Kronotoksisitas Ginjal yang Berbeda Dari Bromobenzene Dan Metabolit Antaranya Pada Mencit

Bromobenzene (BB) diketahui menimbulkan ancaman serius bagi kesehatan manusia. Kami sebelumnya menunjukkan bahwa BB menunjukkan kronotoksisitas, yaitu fluktuasi harian dalam tingkat keparahan hepatotoksisitas yang diinduksi pada tikus. Meskipun BB menunjukkan nefrotoksisitas ringan, fluktuasi harian tidak diamati pada toksisitas ini. Ini mungkin dikaitkan dengan fakta bahwa kronotoksisitas yang diinduksi BB hanya diamati di hati dan tidak diginjaldan bahwa kerusakan yang disebabkan oleh BB menonjol di hati, menutupi fluktuasi harian nefrotoksisitas. Untuk mengkonfirmasi dua kemungkinan ini, kami memeriksa fluktuasi harian nefrotoksisitas karena metabolit antara BB yang menargetkanginjal: 3-bromophenol, bromohydroquinone, dan 4-bromocatechol. Tikus disuntik dengan 3-bromophenol, bromohydroquinone, atau 4-bromocatechol secara intraperitoneal pada enam titik waktu yang berbeda dalam satu hari (waktu zeitgeber (ZT): ZT2, ZT6, ZT10, ZT14, ZT18, atau ZT22). Kematian dipantau selama 7 hari pasca injeksi. Tikus lebih sensitif terhadap toksisitas akut metabolit ini di sekitar paparan ZT14 (fase gelap) daripada di sekitar paparan ZT2 (fase terang). Selanjutnya, tikus yang diberikan dengan dosis non-mematikan 4-bromocatechol menunjukkan peningkatan yang signifikan dalam kadar nitrogen urea darah plasma danginjalmalondialdehid pada paparan ZT14. Selain itu, glutathione peroksidase-4, indikator ferroptosis, dilemahkan pada paparan ZT14. Hasil ini menunjukkan toksisitas metabolit BB lebih tinggi selama paparan fase gelap, dan menunjukkan alasan mengapa variasi diurnal nefrotoksisitas oleh BB tidak diamati dalam laporan kami sebelumnya adalah bahwaginjalkerusakantertutup karena kerusakan hati yang parah.

Klik untuk Cistanche tubulosa Tablets untuk penyakit ginjal

Kata kunci bromobenzena; variasi harian; ritme sirkadian; kronotoksisitas;ginjal

PENGANTAR

Bromobenzena (BB) adalah reagen industri umum yang biasanya digunakan sebagai bahan baku sintesis obat-obatan, pewarna, dan pestisida.1,2) BB merupakan polutan organik yang merusak lingkungan alam dan merupakan ancaman serius bagi kesehatan manusia. . Satu studi menyatakan bahwa BB menginduksi hepatotoksisitas berat dan ringanginjaltoksisitas pada tikus.3) Meskipun BB itu sendiri, bentuk non-metabolit, memiliki toksisitas rendah, metabolit perantaranya memiliki efek toksik pada hati danginjal. CYP450s hati, seperti CYP1A2, CYP1B1, dan CYP2E1, memetabolisme BB menjadi empat metabolit: 3-bromophenol (3-BrP), bromohydroquinone (BrHQ), 4-bromocatechol (4- BrC), dan BB-3,4-oksida. BB-3,4-oksida menunjukkan hepatotoksisitas yang tinggi dan metabolit lainnya menunjukkan nefrotoksisitas,4-6) menunjukkan bahwa metabolit ini memiliki organ target yang berbeda.

Dalam penelitian ini, kami menargetkan "kronotoksikologi" karena kami sebelumnya telah menyarankan hubungan antara waktu pemberian dan tingkat keparahan toksisitas bahan kimia.7-9) Penelitian kami sebelumnya menunjukkan fluktuasi harian yang penting dalam tingkat keparahan respons toksik terhadap BB pada tikus, yaitu , tikus lebih toleran terhadap cedera hati yang diinduksi BB selama paparan fase gelap (2:00) dibandingkan selama paparan fase terang (14:00).8) Meskipun BB menunjukkan nefrotoksisitas ringan , kronotoksisitas tidak diamati padaginjal. Dengan demikian, kronotoksisitas yang diinduksi BB mungkin hanya diamati di hati dan tidak diginjal. Dalam penelitian kami sebelumnya, streptomisin, antibiotik yang diketahui menginduksi nefrotoksisitas, menunjukkan variasi diurnal yang jelas dalam induksi nefrotoksisitas pada tikus. 9) Berdasarkan data yang tersedia, kami berhipotesis bahwa kronotoksisitas yang disebabkan oleh BB lebih menonjol di hati daripada di ituginjal, sehingga menutupi kronotoksisitas di organ yang terakhir. Metabolit BB yang dihasilkan melalui berbagai jalur metabolisme terjadi dalam konsentrasi rendah dan dengan demikian dapat menyebabkan kerusakan ginjal yang dapat diabaikan; karena ini, nefrotoksisitas yang diinduksi metabolit BB tidak dapat diperkirakan secara klinis. Dalam penelitian ini, kami menguji variasi diurnal dalam nefrotoksisitas metabolit antara BB: 3-BrP, BrHQ, dan 4-BrC (Gbr. 1).

BAHAN DAN METODE

Perawatan Hewan

Tikus ICR jantan dibeli dari Japan SLC Inc. (Shizuoka, Jepang) dan dipelihara dalam kondisi standar suhu terkontrol (24 ± 1 derajat ), kelembaban (55 ± 5 persen ), dan cahaya (12: 12-jam siklus terang/gelap, lampu menyala pada pukul 08: 00), dengan akses gratis ke air dan makanan. Perlakuan eksperimental dilakukan dengan menggunakan hewan berumur 7-minggu. Setelah percobaan selesai, mencit yang masih hidup dikorbankan menggunakan pentobarbital. Semua eksperimen telah disetujui oleh Institutional Animal Care and Experiment Committee Universitas Kinjo Gakuin.

Protokol Eksperimental

Untuk uji kematian, tikus ICR jantan berumur {{0}}minggu menerima injeksi intraperitoneal (ip) tunggal 500 mg/kg 3-BrP, 180 mg/kg BrHQ, atau 220 mg/kg 4-BrC (pada volume 0,1 mL/10 g berat badan; Tokyo Kasei Corp, Tokyo, Jepang). Dosis ini ditentukan sesuai dengan nilai LD50 dalam lembar data keselamatan untuk setiap bahan kimia. Untuk injeksi setiap metabolit, tikus ditugaskan ke enam kelompok yang masing-masing terdiri dari lima hewan. Metabolit BB diberikan pada enam titik waktu yang berbeda (waktu jam: 10:00, 14:00, 18:00, 22:00, 02 : {{21 }}, dan 06 : 00), digambarkan sebagai waktu zeitgeber (ZTs): ZT2, ZT6, ZT10, ZT14, ZT18, dan ZT22. Tikus kontrol menerima volume saline yang sama. Kematian dipantau selama 7 hari pasca injeksi.

Untuk menganalisis variasi sirkadian dalamginjalcedera, 7-tikus ICR jantan berumur seminggu (5-9 tikus) diberikan injeksi ip 165 mg/kg 4-BrC pada ZT2 atau ZT14. Tikus kontrol menerima volume garam yang sama seperti yang dijelaskan di atas. Hewan di-eutanasia menggunakan pentobarbital, dan sampel plasmanya dikumpulkan 24 jam setelah injeksi. Sampel plasma yang diperoleh disimpan pada suhu -80 derajat. Ituginjaldari semua hewan dipanen dan disimpan pada suhu -80 derajat.

Kadar Plasma Darah Urea Nitrogen (BUN), Aspartat Aminotransferase (AST), dan Renal Malondialdehyde (MDA)

Kadar BUN dan AST plasma ditentukan menggunakan Uji Wako BUN dan Uji Wako CII transaminase (FUJIFILM Wako Chemicals, Osaka, Jepang), sesuai dengan instruksi pabriknya.8) TotalginjalTingkat MDA diukur melalui uji microplate kolorimetri (Oxford Biomedical Research, MI, USA), sesuai dengan instruksi pabriknya.8)

Analisis Western Blot

Sampel protein (50 g) diekstraksi dariginjaldipisahkan melalui elektroforesis gel natrium dodesil sulfat-poliakrilamida 10 persen.10) Antibodi utama yang digunakan adalah sebagai berikut (semua diencerkan 1: 1500): protein interaksi reseptor tikus (RIP) 1 antibodi monoklonal, antibodi monoklonal RIP3 tikus, dan glutathione tikus antibodi monoklonal peroksidase 4 (GPX4) (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA); kelinci dibelah caspase-3 antibodi poliklonal (Teknologi Pensinyalan Sel); dan antibodi monoklonal aktin tikus (Medical & Biological Laboratories Co., Ltd., Aichi, Jepang).

Analisis statistik

Beberapa perbandingan dilakukan dengan menggunakan uji post-hoc Tukey-Kramer. Semua analisis statistik dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak SPSS 25.0 (Chicago, IL, USA). Hasil dengan p< 0.05="" were="" considered="" statistically="">

HASIL DAN DISKUSI

Dalam penelitian ini, kami membandingkan kronotoksisitas dari tiga metabolit antara BB (3-BrP, BrHQ, dan 4-BrC) yang diketahui menginduksiginjaltoksisitas. Kami pertama-tama menyelidiki efek waktu injeksi pada mortalitas yang diinduksi metabolit menengah BB. Gambar 2 menunjukkan jumlah hewan yang bertahan hidup dan mean survival time (MST) 7 hari setelah penyuntikan. Ketika 3-BrP diberikan pada ZT10 dan ZT14, semua tikus mati (0 persen ) dalam waktu 4 jam (Gbr. 2A). Sebaliknya, ketika 3-BrP diberikan pada ZT6 dan ZT22, tiga tikus (60 persen ) selamat; ketika diberikan pada ZT2 dan ZT18, jumlah tikus yang masih hidup adalah satu dan dua (20 dan 40 persen), masing-masing. Setelah pemberian BrHQ, kematian tikus diamati hanya dalam waktu 4 jam setelah pemberian pada semua kelompok ZT. Pada 7 hari setelah pemberian, tidak ada tikus yang bertahan dalam kelompok ZT14 dan ZT18 dan tiga (60 persen) bertahan dalam kelompok ZT2 dan ZT6. Dalam kelompok ZT10 dan ZT 22, jumlah tikus yang masih hidup adalah dua dan satu (40 dan 20 persen), masing-masing (Gbr. 2B). Setelah pemberian 4-BrC, semua tikus mati dalam waktu 3 hari ketika diberi dosis ZT14 atau ZT18 (0 persen) dan hanya satu atau dua (20 atau 40 persen) yang bertahan pada kelompok ZT lainnya (Gbr. 2C). MST hampir konsisten dengan jumlah tikus yang masih hidup di semua kelompok (Gbr. 2D-F). Hasil ini menunjukkan kronotoksisitas mematikan dari tiga metabolit antara BB. Setelah pemberian pada ZT14 (fase gelap), ketiga metabolit menunjukkan toksisitas tinggi. Menariknya, pola kronotoksisitas dari metabolit BB ini berbeda dari BB itu sendiri, yaitu, tikus yang terpapar BB dalam fase gelap memiliki sensitivitas yang lebih rendah terhadap toksisitas.8) Kami sebelumnya melaporkan bahwa streptomisin, yang menunjukkan nefrotoksisitas, sangat toksik setelah paparan fase gelap dan kurang toksik setelah paparan fase terang.9) Temuan penelitian sebelumnya tidak bertentangan dengan penelitian ini, menunjukkan bahwa perbedaan toksisitas BB dan tiga metabolit antara BB dikaitkan dengan organ target mereka. . BB menargetkan hati, sedangkan metabolit perantaranya menargetkanginjal.

Kami selanjutnya memeriksa efek waktu injeksi pada tingkat keparahan toksisitas organ menggunakan dosis 4-BrC yang tidak mematikan (165 mg/kg). Karena kematian dini dalam 4 jam diamati dengan injeksi 3-BrP dan BrHQ, dijelaskan seperti di atas, kami hanya memilih 4-BrC untuk eksperimen selanjutnya. Untuk kenyamanan eksperimental, kami memilih ZT2 dan ZT14 sebagai waktu injeksi. Pada kelompok ZT2, kadar plasma BUN, indikator nefrotoksisitas, tidak meningkat setelah paparan 4-BrC; namun, tingkat BUN meningkat tajam pada kelompok ZT14 (Gbr. 3A). Sejalan dengan BUN, kami mengukur tingkat AST plasma, indikator hepatotoksisitas. Kami menemukan bahwa pemberian 4-BrC tidak mempengaruhi kadar AST plasma baik di ZT2 dan ZT14 (Gbr. 3B), menunjukkan bahwa 4-BrC hanya toksik terhadapginjal. Selain itu, kami memperkirakan kadar MDA sebagai indikator stres oksidatif diginjal. Pemberian 4-BrC secara signifikan meningkatkan kadar MDA ginjal pada kelompok ZT14 dan ZT2. Namun, tingkat MDA pada kelompok injeksi ZT2 secara signifikan lebih rendah dibandingkan pada kelompok ZT14 (Gbr. 3C).

Sampai saat ini, berbagai jalur kematian sel seperti apoptosis, nekroptosis, dan ferroptosis telah dilaporkan.11) Selain itu, telah dilaporkan bahwa kematian sel yang disebabkan oleh 4-BrC terutama dimediasi melalui nekrosis.6) Untuk menyelidiki jenis kematian sel yang diinduksi oleh 4-BrC, kami menganalisis tingkat protein yang berhubungan dengan kematian sel: cleaved caspase-3 untuk apoptosis, RIP1/ RIP3 untuk nekroptosis, dan GPX4 untuk ferroptosis. Tidak ada perubahan nyata yang diamati pada level cleaved caspase-3, RIP1, dan RIP3 pada kelompok mana pun, menunjukkan bahwa apoptosis dan nekroptosis tidak diinduksi oleh 4-BrC (Gbr. 4). Sebaliknya, penurunan tingkat GPX4 diamati setelah pemberian 4-BrC di ZT14 (Gbr. 4). Kami tidak mengamati 4-nekrosis ginjal yang diinduksi oleh BrC dengan analisis histopatologi (data tidak ditampilkan). Hal ini menunjukkan bahwa konsentrasi 4-BrC yang digunakan dalam penelitian ini menyebabkan kerusakan ginjal ringan dan tidak menyebabkan nekrosis. Dari hasil tersebut dapat diduga bahwa 4-BrC menyebabkan ferroptosis yang menunjukkan variasi diurnal.

Dalam penelitian ini, kami menunjukkan metabolit antara BB menginduksi kronotoksisitas dalamginjal. Sebaliknya, hasil kami sebelumnya menunjukkan nefrotoksisitas yang diinduksi BB. Namun, kronotoksisitas ginjal tidak berubah antara fase terang dan fase gelap.8) Meskipun alasan kritis untuk perbedaan antara penelitian sebelumnya dan saat ini belum jelas, kami pikir itu terjadi untuk menutupi kronotoksisitas ginjal dengan menginduksi hati yang parah. cedera. Dalam percobaan di masa depan, kita perlu mengukur jumlah akumulasi setiap metabolit perantara BB karena jumlah ini mungkin berubah oleh CYP dan/atau tingkat cedera.

Banyak faktor biologis menunjukkan ritme sirkadian dalam tingkat ekspresinya. Misalnya, Xu et al. telah melaporkan variasi diurnal dalam ekspresi gen antioksidan hati pada tikus.12) Glutathione (GSH) adalah antioksidan yang sangat penting untuk menjaga kesehatan dan melindungi terhadap senyawa beracun. Baik 4-BrC dan 3-BrP telah dilaporkan menurunkan kadar GSH ginjal.4,13) Ferroptosis diusulkan pada tahun 2012 sebagai bentuk kematian sel yang diinduksi oleh elastin, yang menghambat impor sistein, menyebabkan penipisan GSH dan inaktivasi GPX4.14) Hasil kami menunjukkan bahwa GPX4 hanya ditekan pada ZT14 oleh 4-BrC. Oleh karena itu, protein atau gen terkait GSH dapat dikaitkan dengan kronotoksisitas.

Sebagai kesimpulan, penelitian kami saat ini menunjukkan bahwa BB menginduksi kerusakan ginjal serta kerusakan hati melalui metabolitnya, seperti 3-BrP, BrHQ, dan 4-BrC. Alasan mengapa variasi diurnal nefrotoksisitas oleh BB tidak diamati dalam laporan kami sebelumnya adalah bahwa kerusakan ginjal tertutup karena kerusakan hati yang parah.

REFERENSI

1) Lau SS, Biksu TJ. Kontribusi bromobenzena pada pemahaman kita saat ini tentang toksisitas yang diinduksi secara kimia. Ilmu Kehidupan., 42, 1259–1269 (1988).

2) Zhao H, Cheng N, He L, Peng G, Liu Q, Ma T, Cao W. Efek Hepatoprotektif Madu Apis cerana Fabricius pada kerusakan hati yang diinduksi bromobenzena pada tikus. J. Food Sci., 83, 509–516 (2018).

3) Vedi M, Sabina EP. Penilaian potensi hepatoprotektif dan nefroprotektif dari withaferin A pada cedera yang diinduksi bromobenzena pada tikus albino Swiss: kemungkinan keterlibatan disfungsi mitokondria dan peradangan. Biol Sel. Toksikol., 32, 373–390 (2016).

4) Dankovic DA, Billings RE. Peran 4-bromophenol dan 4-bromocatechol dalam ikatan kovalen bromobenzena dan toksisitas pada hepatosit tikus yang diisolasi. racun. aplikasi Pharmacol., 79, 323–331 (1985).

5) Lau SS, Monks TJ, Gillette JR. Identifikasi 2-bromohydroquinone sebagai metabolit bromobenzene dan o-bromophenol: implikasi untuk nefrotoksisitas yang diinduksi bromobenzene. J. Farmakol. Eks. Ada., 230, 360–366 (1984).

6) Rush GF, Newton JF, Maita K, Kuo CH, Hook JB. Nefrotoksisitas metabolit bromobenzena fenolik pada tikus. Toksikologi, 30, 259–272 (1984).

7) Miura N, Yoshioka H, ​​Nishimori A, Ohtani K, Hasegawa T, Hwang GW, Ikeda M, Nonogaki T. Analisis multiarah kronotoksisitas hati yang disebabkan oleh kadmium dan pada tikus. J.Toksikol. Sci., 42, 597–604 (2017).

8) Yoshioka H, ​​Nonogaki T, Fukuishi N, Shinohara Y, Hwang GW, Ohtani K, Miura N. Chronotoxicity dari cedera hati yang diinduksi bromobenzene pada tikus. J.Toksikol. Sci., 42, 251–258 (2017).

9) Yoshioka H, ​​Tominaga S, Shinohara Y, Hwang GW, Maeda T, Miura N. Chronotoxicity cedera ginjal yang diinduksi streptomisin pada tikus. Biol. Farmasi. Banteng., 43, 53–58 (2020).

10) Yoshioka H, ​​Ichimaru Y, Fukaya S, Nagatsu A, Nonogaki T. Efek potensial dari acetaminophen dan hepatotoksisitas yang diinduksi karbon tetraklorida dimediasi oleh aktivasi protein interaksi reseptor pada tikus. racun. mekanisme Metode, 28, 615–621 (2018).

11) Kim EH, Wong SW, Martinez J. Nekrosis dan Penyakit Terprogram: Kami menghentikan program reguler Anda untuk memberi Anda peradangan nekro. Kematian Sel Berbeda., 26, 25–40 (2019).

12) Xu YQ, Zhang D, Jin T, Cai DJ, Wu Q, Lu Y, Liu J, Klaassen CD. Variasi diurnal ekspresi gen antioksidan hati pada tikus. PLOS SATU, 7, e44237 (2012).

13) Biksu TJ, Hinson JA, Gillette JR. Toksisitas bromobenzena dan p-bromofenol dan ikatan kovalen in vivo. Life Sci., 30, 841–848 (1982).

14) Dixon SJ, Lemberg KM, Lamprecht MR, Skouta R, Zaitsev EM, Gleason CE, Patel DN, Bauer AJ, Cantley AM, Yang WS, Morrison B 3rd, Stockwell BR. Ferroptosis: bentuk kematian sel nonapoptosis yang bergantung pada besi. Sel, 149, 1060–1072 (2012).

Hiroki Yoshioka, a,b,# Sarah Tominaga, a,# Mai Nishikawa, Yasuro Shinohara, Makoto Nakao, Masae Yoshikawa, Tohru Maeda,*, a dan Nobuhiko Miura*,c

Sekolah Tinggi Farmasi, Universitas Kinjo Gakuin; 2–1723 Omori, Moriyama-Ku, Nagoya 463–8521, Jepang: b Pusat Penelitian Kraniofasial, Pusat Ilmu Kesehatan Universitas Texas di Houston, Sekolah Kedokteran Gigi; 1941 East Road, Houston, TX 77054, AS: dan cDepartment of Health Science, Yokohoma University of Pharmacy; 601 Momono-Cho, Totsuka-Ku, Yokohama 245–2006, Jepang. Diterima 30 Agustus 2020; diterima 25 Oktober 2020

untuk informasi lebih lanjut: Ali.ma@wecistanche.com