Pola Ekspresi -Tubulin, Inversin Dan Sasarannya Acak-1 Dan Morfologi Silia Primer Pada Perkembangan Dan Penyakit Ginjal Manusia Normal

{0}}

Abstrak:Ekspresi spatiotemporal protein -tubulin, inversi, dan acak-acakan-1 (DVL-1) yang terkait dengan jalur pensinyalan Wnt, dan morfologi silia primer dianalisis dalam pengembanganginjal(minggu perkembangan ke-14-38), pascakelahiran yang sehat (1.5- dan 7-tahun), dan manusia yang berubah secara patologisginjal,termasuk displastik multikistikginjal(MCDK), glomerulosclerosis fokal segmental (FSGS) dan sindrom nefrotik tipe Finlandia (CNF). Analisis dilakukan dengan metode imunofluoresensi ganda, mikroskop elektron, semikuantitatif dan statistik. Ko-ekspresi sitoplasma dari -tubulin, inversi, dan DVL-1 diamati pada tubulus kontortus proksimal (pct), tubulus kontortus distal (dct), dan glomeruli (g) dari jaringan yang dianalisis. Selamaginjalperkembangan, ekspresi keseluruhan -tubulin, inversi, dan DVL-1menurun, sedangkan pada periode pascanatal sedikit meningkat. Ekspresi -tubulin dan inversi tertinggi mencirikan dct dan g, sedangkan DVL-1 yang tinggi mencirikan pct. -tubulin, inversi, dan pola ekspresi DVL-1 di MCDK, FSGS, dan CNFginjalberbeda secara signifikan dari kontrol yang sehat. Dibandingkan dengan sehatginjal, berubah secara patologisginjalmemiliki silia primer dismorfik. Dinamika ekspresi yang berbeda dari -tubulin, inversi, dan DVL-1 selamaginjalpengembangan dapat menunjukkan bahwa peralihan antara pensinyalan Wnt kanonik dan nonkanonik sangat penting untuk normalginjalmorfogenesis. Sebaliknya, ekspresi mereka yang terganggu secara patologisginjalmungkin terkait dengan silia primer yang abnormal, yang mengarah kepenyakit ginjal.

Kata kunci:perkembangan ginjal manusia; -tubulin; terbalik; DVL-1; MCDK; FSGS; CNF; ginjal, ginjal

CISTANCHE AKAN MENINGKATKAN PENYAKIT GINJAL/GINJAL

pengantar 

Perkembangan definitif atau metanephricginjaldimulai selama minggu kehamilan kelima (GW), yang kemudian terus berdiferensiasi membentuk ginjal permanen [1,2]. Interaksi pensinyalan antara mesenkim metanefrik dan tunas ureter memastikanginjalperkembangan selama nefrogenesis. Secara singkat, tunas ureter menginduksi transisi mesenchymal-to-epithelial (MET) di mesenkim metanephric, yang berkondensasi dan membentukginjalvesikel, diikuti oleh badan berbentuk koma dan S, dan akhirnya mengarah ke pembentukan glomeruli [3]. Sebagai imbalannya, mesenkim menginduksi percabangan lebih lanjut dari tunas ureter. Ginjal metanephric menjadi unit ekskresi fungsional pada minggu ke-11 perkembangan manusia. Namun, nefrogenesis selesai dalam 34-36 minggu perkembangan janin, ketika beberapa percabangan selesai, tetapi proses diferensiasi lebih lanjut dari ginjal berlanjut ke periode postnatal [4,5]. Gangguan pada interaksi kompleks ini mengakibatkan berbagai kelainan kongenital ginjal dan saluran kemih (CAKUT), termasuk displasia, penyakit ginjal polikistik, displastik multikistik.penyakit ginjal(MCDK), akibatnya mengarah ke kronispenyakit ginjal(CKD) [6].

Dalam penelitian ini, kami fokus pada penampilan silia primer dan jalur pensinyalan Wnt, yang memainkan peran penting selama nefrogenesis normal dan dalamginjalproses perbaikan, setelah akut atau kronispenyakit ginjal[7]. Keberadaan silia primer selama nefrogenesis dan sejumlah besar perkembanganginjalcacat yang terjadi pada pasien dengan penyakit silia menunjukkan bahwa fungsi silia primer asli diperlukan untuk normalginjalorganogenesis [8,9]. Silia primer adalah organel berbasis mikrotubulus yang penting untuk homeostasis jaringan, di mana -tubulin adalah komponen dasarnya [10]. Hilangnya asetilasi -tubulin dalam sel yang diabadikan memicu transisi epitel-ke-mesenkim (EMT), sehingga menyiratkan bahwa -tubulin asetat penting dalam stabilisasi mikrotubulus [11]. Selama perkembangan manusia, jalur Wnt yang dimediasi silia primer memungkinkan proliferasi sel, diferensiasi dan morfogenesis jaringan [12]. Sejumlah besar anak dengan gangguan fungsi silia primer dan gangguan jalur pensinyalan Wnt berkembang menjadi CKD, di mana bawaanginjalgangguan bertanggung jawab untuk hampir setengah dari kasus [13]. Penyakit kistik kongenital yang paling umum pada anak-anak adalah displastik multikistikpenyakit ginjal(MCDK) [14]. Kista multipel yang tidak berkomunikasi [15] dan kurang normalginjalparenkim adalah temuan mikroskopis karakteristik untuk MCDK. Glomerulosklerosis segmental fokal (FSGS) adalah salah satu penyakit glomerulus yang paling umum yang mengarah ke stadium akhir.penyakit ginjal[16]. Pada awalnya, FSGS bersifat fokal, hanya melibatkan sebagian kecil glomerulus dan segmental, melibatkan perubahan hanya pada sebagian lingkaran glomerulus [17]. Sindrom nefrotik kongenital tipe Finlandia (CNF) adalah kelainan autosomal yang diturunkan secara resesifpenyakit ginjaldiwakili oleh wabah prenatal kehilangan protein yang luas [18], terkait dengan cystogenesis tubulus proksimal [19]. Banyak bentuk penyakit glomerulus primer mengembangkan proteinuria sebagai akibat dari kerusakan penghalang filtrasi glomerulus [20]. Sejumlah besar penelitian menyiratkan bahwa cedera dan disfungsi podosit memiliki peran intrinsik dalam patogenesis proteinuria CKD [21]. Studi oleh Vukojevic et al. menunjukkan peningkatan jumlah podosit bersilia dan berdiferensiasi buruk di CNF [22]. Studi sebelumnya menunjukkan bahwa jalur pensinyalan Wnt/-catenin memiliki peran mendasar dalam memoderasi disfungsi podosit dengan proteinuria [23]. Ada dua jalur pensinyalan Wnt utama, satu dikenal sebagai canonical -catenin-dependent dan noncanonical, -catenin independent. Selama tikusginjalperkembangannya, pensinyalan Wnt kanonik aktif pada ujung tunas ureter dan pada badan berbentuk S [24]. Selanjutnya, Wnt melalui pensinyalan kanonik memiliki relevansi dalam mempertahankan MET selama nefrogenesis [25]. Yaitu, pengikatan kompleks protein yang mengandung Dvl ke reseptor membran adalah wajib untuk aktivasi jalur Wnt, sementara menonaktifkan komponen kunci dari jalur ini menghasilkan kematian perinatal dini karena tidak adanya zona nefrogenik diginjal[25]. 

Sebuah protein penting sebagai peralihan molekuler antara jalur pensinyalan Wnt kanonik dan nonkanonik ditemukan sebagai inversi [26]. Meskipun interaksi berbagai protein dengan inversi telah terdeteksi, fungsi pastinya belum sepenuhnya diklarifikasi. Dalamginjalsel epitel, inversi terletak di silia primer, bertindak sebagai protein silia [27]. Selain itu, inversi membentuk kompleks yang stabil dengan tubulin dalam kulturginjalsel, dan mereka berkolokasi in vivo [27,28]. Inversi tampaknya memainkan peran penting dalam morfogenesis awal sistem pronefrik dan penentuan simetri kiri-kanan selama perkembangan [29,30]. Peristiwa penting untuk jalur pensinyalan Wnt kanonik dan nonkanonik dalam perekrutan Dvl sitoplasma ke membran sel. Karena temuan sebelumnya menunjukkan bahwa inversi dan Dvl berkolokasi dalam sel epitel ginjal, dapat berspekulasi bahwa inversi mungkin juga memiliki peran dalam pensinyalan nonkanonik. Disregulasi pensinyalan Wnt yang dimediasi oleh inversi memicu proliferasi yang menyimpang di tubulus [31]. Tes genetik mengungkapkan mutasi DVL -1 pada pasien dengan sindrom Robinow autosomal-dominan, menyajikan gangguan heterogen pada beberapa pasien yang berhubungan dengan urogenital danginjalanomali [32].

CISTANCHE AKAN MENINGKATKAN GINJAL / RENAL DIALYSIS

Pola ekspresi perkembangan -tubulin, inversi dan DVL-1 telah diselidiki pada model hewan yang berbeda. Dengan demikian, ekspresi mereka dalam pronefros Xenopus laevis telah dikonfirmasi dengan menggunakan mikroskop intravital [31], sementara mereka ditemukan dalam garis sel yang berasal dari sel tubulus proksimal murine dengan menggunakan mikroskop confocal dan spektrometri massa [33]. Selain itu, mikroskop cahaya dan imunofluoresensi ganda mengungkapkan kehadiran mereka di bagian tikusginjal[34]. Studi pada tikus knockout inversi melaporkan kista yang membesar dan menyebar diginjalmedula dan korteks terkait dengan inversi situs visceral [35]. Pada manusia, mutasi inversi ditunjukkan dengan nephronophthisis infantil yang menyebabkan terminasi kehamilan [36]. Meskipun banyak penelitian tentangginjalPola dan fungsi ekspresi -tubulin, inversi dan DVL-1, sejauh yang kami ketahui, pola ekspresi protein ini dalam jaringan manusia janin dan pascakelahiran manusia belum diselidiki dan dibawa ke korelasi. Selain itu, belum ada bukti yang dilaporkan mengingat ekspresi inversi dan DVL-1 dalam perkembangan manusia awal. Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan untuk menganalisis pola ekspresi spasial dan temporal -tubulin, inversi dan DVL-1 selama tahap janin dan pascakelahiran manusia sehat.ginjal, serta dalamginjaljaringan MCDK, FSGS dan CNFginjaluntuk membangun kemungkinan mata rantai yang hilang antara entitas-entitas ini. Yaitu, kami mengusulkan bahwa pola ekspresi yang terganggu dari protein -tubulin, inversi dan DVL-1 mungkin merupakan proses sistogenesis yang mendasari dan fungsi abnormal silia primer yang mengarah ke kronis.penyakit ginjal. 

Hasil

Analisis perkembangan dan pascakelahiranginjaljaringan dilakukan pada struktur yang dibedakan secara jelas dariginjal:tubulus kontortus proksimal (pct), tubulus kontortus distal (dct) dan glomeruli (g). Selama tahap perkembangan yang dianalisis dan pascakelahiranginjaljaringan, -tubulin, inversi dan DVL-1 menunjukkan pola ekspresi positif tetapi dengan perbedaan intensitas, distribusi dan kuantitas. Analisis patologisjaringan ginjaldari MCDK, FSGS dan CNF dilakukan pada jumlah gambar penuh dari sel-sel positif dibandingkan dengan kontrol jaringan ginjal yang sehat.

2.1. Mikroskop Cahaya, Mikroskop Elektron dan Imunohistokimia (-Tubulin) Jaringan Ginjal Manusia Pascanatal yang Sehat dan Berubah Secara Patologis

2.1.1. Cahaya Ginjal Pasca Melahirkan yang Sehat

mikroskopi postnatalginjaljaringan menunjukkan terdefinisi dengan baikginjalstruktur, dengan perbedaan yang jelas antara medula dan korteks dan pembentukan persen, dct, dan g di wilayah kortikal. Pewarnaan imunohistokimia -tubulin mengungkapkan adanya satu silia primer di tengah permukaan sel apikal setiap sel tubulus dan 0.018 persen ± 0,00014 persen SD pada permukaan sel glomerulus. Mikroskop elektron menunjukkan adanya hanya satu silia primer yang muncul dari badan basal pada permukaan sel apikal tubulus (Gambar 1a).

2.1.2. CNF

Sebagian besar g yang dianalisis lebih kecil dan berlobus (80 persen ), sedangkan sebagian kecil berukuran normal atau hipertrofik (20 persen , n=100). Ditemukan sklerosis segmental atau global g, sedangkan persen dan dct sebagian melebar dan dilapisi epitel atrofi. Ultrastruktural, hilangnya mikrovili dan penurunan tinggi sel dengan multifragmentasi inti diamati. Pada podosit, prosesus kaki hilang secara difus. Silia primer tubular tidak teratur, terutama pada kista tubulus proksimal, menunjukkan perubahan panjang dan posisi sitoplasma (Gambar 1b).

2.1.3. MCDK

Pada jaringan ginjal, g imatur dan matur sporadis dapat ditemukan.Ginjaljaringan diisi dengan banyak kista oval. Sel epitel kolumnar menutupi kista dan dikelilingi oleh jaringan ikat longgar. Pewarnaan imunohistokimia pada -tubulin menunjukkan beberapa silia primer yang panjang dan tidak teratur pada permukaan sel epitel (Gambar 1c).

2.1.4. FSGS

Dalam 90 persen g, ditemukan sklerosis segmental yang luas (n=100), berhubungan dengan fibrosis interstisial dan tanda-tanda kerusakan tubulus. Penurunan tinggi sel epitel dengan hilangnya mikrovili ditemukan pada mikroskop elektron, sedangkan sel endotel dan daerah mesangial memiliki ultrastruktur yang teratur. Dalam mikroskop elektron, silia yang sangat panjang dan terkilir (terdesentralisasi) diamati pada permukaan sel tubulus distal (Gambar 1e). Podosit menunjukkan hilangnya prosesus kaki difus dengan jaringan mikrovilus yang luas. Pewarnaan imunohistokimia pada -tubulin menunjukkan beberapa silia primer yang panjang dan tidak teratur pada permukaan sel epitel (Gambar 1c).

2.2. Pewarnaan Imunohistokimia pada Tubulin, Inversi dan DVL-1- dan Analisis Statistik Perkembangan Ginjal Manusia Pascanatal yang Sehat dan Berkembang

Pada minggu ke-14, 15 dan 16 kehamilan,ginjaljaringan disajikan dengan tahap perkembangan yang berbeda dari pembentukan nefron: dari cangkir metanephric,ginjaltahap vesikel untuk memerintahkan nefron berbentuk S, sehingga membentuk zona nefrogenik di korteks luar (Gambar 2). Membedakan persen, dct dan g dapat diamati di daerah kortikal yang lebih dekat keginjalsumsum belakang. Selama GW ke-22, bagian medula dan korteks menjadi jelas berbeda, sedangkan pada GW ke-38,ginjalstruktur tampak sangat terdiferensiasi, mengandung bentuk matang dari pct, dct dan g

2.2.1. a-tubulin

Selama perkembangan, a-tubulin diekspresikan dengan kuat di semua perkembanganginjalstruktur, terutama memvisualisasikan bentuk silia primer pada permukaan sel epitel parietal kapsul Bowman, g, pct dan dct. Di dalamginjaljaringan, 82—97 persen sel persen mengekspresikan -tubulin, sementara pada ekspresi dct turun dari 99 persen menjadi 72 persen pada GW ke-38 (lihat Gambar 3, Tabel 1). Di antara tahap perkembangan yang berbeda, ekspresi -tubulin yang paling kuat ditemukan pada g dari GW . ke-16ginjal, mengandung 93 persen sel positif. GW ke-14, ke-15 dan ke-22 (lihat Gambar 3a,b, Tabel 1), sekitar 70 persen sel g mengekspresikan a-tubulin, sedangkan ekspresi paling sedikit diamati pada GW ke-38 (p <0,01) dengan="" 34="" persen="" sel="" positif="" (gambar="" 3c).="" di="" masa="" pasca="">ginjaljaringan (1.5-tahun dan 7-tahunginjal), imunoreaktivitas terkuat terhadap -tubulin diamati pada permukaan sel apikal dari persen dan dct (Gambar 3d-f). Ekspresi -tubulin juga terdapat dalam sitoplasma perinuklear dct dan sel epitel parietal kapsul Bowman. noda a-tubulin semuaginjalstruktur dengan rata-rata 50 persen sel positif dalam persen, 94 persen dalam dct dan 85 persen dalam g (Gambar 3f). Pewarnaan Dct berbeda nyata dengan persen (p < 0,0001).="" semua="" struktur="" yang="" diselidiki="" bernoda="" positif="" pada="" -tubulin,="" dengan="" 77="" persen="" sel="" positif="" dalam="" persen,="" 72="" persen="" dalam="" dct="" dan="" 58="" persen="" dalam="" g="">

Gambar 3. Pewarnaan imunofluoresensi -tubulin dan DAPI pada jaringan ginjal manusia yang sedang berkembang dan pascakelahiran (a–e). Ginjal 14, 15/16, 38 GW (a–c);ginjaldari 1.5- dan anak-anak berusia 7-tahun (d,e). Pewarnaan positif -tubulin (panah) ditunjukkan pada setiap struktur di korteks melalui fase perkembangan dan pascakelahiran (a–e), tubulus kontortus proksimal (pct), tubulus kontortus distal (dct) dan glomeruli (g). Rincian silia primer dalam persen (d) dan dct (a–c,e) ditampilkan sebagai sisipan perbesaran yang lebih tinggi (kotak putih). Pembesaran ×40, bilah skala 100 m. Distribusi sel-sel positif -Tubulin per struktur di seluruh tahap perkembangan yang berbeda dan pada periode pascakelahiran ditunjukkan pada grafik (f). Grafik (g) (jumlah keseluruhan sel protein-positif dalam struktur yang diamati) menunjukkan ekspresi protein terkait dengan waktu perkembangan (Regresi linier) dan keterkaitan -Tubulin dengan DVL-1 melalui pengembangan dan pematangan (ANOVA Dua Arah diikuti oleh tes posthoc SIDAK). Data ditampilkan sebagai mean ± SD.

Distribusi sel -tubulin-positif per struktur sepanjang berbagai tahap perkembangan dan pada periode pascakelahiran ditunjukkan pada grafik (f). Grafik (g) (jumlah keseluruhan sel protein-positif dalam struktur yang diamati) menunjukkan ekspresi protein yang terkait dengan waktu perkembangan (Regresi linier) dan keterkaitan -tubulin dengan DVL-1 melalui pengembangan dan pematangan (ANOVA dua arah diikuti oleh uji post hoc Sidak). Data ditampilkan sebagai sarana ± SD.

2.2.2. Pewarnaan Imunoflfluoresensi Ganda terhadap Inversi dan DVL-1 dan Pewarnaan Nuklir DAPI dalam Perkembangan dan Kesehatan Ginjal Postnatal Ekspresi Inversi pada Jaringan Ginjal yang Berkembang dan Setelah Melahirkan

Pada GW 14, 15 dan 16, inversi menunjukkan ekspresi granular yang kuat dalam g, dan ekspresi granular ringan di sitoplasma persen dan dct (Gambar 4a,b), sedangkan pada GW ke-22 dan ke-38 (lihat Gambar 4c), ekspresi positif diamati pada g (Tabel 1). Antara 14 dan 22 GW, sekitar 50 persen dari sel versi ekspres. Pada GW ke-16, persen sel mengekspresikan inversi dalam 73 persen sel, sementara menurun menjadi 29 persen sel (p <0,05) pada="" gw="" ke-38="" (lihat="" gambar="" 4f).="" ekspresi="" positif="" dari="" inversi="" ditemukan="" pada="" sekitar="" 80-90="" persen="" sel="" dct="" dan="" sel="" g="" pada="">ginjaljaringan dari 14 dan 16 GW, dengan ekspresi terendah di dct dari 38 GW (p < 0.05,="" p=""><0,0001, masing-masing)="" di="" mana="" 66="" persen="" sel="" positif.="" setelah="">ginjal, % terwarnai kuat pada membran sel apikal, sedangkan dct sebagian besar terwarnai pada membran sel basal dan di sitoplasma perinuklear (Gambar 4d,e). Pada tahap itu, kami menemukan ekspresi inversi di semua yang diselidikiginjalstruktur, termasuk persen, dct dan g, dengan ekspresi rata-rata sel positif 92 persen untuk persen, 88 persen untuk dct dan 90 persen untuk g (Gambar 4f). Kami tidak mengamati perbedaan yang signifikan dalam kekuatan sinyal ekspresi inversi antara struktur. Ekspresi inversi tertinggi ditemukan di g, dengan rata-rata 94 persen sel positif (Gambar 4f). Perbedaan yang signifikan ditemukan membandingkan pewarnaan g (di mana 94 persen sel bernoda positif) dengan persen, di mana 58 persen sel bernoda positif (p < 0.01)="" dan="" dct,="" di="" mana="" 49="" persen="" sel="" diwarnai.="" positif="" (p="">< 0,0001,="" gambar="">

Ekspresi DVL-1 dalam Pengembangan dan Jaringan Ginjal Pascanatal

Ekspresi DVL ringan hingga kuat{{0}} diamati dalam sitoplasma persen, dct dan g pada periode janin (lihat Gambar 4a–c, Tabel 1). Dalam persen, 76–86 persen sel mengekspresikan DVL-1 pada GW ke-14-22, sedangkan pada GW ke-38, ada 57 persen sel positif (Gambar 4g). Pada dct GW ke-14 dan ke-15, 68–70 persen sel mengekspresikan DVL-1, pada GW ke-16 dan ke-22, jumlah sel positif turun menjadi 42–5{{41} } persen , sedangkan dalam ekspresi GW ke-38 (p <0,001), diamati="" pada="" 19="" persen="" sel="" dct.="" ekspresi="" dvl-1="" meningkat="" dalam="" g="" selama="" tahap="" janin:="" pada="" gw="" ke-14,="" adalah="" 6="" persen="" ,="" sedangkan="" pada="" gw="" ke-15,="" 16="" dan="" 22,="" meningkat="" menjadi="" 10="" persen="" (p=""><0,01). dalam="" 38="" gw,="" 14="" persen="" sel="" g="" mengekspresikan="" dvl-1="" (gambar="" 4="" g).="" pada="" periode="" pascakelahiran,="" imunoreaktivitas="" dvl-1="" tersebar="" di="" sitoplasma="" (tabel="" 1)="" dari="" kedua="" persen="" dan="" dct="" (gambar="" 4d,e).="" sinyal="" ditemukan="" di="" semua="" struktur="" yang="" diselidiki="" tetapi="" sebagian="" besar="" di="" sitoplasma="" perinuklear.="" intensitas="" ekspresi="" dvl-1="" secara="" signifikan="" lebih="" tinggi="" dalam="" persen="" dibandingkan="" dengan="" dct="" dan="" g="" (p=""><0,01). 39–45="" persen="" sel="" dalam="" persen="" dan="" dct="" mengekspresikan="" dvl-1,="" sedangkan="" dalam="" g,="" 21="" persen="" sel="" positif="" (gambar="" 4="" g).="" kami="" tidak="" menemukan="" perbedaan="" yang="" signifikan="" antara="" persentase="" sel="" imunoreaktif="" di="" yang="">ginjalstruktur. Persentase sel imunoreaktif DVL-1 adalah 34 persen di persen, 36 persen di dct dan 27 persen di g, masing-masing (Gambar 4g).

Gambar 4. Pewarnaan imunofluoresensi ganda pada inversi (hijau), DVL-1 (merah) dan DAPI (biru) pada jaringan ginjal yang sedang berkembang dan pascakelahiran (GW ke-14-38, 1.5- dan {{6 }}jaringan ginjal berumur setahun). Pewarnaan positif (panah) ditunjukkan pada setiap struktur sepanjang semua fase perkembangan (a-c) dan periode pascakelahiran (d,e). Mikrofon yang digabungkan bersama dengan struktur yang menarik di korteks: tubulus berbelit-belit proksimal (pct), tubulus berbelit-belit distal (dct) dan glomeruli (g). Kolokalisasi inversi/DVL-1 (panah) ditampilkan dalam mikrofotografi gabungan. Pewarnaan kontrol negatif ditampilkan sebagai sisipan pada inversi dan DVL-1 (a). Eritrosit dapat dilihat sebagai sel yang bernoda kuat di dekat dct. Detail ditampilkan sebagai sisipan perbesaran yang lebih tinggi. Pembesaran ×40, bilah skala 100 m. Distribusi sel positif yang dinamis dari inversi dan DVL-1 dalam struktur ginjal (pct, dct, g) selama tahap perkembangan dan pascakelahiran ditunjukkan dalam grafik (f,g). Grafik (h) menunjukkan ekspresi protein (jumlah keseluruhan sel positif dalam struktur) terkait dengan waktu perkembangan (Regresi linier) dan keterkaitan inversi ke DVL-1 melalui pengembangan dan pematangan (ANOVA dua arah diikuti oleh uji post hoc Sidak ). Data ditampilkan sebagai sarana ± SD.

Co-ekspresi inversi dan DVL-1 diamati dalam sitoplasma g ginjal, dct dan pct selama perkembangan (lihat Gambar 4a–c, penggabungan). Pada periode pascakelahiran, koekspresi inversi dan DVL-1 mencirikan kompartemen seluler yang berbeda dari sel tubulus dalam persen dan dct, sedangkan koekspresi dalam g dicirikan oleh prevalensi ekspresi inversi yang kuat (lihat Gambar 4d, gabungkan ). Dalam 7-tahun ginjal pascakelahiran, ko-ekspresi inversi dan DVL-1 terlihat pada sel tubulus dct dan pct, dan dalam g di mana ekspresi inversi sedikit lebih menonjol dibandingkan dengan DVL-1 (Gambar 4e, gabungkan).

2.2.3. Perbedaan Ekspresi -Tubulin, Inversi dan DVL-1 antara Berbagai Tahap Perkembangan Ginjal dan Ginjal Pascanatal

Jumlah sel -tubulin-positif di persen jaringan ginjal janin secara statistik lebih tinggi secara signifikan dibandingkan dengan jaringan ginjal anak-anak 7-tahun ke-13 (p < 0.0{="" {11}}1),="" ke-15="" (p="">< 0.0001)="" dan="" ke-16="" (p="">< 0.00001)="" gw).="" dct="" tahap="" janin="" awal="" (gw="" 13,="" 15,="" 16="" dan="" 22)="" memiliki="" sel="" yang="" lebih="" positif="" dibandingkan="" dengan="" jaringan="" ginjal="" anak-anak="" berusia="" 38="" gw="" dan="" 1.{19}}tahun="" (p=""><0,0001, masing-masing,="" gambar="" 3f).="" ketika="" tahap="" perkembangan="" yang="" berbeda="" dibandingkan,="" kami="" menemukan="" tingkat="" ekspresi="" inversi="" yang="" lebih="" rendah="" di="" persen="" ke-13="" (p=""><0,0001), ke-15="" (p=""><0,00001), ke-22="" (p=""><0,001) dan="" ke-38="" (p=""><0,0001) gw="" dibandingkan="" dengan="">ginjaltisu dari anak berusia 1.5-tahun. Di dct, ekspresi inversi rendah yang signifikan secara statistik ditemukan membandingkan jaringan ginjal GW ke-16 dengan GW ke-38 (p < 0.0001).="" lebih="" lanjut,="" ekspresi="" inversi="" yang="" lebih="" rendah="" dalam="" dct="" diamati="" pada="" jaringan="" ginjal="" anak="" berusia="" 7-tahun;="" membandingkan="" jaringan="" ginjal="" ke-13,="" ke-15="" (p=""><0,001), 16="" dan="" 1.5-tahun="" dengan="" dct="" jaringan="" ginjal="" berusia="" 7-tahun="" (p=""><0,00001, masing-masing,="" gambar="" 4f).="" sinyal="" yang="" diamati="" dari="" ekspresi="" dvl-1="" melalui="" tahapan="" yang="" berbeda="" mengungkapkan="" bahwa="" persen="" dari="" tanggal="" 13="" (p="">< 0,01),="" 15,="" 16="">< 0.001,="" respectively)="" and="" 22nd="" (p="" <="" 0.0001)="" gw="" had="" higher="" expression="" of="" immunoreactive="" cells="" compared="" to="" the="" pct="" of="" 7-year-old="" children="" kidney="" tissue.="" dvl-1="" immune-expression="" in="" dct="" of="" the="" kidney="" from="" 13th="" and="" 15th="" gw="" was="" significantly="" higher="" than="" in="" the="" 38th="" gw="" tissue="" (p="" <="" 0.0001,="" respectively,="" figure="">

2.2.4. Hubungan Ekspresi -Tubulin dan Inversi ke DVL-1 Pada Jaringan Ginjal Berkembang dan Pascanatal

Ekspresi -Tubulin dan inversi dibandingkan dengan ekspresi DVL-1 selama tahap perkembangan dan pada jaringan ginjal pascakelahiran. -tubulin memiliki ekspresi yang lebih tinggi secara statistik di semua tahap yang diamati, dibandingkan dengan ekspresi DVL-1 (p < 0.001,="" gambar="" 3g).="" melalui="" semua="" tahapan="" yang="" diamati,="" inversi="" memiliki="" ekspresi="" yang="" lebih="" tinggi="" jika="" dibandingkan="" dengan="" dvl-1="" (p="">< 0,0001,="" gambar="" 4="">

2.2.5. Perbandingan Pewarnaan Imunohistokimia terhadap -Tubulin, versi dan DVL-1- dan Analisis Statistik Jaringan Ginjal yang Berubah Secara Patologis (MCDK, CNF, FSGS) -Tubulin Perbedaan pewarnaan -tubulin pada MCDK, FSGS dan CNF secara statistik signifikan dibandingkan untuk jaringan ginjal postnatal yang sehat sebagai kelompok kontrol (p < 0.0001,="" masing-masing).="" jaringan="" ginjal="" displastik="" memiliki="" ekspresi="" yang="" lebih="" tinggi="" secara="" signifikan="" dibandingkan="" dengan="" kelompok="" kontrol,="" sedangkan="" fsgs="" dan="" cnf="" menunjukkan="" ekspresi="" -tubulin="" yang="" secara="" signifikan="" lebih="" rendah="" jika="" dibandingkan="" dengan="" kontrol="" yang="" sehat="" (gambar="">

Inversi

Inversi diekspresikan dalam sitoplasma sel epitel yang tidak teratur dan tubulus MCDK (Gambar 5a). Dalam CNF, ekspresi inversi mencirikan g dan dct, sementara itu menunjukkan kurang intensif pada kista persen (Gambar 5b). Dalam FSGS, inversi diekspresikan secara kuat dalam g dan dct tetapi kurang intensif pada kista persen (Gambar 5c). Ekspresi spasial inversi menunjukkan tingkat pewarnaan yang lebih tinggi secara statistik signifikan pada jaringan ginjal yang sehat (Gambar 5g) bila dibandingkan dengan MCDK, FSGS dan CNF (p <0.0001,>

Gambar 5. Pewarnaan imunofluoresensi ganda pada inversi (hijau), DVL-1 (merah) dan DAPI (biru) pada jaringan ginjal patologis pada MCDK (a), CNF (b) dan FSGS (c): tubulus (t) , glomeruli (g), persen kista (c), tinggi sel epitel persen (*). Struktur dan ko-lokalisasi sel dari inversi dan DVL-1 (panah) ditampilkan di bagian gabungan dengan detail di sisipan perbesaran yang lebih tinggi. Pewarnaan kontrol negatif ditampilkan sebagai sisipan pada inversi dan DVL-1 (a). Pembesaran ×40, bilah skala 10{{20}} m. Hubungan -tubulin (d) dan inversi (e) terhadap ekspresi DVL-1 pada MCDK, FSGS dan CNF (ANOVA dua arah dilanjutkan dengan uji post hoc SIDAK). Perbedaan tinggi sel epitel (f) persen FSGS, CNF dan MCDK dibandingkan dengan kontrol sehat (ANOVA satu arah diikuti uji post hoc Tukey, n=50). Perbedaan persentase sel positif keseluruhan dari -tubulin, inversi dan DVL-1 di MCDK, CNF dan FSGS bila dibandingkan dengan kontrol yang sehat (g-i), ANOVA satu arah diikuti dengan uji post hoc Tukey). Data ditampilkan sebagai sarana ± SD. Perbedaan yang signifikan ditunjukkan oleh nilai p (* p < 0,05,="" **="" p="">< 0,01,="" ****="" p="">< 0,0001).="" dvl-1="" dvl-1="" sangat="" ringan="" diekspresikan="" hanya="" dalam="" tubulus="" mcdk="" yang="" tidak="" terorganisir,="" sedangkan="" pada="" cnf,="" ekspresinya="" mencirikan="" dct="" dan="" g="" (gambar="" 5a,b).="" dalam="" fsgs,="" dvl-1="" diamati="" sebagai="" reaktivitas="" ringan="" dalam="" g,="" dct="" dan="" pct="" (gambar="" 5c).="" jaringan="" ginjal="" sehat="" yang="" diwarnai="" dengan="" dvl-1="" menunjukkan="" tingkat="" pewarnaan="" yang="" lebih="" tinggi="" secara="" signifikan="" (gambar="" 5="" jam)="" dibandingkan="" dengan="" mcdk="" dan="" fsgs="" (p=""><0,0001, keduanya),="" sementara="" tidak="" ada="" perbedaan="" signifikan="" yang="" ditemukan="" untuk="">

2.2.6. Hubungan antara Ekspresi -Tubulin dan Inversi ke DVL-1 pada Jaringan Ginjal yang Berubah Secara Patologis (MCDK, CNF, FSGS)Dalam MCDK, FSGS dan CNF, -tubulin diwarnai secara signifikan lebih tinggi dari DVL-1 (p < 0.0001,="" masing-masing,="" gambar="" 5d).="" inversi="" diwarnai="" secara="" signifikan="" lebih="" tinggi="" bila="" dibandingkan="" dengan="" dvl-1="" di="" mdck="" (p=""><0,0001) dan="" di="" fsgs="" (p=""><0,01, gambar="">

2.2.7. Perbedaan Tinggi Sel Epitel Tubulus Kontortus Proksimal antara Kontrol Sehat dan Jaringan Ginjal yang Berubah Secara Patologis (MCDK, CNF, FSGS)Tinggi sel epitel persen (n {{0}} per kelompok) dibandingkan antara sel tubulus pada jaringan ginjal yang sehat dan jaringan ginjal yang berubah secara patologis (Gambar 5b,c,f). Rata-rata tinggi sel epitel pada HC adalah 12,91 m ± 1,847 m dan secara signifikan lebih tinggi bila dibandingkan dengan CNF dan FSGS (p < 0.0001,="" masing-masing).="" rata-rata="" tinggi="" sel="" pada="" persen="" cnf="" adalah="" 9,011="" m="" ±="" 1,453="" m,="" sedangkan="" pada="" fsgs="" adalah="" 8,114="" m="" ±="" 0,9248="" m.="" sel="" epitel="" pct="" mcdk="" tidak="" menunjukkan="" perubahan="" tinggi="" yang="" signifikan="" (12,17="" m="" ±="" 1,476="" m)="" jika="" dibandingkan="" dengan="">

2.2.8. Perbedaan Panjang Silia Primer Antara Kontrol Sehat dan Jaringan Ginjal yang Berubah Secara Patologis (MCDK, CNF, FSGS)

Panjang silia primer (n= 50 per kelompok) dibandingkan antara HC dan jaringan ginjal yang berubah secara patologis (Gambar 6c). Jaringan ginjal yang sehat dan MCDK diwarnai dengan -tubulin untuk memastikan spesifisitas pewarnaan -tubulin silia (Gambar 6a,b). Pada jaringan ginjal yang sehat, silia primer memiliki panjang 5.065 m ± 1.229 m, sedangkan pada MCDK, CNF dan FSGS secara signifikan lebih panjang (p<0.0005, respectively).="" primary="" cilium="" length="" in="" mcdk="" was="" 9.908="" µm="" ±="" 2.434="" µm,="" in="" cnf="" 13.65="" µm="" ±="" 3.218="" µm,="" while="" in="" fsgs="" was="" significantly="" longer,="" 18.29="" µm="" ±="" 4.717="" µm,="" when="" compared="" to="" hc=""><0.0001) and="" other="" pathological="" kidney="" tissues="" of="" mcdk=""><0.0001) and="" cnf=""><>

Diskusi

Tujuan dari penelitian kami adalah untuk menyelidiki ekspresi imunohistokimia dari a-tubulin, inversi dan DVL-1 pada janinginjaljaringan dan jaringan ginjal postnatal. Selanjutnya, kami ingin mengeksplorasi apakah ekspresi dan pola pewarnaan a-tubulin, inversi dan DVL-1 terganggu pada penyakit ginjal yang berbeda bila dibandingkan dengan kontrol yang sehat. Yaitu, terlepas dari minat yang luas dari para peneliti lain tentang peran a-tubulin, inversi dan DVL-1 selama perkembangan ginjal, sebagian besar penelitian sebelumnya telah menggunakan hewan atau model eksperimental in vitro. Sejauh yang kami ketahui, ini adalah studi pertama yang menunjukkan ekspresi dan lokalisasi a-tubulin bersama dengan inversi dan DVL-1 pada ginjal manusia janin dan pascakelahiran, dan yang telah mengeksplorasi ekspresi protein yang disebutkan di ginjal. penyakit, seperti MCDK, FSGS dan CNF. Kami juga menganalisis perubahan panjang dan penampilan silia dengan mikroskop cahaya dan elektron, karena penelitian kami sebelumnya telah menunjukkan bahwa gangguan silia mungkin terkait dengan cystogenesis di FSGF dan CNF [19].

Dalam jalur pensinyalan Wnt kanonik, pengikatan ligan Wnt ke reseptor merekrut Dvl [37]. Proses MET dan jalur polaritas sel planar selama tahap awal morfogenesis ginjal dikendalikan oleh pensinyalan Wnt. Dengan memediasi jalur Wnt, silia primer mengontrol proliferasi sel, diferensiasi dan morfogenesis jaringan [12] melalui pengorganisasian sitoskeleton sel dan orientasi sel serta pemanjangan struktur tubular [2,38]. Dalam penelitian kami, -tubulin, inversi dan DVL-1 semuanya ada dalam struktur ginjal, dan semuanya terlokalisasi tidak hanya selama perkembangan ginjal janin tetapi juga di jaringan ginjal dari 1.5- dan {{9 }}anak-anak berusia tahun. Temuan ini sesuai dengan aktivasi jalur pensinyalan Wnt yang terbukti sudah terjadi selama tubulogenesis [39]. Selain itu, hasil kami telah mengungkapkan bahwa ekspresi -tubulin dan inversi terkait secara timbal balik dengan DVL-1 dan bahwa mereka menunjukkan perbedaan yang signifikan secara statistik antara pola ekspresinya. Itu berkorelasi dengan model eksperimental, karena mutasi keluarga protein Dvl penuh pada tikus menghasilkan kurangnya proses gastrulasi, sementara mutasi yang tidak mencakup seluruh keluarga protein menunjukkan cacat pada penempatan silia nodal bersama dengan cacat organ [40] . Temuan sebelumnya menunjukkan bahwa inversi memiliki peran dalam migrasi sel di Xenopus pronephros. Karena segmen tersebut berkorelasi dengan lengkung Henle mamalia dan tubulus distal, ini dapat menunjukkan pentingnya inversi selama perkembangan ginjal pada manusia juga [41]. Sesuai dengan premis itu, penelitian sebelumnya mengungkapkan bahwa mutasi gen inversi dapat mengakibatkan nephronophthisis tipe 2, yang dimediasi oleh ekspresi DVL-1 abnormal [42]. Meskipun peran silia primer menjadi kontroversial dalam regulasi jalur pensinyalan Wnt, kami menemukan bahwa -tubulin berkolokasi dengan inversi dan DVL-1 dalam sampel ginjal yang dianalisis. Selanjutnya, penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa silia primer bersama dengan inversi mengatur degradasi Dvl dengan mempengaruhi jalur pensinyalan Wnt [43]. Pada penyakit ginjal manusia yang terkait dengan perkembangan kista, lokalisasi abnormal dan fungsi silia primer telah diamati [19]. Demikian pula, penelitian ini juga mengkonfirmasi perubahan morfologi pembentukan silia primer dalam kondisi patologis seperti CNF, FSGS dan MCDK. Temuan sebelumnya mengakui bahwa aktivasi berlebihan jalur Wnt kanonik setelah kerusakan ginjal menyebabkan perubahan struktural ireversibel jaringan ginjal [44]. Sebaliknya, silia primer diberi peran beralih dari jalur Wnt kanonik ke nonkanonik dalam membantuginjalmemperbaiki. Lebih lanjut, aktivasi berlebih dari jalur kanonik Wnt pada jaringan ginjal yang ditransplantasikan ditemukan memiliki nilai prediksi positif terhadap fibrosis ginjal [45]. Jika jalur Wnt kanonik berlaku dengan mengorbankan nonkanonik, ini mendukung teori fibrosis ginjal sebagai hasilnya. Temuan kami tentang penurunan -tubulin dan ekspresi inversi dalam CNF dan FSGS menyiratkan tidak aktifnya jalur Wnt nonkanonik, terutama karena kedua kondisi tersebut cenderung mengarah ke tahap akhirpenyakit ginjal.Yaitu, diyakini bahwa lokalisasi normal dan fungsi silia primer dapat menjadi faktor dalam mempertahankan jalur Wnt reguler dan, oleh karena itu, prasyarat untuk perkembangan normal. Sebaliknya, jika jalur Wnt ditingkatkan, dapat mengakibatkan proliferasi dan diferensiasi sel yang tidak teratur yang mengarah ke karsinogenesis [46]. Seperti yang dijelaskan sebelumnya, jalur Wnt kanonik wajib untuk inisiasi MET dan pembentukan nefron, sementara gangguannya dapat menyebabkanginjalhipoplasia [47]. Hasil kami mendukung gagasan ini dengan mengungkapkan ekspresi DVL terendah-1 dengan ekspresi -tubulin tertinggi di MCDK dibandingkan dengan kontrol yang sehat. Hasil ini mungkin menyiratkan aktivasi terendah dari jalur Wnt kanonik, yang bisa menjadi penyebab utama tidak adanya pembentukan nefron. Sebaliknya, ekspresi -tubulin tertinggi dengan ekspresi DVL -1 terendah mungkin menjelaskan temuan beberapa kista karena tidak ada pemanjangan dan polarisasi sel terorganisir yang dipandu oleh jalur Wnt nonkanonik. Studi sebelumnya juga menunjukkan bahwa inversi menghambat jalur pensinyalan Wnt kanonik dengan menargetkan Dvl untuk degradasi [26]. Langkah ini dalam interaksi mereka ditemukan diperlukan untuk menghambat pensinyalan Wnt kanonik dalam pemeliharaan pemanjangan dan pemosisian tubular normal. Mutasi inversi menghasilkan peningkatan regulasi pensinyalan Wnt kanonik, yang kemudian memicu proliferasi abnormal dalam sel tubular. Langkah ini telah terbukti penting dalam cystogenesis [42], sedangkan knockout inversi pada tikus menyebabkan penyakit ginjal polikistik [48]. Menurut teoriginjalcystogenesis, inversi dianggap sebagai "mycoprotein", karena lokalisasi ke silia primer diginjalsel tubulus. Dalam penelitian kami, silia primer hadir pada permukaan sel apikal sel tubular di semua tahap yang dianalisis, sementara selama tahap janin, ekspresi -tubulin lebih kuat daripada pada periode pascakelahiran.

CISTANCHE AKAN MENINGKATKAN NYERI GINJAL / GINJAL

Penelitian sebelumnya telah menunjukkan bahwa fungsi silia primer dapat dipengaruhi oleh disregulasi -tubulin selama perkembangan, yang dapat menyebabkan cystogenesis, perkembangan ginjal abnormal dan kemungkinan penyakit ginjal kronis pada masa kanak-kanak [31,49]. Ini sesuai dengan temuan kami tentang silia primer yang memendek dan dismorfik yang diamati pada MCDK atau dengan silia multipel dan sangat memanjang atau terkilir yang ditemukan dalam tubulus CNF dan FSGS yang melebar bila dibandingkan dengan kontrol yang sehat. Untuk mendukung fakta bahwa jalur pensinyalan Wnt kanonik dan nonkanonik, yang diatur oleh silia primer, dianggap wajib untuk perkembangan ginjal normal, kami menemukan pewarnaan inversi dan DVL-1 yang jauh lebih rendah pada MCDK bila dibandingkan dengan kontrol yang sehat [31,49]. Dinamika pola ekspresi yang berbeda dari -tubulin, inversi, dan DVL-1 di seluruh fase perkembangan ginjal yang berbeda dapat mengindikasikan peralihan antara jalur pensinyalan Wnt kanonik dan nonkanonik selama morfogenesis ginjal normal. Kami menyarankan bahwa pertukaran mereka menentukan transkripsi dalam jalur kanonik atau urutan migrasi dan polarisasi sel selama perkembangan ginjal dalam jalur pensinyalan nonkanonik. Keseimbangan dan ekspresi mereka di semua struktur ginjal yang diselidiki menyiratkan peran penting mereka dalam perkembangan ginjal normal. Selama perkembangan ginjal normal (dari 13 GW ke 38 GW), ekspresi keseluruhan -tubulin, inversi dan DVL-1 menurun karena jaringan ginjal memperoleh morfologi matang. Pada jaringan ginjal berusia 1.5- dan 7-tahun, -tubulin dan inversi menunjukkan sedikit peningkatan ekspresi yang mendukung fakta bahwa jalur Wnt nonkanonik tetap aktif setelah lahir. Sebaliknya, DVL-1 bertahan dengan pola ekspresi yang menurun yang mungkin menambah kesimpulan bahwa jalur Wnt kanonik dibungkam dalam jaringan ginjal yang sehat. Sebagai akibat dari kondisi patologis ginjal, sel epitel ginjal mungkin bereaksi dengan munculnya kembali EMT dan fibrosis [50] terkait dengan reaktivasi jalur Wnt kanonik [44]. Oleh karena itu, gangguan -tubulin, inversi, dan DVL-1 yang ditemukan pada ginjal yang sakit mungkin merupakan mekanisme patologis yang mendasari dan akibat peralihan dari jalur Wnt nonkanonik ke kanonik pada ginjal yang sedang berkembang yang mengacu pada peralihan antara ginjal yang reversibel ke ireversibel kerusakan. Selanjutnya, perubahan dalam prenatal dan postnatal merekaginjalPola ekspresi mungkin terkait dengan gangguan fungsi ginjal di masa dewasa, yang mengarah ke penyakit bawaan dan gagal ginjal kronis.

4. Bahan dan Metode

4.1. Sampel Manusia

Sampel jaringan ginjal janin dikumpulkan setelah keguguran pada tanggal 14, 15, 16, 22 dan 38 GW di Departemen Ginekologi dan Obstetri University Hospital Center Split. Semua materi janin yang diperoleh diperiksa oleh ahli patologi, dan hanya jaringan tanpa tanda-tanda kelainan, maserasi atau kematian intrauterin dan dengan kariogram normal yang digunakan untuk penelitian. Catatan medis ibu diperiksa sebelum pengumpulan sampel dan dalam kasus masalah kesehatan yang mungkin mempengaruhi hasil kehamilan, jaringan ginjal dikeluarkan dari penelitian. Kematangan ditentukan oleh lingkar kepala, lingkar perut dan panjang tulang paha [51] yang berkorelasi dengan kalender menstruasi pasien. Spesimen jaringan ginjal berusia 1.5- dan 7-tahun dikumpulkan setelah kematian yang tidak disengaja. Sampel diperoleh di Departemen Patologi University Hospital Center Split. Sampel jaringan ginjal displastik multikistik (MCDK) diperoleh setelah keguguran, glomerulosklerosis segmental fokal (FSGS) dan sindrom nefrotik tipe Finlandia (CNF) diperoleh karena nefrektomi. Semua bahan yang diperoleh diperiksa dan dievaluasi oleh ahli patologi, yang mengklasifikasikan diagnosis. Protokol penelitian telah disetujui oleh Komite Etik Fakultas Kedokteran Universitas Split (20 Mei 2016) sesuai dengan Deklarasi Helsinki dan pembaruannya (no. klasifikasi: 003-08/16-03/0001, no registrasi: 2181-198-03-04-16-0024, 20 Mei 2016) [52].

4.2. Imunohistokimia

Fiksasi sampel jaringan yang dikumpulkan diproses dengan 4 persen paraformaldehyde dalam phosphate-buffered saline (PBS) selama 24 jam pada 22 C. Setelah dehidrasi dalam etanol 100 persen, sampel dimasukkan ke dalam parafin, seperti yang dijelaskan sebelumnya [53]. Spesimen diiris menjadi bagian setebal 5 m menggunakan mikrotom dan kemudian dipasang pada slide mikroskop. Untuk memverifikasi pelestarian jaringan, setiap 10 bagian diwarnai dengan hematoxylin dan eosin [54]. Depart- feminisasi dan imunohistokimia dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya [2,55,56]. Setelah dibilas dalam PBS, slide mikroskop diinkubasi semalaman dengan antibodi primer dalam ruang lembab pada 22 C (sistem pewarnaan slide StainTray; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Antibodi primer yang digunakan adalah antibodi anti-alfa tubulin monoklonal kelinci (pengenceran 1:1000; ab179484, Abcam, Cambridge, UK), antibodi Anti-inversi poliklonal kelinci (pengenceran 1:100; ab65187, Abcam, Cambridge, UK), DVL monoklonal tikus -1 antibodi (pengenceran 1:150; sc-8025, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) dan antibodi tubulin anti-gamma poliklonal kelinci (untuk memverifikasi pewarnaan spesifik silia primer dengan alpha- tubulin, pengenceran 1:500; ab11321, Abcam, Cambridge, UK). Setelah dibilas dalam PBS, antibodi sekunder diberikan selama satu jam seperti yang tercantum: IgG H&L anti-kelinci keledai, Alexa Fluor 488 (pengenceran 1:400; ab150073, Abcam, Cambridge, UK) dan IgG H&L anti-tikus kambing, TRITC (pengenceran 1:400; ab6786, Abcam, Cambridge, UK) 4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) digunakan untuk pewarnaan inti dan setelah inkubasi 2-min, slide dicuci dalam PBS dan dilapisi dengan media pemasangan dan kaca penutup. Pewarnaan nonspesifik dicegah dengan menggunakan blok protein (ab64226; Abcam, Cambridge, UK) sebelum aplikasi antibodi primer. Sebagai kontrol negatif, uji pra-adsorpsi dilakukan, sedangkan spesifisitas antibodi sekunder diperiksa dengan menghilangkan antibodi primer dari prosedur pewarnaan.

4.3. Mikroskop elektron

Fiksasi dariginjaljaringan dilakukan dalam 4 persen paraformaldehida selama 24 jam, diikuti oleh pasca-fiksasi dalam 1 persen osmium tetroksida selama 1 jam. Proses dehidrasi dilakukan dengan ethanol series dan diakhiri dengan embedding pada resin LX 112 [22]. Bagian tipis satu mikrometer diwarnai menggunakan toluidine blue dan dipelajari untuk memilih bagian ultrathin. Bagian ultra tipis dengan ketebalan 0.05 mikrometer diperiksa setelah pewarnaan dengan uranil asetat dan timbal sitrat. Mikroskop JEOL 1200 EX digunakan untuk mendapatkan mikrofotografi.

4.4. Analisis Genetika

Seperti yang dijelaskan sebelumnya [19], menggunakan leukosit dari darah tepi, DNA genom diekstraksi. Sebuah mutasi missense homozigot pada gen NPHS1 ditemukan (c.1096A > C; p.Ser366Arg) yang mengkonfirmasi diagnosis sindrom nefrotik kongenital tipe Finlandia (CNF) [57].

CISTANCHE AKAN MENINGKATKAN INFEKSI GINJAL/GINJAL

4.5. Analisis data

Analisis bagian dilakukan pada mikroskop fluoresensi FL menggunakan 3 saluran fluoresensi FL (Olympus BX51, Tokyo, Jepang). Gambar diambil dengan kamera digital DP71 (Olympus, Tokyo, Jepang) pada perbesaran daya tinggi (×40). Hanyaginjalkorteks yang mengandung tubulus berbelit-belit proksimal (pct), tubulus berbelit-belit distal (dct) dan glomeruli (g) yang menarik. Gambar kemudian diproses oleh perangkat lunak ImageJ (Rasband, WS, ImageJ, US National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA, https://imagej.nih.gov/ij/ (diakses pada 15 Oktober 2018), 1997–2021. ) dan Adobe Photoshop (Adobe Inc., San Jose, California, USA) untuk evaluasi lebih lanjut. Sebelum penghitungan sel, alat ImageJ saluran terpisah digunakan. Setelah itu, foto mikroskopis imunofluoresensi asli dikurangi dengan saluran merah atau hijau (tergantung pada saluran aslinya) menggunakan alat kalkulator gambar ImageJ untuk mencegah kebocoran sinyal. Nilai di bawah ambang batas level 50 dianggap negatif. Kami menghitung sinyal imunoreaktif dalam sel dengan setidaknya 20 struktur (pct, dct, atau g) per tahap atau jumlah sel positif keseluruhan per foto mikro displastik multikistikginjaljaringan, FSGS dan CNF. Kami mengklasifikasikan sel sebagai positif jika sinyal imunofluoresensi terakumulasi pada setiap tingkat membran, sitoplasma, atau nukleus di atas nilai 50 yang diukur pada perangkat lunak ImageJ menggunakan perintah ambang batas. Sel negatif dikategorikan sebagai sel dengan tidak adanya imunoreaktivitas. Dua peneliti independen menganalisis data.

4.6. Analisis Semikuantitatif

Intensitas sinyal pewarnaan -tubulin, inversi dan DVL-1 dievaluasi oleh dua peneliti independen menggunakan perangkat lunak ImageJ. Intensitas sinyal keseluruhan diukur setelah gambar disetel dalam 8-tipe bit; setelah itu, intensitas pewarnaan marker dievaluasi dalam 20 pct, dct dan g dengan mengukur luas area struktur. Jika hasil antara evaluator berbeda, peneliti independen ketiga mengklarifikasi keraguan tersebut. Intensitas sinyal maksimum untuk -tubulin adalah 84.125 ± 3.214 SD, untuk inversi adalah 71.50 ± 2.715 SD dan untuk DVL-1 80.916 ± 1.875 SD. Saturasi warna sinyal tertinggi pada foto mikroskop ditandai sebagai 3 (66,66–99,99 persen dari keseluruhan intensitas gambar sinyal), diikuti oleh 2 (33,33–66,66 persen ) untuk intensitas sinyal menengah dan 1 (0,33 persen –33,33 persen ) untuk intensitas sinyal rendah (Tabel 1.).

4.7. Analisis statistik

Untuk penentuan perbedaan antara tahapan dan struktur, dilakukan uji Kruskal–Wallis, dilanjutkan dengan post hoc Dunn menggunakan software GraphPad Prism (Graphpad Software Inc., San Diego California, USA, www.graphpad.com (diakses pada 15 Oktober 2018.)). Jumlah sel positif dinyatakan dalam persentase sebagai nilai rata-rata ± standar deviasi (SD), sedangkan signifikansi statistik diakui pada p <0,05. jumlah="" struktur="" yang="" dianalisis="" adalah="" 4.200="" dalam="" 35="" sampel,="" dengan="" jumlah="" keseluruhan="" 135.256="" sel="" yang="" dihitung.="" kami="" menggunakan="" 2-anova="" cara="" dengan="" uji="" post="" hoc="" sidak="" untuk="" menguji="" perbedaan="" ekspresi="" -tubulin,="" inversi="" dan="" dvl-1="" dalam="" tahap="" perkembangan="" yang="" berbeda.="" untuk="" mempelajari="" ekspresi="" protein="" mengenai="" waktu="" perkembangan,="" kami="" menggunakan="" regresi="" linier.="" anova="" satu="" arah="" yang="" dilanjutkan="" dengan="" uji="" post="" hoc="" tukey="" digunakan="" untuk="" mengeksplorasi="" perbedaan="" ekspresi="" -tubulin,="" inversi="" dan="" dvl-1="" pada="" orang="">ginjaljaringan dibandingkan dengan jaringan MCDK, FSGS dan CNF. Perbedaan ekspresi protein antara MCDK, FSGS dan CNF diselidiki dengan 2-way ANOVA diikuti dengan uji post hoc Sidak. ANOVA satu arah diikuti dengan uji post hoc Tukey digunakan untuk mengevaluasi perbedaan panjang silia dan tinggi sel epitel persen antara kontrol sehat dan patologis.ginjaltisu. Data ditampilkan sebagai nilai rata-rata ± standar deviasi (SD) dengan perbedaan statistik diakui pada p <>