Kloning Gen, Identifikasi Fungsi, Analisis Struktural Dan Ekspresi Sukrosa Sintase Dari Cistanche Tubulosa

Abstrak:Sukrosa sintase memainkan peran penting dalam jalur metabolisme gula tanaman dengan mengkatalisis produksi uridin difosfat (UDP)-glukosa, yang berfungsi sebagai donor glikosil bioaktif untuk berbagai proses metabolisme. Dalam penelitian ini, gen sukrosa sintase bernama CtSus dikloningCistanche tubulosa, pengobatan tradisional Tiongkok yang terkenal kaya akan khasiatnyakandungan beragam glikosida, berdasarkan hasil analisis transkriptome. Kerangka pembacaan terbuka CtSus memiliki panjang 2 418 bp yang mengkode 805 asam amino. Analisis sekuens mengungkapkan domain yang dilestarikan yang terkait dengan keluarga sukrosa sintase tanaman di daerah N-terminal dan C-terminal protein CtSus. Analisis filogenetik menunjukkan bahwa CtSus memiliki hubungan evolusioner yang erat dengansintase sukrosadari tanaman lain dalam urutan yang sama. Identifikasi fungsional CtSus dilakukan melalui katalisis seluruh sel dengan UGT71BD1, suatu enzim glikosiltransferase yang berkarakter. Hasil penelitian menunjukkan bahwa pengenalan CtSus secara signifikan meningkatkan laju konversi glikosilasi yang dikatalisis oleh UGT71BD1. Ekspresi larut CtSus dalam Escherichia coli selanjutnya dicapai dengan menggunakan vektor ekspresi pCold™ TF. Uji enzimatik in vitro menunjukkan aktivitas CtSus dalam mengkatalisis pembentukan UDP-glukosa dengan adanya sukrosa dan UDP. Hasil reaksi berantai polimerase kuantitatif waktu nyata menunjukkan bahwa pola ekspresi gen CtSus di berbagai bagian C. tubulosa dan kultur sel suspensi C. tubulosa di bawah tekanan kekeringan berkorelasi dengan pola akumulasi yang diamati masing-masing untuk glikosida feniletanol. Selanjutnya, asam amino kunci dan interaksinya antara enzim dan substrat dieksplorasi berdasarkan prediksi struktur protein dan hasil docking molekuler. Secara keseluruhan, temuan kami mengidentifikasi sukrosa sintase CtSus yang bertanggung jawab atas penyediaan donor glikosil aktif UDP-glukosa selama biosintesis produk glikosida di C. tubulosa dan juga menyediakan elemen gen yang dapat digunakan dalam rekayasa konstruksi regangan untuk produksi produk glikosida.

Kata kunci: Cistanche tubulosa; sukrosa sintase; glikosida; UDP-glukosa; katalisis enzimatik

DASAR BUDAYA DICHEN CISTANCHE DI YUTIAN, HOTAN, XINJIANG

Layanan Pendukung Wecistanche-Ekspor cistanche terbesar di Cina:

Surel:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Telp:+86 15292862950

Cistanche tubulosa (Schenk) R.Wightadalah tanaman parasit herba abadi dari genus Cistanche dalam keluarga Orobanchaceae. Ini adalah bahan obat tradisional Tiongkok yang langka dan berharga, berasal dari Xinjiang dan Mongolia Dalam. Rasanya manis, asin dan hangat, serta memiliki fungsimemperkuat Yang ginjal, memberi manfaat esensi dan darah, dan melembabkan usus danmenghilangkan sembelit. Ini dikenal sebagai "ginseng gurun" [1]. Penelitian modern telah menemukan hal ituCistanche tubulosaberisiberbagai komponen kimiasepertiglikosida feniletanoid, terpen iridoid eterdan glikosidanya, lignan dan glikosidanya, ester oligosakarida, polisakarida, poliol, oligosakarida, sterol dan glikosidanya, glikosida monoterpenoid, gula, asam amino dan minyak atsiri [2,3], terutama senyawa glikosida merupakan bahan aktif terpenting. Diantaranya, senyawa glikosida feniletanoid memiliki kandungan tertinggi dalam bahan obat asli dan memiliki aktivitas farmakologis yang luas seperti perlindungan saraf dan anti penuaan [4]. Biosintesis senyawa glikosida yang disebutkan di atas melibatkan beberapa langkah reaksi glikosilasi, yang dikatalisis olehglikosiltransferase pada tanaman, dan itupenyediaan donor glikosil aktifsangat penting dalam proses ini. Donor gula aktif yang umum dalam organisme termasuk uridin difosfat (UDP), timidin difosfat (TDP), dan guanosin difosfat (GDP). Diantaranya, UDP-glukosa adalah donor glikosil aktif yang paling umum pada tumbuhan. Ini tidak hanya dapat dikenali secara langsung oleh glukosiltransferase untuk mengkatalisis reaksi transfer glukosil, tetapi juga dapat digunakan sebagai prekursor untuk berpartisipasi dalam sintesis donor glikosil jenis lain. Misalnya, UDP-glukosa dapat digunakan sebagai substrat untuk menghasilkan UDP-rhamnose dengan katalisis 4,6-dehidratase, 3,5-isomerase dan 4-reduktase[5]; UDP-glukosa dapat digunakan sebagai substrat untuk mengkatalisis sintesis UDP-xilosa melalui UDP-glukosa dehidrogenase dan UDP-xilosa sintase; UDP-xilosa selanjutnya dapat dikatalisis oleh UDP-xilosa epimerase untuk menghasilkan UDP-arabinosa[6]; UDP-glukosa dan UDP-galaktosa adalah diastereomer dan dapat diubah menjadi satu sama lain melalui epimerase [7,8]. Oleh karena itu, sintesis UDP-glukosa mempunyai pengaruh penting terhadap penyediaan donor glikosil aktif pada tanaman dan modifikasi glikosilasi metabolit sekunder.

Sintesis UDP-glukosa pada tumbuhan dapat dicapai melalui jalur sintase, jalur fosforilase, dan jalur kinase. Diantaranya, sukrosa sintase dapat secara langsung mengkatalisis reaksi antara UDP dan sukrosa untuk menghasilkan UDP-glukosa dan fruktosa, serta reaksi sebaliknya [9]. Dalam arti luas, sukrosa sintase termasuk dalam subfamili glikosiltransferase-4, yang mencakup berbagai glikosiltransferase, seperti sukrosa sintesis fosfatase, trehalosa sintase, dan trehalosa fosforilase [10]. Sukrosa sintase pertama kali diidentifikasi pada bibit gandum [11]. Sejak itu, para peneliti telah mengidentifikasi ratusan gen sukrosa sintase dari berbagai tanaman seperti kacang hijau (Vigna radiata), padi (Oryza sativa), jagung (Zea mays), kedelai (Glycine max) dan persik (Amygdalus persica). Mereka terlibat dalam berbagai proses metabolisme pada tanaman, termasuk transportasi dan distribusi sukrosa, sintesis pati, sintesis selulosa dan komposisi dinding sel, stres biotik dan abiotik, dll., dan memainkan peran pengaturan penting dalam alokasi sumber karbon tanaman [12]. Selain itu, berdasarkan kajian fungsi fisiologis, peneliti juga menggunakan sukrosa sintase yang diperoleh sebagai elemen gen untuk sintesis enzimatik senyawa glikosida, dan mencapai hasil yang ideal. Misalnya, Masada dkk. [13] bersama-sama mengekspresikan gen sukrosa sintase AtSus-1 dari Arabidopsis thaliana dan gen glikosiltransferase CaUGT2 dari Catharanthus roseus secara in vitro, dan menggunakan sistem enzim ganda satu pot untuk mengkatalisis reaksi glikosilasi kurkumin, yang meningkatkan hasil kurkumin glikosida sebanyak 7 kali lipat. Pada saat yang sama, jumlah donor UDP-glukosa yang digunakan hanya sepersepuluh dari jumlah awal.

Bungaruang dkk. [14] membangun sistem katalitik berpasangan menggunakan sukrosa sintase GmSuSy dari kedelai dan glikosiltransferase OsUGT dari beras. Mereka mencapai modifikasi glikosilasi nothofagin dengan menambahkan hanya sejumlah kecil UDP (1.0 mmol·L-1) dan sukrosa. Dibandingkan dengan katalisis enzim tunggal OsUGT, produksi produk glikosilasi meningkat tiga kali lipat, dari μmol·L-1 menjadi mol·L-1.

Kekayaan dan keragaman senyawa glikosida dalam Cistanche tubulosa menunjukkan bahwa ia harus mengandung sukrosa sintase kuat yang terkait dengan modifikasi glikosilasi metabolit sekunder, namun enzim ini belum dilaporkan pada tanaman dari genus Cistanche. Dalam makalah ini digunakan Cistanche tubulosa, bahan obat yang termasuk dalam farmakope, sebagai bahannya. Melalui analisis transkriptome dan analisis transkriptome komparatif dari berbagai bagian, teknik biologi molekuler digunakan untuk menambang dan mengidentifikasi gen sukrosa sintase CtSus. Analisis bioinformatika, biotransformasi sel utuh, ekspresi dan pemurnian prokariotik, analisis aktivitas katalitik enzim in vitro, dan analisis ekspresi gen di berbagai bagian Cistanche tubulosa dan sistem kultur jaringan tanaman di bawah tekanan kekeringan dilakukan untuk mengeksplorasi fungsi CtSus dan korelasinya dengan biosintesis senyawa glikosida di Cistanche tubulosa, meletakkan dasar bagi studi jalur biosintesis senyawa glikosida di Cistanche tubulosa.

Bahan dan metode

Bahan Tanaman Cistanche tubulosa segar dikumpulkan dari Kota Hotan, Xinjiang, Tiongkok, dan identifikasi biologis dilakukan oleh Profesor Tu Pengfei dari Universitas Peking; sistem kultur sel suspensi Cistanche tubulosa didirikan oleh kelompok penelitian kami pada tahap awal [15]; E. coliFast-T1 dibeli dari Nanjing Novozymes Biotech Co., Ltd.; E. coli BL21 (DE3) dibeli dari Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd.; vektor pCold™ I dan pCold™ TF dibeli dari Bio-Tech (Beijing) Co., Ltd.; Kontrol UDP-glukosa dibeli dari Xi'an Qiyue Biotechnology Co., Ltd., dan substrat aesculin dan resveratrol dibeli dari Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.

DASAR BUDAYA DICHEN CISTANCHE DI HOTAN, XINJIANG

Ekstraksi RNA dan sintesis cDNA RNA diekstraksi sesuai dengan instruksi OMEGA RNA Plant Kit (Cat R6827-01, Omega Bio-Tek). Elektroforesis gel agarosa dan spektrofotometer Nanodrop 2000 digunakan untuk mendeteksi kemurnian, konsentrasi dan integritas RNA. Sampel RNA yang memenuhi syarat ditranskripsi terbalik menggunakan kit transkripsi terbalik TransScript® OneStep gDNA Removal dan cDNA Synthesis SuperMix (Cat AT311-02, Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd.) untuk mensintesis rantai pertama cDNA.

Penambangan gen sukrosa sintase dan kloning gen CtSus Urutan asam amino dari Arabidopsis thaliana sukrosa sintase AtSus1 yang diidentifikasi secara fungsional (nomor akses GenBank: AED92894.1) [16] digunakan sebagai templat. Gen sukrosa sintase disaring dari data transkriptome C. tubulosa dengan penyelarasan urutan Blastp lokal, dikombinasikan dengan anotasi gen transkriptome, analisis FPKM (kelimpahan ekspresi gen) dan analisis data transkriptome komparatif. Primer spesifik dirancang berdasarkan informasi urutan gen kandidat yang disediakan oleh data transkriptome generasi kedua C. tubulosa (Tabel 1). C. tubulosa cDNA digunakan sebagai templat dan amplifikasi PCR dari gen target dilakukan menggunakan enzim PCR dengan ketelitian tinggi (Cat P505-d1, Nanjing Novozymes Biotech Co., Ltd.). Produk amplifikasi PCR dimurnikan menggunakan Kit Mini Ekstraksi DNA Gel FastPure (Cat DC201-01, Nanjing Novozymes Biotech Co., Ltd.) dan kemudian dikloning sesuai dengan kit kloning cepat (Cat C112-01, Nanjing Novogene Biotech Co., Ltd.) dihubungkan dengan vektor kloning pCE2 TA/Blunt-Zero sesuai dengan instruksi pengoperasian, ditransfer ke sel kompeten Fast-T1, dan dikultur semalaman pada suhu 37 derajat. Plasmid diekstraksi dan diserahkan ke Beijing Liuhe BGI Genomics Co., Ltd. untuk identifikasi sekuensing.

Tabel 1 Urutan nukleotida primer yang digunakan dalam penelitian ini. qPCR: Reaksi berantai polimerase kuantitatif waktu nyata

Analisis bioinformatika sukrosa sintase CtSus dari Cistanche tubulosa

Perangkat lunak online ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/) digunakan untuk menganalisis sifat fisikokimia protein; perangkat lunak online TMHMM (https://services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM{{0}}.0/) digunakan untuk memprediksi struktur transmembran protein; perangkat lunak SOPMA online (https://npsa-rabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html) digunakan untuk memprediksi struktur sekunder protein; perangkat lunak online SMART (//smart.embl.de/) digunakan untuk memprediksi domain kekal dari rangkaian protein asam amino; perangkat lunak DANMAN digunakan untuk membandingkan rangkaian asam amino CtSus dengan rangkaian sukrosa sintase dari spesies lain; Pohon filogenetik dibangun dengan analisis cluster menggunakan metode neighbour join menggunakan software MEGA11, dengan pengulangan bootstrap sebanyak 1,000 kali.

Analisis ekspresi CtSus di berbagai bagian Cistanche tubulosa dan di bawah tekanan kekeringan

Primer PCR kuantitatif fluoresensi real-time untuk CtSus dan gen referensi internal DNAj dirancang menggunakan perangkat lunak DNAMAN (17) (Tabel 1). Tingkat ekspresi relatif gen CtSus dalam sel suspensi Cistanche tubulosa di berbagai bagian Cistanche tubulosa dan di bawah tekanan kekeringan dianalisis dengan PCR kuantitatif fluoresensi waktu nyata. Analisis PCR kuantitatif fluoresensi real-time dilakukan dengan menggunakan TransStart® Top Green qPCR SuperMix Kit (Cat AQ131-01, Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd.). Program amplifikasi mengadopsi metode dua langkah: 94 derajat selama 30 detik; 94 derajat selama 5 detik, 60 derajat selama 30 detik, diulangi selama 40 siklus; ini dijalankan pada Sistem Deteksi PCR Real-Time Bio-Rad CFX Connect™ (Laboratorium Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Metode 2 – ΔΔCT digunakan untuk menganalisis ekspresi relatif gen CtSus pada kelompok eksperimen yang berbeda. GraphPadPrism 9 digunakan untuk analisis signifikansi dan menggambar grafik batang.

Konstruksi vektor ekspresi prokariotik dan ekspresi heterolog gen CtSus Berdasarkan hasil sekuensing gen, primer spesifik yang mengandung lengan homologi vektor dan situs restriksi (Tabel 1) dirancang untuk amplifikasi PCR. Gen target CtSus dibangun menjadi vektor ekspresi pET-28a, pET-24b, pCold™ I dan pCold™ TF menggunakan teknologi kloning yang mulus menggunakan ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit (CatC115-01 , Nanjing Novogene Biotech Co., Ltd.). Plasmid dari vektor ekspresi rekombinan yang berhasil dibangun diekstraksi dan diubah menjadi sel kompeten ekspresi Escherichia coli Transetta (DE3). Sel-sel dikultur dalam media cair LB yang mengandung 50 µg·mL-1 kanamisin sulfat (dengan pET-28a dan pET-24b sebagai vektor ekspresi) atau 1{{ 22}}0 µg·mL-1 ampisilin (dengan pCold™ I dan pCold™ TF sebagai vektor ekspresi) dan 50 ug·mL-1 kloramfenikol, masing-masing, pada 37 derajat dan 200 r·min{{ 15}} dengan pengocokan hingga nilai A600 larutan bakteri mencapai 0.4-0.6. Tambahkan isopropil-beta-Dthiogalactopyranoside (IPTG) pada konsentrasi akhir 0,5 mmol·L-1 untuk menginduksi ekspresi protein. Inkubasi dalam pengocok suhu konstan pada suhu 23 derajat (dengan pET-28a dan pET-24b sebagai vektor ekspresi) atau 15 derajat (dengan pCold™ I dan pCold™ TF sebagai vektor ekspresi), 180 r· min-1 selama 16 jam (dengan pET28a dan pET-24b sebagai vektor ekspresi) atau 24 jam (dengan pCold™ I dan pCold™ TF sebagai vektor ekspresi), lalu kumpulkan bakteri dengan cara sentrifugasi.

Buffer lisis (20 mmol·L-1 NaH2PO4-Na2HPO4, 0.5 mol·L-1 NaCl, 20 mmol·L{{10} } imidazol, 3% gliserol, 100 mmol·L-1 fenilmetilsulfonil fluorida, 1 mg·mL-1 lisozim, pH 7,4) ditambahkan, dan sel dipecah selama 8 menit dan disentrifugasi. Supernatan dan endapan diambil masing-masing. Supernatan diadsorpsi oleh kolom afinitas HisTrap FF (Cat 17531901, Cytiva) yang diisi dengan pengisi Ni Sepharose 6 Fast Flow untuk mengadsorpsi protein target yang mengandung tag His. Setelah dielusi dengan konsentrasi imidazol yang berbeda, setiap fraksi diambil untuk deteksi SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis). Fraksi yang mengandung protein target digabungkan, dipekatkan dengan sentrifugasi dan dihilangkan garamnya dengan tabung ultrafiltrasi (Millipore), dan disimpan dalam buffer [mengandung 50 mmol·L-1 Tris-HCl (pH 7,5), 0,2 mol·L{{ 30}}NaCl, 1 mmol·L-1 dithiothreitol, 3% gliserol] untuk reaksi katalisis enzimatik in vitro selanjutnya.

Katalisis seluruh sel CtSu Plasmid pCold™ I-CtSus dan ekspresi plasmid pET-28a-UGT71BD1[18] dari glikosiltransferase UGT71BD1, yang telah diidentifikasi oleh kelompok peneliti sebelumnya, secara bersamaan diubah menjadi ekspresi kompeten E.coli Transetta (DE3). Bakteri rekombinan positif yang mengandung gen CtSus dan UGT71BD1 dipilih dan diinokulasi ke dalam medium LB (media pertumbuhan) yang mengandung 50 ug·mL-1 kanamisin sulfat, 100 ug ·mL-1 ampisilin dan 50 ug·mL-1 kloramfenikol dengan perbandingan 1:100 (V/V). Kultur dikultur pada suhu 37 derajat hingga nilai A600 larutan bakteri adalah 0.4-0.6, kemudian ditambahkan IPTG pada konsentrasi akhir 1 mmol·L-1. Kultur dilanjutkan pada 15 derajat dan 180 putaran-1 selama 24 jam. Kultur disentrifugasi pada suhu 4 derajat dan 4 000 r·min-1. Kumpulkan selnya. Inokulasi sel yang terkumpul ke dalam media M9 (media fermentasi) dengan perbandingan 40 mL media kultur per gram bakteri, dan tambahkan 75 μmol·L-1 sukrosa dan 25 μmol·L-1 aesculetin (1) atau resveratrol (2) substrat ke gugus reaksi. Lanjutkan mengocok kultur selama 24 jam, sentrifugasi pada 4000 × g, 4 derajat selama 30 menit, tambahkan metanol untuk memecah endapan secara ultrasonik, tambahkan 2 kali volume metanol ke supernatan, sentrifugasi pada 4000 × g, 4 derajat selama 30 menit, ambil supernatan dan gabungkan, uapkan pelarut pada tekanan rendah, larutkan kembali dalam metanol, saring melalui membran filter 0,22 μm, dan deteksi produk reaksi menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi Agilent 1260. KOLOM CAPCELL PAK C18 (250 mm×4,6 mm, 5 µm) digunakan sebagai kolom analitik, 0,1% air asam format (A) dan metanol (B) digunakan sebagai fase gerak, dan gradien elusi adalah: {{61 }} mnt, 30%-90% B; 25-27 mnt, 90%-100%B; 27-33 menit, 100% B. Parameter spektrometri massa adalah mode ion positif dan negatif, dan pemindaian penuh MS1, MS2, dan MS3 multi-tahap otomatis.

Deteksi aktivitas katalitik enzim CtSus in vitro Protein rekombinan yang diperoleh dengan kromatografi afinitas kolom HisTrap FF yang disebutkan di atas dilakukan penghilangan tag terminal menggunakan Faktor Xa. Sistem pencernaan enzim adalah sebagai berikut: protein rekombinan disesuaikan dengan konsentrasi 1 mg·mL-1, dan 1 μL Faktor Xa ditambahkan ke 50 μL protein rekombinan dalam buffer 20 mmol·L-1 Tris-HCl (pH 8,0), 100 mmol·L-1 NaCl, dan 2 mmol·L-1

CaCl2 pada suhu 23 derajat selama 6 jam. Sistem reaksinya adalah 100 μL. Produk dari sistem pencernaan enzim dilakukan pemisahan protein sekunder dengan kromatografi afinitas HisTrap FF untuk mendapatkan protein target dengan penghilangan tag untuk reaksi katalisis enzim in vitro selanjutnya. Sistem reaksi enzimnya adalah sebagai berikut: 10mmol·L-1 UDP, 100 mmol·L-1 sukrosa, 50 mmol·L-1 MgCl2, 60 ug protein CtSus, Tris-HCl (pH 7.0) ditambah dengan 100 μL, direaksikan dalam penangas air pada suhu 30 derajat selama 6 jam, dan metode pasca perawatan dan analisis HPLC dilakukan seperti yang dijelaskan dalam referensi [19].

Prediksi struktur tiga dimensi dan analisis docking molekul protein CtSus AlphaFold2 digunakan untuk memprediksi struktur tiga dimensi protein CtSus [20]. Molekul ligan dihidrogenasi dan diisi menggunakan perangkat lunak AutoDock Tools 1.5.6. Kantong pengikat substrat diperoleh dengan menyelaraskan dengan protein templat AtSus1 (PDBID 3S28). Rantai samping residu asam amino di sekitar rongga diatur agar fleksibel.

Kotak grid diatur ke 40 × 40 × 40 Å3, dan jarak grid adalah 0,375 Å. Docking molekuler dilakukan di AutoDock Vina [21]. Perangkat lunak PyMOL 2.0 digunakan untuk memvisualisasikan model dengan afinitas terbaik (kcat·mol-1

).

Analisis statistik GraphPad Prism 9 digunakan untuk analisis statistik. Data eksperimen dinyatakan sebagai mean ± standar deviasi. Uji t digunakan untuk perbandingan antara dua kelompok, dan analisis varian satu arah digunakan untuk perbandingan antara beberapa kelompok. Perbedaannya dianggap signifikan secara statistik ketika P < 0,05.