluka RA vs.

kontrol (atas) atau dari grup Ad{{0}}Gal dan Ad-GRP78 (bawah) sebesar 7 dpi. (n=4; * p < 0,05, uji-t Siswa). (B) Kiri, foto mikro perwakilan MN di lokasi ipsilateral dari hewan RA yang terluka yang menerima suntikan kelompok AAVrh10-GFP atau AAVrh10-GRP78 intratekal pada 7 dpi. Sampel diwarnai untuk COX IV (merah) dan LC3 (hijau) dan diwarnai dengan fluorescentNissl (biru).

Bilah skala=10 µm dan zoom digital dalam sisipan 10X.

Perhatikan bahwa pelokalan bersama hanya diamati di grup AAVrh10-GRP78. Kanan, grafik batang menunjukkan analisis % titik ko-lokalisasi COX IV dan LC3. Rata-rata ± SEM ko-lokalisasi COX IV dan LC3 (n=4; ** p < 0.01, uji-t Student). (C) Gambar mikroskop elektron transmisi representatif di mana mitokondria dibedakan dalam MN sumsum tulang belakang: a, gambar sitoplasma MN yang menunjukkan mitokondria pada hewan kontrol; b, gambar sitoplasma MN dari tikus yang terluka RA dari kelompok Ad- -gal; c, gambar sitoplasma MN dari tikus yang terluka RA dari kelompok Ad-GRP78 dengan beberapa mitokondria yang tertelan yang ditandai dengan tanda bintang merah; d, gambar dengan pembesaran lebih tinggi ditunjukkan pada (C) yang menunjukkan kontak mitokondria dan ER yang besar. Bilah skala ditunjukkan pada gambar.

Secara keseluruhan, hasil ini menunjukkan bahwa ekspresi berlebih GRP78 dapat menginduksi MN yang terputus dari mitofagyin setelah RA, dan hal ini dapat meningkatkan perlindungan saraf.

3.1.2. Ekspresi Berlebih GRP78 Mengembalikan Fungsi Mitokondria yang Rusak

Kami kemudian menyelidiki lebih lanjut efek ekspresi berlebih GRP78 pada mitokondria menggunakan model stres ER in vitro karena gangguan ini muncul lebih awal setelah cedera RA in vivo seperti yang dilaporkan sebelumnya [20,26], dan ini adalah metode yang dapat diandalkan untuk menyaring agen neuroprotektif baru [2,44 ].

Model ini menggunakan tunicamycin (Tun), yang merupakan penginduksi stres ER yang menyebabkan pembentukan zat antara N-asetilglukosamin-lipid, sehingga mencegah glikosilasi protein yang baru disintesis dan menyebabkan kesalahan lipatan protein. Kami menggunakan hal tersebut karena terhentinya jalur sekretori juga dilaporkan menjadi kunci dalam proses neurodegeneratif setelah RA [26].

Kami pertama kali memverifikasi bahwa nukleofeksi sel mirip NSC34motoneuron dengan vektor yang sesuai menghasilkan produksi GRP78 (Gambar 3A). Dalam sel-sel ini, ekspresi GRP78 secara signifikan meningkatkan kelangsungan hidup dalam media yang mengandung Tun (Gambar 3B).

Meskipun pengobatan Tun biasanya menginduksi GRP78 itu sendiri, ekspresi berlebih endogen ini cukup terlambat (24 jam) (Gambar S2). Kami juga bertanya-tanya apakah kami dapat menentukan apakah ekspresi berlebih GRP78 memiliki efek neuroprotektif pada model in vitro lain yang sebelumnya kami laporkan mereproduksi beberapa karakteristik kematian MN setelah cedera RA [26].

Model ini didasarkan pada kerusakan sitoskeletal yang disebabkan oleh nocodazole, yang mengganggu polimerisasi mikrotubulus. Ekspresi GRP78 juga meningkatkan viabilitas sel yang dikultur dengan adanya nocodazole (Gambar 3B).

Kemudian, kami menilai fungsi mitokondria dengan mengukur generasi spesies oksigen reaktif (ROS) di mitokondria menggunakan MitoSOX, potensi membran mitokondria (∆ψm) menggunakan tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM), dan tingkat konsumsi O2, dalam sel NSC34 kami yang mengalami tekanan ER. dengan atau tanpa ekspresi berlebih GRP78.

Sebagai kontrol positif, kami menggunakan efavirenz (EFV), suatu agen mitotoksik yang mengubah ketiga parameter tersebut [45]. Kami mengamati bahwa tingkat MitoSOX semakin meningkat setelah penambahan Tun, mencapai signifikansi statistik dalam 24 jam dan bahwa generasi ROS meningkat secara signifikan dalam sel yang diobati dengan EFV dari jam pertama pasca perawatan sehubungan dengan kontrol yang diobati dengan kendaraan (Gambar S3A).

Ekspresi GRP78 yang berlebihan menghasilkan tingkat mitokondria ROSin yang jauh lebih rendah sehubungan dengan sel pengekspres GFP pada 24 jam setelah pengobatan Tun atau EFV (Gambar 3C). ∆ψm runtuh setelah 5 dan 24 jam pengobatan Tun dan setelah 24 jam pengobatan EFV (Gambar S3B). Pemulihan parameter ini dicapai dengan ekspresi berlebih GRP78 pada sel yang diobati dengan Tun atau EFV (Gambar 3D).

Laju konsumsi O2 berkurang selama 80 menit analisis setelah penambahan Tun pada sel yang mengekspresikan GFP (kemiringan −0.063,R2=0.98), namun konsumsi O2 meningkat stabil dalam sel yang mengekspresikan GRP78-secara berlebihan meskipun terdapat Tun (kemiringan −0.221, R2=0.99) (Gambar 3E, kiri).

Setelah 5 jam, respirasi menjadi normal pada sel yang mengekspresikan GRP78-berlebihan dan sangat terganggu pada sel yang mengekspresikan GFP (Gambar 3E, kanan). Secara keseluruhan, hasil ini menunjukkan bahwa GRP78 melemahkan fungsi mitokondria yang disebabkan oleh tekanan ER atau mitosoksisitas.

For more information:1950477648nn@gmail.com