Ferristatin II Efisien Menghambat Replikasi SARS-CoV-2 di Sel Vero

Kontak:{0}}/ WhatsApp: 008618081934791

Abstrak

Sindrom pernapasan akut parah coronavirus 2 (SARS-CoV-2) terus memberikan dampak yang signifikan terhadap kesehatan masyarakat global. Berbagai mekanisme untuk entri sel SARS-CoV-2 telah dijelaskan; namun, peran reseptor transferin 1 (TfR1) dalam infeksi SARS-CoV-2 hanya mendapat sedikit perhatian. Kami menggunakan feritin II untuk menginduksi degradasi TfR1 pada permukaan sel Vero dan untuk mempelajari konsekuensi pengobatan tersebut pada kelangsungan hidup sel dan replikasi SARS-CoV-2. Kami menunjukkan bahwa feritin II tidak beracun untuk sel Vero dalam konsentrasi hingga 400 M. Menurut data mikroskop confocal, distribusi transferin berlabel dan domain pengikat reseptor (RBD) protein Spike secara signifikan dipengaruhi oleh pra-perlakuan 18 jam dengan 100 M feritin II dalam media kultur. Penyerapan protein RBD hampir sepenuhnya dihambat oleh pengobatan feritin II, meskipun protein ini tetap terikat pada permukaan sel. Temuan ini dikonfirmasi dengan baik oleh penghambatan signifikan infeksi SARS-CoV-2 sel Vero oleh feritin II dengan nilai IC50 27 M (untuk virus Wuhan D614G) dan 40 M (untuk virus Delta). Penurunan yang signifikan dalam titer infeksi dari varian Omicron SARS-CoV-2 tercatat pada konsentrasi feritin II serendah 6,25 M. Kami berhipotesis bahwa feritin II memblokir entri sel inang yang dimediasi oleh TfR1-SARS-CoV-2; namun, penelitian lebih lanjut diperlukan untuk menjelaskan mekanisme penuh penghambatan virus ini, termasuk efek feritin II pada reseptor SARS-CoV-2 lainnya, seperti ACE2, Neuropilin-1, dan CD147. Penghambatan masuknya virus dengan menargetkan reseptor pada sel inang, daripada protein rentan mutasi virus, adalah strategi terapi COVID-19 yang menjanjikan.

Kata kunci: SARS-CoV-2;reseptor transferin 1; feritin II; domain pengikat reseptor (RBD); Sel Vero

Alexey Sokolov , Irina Isakova-Sivak *, Natalia Grudina , Daria Mezhenskaya , Elena Litasova , Valeria Kostevich, Ekaterina Stepanova , Alexandra Rak , Ivan Sychev, Olga Kirik dan Larisa Rudenko

Institut Kedokteran Eksperimental, 197376 Saint Petersburg, Rusia

1. Perkenalan

Pandemi penyakit coronavirus 2019 (COVID-19) yang disebabkan oleh sindrom pernapasan akut coronavirus 2 (SARS-CoV-2) terus menimbulkan beban sosial ekonomi yang signifikan bagi populasi dunia. Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) dianggap sebagai reseptor sel inang utama yang digunakan SARS-CoV-2 untuk memasuki sel [1-4]; namun, beberapa reseptor dan koreseptor alternatif yang mampu memfasilitasi masuknya sel dan infektivitas SARS-CoV-2 telah diidentifikasi, seperti Neuropilin-1, CD147, reseptor tirosin-protein kinase UFO (AXL) dan lainnya [5–10]. Selanjutnya, dua langkah pembelahan proteolitik diperlukan untuk masuknya SARS-CoV-2 yang efektif ke dalam sel setelah keterlibatan reseptor sel inang oleh protein lonjakan virus (S). Langkah pertama melibatkan pembelahan batas S1-S2 oleh protease furin dalam sel yang terinfeksi, sedangkan pembelahan situs S20 bergantung pada protease sel target, seperti TMPRSS2 dan cathepsin L, yang mengaktifkan protein S pada membran plasma dan di endolisosom, masing-masing (diulas dalam [11]).

cistanche untuk dijualUntukkemampuan kekebalan

Selain dari target masuk sel inang SARS-CoV-2 yang dipelajari dengan baik, ada bukti bahwa reseptor transferin 1 (TfR1) dapat menjadi co-reseptor alternatif untuk entri SARS-CoV-2 [12]. TfR1, suatu glikoprotein membran homodimerik tipe II 95 kDa, banyak diekspresikan pada membran plasma sebagian besar sel manusia dan memediasi masuknya transferin (Tf) ke dalam sel untuk pengiriman besi [13]. Memang, ada berbagai macam virus manusia dan zoonosis yang dapat menyerang sel inang melalui interaksi dengan TfR1 dan faktor lain dalam jalur penyerapan zat besi, termasuk arenavirus Dunia Baru, virus imunodefisiensi manusia, parvovirus, virus hepatitis C, alphavirus, dan lain-lain. [14]. Oleh karena itu, menargetkan jalur masuk virus yang dimediasi TfR1- merupakan strategi terapi yang menjanjikan untuk infeksi SARS-CoV-2. Studi skrining awal mengidentifikasi dua senyawa ukuran kecil (NCI11079 dan NCI306711) yang memiliki efek penghambatan yang signifikan pada penyerapan zat besi yang dimediasi Tf oleh sel HeLa. Senyawa NCI306711 menargetkan TfR1 dengan menginduksi internalisasi dan degradasinya dan diberi nama "ferritin" karena sifatnya yang tidak biasa dalam menghambat transportasi besi melalui jalur yang bergantung pada kolesterol [15]. Molekul kecil lainnya, feritin II (NSC8679), bekerja dengan cara yang mirip dengan feritin dan mendegradasi TfR1 melalui jalur rakit lipid yang sensitif terhadap nistatin [16]. Mengingat data ini, kami berusaha menilai kemampuan feritin II untuk menghambat replikasi SARS-CoV-2 dalam sel Vero-CCL81 dan untuk mengeksplorasi mekanisme potensial penghambatan ini.

2. Bahan-bahan dan metode-metode

2.1. Virus, Protein, dan Senyawa Kimia

SARS-CoV-2 mengisolasi hCoV-19/St_Petersburg-3524S/2020 (garis keturunan D614G Wuhan), hCoV-19 /Russia/SPE-RII-32759V/2021 (silsilah Delta), dan hCoV-19/Russia/SPE RII-6086V/2021 (silsilah Omicron) diperoleh dari Smorodintsev Research Institute of Influenza (Saint Petersburg, Rusia). Semua pekerjaan dengan virus menular dilakukan di laboratorium biosafety level 3 (BSL-3). Protein rekombinan yang sesuai dengan receptor-binding domain (RBD) protein SARS-CoV-2 S diekspresikan dalam sel eukariotik oleh BIOCAD JSC (St.Petersburg, Rusia). TF serum manusia jenuh besi (Fe2-TF) diisolasi dari serum darah manusia dengan kromatografi penukar ion pada DEAE-Toyopearl, UNOsphere S, dan filtrasi gel pada Sephadex G-75 Prima, seperti yang dijelaskan sebelumnya [17]. Ferristatin II (Gambar 1) dibeli dari Sigma (C-1144, St. Louis, MO, USA). Senyawa diencerkan dalam 150 mM NaCl, 10 mM buffer Na-fosfat, pH 7,4 (PBS) hingga konsentrasi akhir 4 mm, dan larutan disaring melalui membran steril dengan ukuran pori 0,22 m (Sartorius, Jerman) .

2.2. Penyebaran Virus SARS-CoV-2 dan Penilaian Kapasitas Penghambatan Virus Ferristatin II

Virus disebarkan pada sel Vero CCL81 menggunakan DMEM yang dilengkapi dengan 1× antibiotik-antimikotik, 10 mM HEPES, dan 2 persen FBS (semua dari Capricorn, Ebsdorfergrund, Jerman), (DMEM/2 persen FBS). Titer infeksi ditentukan dengan uji 50 persen Dosis Infeksi Kultur Jaringan (TCID50), seperti yang dijelaskan pada [18] dan dinyatakan dalam lgTCID50/mL.

Untuk evaluasi kapasitas netralisasi virus feritin, kami menggunakan uji mikronetralisasi yang dimodifikasi. Sehari sebelum percobaan, sel-sel Vero diunggulkan di {{0}}piring kultur sumur (3 × 104 sel per sumur) di DMEM yang dilengkapi dengan 1 × antibiotik-antimikotik dan 10 persen FBS. Hari berikutnya, media dipindahkan, dan sel diinfeksi dengan 100 TCID50 dari SARS-CoV-2 yang disiapkan pada DMEM/2 persen FBS selama 2 jam pada 37 C, 5 persen CO2. Beberapa sumur tetap tidak terinfeksi sebagai kontrol negatif. Kemudian, inokulum dihilangkan, dan sel-sel ditutupi dengan 150 L pengenceran feritin II dua kali lipat yang disiapkan pada DMEM/2 persen FBS, sedangkan sumur kontrol negatif dan positif ditutup dengan media saja. Setiap pengenceran feritin II dinilai dalam rangkap tiga. Pelat diinkubasi selama 48 jam (untuk virus Wuhan G614D) atau 72 jam (untuk virus Delta dan Omicron) pada 37 C, 5 persen CO2, hingga efek sitopatik yang jelas terlihat pada sumur kontrol positif. Supernatan secara hati-hati dikumpulkan ke dalam tabung 0,2 mL untuk kuantifikasi titer virus dan sel difiksasi dengan 10 persen formaldehida pada 4 C selama 24 jam.

Pelat tetap dipindahkan ke laboratorium BSL{{0}} untuk prosedur ELISA berbasis sel. Ini termasuk mencuci dengan PBST (PBS dengan 0,05 persen dari Tween 20), permeabilisasi sel dengan 0,1 persen Triton X-100 pada suhu kamar selama 15 menit, memblokir dengan 3 persen susu skim pada 37 C selama 1 jam, dan pencucian intensif dengan PBST. Kemudian ditambahkan antibodi anti-RBD kelinci poliklonal murni (BIOCAD JSC, Saint Petersburg, Rusia) dengan konsentrasi 1,5 g/mL selama 1 jam, dilanjutkan dengan pencucian dengan PBST dan penambahan sekunder anti-kelinci anti-IgG HRP- antibodi terkonjugasi (BioRad, Hercules, CA, USA) selama 1 jam pada 37 C. Pelat dikembangkan menggunakan 1-Langkah Ultra TMB-ELISA Solusi Substrat (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Reaksi dihentikan dengan larutan H2SO4 1M, dan hasilnya dibaca pada 450 nm menggunakan xMark Microplate Spectrophotometer (BioRad, Hercules, CA, USA). Untuk menghitung titer IC50, digunakan analisis regresi non-linier empat parametrik, berdasarkan nilai OD450 sel virus-negatif dan virus-positif, seperti yang dijelaskan dalam [18].

beli cistanche dimana

Titer SARS-CoV-2 dalam supernatan sel dihitung dengan RT-PCR kuantitatif real-time. RNA dimurnikan dari 100 L media kultur sel, serta dari SARS-CoV-2 dengan titer yang diketahui untuk pembuatan kurva standar pengujian. Sampel RNA dimurnikan dengan kit ekstraksi RNA (Biolabmix, Novosibirsk, Rusia) sesuai dengan protokol pabrikan. Reaksi RT-PCR dilakukan dalam rangkap dua dengan forwarding primer 50 -CAATGGTTTAACAGGCACAGG-30 dan reverse primer 50 -CTCAAGTGTCTGTG GATCACG-30 [19] menggunakan One-Tube RT-PCR SYBR kit (Evrogen, Moskow, Rusia) pada Quantstudio 1 Real-Time PCR System (Thermofifisher Scientific, Waltham, MA, USA), dengan penambahan 50x Rox sebagai pewarna referensi.

Siklus ambang (Ct) dihitung untuk setiap sampel dengan QuantStudio Design and Analysis Software v1.5.1, dan kurva standar dihasilkan pada setiap pelat reaksi. Titer virus di setiap sumur dihitung menggunakan nilai Ct yang dinormalisasi ke kurva standar yang dihitung berdasarkan titrasi virus standar dan dinyatakan dalam lgTCID50/mL. Untuk menentukan apakah feritin II dapat menghambat langkah awal perlekatan virus ke sel, 100 TCID50 SARS-CoV-2 dicampur dengan pengenceran feritin II, dan setelah inkubasi 1 jam pada 37 C, campuran ini ditambahkan ke Vero sel, diikuti dengan inkubasi 1 jam tambahan pada 37 C. Setelah penyerapan virus, inokulum dihilangkan, dan sel-sel ditutupi dengan 150 L media FBS DMEM/2 persen segar. Setelah 48 jam inkubasi pada 37 C, 5 persen CO2, dan CPE yang terlihat dalam sel kontrol positif, pelat difiksasi dan dikenai ELISA berbasis sel seperti dijelaskan di atas.

2.3. Penilaian Efek Sitotoksik Ferristatin II

Sitotoksisitas feritin II untuk sel Vero dinilai dengan {{0}}(4,5-Dimethylthiazol- 2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide ( uji reduksi MTT [20]. Pengenceran dua kali lipat feritin II disiapkan dalam media DMEM/2 persen FBS mulai dari konsentrasi 400 M dan ditambahkan ke sumur 96-pelat sumur dengan monolayer sel Vero. Setelah inkubasi 48 jam, media dikeluarkan dan sel-sel dicuci dengan lembut dengan PBS hangat. Reagen MTT 0,5 mg/mL ditambahkan ke masing-masing sumur dalam volume 100 L, dan plate diinkubasi lebih lanjut pada suhu 37 C selama 2 jam. Kemudian, reagen dikeluarkan dan sel dicuci dengan PBS dan dikeringkan di udara, dilanjutkan dengan penambahan 100 L etanol 96 persen untuk melarutkan kristal formazan. Intensitas warna direkam menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 535 nm. Sumur pelat yang tidak diunggulkan dengan sel Vero digunakan sebagai kontrol negatif. Penghambatan 50 persen viabilitas sel (CC50) dihitung dengan analisis regresi non-linier empat parametrik menggunakan perangkat lunak GraphPad Prizm.

2.4. Pelabelan Transferin Serum Manusia dan Protein RBD Rekombinan

Reaksi pelabelan dilakukan pada suhu plus 4 C selama 12 jam dengan menambahkan 5 mM larutan NHS-ester 5-TAMRA (Lumiprobe, #47120) dalam dimetilsulfoksida ke dalam larutan 30 M Fe2-TF atau RBD dalam 200 mM NaHCO3, menjaga rasio 5-TAMRA: protein=8:1 (mol/mol). Setelah menghilangkan kelebihan pewarna, tingkat pelabelan diperkirakan dengan rasio A541 dan A280, yang masing-masing adalah 3,5 dan 3,2 mol TAMRA per mol Fe2-TF dan RBD.

2.5.Studi Pengaruh Ferristatin II terhadap Serapan TF dan RBD oleh Sel Vero

Sel Vero dikultur selama 18 jam dalam DMEM/2 persen FBS tanpa feritin Il dan dengan penambahan 100 uM feritin Il dengan kaca penutup untuk mikroskop yang sebelumnya ditempatkan di bagian bawah pelat kultur. Kemudian, media diganti selama 15 jam dengan media tanpa FBS yang mengandung 1,2 M Fe2-TF-TAMRA 0,25 mg/mL） atau 1,2 M RBD-TAMRA (0,1 mg/mL). Setelah inkubasi, sel-sel dicuci dengan lembut dua kali dengan PBS, difiksasi dengan 4 persen paraformaldehyde (b/) dalam PBS selama 10 menit, dicuci dua kali dengan PBS selama 30 menit. Kemudian, inti sel diwarnai dengan 360nM DAPI selama 5 menit, dicuci dengan PBS dan kaca penutup, dan dipasang pada slide menggunakan resin polimerisasi untuk mikroskop fluoresensi (DAKO, Glostrup, Denmark). Gambar diperoleh menggunakan mikroskop pemindaian laser confocal Axio Observer.Z1/7 (Carl Zeiss, Jena, Jerman), dengan tujuan Plan-Apochromat 63×/1.40 Oil DIC M27. Laser A561 nm digunakan untuk merangsang fluoresensi TAMRA, { {28}} filter nm digunakan untuk merekam fluoresensi, laser 405 nm digunakan untuk merangsang DAPI. dan filter 400-570 nm digunakan untuk merekam fluoresensi. Gambar diperoleh dan diproses menggunakan perangkat lunak yang disediakan dengan mikroskop.

3. Hasil

Kami menggunakan dua galur SARS-CoV-2 yang jauh secara antigenik untuk menilai kemampuan feritin II dalam menghambat replikasi virus dalam sel Vero. Pada tahap pertama, kami menilai penghambatan virus dengan keberadaan senyawa yang konstan dalam media kultur. Deteksi antigen virus dalam ELISA berbasis sel menemukan bahwa nilai IC50 untuk feritin II adalah 26,5 dan 40,4 M untuk virus Wuhan D614G dan Delta (Gambar 2A). Kuantifikasi titer virus dalam media kultur menegaskan bahwa pelepasan virus dari sel yang terinfeksi ke dalam media kultur dihambat oleh feritin II, mulai dari konsentrasi 25 M, dan nilai IC50 yang dihitung dari penurunan titer TCID50 adalah 24,0 dan 25,2 M untuk virus Wuhan D614G dan Delta, masing-masing. Selain itu, ketika senyawa ditambahkan pada konsentrasi 100 M, tidak ada replikasi virus yang terjadi pada sel Vero (Gambar 2B).

cistanche dan tongkat ali

Karena perbedaan signifikan dalam protein RBD dari varian D614G Wuhan dan Omicron SARS-CoV-2, yang terakhir tidak dapat dideteksi dalam ELISA berbasis sel menggunakan antibodi anti-RBD yang tersedia, karena dinaikkan menjadi RBD galur SARS-CoV-2 asli. Namun demikian, penurunan titer virus menular dengan adanya feritin II bahkan lebih jelas pada varian Omicron dibandingkan dengan dua strain SARS-CoV-2 lainnya: penurunan sepuluh kali lipat pada titer virus tercatat pada feritin II konsentrasi serendah 6,25 M, tanpa replikasi virus yang terjadi pada konsentrasi 50 M ke atas (Gambar 3). Penting untuk dicatat bahwa penghambatan SARS-CoV-2 ini terjadi hanya ketika feritin II terus-menerus hadir dalam media kultur, sedangkan efek ini tidak diamati ketika sel-sel diberi perlakuan awal dengan senyawa tersebut atau ketika virus/ferritin Campuran II digunakan dalam langkah adsorpsi diikuti dengan inkubasi tanpa zat (data tidak ditampilkan).

We further assessed the cytotoxic effect of ferritin II on Vero-CCL81 cells. The presence of this compound in the culture medium at a concentration up to 400 µM had no negative effect on the viability of the cells, suggesting that the inhibition of SARS-CoV-2 replication was not due to the cell's metabolic dysfunctions (Figure 4). Therefore, the selectivity indices (determined as a ratio of CC50 to IC50 values) for ferritin II were >10, >15, and >64 untuk strain Wuhan D614G, Delta, dan Omicron SARS-CoV-2, masing-masing.

Untuk mengeksplorasi kemungkinan mekanisme penghambatan SARS-CoV-2 oleh feritin II, kami mempelajari efek zat tersebut pada entri virus dengan uji serapan RBD pengganti. Dengan demikian, kami menentukan bagaimana 100 M konsentrasi feritin II yang tidak beracun dapat memengaruhi penyerapan RBD berlabel tetramethylrhodamine (TAMRA) oleh sel Vero. TfR1, target aksi feritin II, diketahui memediasi masuknya Tf; oleh karena itu, TF berlabel TAMRA digunakan sebagai kontrol positif. Kultur sel Vero dengan adanya 100 M feritin II selama 18 jam tanpa menambahkan protein berlabel tidak memiliki efek signifikan pada morfologi inti sel (Gambar 5, panel atas (Mock)), secara tidak langsung menunjukkan tidak adanya nekrosis sel dan apoptosis. Inkubasi sel dengan TF-TAMRA tanpa pengobatan feritin II menghasilkan akumulasi protein berlabel di dalam sel, tanpa mempengaruhi wilayah nuklir bernoda DAPI (triad tengah kiri gambar (TF-TAMRA) pada Gambar 5). Perlakuan sel dengan 100 M feritin II menghasilkan penurunan yang signifikan dalam penyertaan TF berlabel (triad tengah kanan gambar (TF-TAMRA) pada Gambar 5). Inkubasi sel dengan RBD-TAMRA tanpa perlakuan feritin II, seperti dalam kasus TF berlabel, mengakibatkan akumulasi protein berlabel di sitoplasma sel, tanpa mempengaruhi wilayah inti (triad kiri bawah (RBD-TAMRA) pada Gambar 5 ). Ketika sel diperlakukan dengan 100 M feritin II, terjadi redistribusi sinyal TAMRA. Alih-alih memasukkan RBD berlabel ke dalam sel, sinyal TAMRA didistribusikan secara merata di atas permukaan sel, dengan hanya sebagian kecil dari label yang membentuk kluster yang sebagian tumpang tindih dengan pewarnaan DAPI dari inti, yang menunjukkan lokalisasi permukaan label TAMRA (bawah triad kanan (RBD-TAMRA) pada Gambar 5). Hasil yang ditunjukkan pada Gambar 5 menunjukkan bahwa perlakuan sel Vero dengan 100 M feritin II mempengaruhi penggabungan RBD berlabel ke dalam sel. Mempertimbangkan bahwa saat ini tidak ada data yang tersedia tentang efek feritin II pada reseptor ACE2, tidak dapat dikecualikan bahwa efek yang diamati disebabkan oleh pengikatan RBD berlabel ke permukaan sel, tetapi tidak adanya TfR1 pada sel mencegah penggabungan RBD dalam sel yang diobati dengan feritin II.

4. Diskusi

SARS-CoV-2 menggunakan beberapa mekanisme untuk menyerang sel inang dan menyebabkan infeksi virus yang berhasil, dan berbagai penghambat masuknya sel inang saat ini sedang dinilai sebagai strategi terapi COVID-19 [21]. Dalam studi saat ini, kami melaporkan hasil awal dari penghambatan replikasi in vitro SARS-CoV-2 dengan pengobatan sel target oleh feritin II, molekul berukuran kecil yang secara selektif dapat menurunkan reseptor transferin 1. Transferin jenuh besi (Fe2-Tf atau holo-Tf) memiliki afinitas tinggi terhadap reseptornya, yang diekspresikan pada permukaan sebagian besar sel manusia dan diinternalisasi dalam kompleks dengan holo-Tf melalui endositosis yang diperantarai reseptor. Pembentukan kompleks antara besi dan Tf, serta antara holo-Tf dan TfR, bergantung pada pH dan menyediakan pelepasan besi dari Tf dan Tf dari TfR dalam lingkungan asam endosom. Daur ulang hasil endosom di TfR kembali ke membran plasma dan melepaskan bentuk-apo Tf untuk putaran pengiriman besi lebih lanjut ke sel. Penyerapan zat besi oleh sel mamalia merupakan proses penting untuk mengatur pertumbuhan sel kanker yang kekurangan agen farmakologis dengan mekanisme aksi yang diketahui. Sebuah skrining dari 2000 senyawa ukuran kecil dari perpustakaan Diversity Set National Cancer Institute mengidentifikasi 10 inhibitor transport besi dengan nilai IC50 mulai dari 5 sampai 30 M [22]. Ferristatin II telah digunakan sebagai penghambat TfR1 dalam studi infeksi sel melalui TfR1 dengan virus hepatitis C [23,24], virus gastroenteritis menular [25], dan reovirus [26] (Tabel 1). Perlu dicatat bahwa percobaan degradasi TfR1 dengan feritin II hampir selalu dilakukan dengan adanya zat yang permanen dalam medium.

Dalam pengaturan uji serupa, kami menemukan bahwa feritin II hampir tidak beracun untuk sel Vero selama 48 jam paparan konsentrasi 400 M. Konsentrasi ini cukup untuk degradasi lengkap TfR1 pada permukaan sel kultur [16]. Di satu sisi, efek ini dikonfirmasi oleh pengurangan penyerapan Fe berlabel 2-Tf oleh sel Vero yang diberi 100 M feritin II selama 18 jam. Pemblokiran serapan Tf berlabel yang tidak lengkap, dalam hal ini, dapat dijelaskan dengan tidak adanya feritin II pada saat penambahan protein berlabel. Di sisi lain, pengobatan sel Vero oleh feritin II secara dramatis mengubah penyerapan RBD protein Spike. Dalam studi pendahuluan ini, kami tidak menilai tingkat ekspresi reseptor SARS-CoV-2 lainnya di bawah pengobatan feritin II dan tidak menginduksi knock-out reseptor yang diketahui ini untuk membuktikan peran independen TfR dalam memediasi SARS -CoV-2 entri sel, yang merupakan area penelitian lebih lanjut kami.

Namun demikian, pengikatan RBD yang relatif seragam ke permukaan sel yang diobati dengan feritin II dapat menunjukkan bahwa beberapa reseptor SARS-CoV-2 pada sel Vero tetap berfungsi dan mengikat virus, tetapi tanpa TfR1, virus tidak dapat masuk ke dalam sel. Reseptor ini kemungkinan besar adalah ACE2 sejak Prabhakara et al. menunjukkan peningkatan penyerapan RBD berlabel bersama dengan transferin berlabel oleh sel yang mengekspresikan ACE2 secara berlebihan, menunjukkan bahwa ACE2 mempromosikan penyerapan RBD melalui endositosis yang dimediasi clathrin, yang dieksploitasi oleh TfR1 [28]. Selain itu, terdapat bukti bahwa SARS-CoV-2 dapat menginfeksi sel negatif ACE2-menggunakan jalur masuk alternatif [29]; oleh karena itu, analisis yang lebih dalam dari tindakan feritin II pada berbagai jenis sel memungkinkan untuk infeksi SARS-CoV-2 akan menjelaskan peran TfR1 dalam siklus hidup virus. Untuk memahami seberapa menjanjikan zat ini untuk terapi infeksi SARS-CoV-2 di masa depan, penting untuk mengetahui bagaimana senyawa ini dimetabolisme secara in vivo. Tikus yang diobati dengan feritin II memiliki kadar TfR1 yang lebih rendah di hati, dan mengurangi besi serum dan saturasi Tf tanpa perubahan besi non-heme hati [16].

Selanjutnya, feritin II menginduksi ekspresi hepsidin [16,30]. Pada penelitian lain, ekspresi gen dinilai setelah pemberian feritin II (dalam minyak jagung) ke dalam perut tikus Wistar dengan dosis 146 mg/kg/hari selama 7 hari. Di antara gen protein pengatur besi, penurunan ekspresi HFE dan peningkatan ekspresi CP, GDF15, dan HAMP setelah pemberian feritin II diamati [31]. Sebagai catatan, efek feritin II pada jalur pensinyalan yang bergantung p53-kemungkinan besar merupakan penghalang yang membatasi penggunaannya hanya sebagai penghambat TfR1 pada kultur sel [31].

Ferristatin II juga dikenal sebagai direct black 38, Chlorazol black E, CI 30235, atau CAS 1937- 37-7 dan umumnya digunakan sebagai pewarna untuk pewarnaan granulosit dan onikomikosis [32,33]. Yang penting, metabolit benzidine dari direct black 38 yang memiliki potensi risiko kanker kandung kemih diamati pada sampel urin pekerja di unit skala kecil yang memproduksi pewarna ini [34]. Meskipun feritin II tidak dapat langsung digunakan pada manusia, untuk alasan ini, ada argumen bahwa strategi menghambat masuknya SARS-CoV-2 ke dalam sel dengan memblokir TfR1 cukup menjanjikan, karena pendekatan ini menargetkan reseptor pada inang. sel daripada protein yang rentan terhadap mutasi virus. Selain itu, penelitian lebih lanjut diperlukan untuk mengidentifikasi senyawa kimia yang bertindak seperti molekul feritin II, tetapi tanpa pembentukan metabolit dengan potensi risiko kesehatan.

disfungsi ereksi cistanche

Referensi

1 Scialo, F.; Daniel, A.; Amato, F.; Pastore, L.; Matera, MG; Cazzola, M.; Castaldo, G.; Bianco, A. ACE2: Reseptor Masuk Sel Utama untuk SARS-CoV-2. Paru-paru 2020, 198, 867–877. [CrossRef] [PubMed]

2. Ni, W.; Yang, X.; Yang, D.; Bao, J.; Li, R.; Xiao, Y.; Hou, C.; Wang, H.; Liu, J.; Yang, D.; dkk. Peran enzim pengubah angiotensin 2 (ACE2) pada COVID-19. Kritis. Care 2020, 24, 422. [CrossRef] [PubMed]

3. Shang, J.; Kamu, G.; Shi, K.; Wan, Y.; Luo, C.; Aihara, H.; Geng, Q.; Auerbach, A.; Li, F. Dasar struktural pengenalan reseptor oleh SARS-CoV-2. Alam 2020, 581, 221–224. [CrossRef] [PubMed]

4. Wan, Y.; Shang, J.; Graham, R.; Baric, RS; Li, F. Pengakuan Reseptor oleh Novel Coronavirus dari Wuhan: Sebuah Analisis Berdasarkan Studi Struktural Selama Satu Dekade dari SARS Coronavirus. J. Viral. 2020, 94, e00127-20. [CrossRef] [PubMed]

5. Zhang, T.; Chen, CZ; Swaroop, M.; Xu, M.; Wang, L.; Lee, J.; Wang, AQ; Pradan, M.; Hagen, N.; Chen, L.; dkk. Heparan sulfat membantu SARS-CoV-2 dalam masuk sel dan dapat ditargetkan oleh obat yang disetujui secara in vitro. Penemuan Sel 2020, 6, 80. [CrossRef]

6. Wang, K.; Chen, W.; Zhang, Z.; Deng, Y.; Lian, JQ; Du, P.; Wei, D.; Zhang, Y.; Matahari, XX; Gong, L.; dkk. Protein lonjakan CD147-adalah rute baru untuk infeksi SARS-CoV-2 ke sel inang. Transduksi Sinyal. Target. Ada. 2020, 5, 283. [CrossRef]

7. Wei, C.; Wan, L.; Yan, T.; Wang, X.; Zhang, J.; Yang, X.; Zhang, Y.; Kipas angin, C.; Li, D.; Deng, Y.; dkk. Reseptor pemulung HDL tipe 1 memfasilitasi masuknya SARS-CoV-2. Nat. Meta 2020, 2, 1391–1400. [CrossRef]

8. Daly, JL; Simonetti, B.; Klein, K.; Chen, KE; Williamson, MK; Anton-Plagaro, C.; Tanda sepatu, DK; Simon-Gracia, L.; Bauer, M.; Belanda, R.; dkk. Neuropilin-1 adalah faktor inang untuk infeksi SARS-CoV-2. Sains 2020, 370, 861–865. [CrossRef]

9. Wang, S.; Qiu, Z.; Hou, Y.; Deng, X.; Xu, W.; Zheng, T.; Wu, P.; Xie, S.; Bian, W.; Zhang, C.; dkk. AXL adalah kandidat reseptor untuk SARS-CoV-2 yang memicu infeksi sel epitel paru dan bronkus. Res. 2021, 31, 126-140. [CrossRef]

10. Cantuti-Castelvetri, L.; Ojha, R.; Pedro, LD; Djannatian, M.; Franz, J.; Kuivanen, S.; van der Meer, F.; Kallio, K.; Kaya, T.; Anastasia, M.; dkk. Neuropilin-1 memfasilitasi masuknya sel dan infektivitas SARS-CoV-2. Sains 2020, 370, 856–860. [CrossRef]

11. Jackson, CB; Farzan, M.; Chen, B.; Choe, H. Mekanisme masuknya SARS-CoV-2 ke dalam sel. Nat. Pdt Mol. Biol Sel. 2022, 23, 3–20. [CrossRef] [PubMed]

12. Tang, X.; Yang, M.; Duan, Z.; Liao, Z.; Liu, L.; Cheng, R.; Fang, M.; Wang, G.; Liu, H.; Xu, J.; dkk. Reseptor transferin adalah reseptor lain untuk masuknya SARS-CoV-2. bioRxiv 2020. [CrossRef]

13. Hentze, MW; Muckenthaler, MU; Andrews, NC Balancing bertindak: kontrol molekul metabolisme besi mamalia. Sel 2004, 117, 285–297. [CrossRef] 14. Wessling-Resnick, M. Menyeberangi Gerbang Besi: Mengapa dan Bagaimana Reseptor Transferrin Memediasi Masuknya Virus. annu. Pdt. Nutr. 2018, 38, 431–458. [CrossRef] [PubMed]

15. Horonchik, L.; Wessling-Resnick, M. Molekul kecil besi transport inhibitor feritin/NSC306711 mempromosikan degradasi reseptor transferin. Kimia Biol. 2008, 15, 647–653. [CrossRef]

16. Byrne, SL; Buckett, PD; Kim, J.; Luo, F.; Sanford, J.; Chen, J.; Enns, C.; Wessling-Resnick, M. Ferristatin II mempromosikan degradasi reseptor transferin-1 in vitro dan in vivo. PLoS SATU 2013, 8, e70199. [CrossRef]

17. Sokolov, AV; Voynova, IV; Kostevich, VA; Vlasenko, AY; Zakharova, ET; Vasilyev, VB Perbandingan Interaksi antara Ceruloplasmin dan Laktoferin/Transferrin: Untuk Mengikat atau Tidak Mengikat. Biokimia. Biokhimiia 2017, 82, 1073–1078. [CrossRef]