Genetika Osteopontin pada Pasien Penyakit Ginjal Kronis: Studi Penyakit Ginjal Kronis Jerman Ⅳ

Variabel dasar dan pengukuran

Seperangkat biomarker standar diukur di laboratorium pusat bersertifikat menggunakan protokol standar [81]. Antara lain, kreatinin dan albumin dari serum dan urin diukur menggunakan metodologi IDMS yang dapat ditelusuri (Creatinine plus, Roche, Germany) dan metode turbidimetri (Tina-quant, Roche, Germany) Roche/Hitachi MODULAR P, masing-masing. Laju filtrasi glomerulus (GFR) diperkirakan menggunakan CKD-EPI berbasis kreatinin untuk mula (satuan: mL/menit/1,73m2, [82]). UACR dihitung sebagai pengukuran albumin urin/kreatinin urin (mg/g, [83]). Usia dan jenis kelamin dilaporkan sendiri pada kunjungan awal. Pada tahun 2015, OPN diukur dari sampel serum awal dari kohort studi GCKD lengkap menggunakan teknik immunoassay enzim sandwich kuantitatif (ELISA fase padat; Quantikine Human OPN Immunoassay DOST00 dari R&D Systems (R&D Systems Europe, Abingdon, UK )). Kuantifikasi dilakukan di Institute of Clinical Chemistry and Lab oratory Medicine, Greifswald, Jerman. Koefisien variasi (intra-assay) masing-masing adalah 4,5%, 5,3% dan 3,5% untuk level rendah, median, dan tinggi. Koefisien variasi antar pengujian adalah 6,4%. Reagen dan standar sekunder digunakan sesuai rekomendasi pabrikan.

HERBAL TRADISIONAL ORGANIK UNTUK KESEHATAN GINJAL

Genotipe, kontrol kualitas dan imputasi

Informasi rinci mengenai genotipe dan pembersihan data pada penelitian GCKD telah dijelaskan sebelumnya [18]. Secara singkat, DNA diisolasi dari darah utuh dan di-genotipe pada 2.612.357 varian untuk 5.123 peserta GCKD menggunakan rangkaian Illumina HumanOmni2.5 Exome BeadChip (Illumina, GenomeStudio, Genotyping Module Versi 1.9.4) di Helmholtz Center Munich. Pembersihan data dilakukan secara terpisah untuk konten Omni2.5 dan konten chip exome dari array. Berdasarkan protokol standar [84], skrip tertulis khusus (R, Perl) dan perangkat lunak Plink1.9 [85] digunakan untuk kontrol kualitas (QC) konten Omni2.5. Langkah-langkah QC berbasis sampel mencakup pemeriksaan tingkat panggilan, jenis kelamin, heterozigositas, keturunan genetik dan keterkaitan, yang menyebabkan 89 sampel dikeluarkan. Pada tingkat varian, polimorfisme nukleotida tunggal (SNP) dikeluarkan jika tingkat panggilannya<0.96, and whenever the assumption of the Hardy-Weinberg equilibrium was violated (p-value <1.0E-05). After removing SNPs on duplicate positions, the cleaned dataset contained 5,034 individuals and 2,337,794 SNPs (S1 Fig). Genotypes were then imputed using minimac3 v2.0.1 at the Michigan Imputation Server [86]. The Haplotype Reference Consortium (HRC) haplotypes version r1.1 were used as the reference panel, and Eagle 2.3 was used for phasing. The final dataset contains data of 5,034 participants and 7,750,367 high-quality autosomal bi-allelic variants (imputation quality of R2 �0.3, MAF �1%). For the exome chip content, QC was similarly conducted [18]. In addition, checks specific for exome variants were added [87]. In brief, 96 individuals and 3,818 SNPs were removed, the latter of which had a call rate <0.95 and a Hardy-Weinberg equilibrium p-value <1.0E−05. The final exome chip dataset contains 5,027 participants with 226,233 variants (S1 Fig). For the exome chip association analysis, the genotypes were post-processed using zCall with a zscore threshold of six [88]. Genomic positions base on human genome build GRCh37.

Studi asosiasi genom terhadap varian umum

Seperti dilaporkan sebelumnya [17,18], GWAS dilakukan untuk peserta GCKD dengan data genotipe lengkap (Omni2.5), eGFR, UACR dan log2(OPN) (N=4,897) menggunakan regresi linier log2 (OPN) pada SNP (model genetik aditif) dengan MAF �1%, disesuaikan dengan usia, jenis kelamin, log(eGFR), dan log(UACR) (Gambar S1). Analisis asosiasi dilakukan dengan menggunakan SNPTEST v2.5 [89]. Ringkasan statistik diperiksa kualitasnya menggunakan GWAtoolbox (90) dan inflasi menggunakan kontrol genom (91). Namun, koreksi kontrol genom tidak diminta (λ=1.01). Asosiasi dengan nilai p<5.0E-08 were considered significant. Per chromosome, an index SNP was defined as the SNP with the lowest genome-wide p-value with a 1-Mb interval centered around this SNP. This approach was repeated until no further SNP outside the interval(s) was available passing the genome-wide significance threshold. In order to discover further independent signals, we repeated GWAS analysis for chromosomes with significant results by conditioning on the genotype of the SNP with the lowest association pvalue of the respective chromosome. This procedure was repeated until no further genomewide signal was observed.

Anotasi fungsional varian dilakukan menggunakan ANNOVAR (92), SNiPA (93), Open Targets Genetics (94), FAVOR (95), dan RegulomeDB (96). Plot asosiasi regional diplot menggunakan LocusZoom v1.3 [97].

Pemetaan Halus

Statistical fine-mapping [21] was carried out as previously described [17] for the two replicated SNPs within a region ±500kb. Approximate Bayes factors (ABFs) were then derived from the original GWAS statistics estimates. The SD prior was chosen as 0.61 because 95% of the effect size estimates fell within the −1.2 to 1.2 interval [21]. The ABF of the SNPs were used to calculate the posterior probability for each variant driving the association signal (PPA, 'causal variant'). Credible sets were determined by summing up PPA-ranked variants until the cumulative PPA was >99%.

Analisis kolokalisasi

Untuk lebih memahami mekanisme molekuler dan fenotipe terkait yang mendasari hubungan tersebut, kami melakukan analisis kolokalisasi dari statistik ringkasan OPN GWAS terkait dengan dua lokus OPN yang direplikasi dengan statistik ringkasan GWAS dari tiga sumber lain sebagaimana diuraikan di bawah ini. Untuk semua analisis kolokalisasi, kami menggunakan fungsi 'coloc.fast' dari paket R gtx dengan parameter default dan definisi sebelumnya (https://github.com/tobyjohnson/gtx), sebuah implementasi dari versi adaptasi dari metode kolokalisasi yang diperkenalkan oleh Giambartolomei dkk. [98]. Kami mempertimbangkan kolokalisasi positif ketika probabilitas posterior dari varian sebab akibat yang sama pada lokus asosiasi untuk kedua sifat (H4, p12) adalah > 0.8.

Ekspresi gen.

Pertama, kami menggunakan statistik ringkasan GWAS dari data ekspresi gen dari proyek GTEx [99] dan studi NEPTUNE [100]. Data eQTL dari GTEx V8 (49 jaringan) dan studi NEPTUNE (NephQTL dari bagian ginjal glomerulus dan tubulointerstitial) diunduh dari Portal GTEx (//www.gtexportal.org/home/) dan situs web NephQTL (http ://nephqtl.org/), masing-masing. Langkah-langkah analisis kolokalisasi telah dijelaskan secara rinci di tempat lain [17]. Pertama, ringkasan GWAS dari GTEx dan NephQTL di wilayah genom ±100kb dari dua SNP OPN diekstraksi. Gen dalam GWAS yang diekstraksi diidentifikasi dan untuk setiap gen, jendela cis berukuran 500kb yang mengapit awal dan akhir gen ditentukan. Kemudian, untuk setiap jendela gen cis tersebut, dengan setidaknya satu SNP memiliki asosiasi nilai p <0,001, ringkasan GWAS dari jaringan GTEx dan NephQTL serta OPN GWAS diekstraksi dan digunakan sebagai masukan untuk analisis kolokalisasi.