Ekspresi Diferensial Enzim Metabolisme Sphingolipid pada Tikus Spontan Hipertensi: Substrat Kemungkinan Untuk Kerentanan Terhadap Kerusakan Otak Dan Ginjal

{0}}

Abstrak: Perubahan dalam metabolisme sphingolipids, kelas molekul biologis aktif dalam membran sel dengan efek langsung pada homeostasis vaskular, semakin diakui sebagai penentu penting dalam gangguan vaskular yang berbeda. Namun, tidak jelas apakah sphingolipids terlibat dalam patogenesis penyakit serebrovaskular dan hipertensi terkait.kerusakan ginjal. Dalam penelitian ini, kami mengevaluasi adanya kemungkinan kelainan yang terkait dengan metabolisme sphingolipid di otak danGinjaldari dua strain tikus hipertensi spontan yang divalidasi dengan baik, model rawan stroke (SHRSP) dan model tahan stroke (SHRSR), dibandingkan dengan strain tikus Wistar Kyoto (WKY) yang normotensif. Hasil kami menunjukkan perubahan global dalam metabolisme sphingolipids di otak danginjal jaringan kedua strain hipertensi dibandingkan dengan tikus normotensif. Namun, beberapa cacat, seperti berkurangnya ekspresi enzim yang terlibat dalam metabolisme/katabolisme sphingosine-1-fosfat dan dalam jalur biosintetik de novo, secara eksklusif terdeteksi di SHRSP. Meskipun penelitian lebih lanjut diperlukan untuk sepenuhnya memahami signifikansi temuan ini, mereka menunjukkan bahwa cacat pada molekul lipid tertentu dan/atau jalur metabolisme terkait kemungkinan berkontribusi pada patogenesis kerusakan organ target hipertensi dan pada akhirnya dapat berfungsi sebagai target terapi di masa depan untuk mengurangi konsekuensi vaskular dari hipertensi.

Kata kunci:sphingolipid; pukulan; otak; ginjal; SHR; WKY 

pengantarHipertensi merupakan masalah kesehatan utama yang menyebabkan kerusakan organ tertentu dan konsekuensi klinis yang dramatis, yang menyebabkan peningkatan angka kematian dan kecacatan di masyarakat Barat [1-3]. Untuk mengurangi beban komplikasi hipertensi, pemahaman yang lebih komprehensif tentang mekanisme etiopatogenetik yang mendasari diperlukan. Ketersediaan model hewan yang mungkin sangat mirip dengan patologi manusia dan, pada saat yang sama, menyederhanakan kompleksitas yang melekat dalam studi populasi manusia, mungkin sangat berguna dalam kontes ini. Saat ini, tikus hipertensi spontan yang rentan terhadap stroke (SHRSP), yang menampilkan predisposisi utama untuk penyakit otak dankerusakan ginjal, terutama bila diberi makan dengan diet tinggi garam/rendah kalium, merupakan model yang ideal. Hipertensi dan faktor makanan berperilaku sebagai faktor risiko predisposisi untuk tikus dan manusia [4,5]. SHRSP menunjukkan frekuensi stroke yang lebih tinggi ketika diberi makan dengan diet gaya Jepang (JD) daripada kontrol yang terkait secara ketat, tahan stroke (SHRSR), meskipun tingkat tekanan darahnya serupa [6]. Sebagai catatan,kerusakan ginjal selalu mendahului kejadian stroke [6]. Meskipun mekanisme molekuler yang mendasarinya tidak sepenuhnya dipahami, bukti menunjukkan bahwa disfungsi vaskular yang dihasilkan dan lesi struktural yang diakibatkannya mendukungkerusakan ginjaldan perkembangan stroke.

CISTANCHE AKAN MENINGKATKAN FUNGSI GINJAL/GINjal

Selama beberapa tahun terakhir, beberapa aspek mekanistik dan determinan serebrovaskular dankerusakan ginjalkejadian telah diidentifikasi dalam model SHRSP [7-12]. Namun, masih banyak yang harus ditemukan. Sphingolipids, termasuk Ceramides (Cer), sphingosine dan bentuk terfosforilasinya Sphingosine-1-phosphate (S1P), mewakili konstituen lipid utama dari membran biologis dan memodulasi beberapa fungsi penting untuk populasi sel neuronal dan non-neuronal [13]. Tidak kalah pentingnya, bagaimanapun, adalah peran penting yang mereka mainkan dalam pembentukan dan fungsi vaskular [13-15], serta dalam regulasi integritas sawar darah otak (BBB) ​​melalui modulasi protein persimpangan ketat [16]. Dalam hal ini, bukti menunjukkan bahwa sintesis de novo sphingolipids sangat penting dalam menjaga fungsi sel endotel [17,18], kemungkinan berkontribusi pada integritas vaskular dan homeostasis. Metabolisme sphingolipid yang rusak telah dijelaskan mendasari kondisi kardiovaskular yang berbeda [19,20]. Namun, belum ada bukti langsung tentang peran penyebab sphingolipids dalam patogenesis kerusakan organ target hipertensi. Meskipun kurangnya detail mekanistik, jalur S1P, lipid bioaktif, telah terbukti menjadi pelindung saraf selama iskemia [21,22], dan stimulasi reseptornya menyebabkan efek menguntungkan pada model hewan stroke [23]. Dengan demikian, dapat dibayangkan bahwa ada interaksi yang erat antara stroke dan sphingolipids. Dalam penelitian ini, kami menyelidiki otak danginjalekspresi beberapa molekul yang terlibat dalam jalur sphingolipid di kedua strain SHRSP dan SHRSR, sehubungan dengan strain WKY normotensif. Temuan kami menyoroti, untuk pertama kalinya, metabolisme sphingolipid yang menyimpang baik di otak atau di ginjal kedua model hewan hipertensi. Yang penting, beberapa cacat secara eksklusif terdeteksi pada strain SHSRP. Bukti ini menunjukkan bahwa perubahan pada molekul lipid spesifik dan/atau jalur spesifiknya berpotensi berkontribusi pada patogenesis hipertensi dan kerusakan organ target hipertensi.

Hasil

Tingkat Enzim S1P-Metabolisasi Diganggu di SHRSPUntuk mengungkapkan apakah ada gangguan potensial dalam metabolisme sphingolipid yang dapat dideteksi pada strain SHRSP dan SHRSR, pertama-tama kami menyelidiki ekspresi molekul yang terlibat dalam jalur sintesis dan degradasi S1P (direncanakan pada Gambar 1). Untuk tujuan ini, kami menilai tingkat SPHK1 dan 2 serta SGPL1 di otak danginjaljaringan dari kedua tikus hipertensi spontan dibandingkan dengan strain WKY. Seperti yang dilaporkan pada Gambar 2, tikus SHRSP dicirikan oleh pengurangan signifikan SPHK2 serta SGPL1 di otak bila dibandingkan dengan WKY dan SHRSR. Tidak ada perbedaan dalamginjalekspresi semua enzim terdeteksi di antara tiga strain tikus.

Tingkat Reseptor S1P yang menyimpang pada Tikus Spontan HipertensiBukti menunjukkan bahwa modulasi reseptor S1P mungkin bermanfaat dalam model iskemik [23]. Di sini, untuk menentukan apakah perubahan ekspresi mereka pada akhirnya dapat dikaitkan dengan fenotipe penyakit, kami menilai kadar protein dari reseptor yang paling melimpah, S1PR1-3 [24], dalam tiga galur tikus. Analisis imunoblotting mengungkapkan variasi dalam ekspresi ketiga reseptor dengan cara yang bergantung pada jaringan. Menariknya, S1PR1 adalah satu-satunya reseptor yang ekspresinya meningkat di otak dan ginjal SHRSR (Gambar 3A,3B). Sebaliknya, analisis jaringan SHRSP tidak menunjukkan variasi ekspresi semua reseptor, kecuali S1PR3 yang kadarnya meningkat di otak, serupa dengan yang terdeteksi di SHRSR (Gambar 3E)

Ekspresi Sintase Ceramide Rusak di Beberapa Jaringan dari Model SHRSP dan SHRSRBukti sebelumnya menunjukkan bahwa tingkat ceramide meningkat pada model pra-klinis stroke serta pada pasien manusia [25-27]. Di sini, untuk menilai apakah metabolisme ceramide mungkin terpengaruh pada tikus hipertensi spontan, yang akhirnya menghasilkan peningkatan kadar ceramide, kami menyelidiki ekspresi ceramide synthase, yang dilaporkan paling melimpah di otak (CerS1 dan CerS2) dan diginjal(CerS2 dan CerS4) [28]. Seperti yang dilaporkan pada Gambar 4, analisis qPCR mengungkapkan kekacauan umum dalam ekspresi sintase, dengan beberapa perbedaan antara dua strain hipertensi spontan. SHRSP menunjukkan peningkatan kadar CerS1 mRNA di otak bila dibandingkan dengan WKY atau SHRSR (Gambar 4A) dan penurunan kadar CerS6 di otak.ginjal, mirip dengan yang diamati di SHRSR (Gambar 4D). Sebaliknya, SHRSR dicirikan oleh penurunan ekspresi mRNA CerS2 di otak dan ginjal (Gambar 4B,4C).

Ekspresi SPTLC1 Berkurang dalam Jaringan SHRSPStudi terbaru telah menunjukkan potensi keterlibatan biosintesis de novo sphingolipids pada hipertensi dan penyakit pembuluh darah [29,30]. Untuk menyelidiki kemungkinan hubungan antara jalur sphingolipid de novo dan stroke, kami menilai profil ekspresi protein SPTLC1 dan 2, dua subunit SPT, enzim pembatas laju dalam biosintesis de novo sphingolipids [13], di otak danginjaltisu. Seperti yang dilaporkan pada Gambar 5A, B, tikus SHRSP dicirikan oleh pengurangan SPTLC1 yang signifikan di otak danginjal.Menariknya, SPTCL2 juga berkurang di otak SHRSP dibandingkan dengan SHRSR (Gambar 5C).

Ekspresi 3-Keto-Dihydrosphingosine Reductase Berkurang pada Kedua Tikus Spontan HipertensiPerubahan dalam biosintesis de novo sphingolipid lebih lanjut dikonfirmasi oleh analisis enzim 3-keto dihydrosphingosine reductase (KDSR) dan ceramide desaturase (DES), biasanya terlibat dalam sintesis de novo sphingolipids [13]. Analisis qPCR menunjukkan penurunan yang signifikan dari tingkat ekspresi mRNA KDSR diginjaldari kedua SHRSP dan SHRSR (Gambar 6B). Tidak ada perubahan lebih lanjut yang diamati.

Gambar 2. Ekspresi enzim metabolisme S1P rusak di jaringan otak dari SHRSP. Imunoblottings yang dipangkas dan analisis densitometri SPHK1 (sphingosine kinase 1) (A,B), SPHK2 (sphingosine kinase 2) (C,D) dan SGPL1 (S1P-Lyase) (E,F) di jaringan otak dan ginjal dari WKY, SHRSP dan SHRSR. Dalam setiap imunoblotting, semua sampel dijalankan pada gel yang sama. Sampel yang tidak berdekatan dipisahkan oleh garis hitam. Data direpresentasikan sebagai mean ± SD, n {{10}}/7 untuk setiap kelompok tikus. * p < 0.05;="" **="" p="">< 0,01;="" ***="" p="">< 0,001="" (anova="" satu="" arah,="" post-test="" tukey).="" tanggal="" mentah="" untuk="" menghasilkan="" figur="" dilaporkan="" dalam="" tabel="" bahan="" tambahan="">

Diskusi

Meskipun upaya penelitian yang luar biasa oleh ilmuwan dasar dan klinis, komplikasi hipertensi seperti stroke danginjalpenyakit masih merupakan penyebab utama kematian di seluruh dunia [1-3]. Dengan demikian, pengetahuan tentang jalur patogen alternatif dan target obat baru diperlukan untuk menjaga kesehatan serebrovaskular dan ginjal. Menjelajahi metabolisme sphingolipids, kelas molekul biologis aktif dalam membran sel yang memainkan peran kunci dalam homeostasis vaskular, dapat membuka jalan menuju cakrawala pemahaman baru. Meskipun bukti yang muncul menunjukkan bahwa perubahan dalam metabolisme sphingolipids, seperti S1P dan ceramides, mungkin memiliki peran dalam gangguan pembuluh darah dan hipertensi [31], apakah mereka terlibat dalam patogenesis kerusakan organ hipertensi masih belum jelas. Dalam penelitian ini, kami berusaha untuk mendapatkan beberapa wawasan tentang metabolisme sphingolipids pada strain tikus SHRSP dan SHRSR, dua model pra-klinis hipertensi spontan dengan kerentanan yang berbeda terhadapginjaldan perkembangan kerusakan serebrovaskular. Secara khusus, kami melakukan penelitian pada tikus berumur 8-minggu, pada usia ketika mereka menjadi hipertensi tetapi masih bebas dari kerusakan organ target. Melalui pendekatan ini, kami bertujuan untuk mengidentifikasi tanda "sphingobiological" yang berpotensi terlibat dalam hasil yang berbeda dari penyakit hipertensi pada dua model tikus. Strain tikus normotensif berfungsi sebagai kontrol yang sesuai. Temuan kami menunjukkan untuk pertama kalinya bahwa kedua model tikus hipertensi dicirikan oleh kekacauan global metabolisme sphingolipid, tetapi hanya sedikit perubahan yang spesifik untuk strain SHRSP atau SHRSR. Secara khusus, ekspresi SPHK2 dan SGPL1 berkurang secara signifikan hanya di otak SHRSP. Pengurangan kadar SPHK2 mungkin memiliki efek yang sangat merusak di otak, di mana ia sangat melimpah di sel endotel mikrovaskular dan memberikan peran protektif terhadap iskemia yang diinduksi oleh hipoksia [32]. Di sisi lain, pengurangan SGPL1 mungkin berpotensi menjadi racun bagi fungsi sel saraf [33].

Mengingat hal ini, dapat dibayangkan bahwa ketidakseimbangan enzim metabolisme S1P, dengan konsekuensi bioavailabilitas S1P yang rusak, dapat mengakibatkan peningkatan kerusakan pembuluh darah. Kemungkinan keterlibatan S1P dalam regulasi mekanisme molekuler yang berpotensi terkait dengan stroke berasal dari bukti bahwa kadar S1PR1, yang baru-baru ini diidentifikasi sebagai gen kandidat posisi untuk sensitivitas garam di SHRSP [22], meningkat di jaringan SHRSR. . Hasil ini menunjukkan kemungkinan peran ganda S1P dalam penentuan kerusakan pembuluh darah dan kejadian stroke yang diakibatkannya. Faktanya, pengurangan bioavailabilitas S1P dan / atau regulasi yang rusak dari jalur terkaitnya dapat meningkatkan kerentanan terhadap stroke di SHRSP. Sebaliknya, peningkatan ekspresi S1PR1, yang aktivasinya telah dilaporkan bermanfaat dalam model eksperimental iskemia serebral [34-36], pada akhirnya dapat mewakili faktor pelindung dalam SHRSR. Temuan kami mengungkapkan perbedaan menarik lainnya antara dua strain tikus yang mengalami hipertensi spontan. Peningkatan ekspresi CerS1, yang hanya terdeteksi di SHRSP, mungkin menunjukkan peningkatan bioavailabilitas ceramide serebral yang dapat mengungkapkan toksik dan berpotensi terkait dengan peningkatan kerentanan terhadap stroke. Hal ini dikuatkan oleh beberapa penelitian yang melaporkan hubungan antara peningkatan kandungan ceramide, penyakit iskemik pembuluh darah kecil dan hiper-intensitas materi putih [37,38].

CISTANCHE AKAN MENINGKATKAN FUNGSI GINJAL/GINjal

Pengamatan penting lainnya yang diperoleh dari penelitian kami adalah pengurangan signifikan SPTLC1 dan 2 di SHRSP dibandingkan dengan SHRSR, di mana tidak ada variasi yang terdeteksi. Meskipun kedua strain hipertensi berbagi beberapa cacat dalam ekspresi gen lain yang terlibat dalam sintesis sphingolipid de novo, pengurangan SPTLC jelas menunjukkan peran kunci dari rute metabolisme ini dalam patogenesis penyakit serebrovaskular. Dalam konteks ini, bukti terbaru menunjukkan bahwa sintesis endotel de novo dari sphingolipids mengatur tekanan darah dan homeostasis endotel [30], menyoroti peran penting sphingolipid yang disintesis secara de novo pada penyakit vaskular. Data saat ini mungkin menunjukkan bahwa sintesis de novo sphingolipids dapat terganggu di SHRSP. Studi kami adalah yang pertama membahas aspek spesifik metabolisme sphingolipid sehubungan dengan stroke. Meskipun kami tidak melakukan analisis kuantitatif sphingolipids dalam jaringan tikus, temuan kami menyarankan perubahan potensial dalam bioavailabilitas sphingolipids yang berbeda seperti S1P dan ceramide di SHRSP. Sejak S1P merangsang proliferasi sel dan jalur kelangsungan hidup sedangkan ceramide biasanya memberikan efek anti-proliferatif dan apoptosis [39], ketidakseimbangan antara mereka dapat mempengaruhi homeostasis otak di SHRSP dan berpotensi berkontribusi pada patogenesis stroke. Mempertimbangkan sifat korelatif dari penelitian kami, penyelidikan lebih lanjut diperlukan untuk sepenuhnya memahami potensi peran penting dari perubahan sphingolipid dalam patogenesis kerusakan organ hipertensi untuk mengembangkan strategi terapi "berbasis sphingolipid" yang lebih efektif. Mempertimbangkan bahwa beberapa obat, yang target molekulnya termasuk dalam jalur sphingolipid, sudah tersedia untuk pengobatan penyakit lain [40], kami percaya bahwa temuan kami dapat menawarkan dukungan untuk mengeksplorasi potensi terapeutik mereka di otak hipertensi danginjalgangguan vaskular.

Bahan dan metode

Model HewanSemua percobaan dilakukan dengan menggunakan tikus jantan berusia dua bulan yang rentan terhadap stroke (SHRSP), galur tikus yang resisten terhadap stroke (SHRSR), dan membandingkannya dengan galur tikus normotensif yang sesuai dengan usia dan jenis kelamin, WistarKyoto (WKY) . SHRSP dan SHRSR adalah model hewan yang paling umum digunakan dalam studi praklinis hipertensi dan stroke terkait [5,6]. Mereka disimpan di fasilitas hewan IRCCS Neuromed, dipertahankan pada suhu kamar yang konstan dan siklus 12 jam siang / malam, dan diberi makan dengan makanan tikus biasa dan air ad libitum. Semua penelitian pada hewan dilakukan sesuai dengan protokol yang disetujui oleh Dewan Peninjau Perawatan Hewan Neuromed IRCCS dan oleh "Istituto Superiore di Sanit" (nomor izin ISS: 1086/2020) dan dilakukan sesuai dengan EU Directive 2010/63/EU untuk eksperimen hewan .

ImunoblottingTikus dikorbankan dengan pemenggalan kepala dan jaringan (otak danginjal) dibekukan dalam cairan N2 dan dihaluskan dalam mortar dengan alu. Jaringan yang dihaluskan dihomogenisasi dalam buffer lisis yang mengandung 20 mM Tris, pH 7,4, 1 persen Nonidet P-40, 1 mM EDTA, 20 mM NaF, 2 mM Na3VO4 dan campuran protease inhibitor 1:1000 (Sigma-Aldrich) dan disonikasi dengan pulsa 2*10 detik. Untuk imunoblotting, 20 g protein total lisat diimunisasi dengan antibodi berikut: anti-SPHK1 (1:1000) (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas, USA), anti-SPHK2 (1:1000) (Abcam, Cambridge, UK ), anti-SGPL1 (1:1000) (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, AS), anti-S1PR1 (1:1000) (Ilmu Imunologi), anti-S1PR2 (1:1000)(Bioteknologi Santa Cruz) , anti-S1PR3 (1:1000) (Ilmu Imunologi), anti SPTLC1 (1:1000) (Abcam) dan anti-SPTLC2 (1:1000) (Abcam). Untuk normalisasi protein, anti-aktin (1:2000) (Ilmu imunologi, Roma, Italia) digunakan. Pita protein dideteksi oleh ECL Prime (GE Healthcare) dan dihitung dengan Quantity One Software (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).

Ekstraksi RNA dan qPCR.

Total RNA diekstraksi menggunakan kit Rneasy (Qiagen) sesuai dengan instruksi pabrik. 1000 ng total RNA disintesis menggunakan Super Script III reverse transcriptase (Invitrogen) dan cDNA yang dihasilkan diamplifikasi menggunakan Power SYBR Green PCR Master Mix (Bio-Rad) mengikuti instruksi pabrik. Analisis qPCR kuantitatif dilakukan dengan menggunakan primer spesifik: Kdsr FW: 50-TAAAGCAGGCACAGGAGAAG-30; Kdsr RV: 50-GCCTGAGAGAGGACACAAACA -30; Des FW: 50-AGAGGAGTTCGAATGGGTCTA-30; Des RV: 50- GATAGCCAGAGTCATGGAATGG-30; CerS1 FW: 50- CCTGGAAGCTTCTGTTCTACTT-30; CerS1 RV: 50- CATGTACACGGTGGCATAGA-30; CerS2 FW: 50- CATGGCTGTCACTGTGGATAA-30; CerS2 RV: 50- GAGAAGCAGAGGAGAATGATGG-30; CerS6 FW: 50- CAGGAGTGGACAAAGCAAGA-30; CerS6 RV: 50- TGGTTTGGCTATGAATCTCTCG-30; Gapdh FW: 50- AACGACCCCTTCATTGACCTC-30; Gapdh RV: 50- CCTTGACTGTGCCGTTGAACT-30.

CISTANCHE AKAN MENINGKATKAN FUNGSI GINJAL/GINjal