Kontrol Diferensial Sel Treg Manusia Dan Efektor T dalam Kekebalan Tumor Oleh Anti-CTLA -4 Antibodi yang Direkayasa-Fc

Anti–CTLA-4 mAb berkhasiat dalam meningkatkan kekebalan tumor pada manusia. CTLA-4 diekspresikan oleh sel T konvensional pada saat aktivasi dan dengan FOXP3 plus CD4 plus sel Treg yang terjadi secara alami, menimbulkan pertanyaan tentang bagaimana anti-CTLA-4 mAb dapat secara berbeda mengontrol populasi sel T yang berlawanan secara fungsional ini di kekebalan tumor. Di sini kami menunjukkan bahwa FOXP3 sel Treg efektor penekan berpotensi tinggi berlimpah di jaringan melanoma, mengekspresikan CTLA-4 pada tingkat yang lebih tinggi daripada CD8 plus sel T yang menginfiltrasi tumor. Setelah stimulasi antigen-tumor in vitro sel mononuklear darah tepi dari individu sehat atau pasien melanoma, Fc-region–modified anti-CTLA-4 mAb dengan sitotoksisitas yang dimediasi sel (ADCC) yang bergantung pada antibodi tinggi dan fagositosis seluler (ADCP ) aktivitas CTLA yang terkuras secara selektif-4 plus FOXP3 plus sel Treg dan akibatnya sel CD8 plus sel T spesifik antigen tumor diperluas.

Yang penting, perluasan terjadi hanya ketika stimulasi antigen ditunda beberapa hari dari pengobatan antibodi untuk menyisihkan CTLA-4 plus CD8 efektor aktif plus sel T dari pembunuhan yang dimediasi mAb. Demikian pula, pada tikus yang mengandung tumor, pengobatan mAb anti-CTLA-4 ADCC/ADCP tinggi dengan vaksinasi antigen tumor yang tertunda secara signifikan memperpanjang kelangsungan hidup mereka dan secara nyata meningkatkan produksi sitokin oleh sel CD8 plus T yang menginfiltrasi tumor, sedangkan pengobatan antibodi bersamaan dengan vaksinasi tidak. Anti-CTLA4 mAb yang dimodifikasi untuk menunjukkan aktivitas pengikatan Fc yang lebih rendah atau tidak ada gagal untuk menunjukkan peningkatan kekebalan in vitro dan in vivo yang bergantung pada waktu. Dengan demikian, mAb anti-CTLA -4 ADCC yang tinggi dapat secara selektif menguras sel Treg efektor dan membangkitkan kekebalan tumor tergantung pada CTLA -4}– yang mengekspresikan status CD8 efektor plus sel T. Temuan ini berperan penting dalam merancang imunoterapi kanker dengan mAb yang menargetkan molekul yang biasanya diekspresikan oleh FOXP3 plus sel Treg dan sel T efektor tumor-reaktif.

Sel T pengatur|CTLA-4|FOXP3|imunoterapi kanker|sitotoksisitas yang dimediasi sel yang bergantung pada antibodi.

Sel CD25 plus CD4 plus Treg yang terjadi secara alami, yang mengekspresikan faktor transkripsi FOXP3, memainkan peran yang sangat diperlukan dalam pemeliharaan toleransi diri dan homeostasis imunologis (1). Namun, mereka juga menghambat respon kekebalan yang efektif terhadap sel tumor yang timbul dari diri sendiri, seperti yang diilustrasikan oleh temuan bahwa tumor tikus dapat diberantas hanya dengan menipisnya sel Treg (2-5).

Pada manusia, ada bukti yang terkumpul untuk infiltrasi sel Treg yang melimpah ke dalam berbagai jaringan tumor (6-8), dan korelasi yang signifikan antara infiltrasi Treg dan prognosis buruk pada berbagai jenis kanker (9). Oleh karena itu, kontrol sel Treg dalam jaringan tumor kemungkinan menjadi salah satu cara yang menjanjikan untuk membangkitkan kekebalan tumor yang efektif pada pasien kanker.

Untuk anti tumor, kami menemukan bahwa Cistanche deserticola memiliki efek anti tumor yang jelas pada penelitian tikus. 3 Komponen polisakarida dalam Cistanche deserticola dapat meningkatkan fungsi kekebalan tubuh, meningkatkan aktivasi sel darah putih, meningkatkan status kekebalan tubuh, dan juga dapat langsung bekerja pada sel tumor. Menghambat proliferasi, metastasis, dan invasi sel tumor. Juga menghambat angiogenesis. Pertumbuhan tumor dan metastasis membutuhkan dukungan pertumbuhan pembuluh darah baru, dan komponen polisakarida dalam Cistanche dapat menghambat angiogenesis sehingga mengurangi pertumbuhan tumor dan metastasis.

Klik di sini untuk membeli cistanche

FOXP3-manusia yang mengekspresikan CD4 plus sel T memiliki fungsi yang heterogen, termasuk sel Treg dan sel T konvensional yang tidak menekan. Mereka dapat difraksinasi menjadi tiga subpopulasi dengan tingkat ekspresi FOXP3 dan CD45RA yang berbeda (10) (Gbr. 1A): (i) CD45RA plus FOXP3lo sel Treg naif / istirahat [Fraction (Fr). I];(ii) sel Treg (Treg) efektor CD45RA− FOXP3hi (Fr.II), yang berdiferensiasi akhir dan sangat menekan; dan (iii) sel non-Treg CD45RA− FOXP3lo (Fr. III), yang tidak memiliki aktivitas penekan dan mampu mensekresi sitokin proinflamasi. Setelah stimulasi antigenik, Fr. Sel Treg yang naif berdiferensiasi menjadi Fr. Sel Treg II, yang sangat mengekspresikan CTLA-4 (10).

Gambar 1. Ekspresi CTLA-4 preferensial oleh sel FOXP3hi Treg dalam jaringan melanoma. (A dan B) Plot representatif dari CD4 plus pewarnaan sel T (A) dan frekuensi setiap fraksi (B). PBMC donor sehat (HD, n=5), dan PBMC dan TIL pasien melanoma (n=11 dan 14, masing-masing) menjadi sasaran pewarnaan langsung untuk CD4, CD45RA, dan FOXP3. (C dan D) Plot representatif dari ekspresi CCR7 dan CD45RA oleh CD8 plus sel T (C) dan ringkasan dari setiap CD8 plus subset sel T (D). (E) CTLA-4–mengekspresikan cluster (garis putus-putus) dalam PBMC dan TIL dari pasien melanoma dengan analisis CyTOF. plot viSNE dari CD4 plus dan CD8 plus sel T dengan peta panas untuk tingkat ekspresi penanda yang ditunjukkan ditampilkan (n=2). (F) Pewarnaan CTLA-4 hanya permukaan atau permukaan dan intraseluler pada HD PBMC. (G) Ekspresi CTLA-4 permukaan oleh setiap fraksi seluler dari TIL dan PBMC pasien melanoma. Berarti ± SEM. *P Kurang dari atau sama dengan {{20}}.05, **P Kurang dari atau sama dengan 0.01, ***P Kurang dari atau sama dengan 0,001, dan ****P Kurang dari atau sama dengan 0,0001 dengan ANOVA satu arah dengan uji HSD post hoc Tukey.

Meskipun sebagian besar sel di Fr. III adalah sel non-Treg dan tidak berdiferensiasi menjadi Fr. Sel eTreg II, subset sirkulasi sel pengatur folikel-T, yaitu CXCR5 plus CD45RA−, termasuk dalam Fr. III (11), menunjukkan heterogenitas Fr. populasi III. Sebaliknya, dengan adanya ketiga populasi FOXP3 plus ini dalam darah, sebagian besar tumor menunjukkan infiltrasi sel Treg yang dominan, yang tampaknya menekan respons imun antitumor yang efektif pada pasien kanker (12). Temuan ini menunjukkan bahwa penipisan/pengurangan sel Treg pada tumor dan kelenjar getah bening regional berperan penting dalam membangkitkan dan menambah respon imun antitumor, seperti yang ditunjukkan baru-baru ini dengan beberapa antibodi monoklonal (mAbs) khusus untuk molekul yang secara khusus diekspresikan oleh sel Treg (13).

CTLA-4 diekspresikan oleh sel T konvensional saat aktivasi dan oleh FOXP3 plus CD25 plus CD4 plus sel Treg secara konstitutif. Ini memainkan peran kunci dalam Treg-mediated supresi, setidaknya sebagian, melalui pengontrolan ekspresi CD80/CD86 oleh antigen-presenting cells (APC) (14–16). Anti-human CTLA-4 mAb, yang secara klinis efektif dalam mengobati melanoma (17, 18), pada awalnya dianggap memblokir sinyal negatif yang dimediasi CTLA-4–menjadi sel T efektor aktif, mempertahankan status aktifnya di menyerang sel tumor. Namun, studi praklinis baru-baru ini menunjukkan bahwa mAb anti-CTLA-4 dapat menghabiskan sel FOXP3 plus Treg, terutama di jaringan tumor, sehingga menambah kekebalan tumor (19-21). Namun, pada manusia, kontroversial apakah CTLA-4 mAb memengaruhi jumlah atau fungsi sel Treg atau sel T efektor, atau keduanya, dalam meningkatkan respons imun antitumor dalam konteks klinis.

Dalam penelitian ini, kami telah menyelidiki in vivo dan in vitro, pada manusia dan tikus, efek anti-CTLA-4 mAbs yang direkayasa Fc pada sel FOXP3 plus Treg dan sel CD8 plus sel T spesifik antigen tumor/sendiri. Kami menunjukkan bahwa mAb anti-CTLA-4 penipisan sel dengan aktivitas sitotoksisitas yang dimediasi sel (ADCC) yang bergantung pada antibodi tinggi dapat membangkitkan respons imun antitumor tergantung pada level dan kinetika ekspresi CTLA-4 oleh dua populasi. Hasilnya dapat diperluas ke mAb penipisan sel yang menargetkan molekul permukaan sel lain yang biasanya diekspresikan oleh sel Treg dan efektor T (Teff) pada tingkat yang berbeda dan dengan kinetika yang berbeda.

Makna

Anti–CTLA-4 mAb dapat menambah kekebalan tumor meskipun ekspresi CTLA-4 dengan melawan populasi sel T secara fungsional: sel efektor T (Teff) yang diaktifkan dan FOXP3 plus CD4 plus sel Treg. Di sini kami menunjukkan bahwa anti-CTLA-4 mAb direkayasa menjadi sel Treg sitotoksik yang terkuras secara efektif in vitro pada manusia dan in vivo pada tikus. Ini memperluas CD8 spesifik antigen plus sel Teff ketika stimulasi antigen tumor ditunda beberapa hari untuk melindunginya dari pembunuhan oleh mAb. Anti–CTLA-4 mAb yang dimodifikasi untuk menunjukkan aktivitas pengurasan sel yang lebih sedikit atau tidak gagal menunjukkan efek tersebut. Strategi mengendalikan sel Treg dan Teff secara berbeda dengan anti-CTLA sitotoksik-4 mAb untuk membangkitkan kekebalan tumor yang efektif akan membantu dalam merancang imunoterapi kanker yang menargetkan molekul lain yang biasanya diekspresikan oleh sel Treg dan Teff.

Kontribusi penulis: DH, A. Tanaka, HN, dan SS merancang penelitian; DH, A. Tanaka, TK, A. Tanemura, DS, JBW, ELL, KWWT, DA, dan IK melakukan penelitian; A. Tanemura menyumbangkan reagen/alat analitik baru; DH, A. Tanaka, TK, DS, DA, EWN, IK, HN, dan SS menganalisis data; dan DH, A. Tanaka, dan SS menulis makalah.

Peninjau: MA, Universitas Kedokteran dan Gigi Tokyo; dan SAQ, University College London.

Pernyataan konflik kepentingan: HN menerima hibah penelitian dari Bristol Myers Squibb. SS menerima hibah penelitian dari Chugai Pharmaceutical Co., Ltd. TK dipekerjakan oleh Chugai Pharmaceutical Co., Ltd. yang menyediakan beberapa antibodi yang digunakan dalam penelitian ini.

Diterbitkan di bawah lisensi PNAS.

1 Alamat sekarang: Department of Immunology, Graduate School of Medicine, Nagoya University, 466-8550 Nagoya, Jepang.

2 Alamat sekarang: Departemen Imunologi, Pusat Kanker Moffitt, Tampa, FL 33612.

3 Alamat sekarang: Divisi Cancer Immunology, Exploratory Oncology Research & Clinical Trial Center, National Cancer Center, 277-8577 Kashiwa, Jepang.

4 Kepada siapa korespondensi harus ditujukan. Email: shimon@ifrec.osaka-u.ac.jp.

Dipublikasikan online pada 26 Desember 2018.

Hasil

Akumulasi CTLA-4–Mengekspresikan Sel Treg FOXP3hi yang Dibedakan Secara Akhir di Jaringan Melanoma.

Kami pertama-tama menilai frekuensi berbagai subpopulasi sel T di antara limfosit yang menginfiltrasi tumor (TIL) pada pasien melanoma. Sel eTreg CD45RA− FOXP3hi (Fr.II) secara dominan (∼10-lipat) meningkat rasionya di antara CD4 plus TIL, dibandingkan dengan CD4 darah tepi plus sel T pada donor sehat atau pasien melanoma (Gbr. 1 A dan B ). Frekuensi CD45RA− FOXP3lo Fr. III sel non-Treg juga sedikit meningkat (∼dua kali lipat) di antara CD4 plus TIL. Sebaliknya, sel Treg naif CD45RA plus FOXP3lo (Fr.I) secara signifikan berkurang dalam TIL menjadi seperempat, rata-rata, dari fraksi yang sesuai dalam sel mononuklear darah tepi (PBMC).

Di antara FOXP3− CD4 plus sel T konvensional dalam TIL, CD45RA− FOXP3− efektor/memori CD4 plus sel T, yang dapat dibedah lebih lanjut ke populasi CD25 plus (Fr.IV) dan CD25− (Fr.V) (10) , sedikit (∼1.3-fold) meningkat, sementara CD45RA plus FOXP3− naif CD4 plus sel T (Fr. VI) berkurang secara signifikan menjadi sepersepuluh dari yang ada di PBMC. Dalam CD8 plus fraksi sel T dari TIL, dibandingkan dengan PBMC pasien atau donor sehat, terdapat peningkatan yang signifikan (∼1.6-kali lipat) dari sel CD45RA− CCR7− memori efektor T (TEM), dengan penurunan yang signifikan dalam CD45RA plus CCR7 plus naif dan CD45RA plus CCR7− sel memori efektor yang dibedakan secara terminal (TEMRA) menjadi setengah dan seperlima, masing-masing, dari yang ada di PBMC, dan tidak ada perubahan signifikan pada CD45RA− CCR7 plus memori pusat T (TCM) sel (Gbr. 1 C dan D). Juga dicatat pada pasien melanoma bahwa CD8 naif ditambah sel T dalam PBMC secara nyata (∼14-kali lipat) menurun dibandingkan dengan donor yang sehat.

Kami kemudian menilai populasi sel-T mana yang mengekspresikan CTLA-4 dalam TIL atau PBMC pasien melanoma dengan sitometri dengan sitometer spektrometri massa time-of-flight (CyTOF) (Gbr. 1E dan SI Lampiran, Gbr. S1A). Kumpulan sel CD4 plus CD45RA− Foxp3hi, mewakili Fr. Sel eTreg II, terutama CTLA4 yang diekspresikan dalam PBMC dan TIL, sedangkan sel CD8 plus T jarang diekspresikan CTLA-4 baik dalam PBMC atau TIL. Pada tikus, ekspresi CTLA4 yang dominan oleh FOXP3 plus sel Treg juga diamati pada jaringan tumor limpa dan CMS5a (Lampiran SI, Gbr. S1B). CTLA4 diungkapkan oleh Fr manusia. Sel Treg II sebagian besar berada di kompartemen intraseluler dan CTLA permukaan sel-4 terbatas (Gbr. 1F). Namun demikian, dalam TILs, sel Treg, dan pada tingkat lebih rendah Fr. III sel non-Treg, ditemukan untuk mengekspresikan permukaan CTLA-4 pada tingkat yang sangat tinggi (Gbr. 1G dan Lampiran SI, Gbr. S2). Sel TIL CD8 plus TCM dan TEM juga menunjukkan tingkat CTLA permukaan-4 yang lebih tinggi dibandingkan dengan fraksi sel T yang bersirkulasi, meskipun sel Treg menunjukkan ekspresi yang jauh lebih tinggi pada pasien melanoma (Gbr. 1G dan Lampiran SI, Gbr. S2).

Secara bersama-sama, fitur kardinal dari jaringan melanoma manusia adalah peningkatan dan penurunan sel Treg dan sel Treg naif, masing-masing, dan peningkatan nyata CD8 efektor / memori plus sel T dengan pengurangan CD8 naif plus sel T. Sel Treg dan CD8 plus sel T di TIL ini mengekspresikan CTLA-4 pada permukaan sel, dengan ekspresi yang lebih tinggi oleh yang pertama daripada yang terakhir. Berbeda dengan sel TIL eTreg, sel eTreg yang bersirkulasi pada pasien melanoma secara signifikan lebih rendah pada tingkat ekspresi CTLA4 permukaan, menunjukkan bahwa mereka mungkin kurang terpengaruh oleh pengobatan anti-CTLA-4 mAb.

Pengurangan Sel Treg dan CD8 Spesifik-Antigen plus Sel T dengan Pengobatan In Vitro dengan Anti-CTLA Penipisan Sel-4 mAb dan Stimulasi Antigen Bersamaan.

Untuk mengatasi apakah efek antitumor anti-CTLA-4 mAb akan bergantung pada kemampuannya untuk menghabiskan sel Treg oleh ADCC, kami memodifikasi bagian Fc dari anti-CTLA-4 IgG1 mAb (clone MDX{{3 }}, ipilimumab), yang memiliki aktivitas ADCC sedang, untuk mengubah afinitasnya terhadap Fc RIIIa (CD16a), Fc R aktif yang diekspresikan oleh sel NK, monosit/makrofag, dan sel lainnya (22) (Gbr. 2A). Anti-CTLA -4 mAb sehingga dihasilkan dengan aktivitas ADCC yang tinggi, yang kami sebut domain teknologi-Fc rekayasa ulang asimetris (ART-Fc), memiliki substitusi asam amino yang berbeda pada setiap rantai berat (23); yaitu, substitusi L234Y/L235Q/G236W/S239M/H268D/D270E/S298A menjadi satu wilayah Fc rantai berat dan substitusi D270E/K326D/A330M/ K334E ke wilayah lainnya. mAb yang direkonstruksi menunjukkan afinitas pengikatan 1,000-kali lipat lebih tinggi untuk Fc RIIIa manusia daripada mAb yang tidak dimodifikasi tanpa meningkatkan afinitas untuk Fc RIIb penghambatan. Kami juga menghasilkan anti-CTLA-4 mAb yang hampir tidak mengikat Fc Rs, yang kami sebut silent-Fc anti-CTLA-4, dengan substitusi asam amino; yaitu, L235R, G236R, dan S239K ke dalam wilayah Fc dari kedua rantai berat. Dibandingkan dengan mAb anti-CTLA-4 Fc yang tidak dimodifikasi atau diam, ART-Fc menunjukkan sitotoksisitas in vitro yang jauh lebih tinggi terhadap CTLA-4– yang mengekspresikan sel ovarium hamster Cina (CHO) dengan adanya PBMC dari donor yang sehat , dengan peningkatan sitotoksisitas dengan inkubasi yang lebih lama (Gbr. 2B). Demikian pula, ART-Fc anti–CTLA-4 mAb secara efektif membunuh Fr. II sel Treg dan, pada tingkat lebih rendah, Fr. III non-Treg atau Fr. Saya naif sel Treg, sedangkan IgG1 (ipilimumab) atau silent-Fc mAb hampir tidak menunjukkan aktivitas pembunuhan (Gbr. 2C).

Selanjutnya, kami menilai efek dari mAb yang direkayasa Fc ini pada ekspansi spesifik antigen in vitro sel CD8 plus T dengan menstimulasi PBMC dari HLA-A*0201–mengekspresikan donor sehat atau pasien melanoma selama 9 hari dengan berbagai peptida, misalnya: berasal dari Melan-A/MART-1, self/tumor-antigen yang diekspresikan oleh melanosit normal dan beberapa sel melanoma (24); dan NY-ESO-1, antigen kanker/testis yang diekspresikan oleh berbagai jenis sel kanker dan sel germline manusia (25), cytomegalovirus (CMV), atau virus influenza (Flu). Stimulasi peptida in vitro ini, misalnya oleh peptida Melan-A, mempertahankan ekspresi CTLA4 yang tinggi oleh sel Treg (Gambar 2D dan Lampiran SI, Gambar. S3). Stimulasi peptida saja juga memperluas tetramer spesifik peptida (Tet) plus CD8 plus sel T, yang mengekspresikan level CTLA-4 yang lebih tinggi, terutama pada permukaan sel, dibandingkan dengan sel Tet− (Gbr. 2 E, F, dan saya). Ketika ART-Fc anti–CTLA-4 mAb hadir dari awal stimulasi peptida PBMC dari donor sehat atau pasien melanoma, rasio CTLA-4–mengekspresikan sel Treg di antara CD4 plus sel T adalah berkurang secara signifikan dengan cara yang tergantung pada dosis, sementara silent-Fc mAb gagal menunjukkan efek ini (Gbr. 2 D dan G dan Lampiran SI, Gambar. S4 dan S5).

Pengurangan sel Treg, bagaimanapun, tidak menyertai perluasan CD8 plus sel T spesifik antigen; alih-alih, pengobatan tersebut menyebabkan penurunan rasio Tet plus CD8 plus sel T di antara CD8 plus sel T (Gbr. 2H). Dalam stimulasi in vitro ini, IgG1 yang tidak dimodifikasi atau silent-Fc anti-CTLA-4 mAb tidak menunjukkan aktivitas penipisan eTreg yang signifikan (Gbr. 2I). Tingkat reduksi sel eTreg oleh mAb ini memang berkorelasi dengan reduksi CD8 plus sel T spesifik antigen, terlepas dari antigen yang merangsang, misalnya peptida Melan-A atau CMV (Gbr. 2I).

Jadi, sementara sel Treg secara konstitutif mengekspresikan CTLA-4, terutama CTLA intraseluler-4, stimulasi antigen memperluas sel CD8 plus T yang mengekspresikan CTLA-4 tingkat tinggi, terutama pada permukaan sel. ART-Fc anti–CTLA-4 mAb dengan aktivitas ADCC yang tinggi, oleh karena itu, mampu menguras tidak hanya CTLA-4 plus sel Treg tetapi juga CTLA yang diaktifkan antigen-4 plus CD8 plus sel T . Efektor CD8 plus penipisan sel T ini dapat mengimbangi efek peningkat kekebalan dari penipisan sel eTreg dalam respons imun in vitro.

Gambar 2. Stimulasi peptida in vitro bersamaan dengan ART-Fc anti-CTLA-4 mAb membatasi CD8 spesifik antigen plus respons sel T. (A) Ringkasan substitusi asam amino yang dilakukan pada bagian Fc dari CTLA anti-manusia-4 IgG1 mAb (kloning MDX-010, ipilimumab) untuk menghasilkan mAb ART-Fc atau silent-Fc, dan afinitasnya untuk menghambat Fc RIIb atau mengaktifkan Fc RIIIa. Afinitas mAb Silent-Fc berada di bawah batas deteksi uji BIACORE. (B) Aktivitas ADCC dari berbagai mAbs anti-CTLA4 terhadap CTLA manusia-4–mengekspresikan sel CHO. Anti–CTLA-4 mAbs (ART, anti–CTLA yang ditingkatkan ADCC-4 ART-Fc; IgG1, anti–CTLA konvensional yang tidak dimodifikasi-4 IgG1; Diam, anti-wilayah-Fc yang tidak aktif CTLA-4 silent-Fc) diinkubasi dengan sel CHO dan HD PBMC (n=3) dengan rasio E/T 50:1. Berarti ± SEM. Tanda bintang menunjukkan perbedaan yang signifikan antara setiap antibodi dan silent-Fc pada konsentrasi masing-masing untuk kultur {{30}}h (hitam) atau 24-h (merah). (C) Aktivitas ADCC ke setiap fraksi seluler sel CD4 plus dan CD8 plus T dari PBMC oleh ART-Fc, IgG1, atau silent-Fc anti-CTLA-4 mAbs (n=4 atau 5). Frekuensi sel mati di antara sel berlabel CTV setelah kultur {{40}}h ditunjukkan. (D) Ekspresi CTLA-4 oleh Fr. Sel Treg II setelah 9 hari stimulasi peptida Melan-A dan pengobatan 1 ug/mL ART-Fc, silent-Fc, atau IgG1 anti-CTLA-4 mAb untuk seluruh PBMC (n {{50 }}). (E dan F) Permukaan CTLA-4 ekspresi oleh Tet plus dan Tet− CD8 plus sel T setelah stimulasi peptida yang ditunjukkan. Histogram representatif (E) dan ringkasan intensitas fluoresensi rata-rata (MFI) (F) (Melan-A, n=9; CMV, n=9; Flu, n=3; ESO{{ 57}}, n=4). (G dan H) Plot representatif dan frekuensi Fr. II sel eTreg (G) dan CD8 spesifik antigen ditambah sel T (H) dari HD (n=6) atau pasien melanoma (n=5) setelah biakan dengan peptida terindikasi dan ART 1 ug/mL -Fc anti–CTLA-4 mAb seperti pada D. (I) Kuantifikasi frekuensi sel Treg (Atas) dan Tet plus CD8 plus sel T (Bawah) setelah 9 hari stimulasi antigen Melan-A atau CMV untuk PBMC HD dengan mAb anti-CTLA-4 terindikasi dalam G dan H. Berarti ± SEM. Signifikansi yang digambarkan antara kedua kelompok dihitung menggunakan uji-t berpasangan, ANOVA satu arah, atau ANOVA dua arah dengan uji HSD Tukey post hoc. *P Kurang dari atau sama dengan 0,05, **P Kurang dari atau sama dengan 0,01, ***P Kurang dari atau sama dengan 0,001, dan ****P Kurang dari atau sama dengan 0,0001.

Ekspansi Kuat dari CD8 plus Sel T Spesifik Antigen oleh Penipisan Sel eTreg Sebelum Stimulasi Antigen.

. Kami selanjutnya berusaha untuk menguras CTLA-4 plus sel Treg sebelum stimulasi antigen untuk mencegah CTLA yang diaktifkan antigen-4–mengekspresikan CD8 plus sel T dari pembunuhan oleh anti–CTLA-4 mAb. Kami membiakkan seluruh PBMC dari donor sehat atau pasien melanoma dengan adanya ART-Fc anti-CTLA-4 mAb selama 5 hari tanpa stimulasi antigen, menghilangkan mAb, kemudian menstimulasi sel dengan berbagai peptida selama 8 hari, dan menganalisisnya untuk rasio sel Treg dan Tet plus CD8 plus sel T di antara CD4 plus sel T atau CD8 plus sel T, masing-masing (Gbr. 3A). Rasio sel FOXP3hi Treg berkurang secara signifikan dalam 5 hari oleh pretreatment ART-Fc (Gbr. 3A dan Lampiran SI, Gbr. S6), dan dipertahankan pada level rendah selama stimulasi peptida berikutnya (Gbr. 3B), menunjukkan bahwa Treg sel belum sepenuhnya pulih selama periode stimulasi antigen. Pra-perawatan ART-Fc ini dikombinasikan dengan stimulasi antigen menginduksi ekspansi yang kuat dari CD8 plus sel T spesifik Melan-A dari PBMC donor yang sehat, dan CD8 plus sel T spesifik NY-ESO-1 dari PBMC pasien yang jaringan melanomanya diekspresikan NY-ESO-1 (Gbr. 3C). CD8 spesifik CMV plus sel T tidak banyak terpengaruh oleh penipisan Treg yang dimediasi oleh ART-Fc. Berbeda dengan ART-Fc, silent-Fc anti-CTLA-4 mAb tidak mengubah frekuensi sel Treg dan gagal memperluas Tet plus CD8 plus sel T terlepas dari spesies antigen (Gbr. 3D).

Salah satu dari berbagai mekanisme supresi yang digunakan oleh sel Treg adalah CTLA-4–regulasi ke bawah CD80 dan ekspresi CD86 yang bergantung pada sel dendritik (DC) (14, 15). Untuk menyelidiki kemungkinan kontribusi dari mekanisme ini terhadap perluasan CD8 plus sel T yang spesifik antigen-diri/tumor setelah pengobatan ART-Fc anti-CTLA-4 mAb in vitro, kami menilai ekspresi CD80 dan CD86 dengan DC, yang secara fenotip didefinisikan sebagai Lin-1− CD11c plus HLA-DR plus , dalam PBMC donor yang sehat. Baik ekspresi CD80 maupun CD86 menunjukkan pengaturan naik yang berbeda pada kelompok pra-perawatan ART-Fc, berbeda dengan ekspresi CD80/CD86 yang tidak diubah dalam IgG1- pra-perawatan yang tidak dimodifikasi, Fc diam – kelompok yang diberi perlakuan sebelumnya, atau tidak diberi perlakuan (Gbr. 3E). Selain itu, tingkat afinitas pengikatan Fc R dari mAbs memiliki korelasi yang baik dengan aktivitas penipisan Treg mereka dan juga dengan Tet plus CD8 plus aktivitas penginduksian sel T (Gbr. 3F). Karena hanya blokade CTLA-4 oleh silent-Fc tidak mengatur CD80/86, hasilnya menunjukkan bahwa penipisan Treg oleh DC yang diaktifkan ART-Fc, meskipun ada kemungkinan bahwa ART-Fc itu sendiri mungkin tambahan berkontribusi pada aktivasi DC melalui pengikatan afinitas tinggi ke reseptor Fc aktif mereka.

Secara keseluruhan, hasil ini menunjukkan bahwa penipisan Treg oleh ART-Fc anti-CTLA-4 mAb beberapa hari sebelum paparan antigen dapat mencegah pembunuhan CTLA-4 plus CD8 yang diaktifkan antigen plus sel T oleh antibodi, mengembangkannya, setidaknya sebagian, melalui peningkatan ekspresi CD80/CD86 oleh APC.

Gambar 3. Predeplesi sel Treg menggunakan ART-Fc anti-CTLA-4 mAb meningkatkan CD8 spesifik-antigen-sendiri/tumor plus respons sel T. (A – D) CD8 plus sel T spesifik antigen diinduksi dari seluruh PBMC HD (n=7) atau pasien (n=5) ​​setelah 5 hari pretreatment dengan ART-Fc anti-CTLA{ {11}} mAb. ( A ) Skema percobaan dan pewarnaan representatif FOXP3 dan CD45RA dari sel CD4 plus T pada hari ke −5 dan hari 0 percobaan. Ringkasan Fr. Frekuensi eTreg II pada hari 0 (Bawah). (B dan C) Representatif FOXP3 pewarnaan CD4 plus sel T (B) dan CD8 spesifik antigen plus sel T (C) dengan atau tanpa pretreatment ART-Fc untuk setiap peptida setelah kultur. Ringkasan Treg dan CD8 spesifik antigen plus frekuensi sel T setelah kultur (Bawah). (D) Ringkasan Fr. II eTreg dan Tet plus CD8 plus frekuensi sel T dengan pretreatment silent-Fc anti-CTLA-4 mAb alih-alih ART-Fc seperti pada A–C. (E) Tingkat ekspresi CD80 dan CD86 oleh Lin-1−CD11c plus HLA-DR plus DC setelah 5 hari stimulasi Melan-A dengan pretreatment anti-CTLA yang diindikasikan -4 mAb (n=6). Angka pada histogram menunjukkan LKM. (F) Ringkasan frekuensi Treg dan Tet plus CD8 plus sel T setelah pra-perawatan dengan mAb anti-CTLA -4 yang diindikasikan diikuti dengan stimulasi Melan-A26–35 seperti pada A–C. Berarti ± SEM. Signifikansi yang digambarkan antara kedua kelompok dihitung dengan menggunakan uji t berpasangan. *P Kurang dari atau sama dengan 0,05.

CTLA-4–Mediated Treg-Depletion Sebelum Vaksinasi Antigen Tumor Meningkatkan Respons Antitumor pada Tikus.

Untuk memvalidasi pada tikus temuan in vitro dengan PBMC manusia dan mAb anti-manusia CTLA-4, kami menghasilkan mAb dengan ADCC tinggi atau rendah dan aktivitas fagositosis seluler (ADCP) yang bergantung pada antibodi dari CTLA anti-tikus{{4 }} mAb (klon UC10) dari isotipe IgG2a (selanjutnya disebut mIgG2a) dengan substitusi asam amino dalam domain Fc (Gbr. 4A). Mutasi S239D di kedua rantai berat meningkatkan afinitas untuk tikus Fc RIV ∼ tujuh kali lipat (varian mFa55 mIgG2a), sementara mutasi L235R, G236R, dan S239K di kedua rantai berat membuat mereka tidak mengikat ke Fc Rs tikus (varian mFa31 mIgG2a); yang pertama disebut mouse ADCC/ADCP–enhanced-Fc (ditingkatkan), yang terakhir mouse silent-Fc (mSilent) mAb. Untuk membandingkan aktivitas antitumor dari mAbs anti-tikus–CTLA-4 yang dimodifikasi Fc ini dalam kombinasi dengan vaksinasi antigen tumor, kami secara subkutan menginokulasi ke dalam sel fibrosarcoma CMS5a tikus BALB/c yang mengekspresikan antigen NY-ESO-1 manusia, dan pada hari ke-9, ketika tumor terbentuk, obati tikus dengan 100 ug setiap mAb dan divaksinasi dengan peptida NY-ESO-1 pada hari yang sama (hari ke-9; selanjutnya kami sebut protokol "perawatan bersamaan") atau 3 hari kemudian (hari ke-12; selanjutnya disebut "Ab pre-treatment") (Gbr. 4B). Ab pretreatment dengan mEnhanced mAb lebih efektif daripada pengobatan bersamaan atau pretreatment dengan mIgG2a atau mSilent mAb dalam menghambat pertumbuhan tumor; efek dari dua mAb terakhir pada pertumbuhan tumor rendah dan tidak berbeda secara signifikan antara pretreatment Ab dan pengobatan bersamaan (Gbr. 4C). Kelangsungan hidup secara signifikan lebih baik pada tikus yang diobati dengan mAb mEnhanced, dan juga pada tikus dengan pengobatan bersamaan atau pretreatment dengan mIgG2a, meskipun salah satu cara pengobatan mIgG2a gagal menginduksi regresi tumor pada sebagian besar tikus (Gbr. 4 C dan D).

Gambar 4. Pretreatment dengan ADCC/ADCP-enhanced anti–CTLA-4 mAb menginduksi efek antitumor yang kuat pada tikus. (A) Ringkasan substitusi asam amino yang dilakukan pada bagian Fc CTLA anti-tikus-4 IgG2a mAb (klon UC10; mIgG2a) untuk menghasilkan anti-tikus–CTLA yang ditingkatkan ADCC/ADCP{{ 10}} (ditingkatkan) atau silent-Fc anti-mouse–CTLA-4 (mSilent) mAbs, dan afinitasnya terhadap mouse Fc RIV ditampilkan. Afinitas mAb mSilent berada di bawah batas deteksi uji BIACORE. (B– D) Skema percobaan (B). Tikus ditantang dengan 2 × 106 fibrosarcoma CMS5a yang mengekspresikan NY-ESO manusia-1 pada hari {{40}}, dan dibiarkan tidak diobati atau diobati dengan mEnhanced, mIgG2a, atau diam anti-tikus–CTLA-4 mAb pada hari ke-9. Vaksinasi NY-ESO-181–88 peptida yang dicampur dengan CFA dilakukan pada hari yang sama (hari ke-9, pengobatan bersamaan) atau 3 hari kemudian (hari 12, Ab pretreatment). Pertumbuhan tumor setiap tikus dengan garis tebal menunjukkan rata-rata setiap kelompok perlakuan (C) (n=8–13 per kelompok). Ringkasan pertumbuhan tumor rata-rata dari setiap kelompok perlakuan (D, Kiri). Tanda bintang menunjukkan nilai P antara kelompok pretreatment mAb mEnhanced dengan ANOVA dua arah dengan uji perbandingan berganda Tukey. Ringkasan tingkat kelangsungan hidup (D, Kanan) dari masing-masing kelompok perlakuan. Nilai P antara kelangsungan hidup masing-masing kelompok dan kelangsungan hidup kontrol vaksin saja dihitung dengan uji log-rank. Peristiwa kematian sesuai dengan panjang tumor lebih dari atau sama dengan 200 mm atau kematian tikus. *P Kurang dari atau sama dengan 0,05, **P Kurang dari atau sama dengan 0,01, ***P Kurang dari atau sama dengan 0,001, dan ****P Kurang dari atau sama dengan 0,0001.

Pretreatment mAb yang ditingkatkan juga menghasilkan peningkatan yang signifikan dalam jumlah sel CD8 plus T yang menginfiltrasi tumor dan rasio CD8 / Treg dalam TIL, meskipun persentase sel FOXP3 plus di antara sel CD4 plus T sedikit meningkat (Gbr. 5 A– C). Selain itu, sedangkan frekuensi NY-ESO-1 CD8 spesifik peptida plus TIL secara statistik tidak berbeda di antara tikus yang diobati dengan setiap mAb atau antara pra-perawatan dan pengobatan bersamaan, CD8 spesifik-antigen plus TIL dari mAb yang disempurnakan sebelum dirawat. tikus, dibandingkan dengan kelompok lain, menunjukkan produksi IL-2 dan IFN- yang lebih aktif secara signifikan pada restimulasi in vitro dengan peptida NY-ESO-1 (Gbr. 5 D dan E). Selain itu, memori efektor CD8 plus sel T didefinisikan sebagai populasi CD44highCD62Llow yang meningkat secara signifikan di antara NY-ESO-1–CD8 spesifik plus TIL pada tikus pra-perawatan mAb yang disempurnakan (Gbr. 5 F dan G).

Secara bersama-sama, pretreatment mAb mEnhanced paling efektif dalam membangkitkan kekebalan tumor, diikuti oleh pretreatment dengan mIgG2a, yang memiliki beberapa aktivitas ADCC, sementara mAb mSilent jauh kurang efektif. Hasilnya menunjukkan bahwa pra-perawatan tikus pembawa tumor dengan mAb anti-CTLA-4 yang ditingkatkan ADCC/ADCP diikuti dengan vaksinasi antigen tumor dapat secara efektif membangkitkan respons imun antitumor in vivo.

Diskusi

Temuan utama dalam laporan ini adalah: (i) sel eTreg yang berdiferensiasi akhir dan sangat supresif melimpah di jaringan tumor dan mengekspresikan CTLA permukaan-4 pada tingkat yang lebih tinggi daripada CD8 plus sel T yang menginfiltrasi tumor; (ii) mAb anti–CTLA-4 dengan aktivitas ADCC tinggi mampu menguras/mengurangi CTLA-4sel eTreg tinggi dan CTLA-4 plus efektor CD8 plus sel T; dan (iii) mAb anti-CTLA-4 penipisan sel dapat membangkitkan dan meningkatkan kekebalan tumor yang efektif ketika rejimen pengobatan antibodi dirancang untuk tidak memengaruhi CTLA-4 plus efektor CD8 plus sel T, misalnya, dengan mengubah waktu penipisan sel Treg dan vaksinasi antigen kanker.

Aktivitas ADCC anti-CTLA-4 mAb adalah penentu utama keefektifan pengurangan eTreg dan perluasan yang dihasilkan dari CD8 plus sel T tumor-reaktif. Mendukung gagasan tersebut, kami menunjukkan bahwa anti-CTLA-4 mAb (ART-Fc) dengan peningkatan aktivitas ADCC (dan/atau aktivitas ADCP pada tikus) mampu meningkatkan respons imun antitumor in vitro pada manusia dan in vivo pada tikus dengan menghabiskan CTLA-4–mengekspresikan sel Treg. Anti–CTLA4 mAbs (silent-Fc) yang dimodifikasi untuk memperlihatkan lebih sedikit atau tidak ada aktivitas ADCC gagal menunjukkan aktivitas antitumor tersebut, bahkan jika mereka memiliki spesifisitas yang sama untuk epitop molekul CTLA-4. Masih belum jelas pada manusia apakah efek antitumor ipilimumab dengan bagian IgG1 Fc dikaitkan dengan blokade molekul CTLA4 atau penipisan sel pengekspres CTLA-4 oleh ADCC. Ditunjukkan pada tikus bahwa peningkatan kekebalan antitumor oleh anti-CTLA-4 mAb membutuhkan penipisan sel Treg yang menginfiltrasi tumor oleh ADCC yang dimediasi Fc R (19-21, 26, 27). Demikian pula, antibodi terhadap molekul GITR, OX40, dan CD25, di mana sel Treg yang menginfiltrasi tumor mengekspresikan jumlah tertinggi, terbukti bergantung pada penipisan sel Treg yang dimediasi oleh ADCC dalam penolakan tumor (19, 26, 28). Juga dilaporkan bahwa pengobatan ipilimumab pada pasien melanoma secara signifikan mengurangi FOXP3 plus sel Treg dalam jaringan tumor, terutama pada responden klinis (29).

Selain itu, laporan baru-baru ini menunjukkan bahwa, di antara pasien melanoma dengan beban mutasi tumor yang tinggi, mereka yang secara genetik memiliki varian Fc RIIIa dengan afinitas tinggi dengan ADCC yang ditingkatkan (varian V158, berlawanan dengan varian afinitas rendah F158) menunjukkan secara signifikan lebih baik. tanggapan klinis terhadap pengobatan ipilimumab dan kelangsungan hidup keseluruhan yang lebih baik (27). Temuan ini mendukung gagasan bahwa anti-CTLA-4 mAb dengan aktivitas penipisan Treg yang lebih baik mungkin lebih efektif daripada ipilimumab dalam imunoterapi kanker. Dengan demikian kemungkinan bahwa ART-Fc anti-CTLA4 mAb, yang memiliki afinitas tinggi untuk varian V158 (KD=3.7 × 10−10 M, dibandingkan dengan 3,1 × 10−6 M untuk ipilimumab atau IgG1) , mungkin memiliki kemanjuran klinis yang lebih baik dalam imunoterapi kanker melalui penipisan sel Treg. Secara keseluruhan, temuan pada manusia dan tikus ini menunjukkan bahwa mAb anti-CTLA-4 ADCC/ADCP yang tinggi dapat efektif dalam membangkitkan dan meningkatkan kekebalan tumor melalui penipisan sel Treg.

Gambar 5. Respon CD8 plus sel T spesifik Ag yang diinduksi pada tikus yang mengandung tumor dengan pretreatment dengan anti-CTLA-4 mAb yang ditingkatkan ADCC/ADCP. (A – G) TIL dari Gambar. 4 dianalisis 19 hari setelah implantasi tumor (n=4–6 per kelompok). Jumlah sel T yang disusupi per gram tumor (A). Rasio sel CD8/Treg (B). Frekuensi sel Foxp3 plus Treg di antara CD4 plus sel T (C). Plot representatif dari IL-2 plus IFN- plus CD8 plus sel T (D). Produksi sitokin diukur dengan menstimulasi ulang TIL dengan ESO-181–88 peptida in vitro selama 5 jam. Ringkasan Tet plus CD8 plus sel T di tumor, dan IL{{20}} plus IFN- plus CD8 plus sel T di D setelah restimulasi (E). Plot representatif (F) dan ringkasan (G) dari ekspresi CD44 dan CD62L oleh NY-ESO-1-Tet plus CD8 plus sel T dalam tumor dari setiap kelompok perlakuan. Data diperoleh dari tiga percobaan independen. Nilai P antara Naïve atau EM CD8 plus himpunan bagian sel T dari setiap kondisi. Berarti ± SEM. *P Kurang dari atau sama dengan 0.05, † P Kurang dari atau sama dengan 0.05, **P Kurang dari atau sama dengan 0,01, ††P Kurang dari atau sama dengan 0,01, dan ***P Kurang dari atau sama dengan 0,001 dengan ANOVA dua arah dengan uji perbandingan berganda Tukey.

Bahan dan metode

Sampel Donor.

Sampel darah tepi diperoleh dari individu sehat atau pasien dengan melanoma stadium III hingga IV. PBMC diisolasi oleh gradien kepadatan dengan Ficoll-Paque (GE Healthcare). TIL diperoleh dari jaringan melanoma yang direseksi. Tumor dicincang, dan suspensi sel tunggal dihasilkan setelah disosiasi MACS yang lembut (Miltenyi) disiapkan dengan menyaring melalui saringan sel 40-μm. Semua donor memberikan persetujuan tertulis sebelum pengambilan sampel sesuai dengan Deklarasi Helsinki. Penelitian ini telah disetujui oleh Institutional Review Board of Osaka University.

Analisis CyTOF.

TIL dan splenosit dari tikus yang mengandung tumor diperkaya untuk sel CD3 plus dan diwarnai dengan 198-cisplatin untuk diskriminasi sel mati dan panel antibodi termasuk antibodi terkonjugasi logam berikut: 172Yb-CD4 (RM4-5 ), 168Er-CD8 (53-6.7), 164Dy-CTLA-4 (UC-10), 158GdFOXP3 (FJK-16s). Untuk PBMC dan TIL manusia, suspensi sel diberi barcode oleh antibodi anti-CD45 dengan berbagai konjugat logam, seperti yang dijelaskan sebelumnya (35), sebelum pewarnaan dengan 198-cisplatin untuk diskriminasi sel mati dan kemudian pewarnaan antibodi dengan panel berikut. Antibodi terkonjugasi logam diperoleh dari Kit Pelabelan Antibodi Fluidigm atau Maxpar (Fluidigm) digunakan sesuai dengan instruksi pabrik untuk mengkonjugasi antibodi yang dimurnikan: 89Y-CD45 (klon: HI30; Fluidigm), 115In-CD45 (HI30; Biolegend), 175Yb- Antibodi CD45 (HI30; Biolegend) digunakan untuk barcode sampel yang berbeda; CLA-FITC (HECA-452; BD), CCR8-PE (L263G8; Biolegend), CXCR5-Biotin (RF8B2; BD), eVolve 605 (114 Cd)-CD8a (RPA -T8; eBioscience), 139La-CD123 (6H6; Biolegend), 141Pr-CCR6 (11A9; Fluidigm), 142Nd-CD14 (M5E2; Biolegend), 144Nd-FITC (CLA) (FIT22; Fluidigm), 145NdCD4 (RPA-T4 ; Fluidigm), 148Sm-CD20 (2H7; Biolegend), 149Sm-CCR4 (205410; Fluidigm), 150Nd-SAV (CXCR5) (1D4-C5; Fluidigm), 151Eu-ICOS (C398.4A; Fluidigm) , 152Sm-CD69 (FN50; Biolegend), 153Eu-CD45RA (HI100; Fluidigm), 154Sm-CD3 (UCHT1; Fluidigm), 155Gd-CD197 (CCR7) (150503; Sistem Litbang), 156Gd-anti-PE (CCR8) ( PE001; Fluidigm), 158Gd-CD27 (L128; Fluidigm), 159TbCD19 (HIB19; Biolegend), 160Gd-CD39 (A1; Fluidigm), 163Dy-CXCR3 (G025H7; Fluidigm), 164Dy-CD95 (DX2; Fluidigm), 165Ho- CD45RO (UCHL1; Fluidigm), 166Er-CD279 (PD-1) (EH12.2H7; Biolegend), 167Er-PDL1 (29E.2A3; Biolegend), 169Tm-CD25 (IL-2R) ( 2A3; Fluidigm), 171Yb-CD11c (3.9; Biolegend), 172YbCD38 (HIT2; Fluidigm), 173Yb-TIGIT (MBSA43; eBioscience), 174Yb-HLA-DR (L243; Fluidigm), 176Yb-CD127 (IL-7R) (A019D5; Fluidigm), 209Bi-CD11b (ICRF44; Fluidigm), 146Nd-Helios (22F6; Biolegend), 161Dy–CTLA-4 (14D3; Fluidigm), 162Dy-FOXP3 (236A/E7; eBioscience), dan 168Er-Ki-67 (Ki-67; Fluidigm).

Sel manusia dan tikus difiksasi dengan eBioscience Foxp3 / buffer pewarnaan faktor transkripsi (ThermoFisher) sebelum pewarnaan intraseluler. Sel-sel yang diwarnai kemudian disuspensikan kembali dalam PFA 2 persen dengan 191/193-interkalator DNA iridium (Fluidigm) semalaman kemudian dicuci dan disuspensikan kembali dalam air Maxpar (Fluidigm) dan manik-manik empat elemen EQ (Fluidigm) segera sebelum analisis dengan Helios CyTOF sistem (fluidagma). Data yang dinormalisasi dianalisis dengan Cytobank Premium.

Stimulasi CD8 plus Sel T Antigen-Spesifik.

Seluruh PBMC dari individu sehat dan pasien melanoma distimulasi dengan 10 μM peptida pendek khusus untuk HLA-A*0201 (Operon Biotechnology) selama 8–9 hari: Melan-A26–35 (EAAGIGILTV), CMV495–503 (NLVPMVATV), Flu58 –66 (GILGFVFTL), atau NY-ESO1157–165 (SLLMWITQC) (12, 22). Untuk menentukan efek anti-CTLA-4 mAb dengan berbagai ADCC, salah satu mAb berikut ditambahkan ke kultur pada 1 ug/mL (kecuali dinyatakan lain) pada hari yang sama atau 5 hari sebelum stimulasi antigen: ADCC -anti-human–CTLA yang disempurnakan-4 IgG1 (MDX-010-ART-Fc), anti-CTLA konvensional yang tidak dimodifikasi-4 IgG1 (MDX-010-IgG1), atau silent-Fc antibodi anti–CTLA-4 IgG1 (MDX-010-silent-Fc): Semua mAb disediakan oleh Chugai Pharmaceutical. Separuh media diganti dengan media segar yang mengandung 10 U/mL IL-2 dan 40 ng/mL IL-7 setiap 3 hari.

Uji Pelepasan Dehidrogenase Laktat dengan CTLA Manusia-4–Mengekspresikan Sel CHO.

Uji pelepasan laktat dehidrogenase (LDH) dilakukan untuk menentukan aktivitas ADCC dalam PBMC. Sel CHO DG44-hCTLA4 (dari Chugai Pharmaceutical) diunggulkan ke 96-pelat dasar bulat (1 × 104 sel per sumur), dan diinkubasi dengan berbagai konsentrasi mAb selama 15 menit. PBMC yang diperoleh dari donor sehat kemudian ditambahkan ke kultur dengan rasio efektor terhadap target (E∕T) 50:1. Sel diinkubasi pada 37 derajat , 5 persen CO2 selama 6 atau 24 jam, 100μL supernatan dari masing-masing sumur dikumpulkan dan absorbansi 492 nm dan 630 nm diukur menggunakan Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (Instrumen BioTek). Pelepasan LDH dianggap maksimum setelah inkubasi sel dalam larutan Nonidet P-40 1 persen. Sitotoksisitas ( persen ) ditentukan dari formula; (AC)∕(BC) × 100, di mana A, B, dan C masing-masing mewakili pelepasan LDH dari setiap percobaan, pelepasan LDH maksimum, dan pelepasan LDH latar belakang. Semua percobaan dilakukan dalam rangkap dua.

Uji ADCC dengan PBMC Manusia yang Baru Diisolasi.

PBMC dari donor sehat diurutkan FACS untuk setiap fraksi sel T dan sel Treg diberi label sebelumnya dengan CellTrace Violet (CTV; ThermoFisher), dan dikultur dengan sel non-T, sebagai sel efektor, dengan rasio target-ke-efektor 1:50. Selanjutnya, 1 ug/mL anti–CTLA–4 mAb terindikasi ditambahkan ke serum AB manusia 10 persen yang mengandung media RPMI1640 dengan 5 IU/mL IL-2. Setelah kultur 24-jam pada suhu 37 derajat , frekuensi sel mati, yang ditunjukkan dengan pewarnaan HIDUP/MATI yang dapat diperbaiki (ThermoFisher), di antara sel CTV plus dinilai oleh FACS.

Eksperimen Tumor Murine.

Tikus BALB/c berumur enam hingga 7- minggu dibeli dari CLEA Jepang dan dipelihara dalam kondisi bebas patogen tertentu. Tikus ditantang secara subkutan dengan 2 × 106 CMS5a-NY-ESO-1. Sembilan hari setelah implantasi tumor, tikus menerima 100 ug mAb anti-tikus–CTLA4 (klon UC-10; mIgG2a, mEnhanced, atau mSilent, dari Chugai Pharmaceutical) secara intravena. varian mEnhanced (varian mFa55 mIgG2a) dihasilkan oleh mutasi S239D di domain CH2 dan menunjukkan peningkatan afinitas pengikatan ke Fc RIV tikus sekitar tujuh kali lipat dibandingkan dengan mIgG2a tipe liar. Tikus diobati dengan vaksinasi 100 ug ESO-181–88 peptida (Operon Biotechnology) dicampur dengan 200 μL CFA/PBS (rasio 1:1) baik pada hari yang sama (hari ke-9, pengobatan bersamaan) atau 3 d kemudian (hari ke-12, Ab pretreatment) secara subkutan. Ukuran tumor diukur setiap 3-4 hari. Eksperimen telah disetujui oleh Institutional Review Board dan dilakukan sesuai dengan peraturan Universitas Osaka.

Aliran Sitometri.

Seperti dijelaskan sebelumnya (12, 23), sel T dan CD8 spesifik antigen yang dihasilkan secara in vitro diwarnai dengan Melan-A, CMV, atau Flu tetramer (TC Matrix) berlabel PE atau NY-ESO berlabel PE-1 tetramer (MBL) selama 10 menit pada 37 derajat, dan kemudian diwarnai dengan berbagai mAbs permukaan. Untuk pewarnaan CTLA permukaan-4 dalam penelitian ini, antibodi CD152 biotinilasi-anti-manusia (klon BNI3; BD Biosciences) digunakan pada 4 derajat selama 15 menit dengan antibodi lain terhadap molekul permukaan. Setelah dicuci, kami menambahkan APC-streptavidin (Biolegend) juga pada suhu 4 derajat selama 15 menit untuk menghindari pewarnaan molekul CTLA-4 yang tereksternalisasi ke permukaan setelah kondisi pewarnaan yang diperpanjang pada suhu 37 derajat . Prosedur pewarnaan ini dilakukan sebelum fiksasi dan permeabilisasi, seperti yang dijelaskan dalam penelitian kami sebelumnya (24).

Pewarnaan FOXP3 intraseluler dilakukan dengan menggunakan set Penyangga Pewarnaan Faktor Transkripsi FOXP3 (eBioscience). Antibodi berikut dengan label fluoresen terindikasi digunakan untuk pewarnaan sel manusia: PerCP/Cy5.5-CCR7 (150503; BD Biosciences), FITC-CD45RA (HI100; BD Biosciences), biotin–CTLA-4 (BNI3 ; BD Biosciences), APC-Streptavidin (BioLegend), V500-CD8 (RPA-T8; BD Biosciences), BrilliantViolet711-CD3 (OKT3; Biolegned), AlexaFluor700-CD4 (RPA -T4; eBioscience), campuran FITC-Lineage (BD Biosciences), PerCP/Cy5.5-CD11c (3.9; BioLegend), APC-HLA-DR (LN3; eBioscience), PE-CD86 (IT2.2; eBioscience), AlexaFluor700-CD80 (L307.4; BD Biosciences), PE-FOXP3 (236A/E7; eBioscience), dan pewarna viabilitas yang dapat diperbaiki eFluor780 (eBioscience). Antibodi berikut digunakan untuk mewarnai sel tikus: V500-CD8 (53-6.7; BD Biosciences), PE-Cy7-CD3e (145-2C11; eBiosciences), eFluor 450-CD4 (RM4-5; eBioscience), APC-CD25 (PC61.5; eBioscience), PE-FOXP3 (FJK-16s; eBioscience), FITC–IFN- (XMG1. 2; BD Biosciences), AlexaFluor647-IL-2 (JES6-5H4; eBiosciences) dan pewarna kelayakan yang dapat diperbaiki eFluor780 (eBioscience). TIL CD8 plus sel T spesifik antigen dari tikus diwarnai dengan berlabel PE, H-2Dd -restricted ESO-181–88 tetramers (TC Matrix), seperti dijelaskan di atas. Untuk mengukur produksi sitokin dari CD8 plus sel T, TIL tikus direstimulasi selama 5 jam pada suhu 37 derajat dengan adanya 10 μM ESO-181–88 peptida yang sama yang digunakan untuk vaksinasi dengan GolgiPlug (BD Bioscience). Fiksasi dan permeabilisasi dilakukan dengan set buffer Cytofix / Cytoperm (BD Bioscience). Sel diperoleh dengan LSR Fortessa (BD Bioscience) dan dianalisis menggunakan perangkat lunak FlowJo v9.9.5.

Analisis statistik

Uji-t berpasangan dua sisi digunakan untuk mengevaluasi signifikansi antara kedua kelompok. ANOVA satu arah atau dua arah dengan uji perbedaan signifikan jujur ​​(HSD) post hoc Tukey digunakan untuk membandingkan beberapa kelompok. Semua analisis statistik dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak Prism v6 (GraphPad). Nilai P < 0.05 dianggap signifikan.

UCAPAN TERIMA KASIH.

Kami berterima kasih kepada anggota Departemen Dermatologi, Sekolah Pascasarjana Kedokteran, Universitas Osaka untuk mengumpulkan sampel pasien; dan K. Teshima, T. Shimizu, dan N. Mizoguchi untuk bantuan teknis. Antibodi anti-manusia dan tikus CTLA-4 yang dibuat dan disediakan oleh Chugai Pharmaceutical Co., Ltd. Studi ini didukung oleh Grant-in-Aid for Specially Promoted Research 16H06295 (to SS), Grants-in-Aid untuk Penelitian Ilmiah (A) 26253030 (kepada SS), dan (B) 26290054 (kepada HN), Grantin-Aid untuk Riset Eksplorasi yang menantang 26670581 (kepada HN), dan Grant-inAid untuk Ilmuwan Muda (B) 26860331 dan 17K15723 (kepada A. Tanaka) dari Kementerian Pendidikan, Kebudayaan, Olahraga, Sains dan Teknologi Jepang; dan Core Research for Evolutional Science and Technology dari Japan Science and Technology Agency (SS). Studi ini sebagian dilakukan sebagai program penelitian dari Project for Development of Innovative Research on Cancer Therapeutics (P-DIRECT), dan Practical Research for Innovative Cancer Control, dan Project for Cancer Research and Therapeutic Evolution (P-CREATE) oleh Jepang Badan Penelitian dan Pengembangan Kedokteran.

1. Sakaguchi S (2004) CD4 yang timbul secara alami ditambah sel T regulator untuk toleransi diri imunologi dan kontrol negatif respon imun. Annu Rev Immunol 22:531–562.

2. Zou W (2006) Sel T regulatori, imunitas tumor, dan imunoterapi. Nat Rev Immunol 6:295–307.

3. Tanaka A, Sakaguchi S (2017) Sel T pengatur dalam imunoterapi kanker. Sel Res 27: 109–118.

4. Quezada SA, Peggs KS, Curran MA, Allison JP (2006) Blokade CTLA4 dan imunoterapi kombinasi GM-CSF mengubah keseimbangan intratumor efektor dan sel T pengatur. J Clin Investasikan 116:1935–1945.

5. Shimizu J, Yamazaki S, Sakaguchi S (1999) Induksi kekebalan tumor dengan menghilangkan sel CD25 plus CD4 plus T: Dasar umum antara imunitas tumor dan autoimunitas. J Immunol 163:5211–5218.

6. Serigala AM, dkk. (2003) Peningkatan sel T regulator dalam darah tepi pasien kanker. Klinik Kanker Res 9:606–612.

7. Curiel TJ, dkk. (2004) Rekrutmen spesifik sel T regulatori pada karsinoma ovarium memupuk hak istimewa kekebalan dan memprediksi penurunan kelangsungan hidup. Nat Med 10:942–949.

8. Petersen RP, dkk. (2006) Tumor-infiltrating Foxp3 plus sel-T pengatur berhubungan dengan kekambuhan pada pasien NSCLC stadium I patologis. Kanker 107:2866–2872.

9. Shang B, Liu Y, Jiang SJ, Liu Y (2015) Nilai prognostik FoxP3 yang menginfiltrasi tumor plus sel T pengatur pada kanker: Tinjauan sistematis dan meta-analisis. Sains Rep 5:15179.

10. Miyara M, dkk. (2009) Delineasi fungsional dan dinamika diferensiasi sel CD4 plus T manusia yang mengekspresikan faktor transkripsi FoxP3. Kekebalan 30:899–911.

11. Wing JB, dkk. (2017) Sebuah subpopulasi yang berbeda dari sel pengatur folikel CD25− T terlokalisasi di pusat germinal. Proc Natl Acad Sci USA 114:E6400–E6409.

12. Saito T, dkk. (2016) Dua subpopulasi sel T FOXP3( plus ) CD4 ( plus ) secara jelas mengontrol prognosis kanker kolorektal. Nat Med 22:679–684.

13. Sugiyama D, dkk. (2013) Anti-CCR4 mAb secara selektif menghabiskan FoxP3 tipe efektor plus CD4 plus sel T regulator, membangkitkan respons imun antitumor pada manusia. Proc Natl Acad Sci USA 110:17945–17950.

14. Shevach EM (2009) Mekanisme dari foxp3 ditambah T pengaturan cell-mediated supresi. Kekebalan 30:636–645.

15. Wing K, dkk. (2008) Kontrol CTLA-4 atas Foxp3 plus fungsi sel T pengatur. Sains 322:271–275.

16. Qureshi OS, dkk. (2011) Trans-endositosis CD80 dan CD86: Basis molekuler untuk fungsi ekstrinsik sel CTLA-4. Sains 332:600–603.

17. Hodi FS, dkk. (2010) Peningkatan kelangsungan hidup dengan ipilimumab pada pasien dengan melanoma metastatik. N Engl J Med 363:711–723.

18. Robert C, dkk. (2011) Ipilimumab plus dacarbazine untuk melanoma metastatik yang sebelumnya tidak diobati. N Engl J Med 364:2517–2526.

19. Bulliard Y, dkk. (2013) Mengaktifkan reseptor Fc berkontribusi pada aktivitas antitumor dari antibodi penargetan reseptor imunoregulasi. J Exp Med 210:1685–1693.

20. Simpson TR, dkk. (2013) Penipisan sel T regulator yang menginfiltrasi tumor yang bergantung pada Fc menentukan bersama kemanjuran terapi anti-CTLA-4 terhadap melanoma. J Exp Med 210:1695–1710.

21. Selby MJ, dkk. (2013) Antibodi anti-CTLA-4 dari isotipe IgG2a meningkatkan aktivitas antitumor melalui pengurangan sel T pengatur intratumoral. Cancer Immunol Res 1: 32–42.

22. Nimmerjahn F, Ravetch JV (2008) reseptor Fcgamma sebagai pengatur respon imun. Nat Rev Immunol 8:34–47.

23. Mimoto F, dkk. (2013) Novel varian Fc antibodi yang direkayasa secara asimetris dengan afinitas dan spesifisitas pengikatan Fc R yang superior dibandingkan dengan varian Fc fukosilasi. MAbs 5:229–236.

24. Maeda Y, dkk. (2014) Deteksi CD8 reaktif diri ditambah sel T dengan fenotipe anergik pada individu sehat. Sains 346:1536–1540.

25. Gnjatic S, dkk. (2006) NY-ESO-1: Tinjauan antigen tumor imunogenik. Adv Cancer Res 95:1–30.

26. Arce Vargas F, dkk.; Konsorsium Melanoma TRACERx; Konsorsium TRACERx Ginjal; Lung TRACERx Consortium (2017) Anti-CD25 yang dioptimalkan Fc menghabiskan sel T pengatur yang menginfiltrasi tumor dan bersinergi dengan blokade PD-1 untuk memberantas tumor yang sudah ada. Kekebalan 46:577–586.

27. Arce Vargas F, dkk.; TRACERx Melanoma; TRACERx Ginjal; TRACERx Lung consortia (2018) Fungsi efektor Fc berkontribusi pada aktivitas antibodi anti-CTLA-4 manusia. Sel Kanker 33:649–663.e4.

28. Bulliard Y, dkk. (2014) Keterlibatan OX40 menghabiskan Treg intratumoral melalui pengaktifan Fc Rs, yang mengarah pada kemanjuran antitumor. Biol Sel Immunol 92:475–480.

29. Romano E, dkk. (2015) Sitotoksisitas yang dimediasi sel yang bergantung pada Ipilimumab dari sel T regulator ex vivo oleh monosit nonklasik pada pasien melanoma. Proc Natl Acad Sci USA 112:6140–6145.

30. Walker LSK, Sansom DM (2011) Peran CTLA4 yang muncul sebagai pengatur sel-ekstrinsik dari respons sel T. Nat Rev Immunol 11:852–863.

31. Linsley PS, dkk. (1996) Perdagangan intraseluler CTLA-4 dan lokalisasi fokus menuju situs keterlibatan TCR. Kekebalan 4:535–543.

32. Egen JG, Allison JP (2002) Akumulasi antigen limfosit T sitotoksik-4 dalam sinaps imunologi diatur oleh kekuatan sinyal TCR. Kekebalan 16:23–35.

33. Ko K, dkk. (2005) Pengobatan tumor lanjut dengan mAb anti-GITR agonistik dan efeknya pada Foxp3 plus CD25 plus CD4 plus sel T regulator yang menginfiltrasi tumor. J Exp Med 202: 885–891.

34. Prieto PA, dkk. (2012) Blokade CTLA-4 dengan ipilimumab: Tindak lanjut jangka panjang dari 177 pasien dengan melanoma metastatik. Klinik Kanker Res 18:2039–2047.

35. Mei HE, Leipold MD, Schulz AR, Chester C, Maecker HT (2015) Barcoding sel mononuklear darah tepi manusia hidup untuk multiplexed mass cytometry. J Immunol 194:2022–2031.

Danbee Haa,b, Atsushi Tanakaa , Tatsuya Kibayashia,c, Atsushi Tanemurad , Daisuke Sugiyamaa,1, James Badger Winga , Ee Lyn Lima , Karen Wei Weng Tenge , Dennis Adeegbea,2, Evan W. Newelle , Ichiro Katayamad , Hiroyoshi Nishikawaa, 1,3, dan Shimon Sakaguchia,b,4.

sebuah Imunologi Eksperimental, Pusat Penelitian Perbatasan Imunologi, Universitas Osaka, 565-0871 Osaka, Jepang; b Laboratorium Imunologi Eksperimental, Departemen Sains dan Teknik Regenerasi, Institut Kehidupan Perbatasan dan Ilmu Kedokteran, Universitas Kyoto, 606-8507 Kyoto, Jepang; c Divisi Riset, Chugai Pharmaceutical Co., Ltd., 247-8530 Kanagawa, Jepang; d Departemen Dermatologi, Sekolah Pascasarjana Kedokteran, Universitas Osaka, 565-0871 Osaka, Jepang; dan e Agency for Science, Technology, and Research, Singapore Immunology Network, 138632 Singapore.

Dikontribusikan oleh Shimon Sakaguchi, 23 November 2018 (dikirim untuk ditinjau 19 Juli 2018; ditinjau oleh Miyuki Azuma dan Sergio A. Quezada).

For more information:1950477648nn@gmail.com