Graham-2023-Pembelajaran Menghasilkan Transkrip Unik

Abstrak:
Pembelajaran dapat menginduksi plastisitas neurofisiologis di korteks pendengaran pada berbagai skala waktu. Perubahan jangka panjang pada fungsi korteks pendengaran yang bertahan selama berhari-hari, berminggu-minggu, atau bahkan seumur hidup, memerlukan ekspresi gen yang dipicu oleh pembelajaran. Memang benar, transkripsi de novo merupakan penentu molekuler apakah pengalaman sementara berubah menjadi ingatan jangka panjang dengan dampak jangka panjang pada perilaku.

Dengan terus berkembangnya ilmu pengetahuan dan teknologi, banyak fenomena kehidupan magis yang bermunculan dalam perjalanan kehidupan manusia, di antaranya yang paling berharga untuk penelitian adalah ingatan. Memori adalah bagian penting dari aktivitas saraf tingkat lanjut manusia, dan juga merupakan catatan dan akumulasi berbagai peristiwa yang terjadi sejak evolusi manusia. Lantas, adakah hubungan antara ekspresi gen dan memori? Jawabannya iya.

Pertama, pengaruh gen terhadap ingatan sangat jelas. Ini dapat mengatur ekspresi berbagai molekul dan protein yang berhubungan dengan memori melalui polimorfisme nukleotida tunggal (SNP) dan metode lainnya. Hal ini dapat mempengaruhi efisiensi komunikasi antar neuron, sehingga mempengaruhi karakteristik kognitif, konseptual, emosional, dan lainnya seseorang, yang menunjukkan kualitas memori.

Kedua, ingatan juga dapat mempunyai dampak tertentu pada ekspresi gen. Dalam proses pembelajaran, ingatan, dan pemikiran kita, tidak hanya terjadi perubahan aktivitas saraf otak tetapi juga regulasi dan intervensi banyak gen dan molekul. Pengaturan gen dan molekul ini akan mencatat jejak-jejak perasaan dan pengalaman yang ada dalam memori jangka panjang kita, dan pada akhirnya akan disimpan dalam gen.

Terakhir, terdapat saling ketergantungan antara sikap positif dan kemampuan memori jangka panjang. Suasana hati yang bahagia dapat membantu kita lebih fokus dan konsentrasi saat proses belajar dan berpikir, sehingga membantu meningkatkan kemampuan daya ingat. Memori jangka panjang yang disengaja juga dapat mendorong pembentukan koneksi dan struktur saraf baru di otak, yang juga sangat membantu pembelajaran dan memori di masa depan.

Oleh karena itu, dapat disimpulkan bahwa terdapat korelasi antara ekspresi gen dan memori. Kita dapat meningkatkan dan meningkatkan kemampuan ingatan kita melalui ingatan yang disengaja, optimisme, dan berpikir positif, yang juga dapat membantu kita mencapai kesehatan fisik dan mental yang lebih baik. Hanya dengan cara ini kita dapat melayani masyarakat dan pembangunan manusia dengan lebih baik. Terlihat bahwa kita perlu meningkatkan daya ingat, dan Cistanche deserticola dapat meningkatkan daya ingat secara signifikan karena Cistanche deserticola merupakan bahan obat tradisional Tiongkok yang memiliki banyak khasiat unik, salah satunya meningkatkan daya ingat. Khasiat daging cincang berasal dari berbagai bahan aktif yang dikandungnya, antara lain asam, polisakarida, flavonoid, dll. Bahan-bahan tersebut dapat meningkatkan kesehatan otak dengan berbagai cara.

Klik suplemen tahu untuk meningkatkan daya ingat

Namun, gen kortikal pendengaran yang mendukung pembelajaran pendengaran, memori, dan perilaku spesifik suara yang diperoleh sebagian besar masih belum diketahui. Laporan ini adalah yang pertama untuk mengidentifikasi perubahan genom dalam ekspresi gen yang diinduksi pembelajaran dalam korteks pendengaran yang diduga mendasari pembentukan memori pendengaran. Analisis bioinformatik pada profil pengayaan gen dari sekuensing RNA mengidentifikasi jalur biologis yang mencakup sinapsis kolinergik dan interaksi reseptor neuroaktif.

Temuan ini mencirikan kandidat efek utama yang mendasari perubahan fungsi kortikal yang mendukung pembentukan memori pendengaran jangka panjang di otak orang dewasa. Molekul dan mekanisme yang teridentifikasi merupakan target terapeutik potensial untuk memfasilitasi perubahan jangka panjang dan spesifik terhadap fungsi pendengaran di masa dewasa dan kini menjadi pilihan utama untuk penyelidikan yang menargetkan gen di masa depan.

Naskah:

Konsep yang diterima dengan baik di bidang pembelajaran dan memori adalah bahwa ingatan disimpan di tempat mereka diproses (Nadel & Hardt, 2011). Peristiwa biologis yang dikenal sebagai konsolidasi memori dapat menstabilkan representasi saraf sementara yang ditimbulkan oleh pengalaman sensorik (Lechner, Squire,& Byrne, 1999; McGaugh, 2000; Dudai, 2012). Mekanisme fundamental dan yang dilestarikan secara evolusioner yang memulai konsolidasi memori adalah transkripsi dan translasi, masing-masing didefinisikan sebagai ekspresi aktif gen dan produk protein berikutnya (Alberini & Kandel, 2014; Costa-Mattioli et al., 2009).

Kami berhipotesis bahwa pembelajaran diskriminasi suara menginduksi ekspresi gen de novo dalam korteks pendengaran. Representasi isyarat suara yang sangat spesifik dapat bertahan lebih lama dari kefanaan pengalaman (detik dan menit) dengan menggabungkannya ke dalam memori jangka panjang (jam hingga hari) yang kemudian memandu perilaku isyarat suara. Meskipun profil transkriptomik regional yang khas dianggap bertanggung jawab atas konsolidasi memori (Katzman, dkk., 2021), peristiwa transkripsi yang dipicu oleh pembelajaran yang mendukung pembentukan memori dalam sistem pendengaran pusat masih sangat kurang dijelaskan.

Sebaliknya, korteks pendengaran telah dijelaskan dengan sangat baik dalam studi pembelajaran pendengaran dan memori pada tingkat perubahan neurofisiologis khususnya dalam bidang reseptif dan peta tonotopik (Schreiner & Polley, 2014; Weinberger NM, 2015; Pienkowski & Eggermont, 2011), kortikosteroid dan korteks pendengaran. konektivitas kortikal dan kortiko-fugal (Souffi et al., 2021; Lesicko & Geffen, 2022; Schreiner & Polley, 2014; Liu et al., 2011; Xiong, Znamenskiy, & Zador, 2015), termasuk pada berbagai skala waktu (Froemke& Martins , 2011; Froemke & Schreiner, 2015; Fritz, Elhilali, David, & Shamma, 2007;Tchernichovski & Margoliash, 2013). Selain itu, perubahan neurofisiologis terkait dengan perilaku, misalnya, untuk tindakan yang diarahkan pada isyarat (Letzkus, Wolff, & Lüthi, 2015), perhatian (Fritz et al., 2007;Elhilali et al., 2007) dan memori untuk sinyal suara (Bieszczad & Weinberger 2010; Grosso dkk.,2015; Aschauer & Rumpel, 2016; Concina, Renna, Grosso, & Sacchetti, 2019; Letzkus, Wolff, &Lüthi, 2015; Ghosh & Zador, 2021).

Bukti selama puluhan tahun mengenai plastisitas neurofisiologis yang disebabkan oleh pembelajaran di korteks pendengaran telah menunjukkan karakteristik perilaku memori pendengaran yang sama (Weinberger 2007a; 2007b), menjadikannya wilayah kandidat teratas untuk konsolidasi memori pendengaran. Dengan menyelidiki korteks pendengaran secara bioinformatika, kami juga memanfaatkan peluang yang tidak memihak untuk mengungkap penjaga gerbang biologis umum atau berbeda dari neuroplastisitas yang mendasari fungsi pendengaran adaptif di seluruh otak. Dari perspektif yang lebih luas, profil transkriptomik regional dapat menghasilkan pemahaman yang lebih lengkap tentang bagaimana sistem sensorik dimodifikasi oleh pengalaman dalam melayani memori.

Profil transkriptomik yang dipicu oleh pembelajaran yang diidentifikasi dalam korteks pendengaran dapat memvalidasi, memperluas, atau mengarah pada model proses biologis baru yang mendukung atau merusak pemrosesan pendengaran adaptif. Konsolidasi memori pendengaran kemungkinan merupakan produk dari perubahan ekspresi gen yang bergantung pada pengalaman yang mempengaruhi fungsi seluler dalam korteks pendengaran, yang pada gilirannya mendorong perubahan jangka panjang terhadap respons neurofisiologis yang ditimbulkan oleh suara yang mengubah perilaku isyarat suara.

Untuk mengidentifikasi transkrip yang diinduksi pembelajaran, analisis profil ekspresi, menggunakan RNAsequencing (RNAseq) dilakukan pada sampel korteks pendengaran yang ditentukan secara anatomi (Bregma -3.10 mm, Interaural 6.90 mm; Paxinos & Watson, 2007 ) dari orang dewasa yang dibatasi airnya, dilatih untuk membatasi tekanan hingga nada murni untuk imbalan air. Tanggapan terhadap frekuensi nada murni target (5,0 kHz; 65 dB SPL) menghasilkan imbalan, sedangkan tanggapan terhadap non-target (11,5 kHz; 65 dB SPL) tidak diberi imbalan dan memulai periode waktu habis yang memperpanjang waktu ke uji coba berikutnya.

Tugas diskriminasi dua warna (2TD) ini tidak sulit secara persepsi; frekuensi akustiknya terpisah lebih dari satu oktaf dan mudah dibedakan oleh hewan pengerat (Talwar & Gerstein, 1998). Sebaliknya, tantangan perilaku bersifat asosiatif: kinerja 2TD menuntut memori yang nadanya dikaitkan dengan imbalan (vs. tanpa imbalan). Tikus terlatih (N=8) dikorbankan setelah tiga sesi pelatihan 2TD 45-menit 2TD setiap hari berturut-turut dan dibandingkan dengan sekelompok tikus yang naif suara (N=4). Ini adalah titik waktu awal pelatihan ketika hewan masih melakukan tugas 2TD. Akuisisi tugas awal ditargetkan untuk menangkap peristiwa transkripsi awal yang dipicu oleh pembelajaran yang menyiapkan panggung untuk peningkatan kinerja 2TD selanjutnya yang diamati dalam perilaku selama berminggu-minggu pelatihan.

Misalnya, kinerja rata-rata berada di atas peluang, namun hanya 66±7,81% setelah 3 hari, dibandingkan dengan Lebih dari atau sama dengan 90% setelah pelatihan diperpanjang (Shang, Bylipudi, & Bieszczad, 2019). Untuk memanfaatkan peluang dalam mengidentifikasi ekspresi gen yang relevan untuk keberhasilan memori asosiatif spesifik suara, kami memanfaatkan penghambat HDAC yang menargetkan regulasi epigenetik dari ekspresi gen yang bergantung pada aktivitas dalam pembelajaran dan pembentukan memori (McQuown, et al., 2011; Kwapis, et al., 2017;Malvaez, dkk., 2012). Yang penting, penelitian selama satu dekade telah menunjukkan bahwa penghambatan HDAC dapat memfasilitasi plastisitas neurofisiologis yang diinduksi pembelajaran dalam respons kortikal pendengaran yang ditimbulkan oleh suara (relatif terhadap kendaraan) dan meningkatkan perilaku diskriminatif pendengaran (Bieszczad et al., 2015; Phan et al., 2017; Shang, Bylipudi, &Bieszczad, 2019; Rotondo & Bieszczad, 2020; Rotondo & Bieszczad 2021a; 2021b) termasuk manusia (Gervain, et al., 2013).

Setengah dari hewan terlatih diberi inhibitor HDAC, RGFP966 (N=4; 10 mg/kg, ApexBio, cat#A8803; sub. cu. injection) , sedangkan separuh lainnya dilatih secara identik tetapi diberikan larutan kendaraan (N=4; volume yang sesuai, injeksi sub. cu.; Gambar 1a). Tidak ada perbedaan kinerja 2TD antar kelompok pada saat pengumpulan otak (RGFP966: 61±5,0% vs. Kendaraan: 71±7,0%; t(5,9166)=-1.21, p=0.272 ; Uji-t Welch). Otak segera dikumpulkan dan dibekukan pada titik waktu yang konsisten dengan konsentrasi puncak inhibitor di korteks pendengaran, satu jam setelah injeksi inhibitor atau kendaraan HDAC pasca-sesi (Bieszczad et al., 2015).

Temuan di sini adalah yang pertama untuk mengidentifikasi profil transkriptomik pembelajaran asosiatif dalam korteks pendengaran. Pembelajaran dalam diskriminasi dua nada menyebabkan perubahan pada tingkat transkripsi ratusan gen (dibandingkan dengan naif suara) (Gbr. 1b). Algoritme pengelompokan hierarki menunjukkan bahwa gen secara unik diregulasi atau diturunkan, mengungkapkan jaringan kompleks peristiwa ekspresi gen kortikal yang disebabkan oleh pembelajaran pendengaran (Gbr. 2a).

Analisis pengayaan (iPathwayGuideTM; metode Analisis Dampak) mengidentifikasi sinapsis kolinergik (gen yang diekspresikan secara berbeda (DEG) / semua gen (ALL): 22/101; p=0.004, Koreksi Bonferroni) sebagai jalur biologis teratas (Tabel 1) . Hasil ini konsisten dengan penelitian sejak tahun 1990an yang menyoroti kecukupan sinyal kolinergik di korteks pendengaran untuk plastisitas neurofisiologis dan perilaku pendengaran terkait (Froemke & Martins, 2011;Weinberger, 2003; Bakin & Weinberger, 1996; Kilgard & Merzenich, 1998). Tingkat transkrip yang diinduksi oleh pembelajaran di bawah penghambatan HDAC diperkuat dalam arah yang sama (dengan peningkatan lebih lanjut atau penurunan lebih lanjut dalam tingkat transkrip gen unik) (Gambar 2b) atau tumpul dibandingkan dengan pembelajaran saja (Gambar 2c). Salah satu jalur biologis teratas dalam kondisi ini adalah interaksi ligan-reseptor neuroaktif (DEG/ALL: 30/194; p=0.016; Tabel 1) yang melibatkan efektor yang penting untuk aktivasi saraf.

Jalur teratas lainnya adalah interaksi reseptor matriks ekstraseluler (reseptor ECM) (DEG/ALL: 14/69; p=0.04; Tabel 1). Komponen ECM sangat penting untuk plastisitas kortikal dan konsolidasi memori (Happel, dkk., 2014; Banerjee, dkk., 2017; El-Tabbal, dkk., 2021; Sonntag, dkk., 2015). Jalur ini menawarkan alternatif potensial, mungkin saling melengkapi, terhadap sinyal kolinergik yang dapat memfasilitasi perubahan fungsi pendengaran yang bergantung pada pengalaman (Ji, Gao, & Suga, 2001; Luo & Yan, 2013; Metherate, 2011). Gen-gen lain yang ekspresinya berubah dengan pembelajaran pendengaran tetapi tidak lebih jauh lagi dengan penghambatan HDAC kemungkinan besar terkait dengan kondisi prosedural tugas, bukan dengan memori asosiatif khusus suara. Misalnya, jalur pensinyalan apelin telah diidentifikasi (DEG/ALL: 20/116; p=0.0005), yang penting di otak untuk pengaturan homeostatis asupan air (Hu, et al., 2021). Perbandingan langsung tingkat transkrip antara dua kelompok tikus terlatih (belajar dengan atau tanpa penghambatan HDAC) menunjukkan sangat sedikit gen yang diekspresikan secara unik dan berbeda (DEG).

Ambang batas yang banyak digunakan untuk mengidentifikasi DEG yang paling mungkin (p =0.05) hanya menemukan Adamts13, U6, Rexo4, dan Cabin1 yang diekspresikan secara berbeda (Gbr. 2d). Dengan demikian, efek utama dari penghambatan HDAC tampaknya memodulasi ekspresi gen yang disebabkan oleh pembelajaran pendengaran dalam kondisi normal, daripada merekrut gen unik baru untuk mempertahankan memori spesifik suara. Bersama-sama, temuan ini menunjukkan perubahan transkriptomik skala besar terjadi di korteks pendengaran pada awal pelatihan ketika hewan dewasa belajar membedakan hubungan asosiatif antara isyarat suara. Bersama dengan laporan neurofisiologis dan perilaku mengenai penghambatan HDAC untuk meningkatkan fungsi pendengaran, temuan ini mendukung taktik penggunaan penghambat HDAC untuk membedakan gen yang ekspresinya menentukan keberhasilan pembentukan memori pendengaran.

Beberapa gen yang menjadi perhatian (GOI) dipilih dari analisis pengayaan dalam jalur biologis untuk memvalidasi pengurutan seluruh genom dengan pendekatan yang ditargetkan pada gen. Sampel dikumpulkan dari kelompok terpisah yang mereplikasi dua kelompok hewan yang dilatih dan diberi perlakuan pada tahap awal yang sama. titik waktu pelatihan (yaitu, satu jam setelah sesi pelatihan 2TD ketiga) untuk digunakan dalam analisis ekspresi gen menggunakan reaksi rantai polimerase waktu-nyata kuantitatif (qRT-PCR). Tidak ada perbedaan kinerja 2TD dalam kelompok replikasi (RGFP9661: 61±5.0% vs. RGFP9662: 67±6.0%; t(8.441)=-0.834, p {{20}}.4274; dan Kendaraan1:71±6.0% vs. Kendaraan2: 74±3.0%; t(4.0809)=-0.444, p {{ 34}}.6796; uji-t Welch).

Pemerintah Indonesia yang pertama adalah Egr1, sebuah "gen awal-awal" yang dipelajari dengan baik dan bergantung pada aktivitas, yang diketahui mencapai puncaknya dalam jam-jam pertama pembelajaran dan penting untuk pembentukan memori (Duclot & Kabbaj, 2017). Itu adalah gen yang diinduksi oleh toplearning dengan peningkatan ekspresi yang dikonfirmasi yang juga diperkuat dengan penghambatan HDAC dalam kelompok hewan yang terpisah dalam penelitian yang ditargetkan pada gen (Gbr. 3). Hal yang sama juga berlaku untuk Per2, sebuah gen yang terlibat dalam regulasi ritme sirkadian dan jalur serotoninergik di otak (Bae, dkk., 2001; Albrecht, dkk., 2001; Cuesta, dkk., 2009; Reh, dkk. ,2020). Per2 adalah bagian dari keluarga "gen jam" yang telah dikaitkan dengan modulasi HDAC di wilayah otak lain (Kwapis, dkk., 2018) dan mungkin juga berperan dalam fungsi pendengaran (Reh dkk.,2020). Sebaliknya, beberapa Pemerintah Indonesia yang mengidentifikasi seluruh genom hanya dikonfirmasi sebagian.

Chrna7 mengkodekan subunit reseptor asetilkolin nikotinat dinamis (nAChR) yang ditemukan diturunkan regulasinya dalam pembelajaran pendengaran, konsisten dengan bukti neurofisiologis (Takesian, dkk., 2018; Kuchibhotla, dkk., 2017). Dengan demikian, kami mengharapkan penelitian yang menargetkan gen untuk mengkonfirmasi penurunan regulasi Chrna7 pada semua hewan yang dilatih 2TD, tetapi penurunan regulasi hanya terlihat pada hewan yang dirawat di kendaraan yang mempelajari 2TD tanpa penghambatan HDAC. GOIs tambahan yang dipilih berasal dari keluarga reseptor nuklir yatim piatu Nr4a, Nr4a1 dan Nr4a2, yang merupakan gen awal yang dilaporkan diperlukan untuk menyebarkan efek hilir dari target HDAC selektif RGFP966 di wilayah otak lain (McQuown et al., 2011; Kwapis, et al. ., 2019).

Konsisten dengan laporan sebelumnya tentang perbedaan regional yang bergantung pada tugas dalam ekspresi gen keluarga Nr4a (McNulty, et al., 2012), Nr4a1 tetapi bukan Nr4a2 diregulasi di korteks pendengaran setelah pembelajaran pendengaran. DEG lainnya, Htr1a atau Adamts13, tidak dikonfirmasi oleh penelitian bertarget gen yang kemungkinan disebabkan oleh perbedaan varian transkrip yang diketahui yang tidak terdeteksi oleh probe bertarget gen yang dirancang khusus, atau karena kesalahan tipe I, atau perbedaan perilaku yang tidak kentara antara kelompok hewan terlatih yang tidak terdeteksi dalam ukuran kinerja 2TD. Kami juga menyelidiki Lynx1, sebuah gen dengan sejarah panjang yang berfungsi untuk membuka kembali plastisitas seperti "masa kritis" di korteks sensorik (Morishita et al., 2010), kemungkinan karena aksinya terhadap modulasi kolinergik dan serotonergik (Takesian, et al. , 2018). Namun konsisten dengan laporan genom sebelumnya yang gagal dideteksi (Kalish, et al., 2020), hal ini tidak terdeteksi dalam kumpulan data RNAseq kami atau penelitian yang menargetkan gen.

Meskipun masih menjadi tantangan untuk menentukan apakah perbedaan dapat dijelaskan oleh variabilitas biologis atau individu nyata antar hewan, atau karena variabilitas teknis dengan kelimpahan rendah atau transkrip ekspresi spesifik tipe sel, kami melaporkan hasil yang sangat konsisten untuk beberapa Pemerintah Indonesia. Karena ekspresi Chrna7, Egr1, dan Per2 yang dipicu oleh pembelajaran konsisten antara pendekatan penargetan gen dan pendekatan genom, dan antara kelompok hewan terlatih yang berbeda, masuk akal bahwa gen-gen ini mungkin merupakan pemain paling mendasar dalam perubahan jangka panjang. fungsi pendengaran dan memori dan sekarang menjadi yang utama untuk penyelidikan di masa depan.

Jika digabungkan, temuan ini mengungkap lanskap transkripsional dinamis di korteks pendengaran orang dewasa yang dapat mendukung fungsi pendengaran yang muncul dalam neurofisiologi dan perilaku. Mengingat semakin banyaknya bukti kontrol epigenetik pada fungsi sistem sensorik (cf, Shang & Bieszczad, 2022), menarik untuk dipertimbangkan. bagaimana mekanisme epigenetik berperan dalam menyeimbangkan stabilitas dengan plastisitas sirkuit kortikal pendengaran yang bergantung pada pengalaman. Misalnya, kumpulan data genom saat ini juga mengidentifikasi pengurangan yang disebabkan oleh pembelajaran dalam ekspresi histone deacetylase yang represif, Hdac9, yang tidak ada dengan penghambatan HDAC.

Sangat menggoda untuk menyamakan efek berkurangnya ekspresi HDAC9 dengan efek penghambatan HDAC secara farmakologis untuk mendorong transkripsi yang dipicu oleh pembelajaran. Kelas penting lainnya dari regulator epigenetik mengubah DNA daripada histon. Contohnya adalah Tet1 dan Gadd45b yang keduanya berdampak pada metilasi DNA (Bayraktar & Kreutz, 2018) dan ditemukan diatur ke bawah dan ke atas dengan pembelajaran, masing-masing, di bawah penghambatan HDAC. Lebih lanjut, kelas mikroRNA muncul sebagai jalur biologis teratas yang diinduksi oleh pembelajaran dengan penghambatan HDAC (lihat Tabel 1), yang telah mendapatkan daya tarik di lapangan sebagai pengatur epigenetik utama dari kontrol transkripsional saraf (Saab & Mansuy, 2014). Interaksi molekuler tingkat tinggi antara pemain epigenetik dan produk protein dari gen yang diekspresikan juga mungkin terjadi. Misalnya, Egr1 teregulasi ke atas yang teridentifikasi dapat merekrut Tet1 untuk menghilangkan tanda metilasi yang represif guna mengaktifkan gen hilir (Sun, et al.,2019). Studi molekuler lebih lanjut akan diperlukan untuk mengurai pentingnya interaksi antara regulator epigenetik dalam sistem pendengaran selama pembelajaran. Selain itu, laporan ini memberikan peluang langsung untuk membangun hubungan antara gen kortikal pendengaran tertentu dan efektor hilirnya.

Menjembatani kesenjangan antara gen dan molekul dengan pengaruhnya terhadap peristiwa neurofisiologis yang ditimbulkan oleh suara sangat penting untuk memahami bagaimana sistem pendengaran orang dewasa beradaptasi dengan pengalaman untuk mengubah perilaku. Memang benar, penerjemahan transkrip de novo diperlukan untuk perubahan fungsi perilaku jangka panjang karena transkrip tersebut menghasilkan perubahan jangka panjang pada fungsi seluler. Misalnya, efektor target utama dari proses transkripsi yang diinduksi pembelajaran dapat mengubah ketersediaan saluran atau reseptor (Metherate, Intskirveli, & Kawai, 2012; Brown & Kaczmarek, 2011; Henton, Zhao, & Tzounopoulos, 2023) dalam sirkuit yang menentukan suara- membangkitkan ambang batas, responsivitas, dan arsitektur bidang reseptif dalam sistem pendengaran. Masuk akal untuk berasumsi bahwa tugas pendengaran yang berbeda akan merekrut jaringan gen unik untuk jalur biologis yang relevan dengan fungsi seluler tertentu yang akan mendukung pembelajaran untuk fitur suara atau struktur tugas yang relevan dengan tugas tersebut.

Secara keseluruhan, laporan ini berfungsi sebagai titik awal untuk menyediakan kumpulan data RNAseq dari korteks pembelajaran, orang dewasa, dan pendengaran (lihat Gudang Data). Upaya untuk mempersempit kesenjangan pengetahuan yang diperburuk oleh kurangnya penelitian yang berfokus pada proses genetik molekuler di korteks pendengaran orang dewasa kini disambut baik. Kami mendorong studi melampaui batasan spatio-temporal sekuensing RNA massal yang sensitivitasnya dibatasi secara teknis juga oleh kedalaman baca (Li& Wang, 2021), terutama karena teknologi Omics modern berkembang dan meningkat dengan cepat.

Meskipun penelitian di korteks pendengaran telah membuat beberapa langkah awal dalam genetika molekuler yang telah mengidentifikasi kaskade molekuler esensial (Schicknick, dkk., 2008), profil IEG yang permisif (Mello, Velho, & Pinaud, 2006; de Hoz, dkk., 2018 ; Peter, et al., 2011) dan bahkan dinamika kromatin (Peter, et al., 2021), ada preseden di pinggiran pendengaran di mana transkripsidinamika dipelajari dengan indah (Kwan, 2016; Barta, et al., 2018; Li, et al., 2020; Ebeid, dkk.,2017). Alat molekuler yang ada seperti pengurutan RNA sel tunggal (RNA-Seq) dan hibridisasi fluoresen in situ molekul kecil (smFISH) akan berguna untuk memberikan wawasan tentang variasi sel-ke-sel yang bergantung pada pengalaman dan interaksi molekuler dalam sel dan sirkuit kortikal pendengaran. Tidak seperti RNAseq massal, metode ini menghormati keragaman seluler yang mendalam dan organisasi tingkat tinggi di korteks pendengaran, seperti sirkuit mikro khusus lapisan dan topografi lemniscal.
Pendekatan cerdas untuk menandai dan mengurutkan transkrip hanya dari sel kortikal pendengaran yang baru aktif (Cho, Huang, & Gray, 2016) dapat meningkatkan sensitivitas sehingga dapat memperoleh set gen yang paling relevan secara fungsional dari jenis dan populasi sel yang paling relevan secara fungsional. Pendekatan serupa juga dapat digunakan secara subkortikal untuk menangkap dan membandingkan profil transkriptomik regional yang bergantung pada aktivitas di korteks yang menghormati integrasi kortikal yang luar biasa dengan fungsi subkortikal dari sistem pendengaran dalam kondisi pendengaran atau tuntutan perilaku yang berbeda. Mengkarakterisasi sepenuhnya perbedaan seluler dan regional dalam mekanisme genetik dan molekuler yang mendasari pembelajaran pendengaran di otak orang dewasa adalah hal yang sangat penting untuk mengembangkan terapi presisi yang selektif terhadap lokasi dan menargetkan molekul yang memungkinkan perubahan fungsional yang kuat dan terus-menerus untuk mendukung kemampuan pendengaran dan pendengaran tertentu sepanjang masa hidup.

Metode

Subyek: Sebanyak 24 tikus Sprague-Dawley jantan dewasa (250 – 300 g pada saat kedatangan; Charles RiverLaboratories, Wilmington, MA) digunakan dalam eksperimen perilaku dan molekuler. Semua hewan ditempatkan satu per satu di ruang koloni yang suhunya dikontrol (24 ˚C) dengan siklus terang/gelap 12-jam. Subjek memiliki akses ad libitum terhadap makanan dan air sebelum pelatihan perilaku. Semua prosedur telah disetujui dan dilakukan sesuai dengan pedoman oleh Komite Perawatan dan Penggunaan Hewan Institusional (IACUC) di Rutgers, Universitas Negeri New Jersey (Protokol No.:999900026 (KMB)).

Peralatan perilaku dan rangsangan suara: Semua sesi perilaku dilakukan di dua ruang pengkondisian instrumental yang identik (H{{0}}TC-NSF; Coulbourn Instruments, Holliston, MA) di dalam kotak yang dilemahkan suara. Sesi pelatihan harian diimbangi untuk memastikan paparan yang sama terhadap kedua ruangan. Setiap ruang (12" W x 10" D x 12" H; lantai wire mesh dilengkapi dengan tuas respons (H21-03R), lampu rumah (H11-01R), speaker (H{ {8}}R), dan sistem pengiriman air (H14-05R). Selama fase pelatihan, hewan dapat menekan tuas respons ("barpress"), yang memicu penyajian cangkir air (~0,02cc) di port hadiah (1,25"W x 1,625" H). Sakelar tangan (H21-01) digunakan selama sesi awal untuk membentuk respons tekanan batang hewan guna memicu presentasi cangkir air yang memungkinkan akses ke waterreward Respons perilaku dicatat menggunakan perangkat lunak Graphic State 4 (CoulbournInstruments, Holliston MA) untuk analisis offline.

Semua rangsangan pendengaran dihasilkan menggunakan perangkat lunak Tucker-Davis Technologies (TDT, Alachua, FL) dan RPvdsEx, dan disajikan melalui speaker yang dipasang di dinding ruang operan. Whitenoise (selama pelatihan prosedural; Gambar 1a) ditampilkan selama 7 atau 9 detik (75 dB SPL). Nada murni (selama pelatihan diskriminasi dua nada; Gambar 1a) selalu ditampilkan selama 8 detik (70dB SPL). Tingkat suara dikalibrasi setiap hari menggunakan pengukur suara digital (Larson DavisSoundTrack LxT1).

Pelatihan perilaku dan penghambatan farmakologis HDAC3: Setelah satu hari menyesuaikan diri dengan vivarium, tikus ditangani setiap hari selama minimal 3 hari. Sebelum memulai pelatihan perilaku, tikus ditempatkan pada jadwal pemberian air terbatas sampai mereka mencapai 85% dari berat hewan kontrol yang tidak dibatasi berat badannya sesuai usia. Tikus yang dibatasi air kemudian dibentuk di dalam ruangan yang dilemahkan dengan tekanan untuk mendapatkan hadiah air (Gbr. 1a). Pembentukan barpress dan pelatihan suara selanjutnya seperti yang dijelaskan sebelumnya (Shang, Bylipudi, & Bieszczad, 2019). Secara singkat, semua hewan dibentuk untuk melakukan barpress selama 5 hari dan kemudian dilatih dalam tugas prosedural untuk belajar bar-press menjadi suara, yang mana pada fase ini adalah stimulus kebisingan Gaussian pita lebar (1-12,5 kHz band-pass filter white noise; 75 dB SPL), untuk mendapatkan hadiah air. Semua hewan berhasil belajar mengasosiasikan suara ini dengan imbalan sebelum melanjutkan ke tahap pelatihan berikutnya. Pelatihan prosedural menunjukkan variabilitas individu mengenai seberapa cepat hewan dapat mempelajari tugas hingga kinerja tingkat tinggi. Meskipun demikian, semua hewan mampu mencapai tingkat kinerja lebih dari atau sama dengan 90% selama dua hari berturut-turut (rata-rata=92.85%, sem =0.01%) setelah rata-rata 12,67 hari ( sd=2,85 hari). Kinerja dihitung menggunakan 100%.

Fase pelatihan berikutnya adalah tugas diskriminasi dua nada (2TD) (Gbr. 1a), di mana tikus dilatih untuk membedakan dua frekuensi suara yang berbeda secara spektral. Penekanan bar ke nada S+ (5.0 kHz; 70 dB SPL) akan menghasilkan hadiah air, sedangkan penekanan bar ke Batu (11,5 kHz; 70 dB SPL) menghasilkan sinyal kesalahan (flashing house ringan) dan "time-out" (penantian tambahan 6 detik untuk dimulainya uji coba berikutnya). Uji coba S+ dan S-S diacak dan berlangsung selama 8 detik. Interval antar percobaan (ITI) rata-rata 15 detik (kisaran: 5-25 detik, acak). Barpress selama ITI senyap tidak penting (tidak ada batas waktu, tidak ada sinyal kesalahan, atau imbalan air). Sesi harian berdurasi 45 menit. Semua hewan melakukan tugas 2TD selama total tiga hari berturut-turut. Tikus dipasangkan oleh pengamat terlatih sehingga hewan dengan tingkat perolehan tugas prosedural yang sama diberi kondisi perlakuan berbeda pada fase 2TD. Pasangan yang kinerjanya cocok menerima suntikan sistemik dari inhibitor HDAC3 farmakologis kelas I RGFP966 (Abcam Inc., ab144819; 10 mg/kg;sc; N=12) atau larutan pembawa (N=9) segera setelah masing-masing pasangan sesi 2TD. Kinerja tugas 2TD dihitung seperti yang dijelaskan sebelumnya: 100% (Shang, Bylipudi, & Bieszczad, 20).

).Pengumpulan jaringan dan isolasi RNA: Satu jam setelah hewan menerima suntikan RGFP966 ketiga dan terakhir setelah sesi ketiga 2TD, otak dengan cepat dibedah dan dibekukan dalam gelas kimia 2-metilbutana yang ditempatkan di atas es kering. Otak yang dibekukan dengan flash kemudian disimpan pada suhu -80˚ C hingga diproses di masa mendatang. Untuk mempersiapkan otak untuk cryosectioning, otak dibungkus dalam senyawa suhu pemotongan optimal (OCT) dan disimpan pada suhu -20˚ C selama 12-24 jam untuk memastikan jaringan otak akan mencapai -20˚ C untuk pemotongan. Otak yang dibungkus dalam OCT kemudian akan diiris secara horizontal dalam cryostat (Leica CM 3050S) dengan ketebalan 250 µm. Dengan menggunakan pukulan mikro jaringan bundar 1 mm, 2 mm3 jaringan kortikal pendengaran dari masing-masing belahan bumi (digabungkan menjadi satu sampel dengan total 4 mm3 per wilayah otak) diambil sampelnya untuk ekstraksi RNA. Lokasi korteks pendengaran diidentifikasi menggunakan The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates (edisi ke-6) karya Paxinos dan Watson sebagai referensi (kira-kira A/P=-3,6 hingga -5,8 mm, M/L {{20} } ±6,4 mm D/V=-4,2 hingga -5,8 mm; dan menggunakan hipokampus sebagai penanda

Total RNA dari setiap sampel diisolasi menggunakan PureLinkTM RNA Mini Kit (ThermoFisher) menggunakan protokol pabrikan. Sampel RNA kemudian dimurnikan dengan RNA Clean andConcentrator™ -25 Kit (Zymo Research).

Gene expression analysis, Gene Ontology (GO) biological process analysis, and gene set enrichment analysis (GSEA): RNA-seq analysis was conducted by the Iowa Institute of Human Genetics (IIHG; Iowa City, IA, USA). Briefly, using 500 ng total RNA (all RIN values >8), perpustakaan pengurutan dihasilkan menggunakan Illumina TruSeq® Stranded mRNA Library Prepkit sesuai dengan protokol yang direkomendasikan pabrikan. Perpustakaan dikumpulkan dan pengurutan dilakukan pada Illumina NovaSeq 6000 yang menjalankan kimia SBS berpasangan 100 bp. Pembacaan diproses dengan saluran informatika sumber terbuka 'bcbio-nextgen.py' yang dikembangkan terutama di Harvard Chan Bioinformatics (v.1.2.4) yang berjalan pada sumber daya Argon HPC di Universitas Iowa. Saluran ini mencakup pendekatan 'praktik terbaik' untuk kontrol kualitas baca, penyelarasan baca, dan kuantisasi. Pipeline 'bcbio-nextgen.py' dijalankan dalam mode "RNA-seq" dengan kunci 'rn6' sebagai pembuatan genom yang dipilih (secara internal mereferensikan rakitan Ensembl dan genebuild 'Rnor_6.0'). Pipeline menyelaraskan pembacaan ke genom Rnor_6.0 menggunakan penyelaras hisat2 yang sangat cepat dan sadar sambungan (2.2.1) dan secara bersamaan mengukur pembacaan ke transkriptome menggunakan penyelaras 'salmon' (1.4.0). Qualimap (2.2.2), alat komputasi yang memeriksa file penyelarasan BAM at2 miliknya, digunakan untuk memeriksa data yang dibaca untuk kontrol kualitas. Skor kualitas urutan lulus pemeriksaan dasar dan tingkat duplikasi urutan berada dalam parameter yang dapat diterima. Semua sampel lulus QC untuk penyelarasan baca ke wilayah eksonik. Kuantifikasi transkrip yang diturunkan dari salmon (TPM atau "transkrip per juta") diimpor dan diringkas ke perkiraan jumlah pada tingkat gen menggunakan tximport (1.12.3) di Rstudio, seperti yang dijelaskan dalam yang terbaik- mempraktikkan sketsa DESeq2(https://bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/DESeq2/inst/doc/DESeq2.html).

Gen dengan perkiraan jumlah kurang dari 5 di seluruh sampel telah disaring sebelumnya dari analisis hilir, sesuai prosedur yang direkomendasikan. Analisis ekspresi gen diferensial dilakukan dengan DESeq2 (v.1.24.0) pada perkiraan jumlah tingkat gen. FDR sebesar 5% dan X< abs(logFC) < 10 was set as a cutoff for differential expression (DEGs). Heatmaps, line graphs, and volcano plots were generated using clusterProfiler packages in R/Bioconductor. Gene level, pathway, and DEG analyses were generated using iPathwayGuide (Advaita Bioinformatics, https://www.advaitabio.com/ipathwayguide; last accessed November 15, 2022). iPathwayGuide scores pathways using the Impact Analysis method (Draghici et al., 2007); Tarca et al., 2009, Khatri et al., 2007). The underlying pathway topologies, comprised of genes and their directional interactions, are obtained from the KEGG database (Kanehisa et al., 2000; Kanehisa et al., 2010; Kanehisa et al., 2012; Kanehisa et al., 2014).

Validasi data RNA-seq dengan qRT-PCR: Data RNA-seq divalidasi oleh qRT-PCR pada mRNA yang diekstraksi dari kelompok tikus yang berbeda. Lima transkrip dipilih dari daftar DEG baru yang ditemukan diperkaya di setiap wilayah pada awal. Tiga dari gen tersebut didorong oleh hipotesis berdasarkan literatur fisiologis dan perilaku kortikal pendengaran, sementara tiga gen lainnya merupakan gen baru yang diidentifikasi dari tingkat gen dan analisis DEG dalam perbandingan antara kelompok Obat dan Kendaraan. Semua sekuens primer dipilih dari literatur sebelumnya tentang jaringan otak pada tikus (urutan disediakan pada tabel di bawah) atau dirancang menggunakan NCBI Primer Blast dan divalidasi untuk spesifisitas target dengan menilai kurva leleh dan sekuensing produk amplikon PCR. Analisis qRT-PCR dilakukan dalam QuantStudio 3 (Applied Biosystems) dengan SsoAdvancedTMUniversal SYBR Green Supermix (Bio-Rad). Untuk setiap sampel, 500 ng cDNA diamplifikasi menggunakan Kit Sintesis cDNA iScriptTM (Bio-Rad).

Ucapan Terima Kasih

Penulis mengucapkan terima kasih kepada Dr. Andrea Shang, Sean Tsaur, dan Sooraz Bylipudi atas bantuan mereka dalam prosedur dan analisis perilaku; Mimi L. Phan atas bantuannya dalam protokol ekstraksi RNA dan pengumpulan sampel; Troy A. Roepke, Ali Yasrebi, dan ChristopherO'Brien atas bantuannya dalam analisis pemurnian sampel RNA; dan Alisa Ray untuk bantuan teknis. Kami ingin mengucapkan terima kasih kepada semua personel CLEF Lab saat ini dan mantan atas bantuan dan dukungan mereka.

Pekerjaan ini didukung oleh Institut Kesehatan Nasional, Institut Nasional Ketulian dan Gangguan Komunikasi [R01-DC014753 ke KMB]; Sekolah Seni dan Sains di Universitas Rutgers; Aresty Foundation di Rutgers University dengan dana hibah kecil untuk penelitian sarjana; dan program Project SUPER di Rutgers University dengan dana hibah kecil untuk penelitian sarjana.

Referensi:

Alberini, CM, & Kandel, ER (2014). Peraturan Transkripsi dalam Konsolidasi Memori. Perspektif ColdSpring Harbour dalam Biologi, 7(1), a021741.doi:https://doi.org/10.1101/cshperspect.a021741

Albrecht, U., Zheng, B., Larkin, D., Sun, Z., & Lee, C. (2001). MPer1 dan mper2 penting untuk mengatur ulang jam sirkadian secara normal. J Biol Irama, 16, 100-104. doi:10.1177/074873001129001791.

Aschauer, D., & Rumpel, S. (2016). Neokorteks Sensorik dan Memori Asosiatif. PerilakuNeurosains Pembelajaran dan Memori, 37, 177-211.doi:https://doi.org/10.1007/7854_2016_453

Bae, K., Jin, X., Maywood, ES, Hastings, MH, Reppert, SM, & Weaver, DR (2001). Diferensial fungsi mPer1, mPer2, dan mPer3 pada jam sirkadian SCN. Neuron, 30, 525-536.doi:10.1016/S0896-6273(01)00302-6.

Bakin, JS, & Weinberger, NM (1996). Induksi memori fisiologis di korteks serebral dengan stimulasi nukleus basalis. Prosiding National Academy of Sciences Amerika Serikat, 93(20), 11219-11224. doi:https://doi.org/10.1073/pnas.93.20.11219

Banerjee, SB, Gutzeit, VA, Baman, J., Aoued, HS, Doshi, NK, Liu, RC, & Ressler, KJ (2017). Jaring perineuronal di korteks sensorik orang dewasa diperlukan untuk pembelajaran rasa takut. Neuron, 95(1), 169-179. doi:10.1016/j.neuron.2017.06.007

Barta, CL, Liu, H., Chen, L., Giffen, KP, Li, Y., Kramer, KL, . . . Dia, DZ (2018). Analisis transkriptomi RNA-seq sel rambut telinga bagian dalam ikan zebra dewasa. Data Ilmiah, 5, 180005.doi:https://doi.org/10.1038/sdata.2018.5

Bayraktar, G., & Kreutz, MR (2018). Peran Demetilasi DNA yang Bergantung pada Aktivitas pada Otak Dewasa dan Gangguan Neurologis. Perbatasan dalam Ilmu Saraf Molekuler, 11, 169.doi:10.3389/fnmol.2018.00169

Bieszczad, KM, Bechay, K., Rusche, JR, Jacques, V., Kudugunti, S., Miao, W., . . . Wood, MA (2015). Penghambatan Histone Deacetylase melalui RGFP966 Melepaskan Rem pada Plastisitas Kortikal Sensorik dan Kekhususan Pembentukan Memori. J Neurosci, 35(38), 13124-13132.doi:https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.0914-15.2015

Brown, MR, & Kaczmarek, LK (2011). Modulasi saluran kalium dan pemrosesan pendengaran. Penelitian Pendengaran, 279(1-2), 32-42. doi:https://doi.org/10.1016/j.heares.2011.03.004

Bychkov, ML, Vasilyeva, NA, Shulepko, MA, Balaban, PM, Kirpichnikov, MP, & Lyukmanova, EN(2018). Lynx1 Mencegah Blokade Potensiasi Jangka Panjang dan Pengurangan Ekspresi Neuromodulator yang Disebabkan oleh Aktivasi A 1-42 dan JNK. Acta Naturae, 10(3), 57-61.

Reference:1950477648n@gmail.com