Bagaimana Cistanche echinacosida meningkatkan androgen melalui sel endotel?

Kontak: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:{0}}

Abstrak.

Echincoside (ECH) adalah senyawa alami dengan efek vasodilatasi yang bergantung pada endotelium. Nitric oxide (NO) adalah vasorelaksan penting yang dilepaskan dari sel endotel. Untuk menguji mekanisme molekuler produksi NO yang diinduksi ECH dalam sel endotel, penelitian ini menyelidiki keterlibatan reseptor androgen (AR) dan jalur fosfatidilinositol 3-kinase (PI3K)/protein kinase B (Akt) di fosforilasi endotel nitric oxide synthase (eNOS) dalam sel endotel vena umbilikalis manusia (HUVECs). Menggunakan probe fluoresen DAF‑FM, produksi NO ditemukan meningkat secara signifikan, dan eNOS difosforilasi pada Ser1177 dengan cara yang bergantung pada konsentrasi di bawah 0.01-10 M ECH pengobatan di HUVECs. Selain itu, produksi NO dan fosforilasi eNOS yang diinduksi oleh ECH berkurang ketika diberi perlakuan awal dengan antagonis AR nilutamide, atau ketika ditransfeksi dengan RNA pengganggu kecil AR. Selanjutnya, fosforilasi Akt yang diinduksi ECH di Ser473 dibatalkan oleh 5 M wortmannin (inhibitor PI3K). Data ini menunjukkan bahwa ECH merangsang produksi NO melalui aktivasi eNOS yang bergantung pada AR di HUVECs dan bahwa jalur PI3K/Akt mungkin terlibat dalam fosforilasi eNOS yang diinduksi oleh ECH.

Cistanche deserticola memiliki banyak efek, klik di sini untuk tahu lebih banyak

pengantar

Cistanche Hoffman. Et Link adalah ramuan parasit abadi dari genus keluarga Orobanchaceae. jamuBenteng, batang dariCistanche deserticolaYC MA danCistanche tubulosa(Schenk). Cistanche adalah ramuan tonik yang telah digunakan untuk mengobatikekurangan ginjal, impotensi, leukorea morbid, dan konstipasi pikun (1), yang mungkin disebabkan oleh efek regulasi hormon seperti androgen atau seks (2). Echinacoside (ECH; C35H46O20; berat molekul, 786,73; Gambar 1), adalah salah satu glikosida fenilethanoid (PhGs) yang diisolasi dari batang HerbaBentengdan menunjukkan beberapa sifat biologis, termasuk antioksidan, antipenuaan, antiinflamasi, hepatoprotektif, dan efek neuroprotektif (3). Penyelidikan farmakologi modern telah menunjukkan bahwa berbagai konstituen HerbalBenteng, termasuk ECH,akteosida, kankanosa, sisi F, dancistanosidaF, menunjukkan aktivitas vasorelaksan (4).

Endotelium adalah pengatur penting dari pembuluh darah, dan oksida nitrat (NO) adalah faktor relaksasi penting yang dilepaskan olehsel endotel.Dengan berdifusi ke dalam sel otot polos, NO mengaktifkan guanylate cyclase, meningkatkan kadar cyclic guanosine monophosphate (cGMP), dan kemudian mengaktifkan cGMP-dependent protein kinases (PKGs) untuk mendorong relaksasi otot polos (5). Sebelumnya telah ditunjukkan bahwa ECH pada 350-400 M secara langsung bekerja pada otot polos pembuluh darah dan menghambat proliferasi yang diinduksi hipoksia pada sel otot polos arteri pulmonalis tikus (6), sedangkan 30-300 M ECH menyebabkan vasorelaksasi akut pada endotelium. cincin utuh dengan cara yang bergantung pada konsentrasi, dan peningkatan produksi cGMP di otot polos korpus kavernosum cincin aorta yang dikontrak oleh fenilefrin (7). Dengan membuka saluran NO-cGMP-PKG-BKCa dalam sel otot polos, 100 atau 300 M ECH menekan kontraksi yang diinduksi noradrenalin di arteri pulmonalis tikus, terutama pada cincin yang tidak dilapisi endotel (8).Sel endoteladalah pengatur utama fungsi kardiovaskular dan, dalam beberapa kasus, telah ditemukan bahwa relaksasi yang bergantung pada endotel disebabkan oleh zat yang dapat ditransfer, seperti NO, yang dilepaskan dari endotel (9). Namun, mekanisme molekuler hulu produksi NO yang diinduksi ECH di vaskularsel endotelmembutuhkan penyelidikan lebih lanjut. Dalam endotel vaskular, pembentukan NO terutama dimediasi oleh NO sintase endotel (eNOS). Beberapa kelompok telah menunjukkan bahwa jalur phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) mengaktifkan serin-treonin protein kinase B (Akt), yang menyebabkan fosforilasi eNOS langsung pada serin 1177 (Ser1177) (10). Reseptor androgen (AR) adalah anggota subfamili reseptor nuklir s3, yang secara kanonik memodifikasi ekspresi gen. Lokalisasi AR ke caveolae dalam membran sel terlibat dalam regulasi non-genomik fungsi sel endotel atau ekspresi gen dengan memicu kaskade c-Src/PI3K/Akt, yang pada akhirnya menghasilkan fosforilasi eNOS dan produksi NO (11). Dalam aorta manusiasel endotel, testosteron telah dilaporkan mengaktifkan pensinyalan PI3K/Akt dan secara cepat menginduksi produksi NO karena interaksi langsung AR dan subunit p85 dari PI3K pada sistem kardiovaskular (12). Dilaporkan bahwa ECH memperburuk gejala yang berhubungan dengan defisiensi hormon dan memberikan efek seperti androgennya karena pengikatan kompetitif pada AR alih-alih testosteron (2). Oleh karena itu, penelitian ini berhipotesis bahwa jalur PI3K / Akt mungkin terlibat dalam produksi NO melalui fosforilasi eNOS yang bergantung pada AR yang diinduksi oleh ECH. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengevaluasi efek berikut dari ECH: i) Induksi produksi NO dan fosforilasi eNOS; ii) keterlibatan AR dalam fosforilasi eNOS, dan iii) aktivasi jalur PI3K/Akt dalam sel endotel vena umbilikalis manusia (HUVECs), model eksperimental terkenal untuk mempelajari regulasi fungsi sel endotel dan angiogenesis (13).

Bahan dan metode

Bahan kimia dan reagen. ECH (kemurnian, 92,5 persen) diperoleh dari Standar Referensi Obat Nasional di Institut Nasional untuk Pengawasan Obat dan Makanan. Antibodi terhadap p-Akt (Ser473; cat. no. ab8805), Akt (cat. no. ab81283), p-eNOS (Ser1177; cat. no. ab184154), dan eNOS (cat. no. ab76198) dibeli dari Abcam . Inhibitor nilutamide dan ICI 182780 diperoleh dari Sigma-Aldrich; Merck KGaA. L-NAME dibeli dari Adamas-Beta, Ltd., dan wortmannin dibeli dari Pribolab.

Kultur sel dan terapi obat.

HUVECs diperoleh dari ScienCell Research Laboratories Inc. dan dikultur disel endotelmedium (ECM; ScienCell Research Laboratories) dengan 5 persen (v/v) serum janin sapi (FBS; Gibco, Thermo Fisher Scientific, Inc.) dan 1 persen suplemen pertumbuhan sel endotel (ECGS) pada 37˚C (5 persen CO2 dan 95 persen kelembaban) (14). Setelah mencapai pertemuan, sel-sel dicerna dengan tripsin dan dilapisi dalam ECM dengan 1 persen FBS dan 1 persen EKGS. Untuk semua percobaan, HUVEC dilapisi pada konsentrasi 1x104/ml dan ditumbuhkan hingga mencapai pertemuan. Sebelum pengobatan dengan ECH atau stimulator lainnya, sel-sel diinkubasi dalam ECM bebas fenol merah tanpa FBS dan EKG selama 6 jam untuk menginduksi penghentian pertumbuhan. Dalam percobaan penghambatan, HUVEC diinkubasi sebelumnya dengan berbagai antagonis atau penghambat, termasuk 10 M nilutamide, 10 M ICI 182780, 0,5 mM L-NAME atau 5 M wortmannin, selama 30 menit, dengan atau tanpa ECH, pada 37˚C. Pada semua kelompok, termasuk kontrol, DMSO digunakan sebagai pelarut dengan konsentrasi yang sama yaitu 0,001 persen .

Pengukuran produksi NO intraseluler.

Perubahan relatif dalam konsentrasi NO sitosol dalam HUVECs dipantau menggunakan probe NO fluoresen DAF‑FM (Cayman Chemical Company), seperti yang dilaporkan sebelumnya (12). Secara singkat, sel-sel dimuat dengan 5 M DAF‑FM diasetat selama 20 menit pada 37˚C dalam pelat mikrotiter hitam dan dibilas beberapa kali dengan PBS (pH 7,4). Fluoresensi ditentukan pada panjang gelombang eksitasi dan emisi masing-masing 495 dan 515 nm, menggunakan pembaca pelat mikro fluoresen (Biotek Synergy H4; BioTek Instruments, Inc.) dan mikroskop terbalik kompak (Nikon Eclipse Ts2R; Nikon Corporation).

analisis noda barat.

Seperti yang dilaporkan sebelumnya (15), lapisan sel tunggal yang konfluen dicuci dua kali dalam PBS sedingin es dan dilisiskan dengan buffer RIPA (P0013D; Beyotime Institute of Biotechnology). Konsentrasi protein dalam supernatan diukur dengan menggunakan metode uji asam bicinchoninic (16). Selanjutnya, 30 g protein dimuat per jalur, dipisahkan menggunakan 10 persen gel poliakrilamida, dan dipindahkan ke membran polivinilidena difluorida. Membran diblokir dengan 5 persen susu skim selama 1 jam pada 25˚C. Setelah inkubasi dengan antibodi monoklonal terhadap pengenceran Akt (1:1,000), p-Akt (pengenceran 1:500), pengenceran eNOS (1:2,000), atau p-eNOS (1 :1,000 pengenceran) pada 4˚C semalaman, membran dicuci dengan TBST (mengandung 0,1 persen Tween-20) 4 kali selama ~15 menit per pencucian pada 25˚C. Selanjutnya, membran diinkubasi dengan antibodi sekunder terkonjugasi lobak peroksidase (pengenceran 1:5,000; antibodi anti-tikus, cat.no. A0216, atau antibodi anti-kelinci, cat.no. A0208, Beyotime Institute Bioteknologi) selama 1 jam pada 25˚C, dan dideteksi menggunakan kit chemiluminescence yang disempurnakan (cat. no. 32209, Thermo Fisher Scientific, Inc.). Intensitas pita diukur menggunakan perangkat lunak analisis gel Image J, versi 1.8.0_112 (National Institutes of Health).

Preparasi dan transfeksi RNA yang mengganggu kecil.

RNA untai ganda panjang disintesis oleh mRNA target AR dan reseptor estrogen (ER) dengan urutan yang ditunjukkan pada Tabel I. Kondisi knockdown siRNA melibatkan transfeksi HUVEC pada pertemuan 70 persen yang dipertahankan dalam non-antimikroba media kultur dalam cawan kultur berlapis kolagen 60 mm. Transfeksi 5 nM AR-siRNA atau 10 nM ER -siRNA dengan reagen Lipofectamine 3000 (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) dilakukan secara terpisah, sesuai dengan protokol pabrikan. Efisiensi transfeksi dievaluasi dengan analisis reverse transcription kuantitatif-PCR (RT-qPCR), seperti yang dilaporkan sebelumnya (17). Kondisi thermocycling adalah sebagai berikut: 10 menit pada 95˚C; 40 siklus 95˚C selama 5 detik dan 60˚C selama 1 menit, dan kurva leleh pada 95˚C selama 15 detik, 60˚C selama 1 menit dan 95˚C selama 15 detik; tiga ulangan biologis independen dilakukan untuk setiap sampel. Eksperimen selanjutnya dilakukan 48 jam setelah transfeksi. Pasangan primer dirancang menggunakan software Primer Premier v5.0 (PREMIER Biosoft) dengan urutan sebagai berikut: AR forward, 5'-GGTTACACCAAAGGGCTAGAA-3' dan reverse, 5'-GACTTGTAGAGAGAGACAGGGTAGA-3'; ER maju, 5'‑CCAGTACCAATGACAAGGGAAG-3' dan mundur, 5'-TCACAGGACCAGACTCCATAA-3'; dan GAPDH maju, 5'‑CAGGGCTGCTTTTAACTCTGGTAA-3' dan mundur, 5'-GGGTGGAATCATATTGGAACATGT-3

Analisis statistik.

Semua data disajikan sebagai mean ± standar deviasi. Perbandingan statistik antar kelompok dilakukan dengan menggunakan uji Kruskal-Wallis atau ANOVA dua arah dengan uji post hoc Tukey untuk beberapa perbandingan. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Hasil

ECH menginduksi produksi NO dan fosforilasi eNOS.

Seperti ditunjukkan pada Gambar. 2A dan B, 1 M ECH secara signifikan meningkatkan produksi NO intraseluler di HUVECs dibandingkan dengan sel kontrol negatif, sedangkan efek stimulasi ECH dilemahkan ke tingkat kontrol dengan perlakuan awal dengan L-NAME. Untuk mendapatkan konsentrasi optimal, fosforilasi eNOS diuji pada 60 menit setelah perlakuan dengan ECH pada konsentrasi 0, 0.01, 0. 1, 1, dan 10 M. Hasil mengungkapkan bahwa ECH pada konsentrasi 0,01-10 M dapat secara signifikan menginduksi fosforilasi eNOS pada Ser 1177 dengan cara yang bergantung pada konsentrasi, dengan fosforilasi eNOS maksimal yang diamati pada induksi 10 M ECH (Gbr. 2C dan D). Selanjutnya, fosforilasi eNOS pada Ser1177 diperiksa dengan analisis western blot pada 0, 5, 15, 30, 60, dan 120 menit setelah inkubasi dengan 1 M ECH. Diamati bahwa fosforilasi eNOS dengan cepat dipicu oleh ECH pada 5 menit, dan terus meningkat hingga 30 menit inkubasi (Gbr. 2E dan F). Selanjutnya, meskipun pengobatan ECH, besarnya relatif fosforilasi eNOS tetap stabil dari 30 menit dan seterusnya; oleh karena itu, ECH tidak mempengaruhi ekspresi eNOS total (Gbr. 2C dan E).

AR memediasi produksi NO yang diinduksi ECH dan fosforilasi eNOS.

Uji RT-qPCR menunjukkan bahwa efek interferensi AR-siRNA-1 dan ER -siRNA-2 adalah yang paling berhasil dalam menghambat ekspresi AR dan ER di HUVECs dalam penelitian ini (Gbr. 3 ). Selanjutnya, antagonis untuk analisis penghambatan fungsi AR dan siRNA untuk analisis hilangnya fungsi AR diterapkan untuk mengevaluasi keterlibatan AR dalam aktivasi eNOS yang diinduksi ECH dan produksi NO. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 4A, 1 M ECH secara signifikan meningkatkan produksi NO di HUVECs (P<0.05). pretreatment="" with="" the="" ar="" antagonist="" nilutamide="" (10="" µm)="" abolished="" ech-induced="" no="" production,="" whereas="" ici182789="" (an="" er="" antagonist)="" did="" not="" exert="" the="" same="" effects.="" furthermore,="" the="" effects="" of="" sirna-mediated="" ar="" knockdown="" on="" no="" production="" were="" examined="" in="" cultured="" cells,="" indicating="" that="" no="" production="" was="" diminished="" by="" transfection="" with="" ar="" sirnas;="" however,="" it="" was="" not="" affected="" by="" er="" sirnas="" or="" control="" random="" sirnas="" (fig.="" 4b).="" representative="" western="" blots="" and="" semi-quantitative="" analysis="" (fig.="" 4c="" and="" d)="" revealed="" that="" the="" phosphorylation="" of="" enos="" induced="" by="" ech="" was="" inhibited="" by="" nilutamide="" and="" ici182789="" and="" that="" the="" inhibitory="" effect="" of="" nilutamide="" on="" ech-induced="" enos="" activation="" was="" significantly="" higher="" compared="" with="" that="" of="" ici182789,="" which="" indicated="" that="" inhibition="" of="" ar="" function="" had="" a="" greater="" impact="" than="" er="" on="" enos="" phosphorylation="" induced="" by="" ech.="" similarly,="" the="" phosphorylation="" of="" enos="" induced="" by="" ech="" was="" reduced="" significantly="" in="" cells="" transfected="" with="" ar-sirna="" and="" er-sirna="" compared="" with="" the="" control="" random="" sirna;="" the="" inhibitory="" effect="" of="" ar‑sirna="" on="" ech‑induced="" enos="" activation="" was="" significantly="" stronger="" compared="" with="" that="" of="" er-sirna="" (fig.="" 4e="" and="" f).="" therefore,="" the="" aforementioned="" results="" suggested="" that="" ech="" may="" cause="" ar-dependent="" activation="" of="" enos="" to="" induce="" no="" production="" in="">

ECH mengaktifkan jalur PI3K/Akt.

Dalam penelitian ini, fosforilasi Akt pada Ser473 diuji 60 menit setelah inkubasi ECH pada konsentrasi 0, 0.01, 0.1 , 1, dan 10 M. Hasilnya menunjukkan bahwa ECH (0.01-10 M) dapat secara signifikan menginduksi fosforilasi Akt. Tingkat ekspresi relatif p-Akt memuncak pada 1 dan 10 M pengobatan ECH (Gbr. 5A dan B). Selanjutnya, fosforilasi Akt diperiksa dengan analisis western blot pada 0, 5, 15, 30, 60, dan 120 menit setelah penambahan 1 M ECH ke kultur HUVEC. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 5C dan D, ECH dengan cepat meningkatkan fosforilasi Akt setelah 5 menit inkubasi, dan tingkat protein maksimum p-Akt diamati pada 60 menit. Sebaliknya, ECH tidak mempengaruhi ekspresi Akt total (Gbr. 5A dan C). Selain itu, untuk menyelidiki efek potensial dari jalur PI3K pada fosforilasi eNOS, HUVECs telah diperlakukan sebelumnya dengan inhibitor PI3K wortmannin sebelum aplikasi ECH. Wortmannin ditemukan mengurangi produksi NO yang diinduksi ECH ke tingkat dasar (Gbr. 5E). Fenomena serupa diamati menggunakan mikroskop fluoresensi saat memeriksa fluoresensi DAF‑FM yang diinduksi ECH (Gbr. 5F). Lebih lanjut, wortmannin mungkin memiliki kemampuan untuk menghilangkan fosforilasi eNOS yang cepat pada HUVECs (Gbr. 5G dan H). Hasil yang disebutkan di atas menunjukkan bahwa ECH dapat mengaktifkan fosforilasi eNOS dan produksi NO melalui jalur PI3K/Akt.

Diskusi

ECH adalah senyawa alami yang diisolasi dari HerbaBenteng, dengan berbagai sifat farmakologis. Sebelumnya telah ditunjukkan bahwa ECH memberikan efek relaksasi vaskular yang bergantung pada endotelium dengan membuka saluran NO-cGMP-PKG-BKCa dalam sel otot polos pembuluh darah (7,8). Temuan saat ini memberikan bukti bahwa ECH mengerahkan aktivasi eNOS yang bergantung pada AR untuk menginduksi produksi NO dengan keterlibatan jalur pensinyalan PI3K / Akt di pembuluh darah.sel endotel.

Sebagai lapisan terdalam dari dinding pembuluh darah, endotelium dapat dengan cepat merasakan dan merespon perubahan aliran darah, yang pada gilirannya menghasilkan transmisi sinyal ke sel-sel otot polos di bawahnya untuk mengatur tonus pembuluh darah (18). Telah dilaporkan secara luas bahwa ada beberapa senyawa vasodilatasi yang diturunkan dari endotel, dengan zat yang paling prototipikal.

menjadi NO, terbentuk dari isoform endotel eNOS, yang menghasilkan fosforilasi (19). Dalam kondisi normal, eNOS tetap tidak aktif ketika terikat ke caveolin, dan diaktifkan dengan rangkaian peristiwa berikut di:sel endotel: i) eNOS terdisosiasi dari caveolin-1 dan berasosiasi dengan Ca2 plus /CaM; ii) protein kejut panas (HSP)90 mempromosikan eNOS.

Selanjutnya, semakin banyak penelitian telah menunjukkan bahwa AR diekspresikan dalamsel endoteldi sejumlah jaringan manusia, yang menunjukkan peran potensial untuk androgen dan analognya, yang bertindak melalui proses yang dimediasi AR, dalam modulasi homeostasis sel endotel manusia (21). Dalam jalur PI3K/Akt non-klasik, AR dapat mengaktifkan PI3K dengan berinteraksi langsung dengan subunit pengatur PI3K p85 (22). Penelitian ini menunjukkan bahwa antagonis AR atau AR siRNA mengurangi produksi NO dan fosforilasi eNOS yang diinduksi oleh ECH dalam HUVECs. Telah dilaporkan sebelumnya bahwa estrogen menginduksi fosforilasi eNOS dan merangsang produksi NO melalui aktivasi ER klasik dalam sel endotel (23), dan pemberian ECH secara signifikan meningkatkan ekspresi ER dalam rahim (24). Namun, dalam penelitian ini, efek AR lebih menonjol dibandingkan dengan ER pada aktivasi eNOS yang diinduksi ECH dan produksi NO. Selain itu, diamati bahwa ECH menyebabkan produksi NO akut dalam beberapa menit melalui aktivasi eNOS yang melibatkan AR di HUVECs, yang konsisten dengan sifat non-genomik dari respons dalam sel endotel. AR dikaitkan dengan protein perancah, termasuk HSP90, HSP70, dan kinase Src, di sitoplasma, dan dapat diangkut ke membran dari kompleks AR dalam waktu 5 menit pengobatan testosteron (23). Berdasarkan strategi 'target fishing', HSP90 diidentifikasi sebagai target PhGs-coupled, yang menunjukkan bahwa ECH dapat memfasilitasi disosiasi AR dari protein scaffolding (25). Studi lain menunjukkan bahwa, di hipotalamus, ECH dapat bergabung dengan saku AR pada asam amino Met-894 dan Val-713 dan menghambat pengangkutan AR sitoplasma ke nukleus (26). Namun, mekanisme yang mendasari di mana ECH memediasi translokasi AR sitoplasma ke membran memerlukan penyelidikan lebih lanjut. Oleh karena itu, penelitian lebih lanjut diperlukan untuk menjelaskan mekanisme di mana ECH mencapai aktivasi eNOS yang bergantung pada AR dan bagaimana hal itu dapat dikaitkan dengan pengikatan ke HSP90 dalam sel endotel vaskular.

Jalur PI3K/Akt adalah salah satu kaskade pensinyalan yang paling penting, aktivasinya diinduksi dengan memproduksi fosfatidilinositol-3,4,5-trisfosfat untuk mengikat domain homologi pleckstrin terminal-N dari Ser/ Thr kinase Akt. Ini memfasilitasi perekrutan Akt ke membran plasma (27). Jalur PI3K/Akt mungkin memainkan peran penting dalam kontrol relaksasi yang bergantung pada NO yang diinduksi oleh ECH. Penelitian ini mengungkapkan bahwa produksi NO yang diinduksi ECH berkurang secara signifikan ketika sel diinkubasi dengan inhibitor PI3K wortmannin. Laporan sebelumnya menunjukkan bahwa 15 mg/kg ECH mengaktifkan jalur pensinyalan PI3K/Akt dalam sel sumsum tulang yang ditekan 5‑fluorouracil (28). Dalam penelitian ini, inhibitor PI3K secara signifikan menurunkan fosforilasi eNOS yang diinduksi ECH di Ser1177. Selain itu, aktivitas Akt sebagian besar diatur oleh jalur regulasi hulu, terutama fosforilasi yang bergantung pada PI3K di Ser473 (20). Dalam penelitian ini, ECH menginduksi fosforilasi Akt pada Ser473 dengan cara yang bergantung pada dosis; serupa, penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa 5, 10, atau 20 M ECH memberikan efek kardioprotektif terhadap pengobatan anoksia/reperfusi dengan cara yang bergantung pada dosis dengan berpotensi meningkatkan regulasi p-Akt dan SLC8A3 (29). Regulasi transkripsi gen Akt sebagian besar masih belum diketahui (30); oleh karena itu, penelitian ini berfokus pada efek regulasi pasca-transkripsi ECH pada Akt. Mempertimbangkan temuan yang disebutkan di atas, disimpulkan bahwa penerapan ECH ke HUVEC dapat mengarah pada aktivasi jalur PI3K / Akt, yang memfosforilasi eNOS dan, selanjutnya, meningkatkan produksi NO.

Kesimpulannya, ECH adalah produk alami yang terutama diisolasi dariHerbal Cistanche. Mekanisme potensial yang mendasari produksi NO yang diinduksi ECH dalamsel endotelmungkin termasuk yang berikut (Gbr. 6): i) ECH bertindak sebagai ligan fungsional AR yang terlokalisasi pada caveolae di membran sel; ii) PI3K mengikat domain hidrofobik Akt di Ser473 dan memfasilitasi perekrutan Akt ke membran sel; iii) perekrutan kaskade PI3K/Akt memicu fosforilasi eNOS yang bergantung pada AR, dan iv) pembentukan NO dimediasi oleh eNOS disel endotel. Pengamatan bahwa ECH menginduksi produksi NO melalui fosforilasi eNOS yang bergantung pada AR dengan keterlibatan jalur PI3K/Akt dapat berkontribusi untuk pemahaman lebih lanjut tentang efek vasorelaksan dari ECH. Lebih lanjut, ECH yang menargetkan jalur NO yang diturunkan dari endotel mungkin disebabkan oleh efek non-genomik. Oleh karena itu, penelitian ini dapat membantu menjelaskan mekanisme di mana ECH memberikan efek farmakologisnya untuk mencegah penyakit kardiovaskular.

Pengarang:

LI GU, DANHONG LIAN, YIMEI ZHENG, WEI ZHOU, JINLEI GU dan XIN LIU

Pusat Penelitian Teknik Pangan dan Kesehatan Kementerian Pendidikan Negara, Sekolah Ilmu Hayati,

Universitas Sun Yat-sen, Guangzhou, Guangdong 510275, PR China

Diterima 1 Mei 2019; Diterima 10 Desember 2019

Referensi

1. komisi Farmakope cina:Benteng jamu. Dalam: Farmakope Republik Rakyat Cina 1. dagu. Med. Sci. Pers, Beijing, hlm 135, 2015.

2. Jiang Z, Wang J, Li X, dan Zhang X:echinacosidadanCistanche tubulosa(Schenk) R. wight memperbaiki kerusakan testis dan sperma yang diinduksi bisphenol A pada tikus melalui enzim steroidogenik yang diatur sumbu gonad. J Ethnopharmacol 193: 321-328, 2016.

3. Liu J, Yang L, Dong Y, Zhang B, dan Ma X:echinacosida, produk alami yang tak ternilai dalam pengobatan gangguan neurologis dan lainnya. Molekul 23: piiE1213, 2018.

4. Yoshikawa M, Matsuda H, Morikawa T, Xie H, Nakamura S dan Muraoka O: Phenyletanoid aminoglikosida dan oligosugar terasilasi dengan aktivitas vasorelaksan dariCistanche tubulosa. Bioorg Med kimia 14: 7468-7475, 2006.

5. Arnold WP, ​​Mittal CK, Katsuki S dan Murad F: Nitric oxide mengaktifkan guanylate cyclase dan meningkatkan kadar guanosin 3':5'-siklik monofosfat dalam berbagai sediaan jaringan. Proc Natl Acad Sci USA 74: 3203-3207, 1977.

6. Gai XY, Tang F, Ma J, Zeng KW, Wang SL, Wang YP, Gelatik TN, Lu dX, Zhou Y dan Ge RL: Efek antiproliferatif dariechinacosidapada sel otot polos arteri pulmonalis tikus di bawah hipoksia. J Pharmacol Sci 126: 155-163, 2014.

7. He WJ, Fang TH, Ma X, Zhang K, Ma ZZ, dan Tu PF:echinacosidamemunculkan relaksasi yang bergantung pada endotelium pada cincin aorta tikus melalui jalur NO-cGMP. Planta Med 75: 1400-1404, 2009.

8. Gai XY, Wei YH, Zhang W, Gelatik TN, Wang YP, Li ZQ, Liu S, Ma L, Lu dX, Zhou Y dan Ge RL:echinacosidamenginduksi vasorelaksasi arteri pulmonalis tikus dengan membuka saluran NO-cGMP-PKG-BKca dan mengurangi ca intraseluler^{2 ditambah}tingkat. Acta Pharmacol Sin 36: 587-596, 2015.

9. Maruhashi T, Kihara Y, dan Higashi Y: Penilaian vasodilatasi endotelium-independen: Dari metodologi untuk perspektif klinis. J Hipertensi 36: 1460-1467, 2018.

10. Ahmad KA, Ze H, Chen J, Khan FU, Chen X, Xu J, dan ding T: Efek perlindungan dari turunan elemen sintetis baru pada vena umbilikalis manusiasel endotelterhadap cedera akibat stres oksidatif: Keterlibatan jalur pensinyalan antioksidan dan PI3k/Akt/eNOS/NO. Farmakoter Biomed 106: 1734-1741, 2018.

11 . Biochem Bioph Res Commun 424: 538-543, 2012.

12. Yu J, Akishita M, Eto M, Ogawa S, Son B, Kato S, Ouchi Y dan Okabe T: Aktivasi yang bergantung pada reseptor androgen dari sintase oksida nitrat endotel di pembuluh darahsel endotel: Peran jalur phosphatidylinositol 3-kinase/Akt. Endokrinologi 151: 1822-1828, 2010.

13. Pittarella P, Squarzanti dF, Molinari c, Invernizzi M, Uberti F dan Reno F: proliferasi dan migrasi yang bergantung pada NO yang diinduksi oleh vitamin d di HUVEc. J Steroid Biochem 149: 35-42, 2015.

14. He Y, Luan Z, Fu X, dan Xu X: Ekspresi berlebih dari uncoupling protein 2 menghambat apoptosis yang diinduksi glukosa tinggi dari vena umbilikalis manusiasel endotel. Int J Mol Med 37: 631-638, 2016.

15. Xiao-Hong d, chang-Qin X, Jian-Hua H, Wen-Jiang Z dan Bing S: Icariin menunda akibat homosisteinsel endotelpenuaan yang melibatkan aktivasi jalur pensinyalan PI3K / AKT-eNOS. Pharm Biol 51: 433-440, 2013.

16. Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT, Mallia AK, Gartner FH, Provenzano Md, Fujimoto EK, Goeke NM, Olson BJ, dan Klenk dc: Pengukuran protein menggunakan asam bicinchoninic. Biokimia Anal 150: 76-85, 1985.

17. Gu L, Zhong X, Lian d, Zheng Y, Wang H, dan Liu X: Biosintesis triterpenoid dan respons transkripsi yang ditimbulkan oleh oksida nitrat dalam fermentasi terendam Ganoderma lucidum.Proses Biochem 60: 19-26, 2017.

18. Ellingsworth dc, Sandow SL, Shukla N, Liu Y, Jeremy JY dan Gutterman dd: Hiperpolarisasi yang diturunkan dari endotel dan vasodilatasi koroner: peran yang beragam dan terintegrasi dari asam epoksieikosatrienoat, hidrogen peroksida, dan sambungan celah. Mikrosirkulasi 23: 15-32, 2016.

19. Freed JK dan Gutterman dd: komunikasi adalah kunci: Mekanisme pensinyalan antar sel dalam vasodilatasi. J Cardiovasc Pharm 69: 264-272, 2017.

20. Quillon A, Dari B dan debat R: Penginderaan lingkungan mikro endotel yang mengarah ke vasodilatasi yang dimediasi oksida nitrat: Tinjauan sinyal saraf dan biomekanik. Nitrat Oksida 45: 20-26, 2015.

21. Torres-Estay V, Carreno V, Francisco IF, Sotomayor P, Godoy AS dan Smith GJ: Reseptor androgen pada manusiasel endotel. J Endokrinol 224: 131-137, 2015.

22. Deng Q, Zhang Z, Wu Y, Yu WY, Zhang J, Jiang ZM, Zhang Y, Liang H, dan Gui YT: Aksi non-genomik androgen dimediasi oleh fosforilasi cepat dan regulasi perdagangan reseptor androgen. Biokimia Fisiol Sel 43: 223‑236, 2017.

23. de Oliveira TS, de Oliveira LM, de Oliveira LP, costa RMd, Tostes Rc, Georg Rc, costa EA, Lobato NS, Filgueira FP, dan Ghedini Pc: Aktivasi jalur PI3K/Akt yang dimediasi oleh reseptor estrogen menyumbang estron- menginduksi aktivasi vaskular dari pensinyalan cGMP. Vascul Pharmacol 110: 42-48, 2018.

24. Li F, Yang X, Yang Y, Guo c, Zhang c, Yang Z dan Li P: Aktivitas antiosteoporosis dariechinacosidapada tikus yang diovariektomi. Fitomedika 20: 549-557, 2013.

25. Zeng KW, Liao LX, Wan YJ, Jiang Y, dan Tu PF: Identifikasi target farmakologis dan analisis kemanjuran glikosida fenilethanoid dariCistanchesHerba berdasarkan strategi 'target fishing'. Dagu Obat Herbal Tradisional 49: 173-178, 2018.

26. Jiang Z, Zhou B, Li X, Kirby GM, dan Zhang X:echinacosidameningkatkan kuantitas sperma pada tikus dengan menargetkan reseptor androgen hipotalamus. Sci Rep 8: 3839-3850, 2018.

27. peti PJ, Jin J, dan Woodgett JR: Protein kinase B (c-Akt): Sebuah mediator multifungsi aktivasi phosphatidylinositol 3-kinase. Biochem J 335, 1-13, 1998.

28. Wang S, Zheng G, Tian S, Zhang Y, Shen L, Pak Y, Shen Y, dan Qian J:echinacosidameningkatkan fungsi hematopoietik pada 5-tikus myelosupresi yang diinduksi FU. Ilmu Kehidupan 123: 86-92, 2015.

29. Chen M, Wang X, Hu B, Zhou J, Wang X, Wei W, dan Zhou H: Efek perlindungan dariechinacosidaterhadap cedera anoksia / reperfusi dalam sel H9c2 melalui p-AKT dan SLc8A3 yang mengatur up-regulation. Farmakoter Biomed 104: 52-59, 2018.

30. Abeyrathna P dan Su Y: Peran penting Akt dalam fungsi kardiovaskular. Vascul Pharmacol 74: 38-48, 2015.