Pengembangan Krim Kosmetik Multifungsi Menggunakan Bahan Bioaktif Dari Streptomyces

Ram Hari Dahala1 , Tuan Manh Nguyen1,2, Dong Seop Shim3, Joon Young Kim4, Jangyul Lee4 dan Jaisoo Kim1,*

Abstrak:Berbagai kosmetik yang memiliki fungsi tunggal semakin banyak digunakan, namun kosmetik yang memiliki aktivitas multifungsi masih terbatas. Kami bertujuan untuk mengembangkan krim kosmetik multifungsi yang memilikiantioksidan, anti-tirosinase, anti-penuaan dan aktivitas antimikroba. Aktivitas antimikroba dilakukan dengan metode difusi cakram. Toksisitas sel dan proliferasi sel dievaluasi dalam 96-well plate dengan garis sel yang berbeda seperti HaCaT, RAW264.7, CCD-986Sk, B16F1, dan B16F10. Penghambatan tirosinase jamur, penghambatan elastase, dan aktivitas pemulung radikal 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH) dievaluasi dan IC50 dihitung. Partikel silika mesopori disintesis menggunakan Pluronic P123 dan tetraethyl ortho-silikat (TEOS). Gambar wajah diambil oleh VISIA-CR (Sistem Pencitraan Wajah untuk Penelitian Klinis). Kekasaran gambar dianalisis dengan perangkat lunak PRIMOS dan kecerahan gambar dianalisis dengan Chromameter CR-400. Produk kasar strain T65 menghambat bakteri patogen manusia yang berbeda seperti Bacillus subtilis, Escherichia coli, Propionibacterium acnes, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, dan Staphylococcus epidermidis. IC50 produk kasar T65 untuk aktivitas penangkal radikal tirosinase, elastase, dan DPPH jamur masing-masing adalah 58,73, 14,68, dan 6,31 ug/mL. Produk kasar T65 memperbanyak kolagen tipe I dalam CCD-986sel Sk hingga 145,91 persen ± 9,11 persen (rata-rata ± SD; rata-rata 24, 48, dan 72 jam) pada 250 pg/mL. Partikel mesopori yang disintesis (SBA-15) mengkonfirmasi kinerja berkelanjutan dengan pelepasan kontrol selama tiga hari. Krim kosmetik fungsional yang diformulasikan yang mengandung T65 embedded SBA-15, secara signifikan mengurangi kekasaran kulit sebesar 4,670 persen dan meningkatkan kecerahan kulit sebesar 0,472 persen setelah aplikasi 4 minggu. Produk mentah T65 menghambat patogen Gram-positif dan Gram-negatif. Partikel mesopori yang disintesis, SBA-15, menegaskan bahwa zat aktif fisiologis dilepaskan dalam kondisi pelepasan berkelanjutan. Produk mentah T65 menunjukkan antimikroba yang sempurna,antioksidan, aktivitas anti-penuaan, dan pemutihan dengan efek non-sitotoksik pada berbagai garis sel yang terkait dengan kulit manusia.

Kata kunci: antioksidan; sitotoksisitas; anti-tirosinase; anti penuaan; antimikroba; partikel silika mesopori; formulasi kosmetik; aplikasi estetika

cistanche herbal kerajaan yang hilangjuga memilikiefek pemutih kulit.

1. Perkenalan

Kulit adalah organ terbesar dan penutup luar tubuh manusia. Tampilan visual kulit memungkinkan untuk memperkirakan usia, jenis kelamin, kesehatan, daya tarik, dan kecantikan [1,2]. Produk kosmetik banyak digunakan untuk meningkatkan penampilan kulit dan mengurangi penuaan kulit. Selain itu, aplikasi kosmetik topikal menunjukkan bagaimana meningkatkan daya tarik dengan memanipulasi faktor kecantikan yang terkait dengan kontras wajah [3,4]. Industri kosmetik terus mencari bahan bioaktif baru dan alami dengan sifat anti-penuaan, antioksidan, anti-tirosinase, dan antimikroba untuk formulasi kosmetik untuk meningkatkan pendekatan perawatan kulit [5,6].

Penuaan kulit adalah proses biologis kompleks yang disebabkan oleh berbagai faktor intrinsik dan ekstrinsik yang menyebabkan disfungsi fisiologis dan hilangnya integritas struktural kulit. Penuaan intrinsik, umumnya dikenal sebagai penuaan alami (chronologic aging) pada kulit berkaitan dengan perubahan hormonal berdasarkan usia, sedangkan penuaan ekstrinsik berkaitan dengan pergerakan otot, polusi, nikotin, paparan radiasi matahari, kafein, suhu, gaya hidup seperti seperti pola makan (gizi), kurang tidur, stres, dan kondisi kesehatan lainnya [7-9]. Elastin membantu kulit untuk kembali ke posisi semula setelah bergerak, sedangkan elastase yang diproduksi di sel asinar mendegradasi elastin dan menyebabkan penuaan kulit [9]. Anti-elastase menghambat elastase dan mempertahankan elastin dalam status awalnya, yang mencegah kulit dari penuaan. Produk kosmetik atau perawatan kulit dengan sifat anti-penuaan secara positif mempengaruhi penuaan kulit [10-13].

Radikal bebas biasanya dihasilkan selama metabolisme sel. Spesies oksigen reaktif (ROS) dan spesies nitrogen reaktif (RNS), seperti radikal anion, superoksida, peroksida, radikal hidroksil, oksida nitrat (NO), peroksinitrit, dan asam hipoklorit bertanggung jawab atas kerusakan oksidatif pada sel, lipid, protein, dan DNA, yang menyebabkan aterosklerosis, karsinogenesis, penyakit kardiovaskular, penuaan seluler, peradangan kronis, diabetes, hipertensi, mutagenesis, neurodegenerasi, rheumatoid arthritis, stroke, syok septik, dan penyakit degeneratif lainnya [7,14-17]. Antioksidan mencegah oksidasi protein dan pembentukan ROS dan RNS yang dapat mengurangi kerusakan akibat radikal bebas pada jaringan normal dengan memerangi stres oksidatif [17-19].

Kulit menghasilkan pigmen gelap yang dikenal sebagai melanin. Produksi melanin mencegah kulit dari kerusakan akibat sinar UV [9]. Namun, kelebihan produksi dan akumulasi melanin menyebabkan hiperpigmentasi kulit, yang menyebabkan komplikasi estetika seperti melasma, bintik-bintik, lentigin pikun, nevus, dan ephelis [9,20]. Tirosinase adalah glikoprotein yang ditemukan di membran melanosom yang bertanggung jawab untuk biosintesis melanin melalui hidroksilasi l-tirosinase menjadi 3,4-dihidroksifenilalanin (l-DOPA) dan oksidasi selanjutnya dari l-DOPA menjadi dopakuinon [21]. Karena polimerisasi spontan, dopaquinone akhirnya diubah menjadi melanin [22]. Produksi melanin yang berlebihan harus dikontrol untuk menjaga integritas kulit. Itulah sebabnya penemuan inhibitor tirosinase baru untuk pengembangan formulasi kosmetik telah menerima minat yang signifikan [23-25].

Pengawet antimikroba ditambahkan ke produk kosmetik untuk menjaga kemurnian mikrobiologis selama seluruh periode aplikasi mereka [26]. Alih-alih menggunakan pengawet kosmetik seperti methylparaben, senyawa antimikroba alami yang memiliki fungsi lain lebih baik dan lebih bermanfaat bagi kesehatan manusia [27-29]. Metabolit sekunder yang diisolasi dari sumber bakteri mungkin memiliki sifat pengawet dan antimikroba yang menghambat kolonisasi bakteri patogen (Propionibacterium acnes, Staphylococcus epidermidis, dan Staphylococcus aureus) di kulit [9,26,28].

Senyawa bioaktif yang dihasilkan oleh bakteri tanah atau laut, terutama actinobacteria, belum tereksploitasi dan masih belum tereksplorasi [23,30]. Berbagai senyawa bioaktif yang dapat diterapkan dalam industri kosmetik dan kosmetik, termasuk yang memiliki sifat anti-penuaan, antioksidan, anti-tirosinase, antimikroba, dan non-sitotoksik, memiliki potensi besar untuk penggunaan baru.

Ada banyak penelitian tentang bahan bioaktif yang diisolasi dari tanaman yang saat ini digunakan dalam formulasi kosmetik, tetapi sangat sedikit penelitian tentang bahan bioaktif dari bakteri yang tersedia [9,21,24-27,31]. Penelitian ini bertujuan untuk mengevaluasi potensi kosmetik ekstrak etil asetat dari strain bakteri Streptomyces sp. T65 untuk aktivitas antioksidan, anti-penuaan, anti-tirosinase, dan antibakteri dan efek sitotoksik apa pun pada garis sel tikus dan manusia yang berbeda. Selain itu, kami bertujuan untuk mensintesis partikel silika mesopori. Akhirnya, tujuan utama dari penelitian ini adalah untuk mengembangkan produk kosmetik akhir untuk aplikasi topikal menggunakan bahan bioaktif yang diekstraksi dari mikroorganisme tanah.

2. Bahan-bahan dan metode-metode

2.1. Reagen, Garis Sel, dan Peralatan

Semua pelarut yang digunakan adalah kelas analitis. Garis sel melanoma B16-F10, garis sel melanoma tikus B16-F1, dan garis sel keratinosit manusia (HaCaT) dibeli dari American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Media Dulbecco yang dimodifikasi Eagles' (DMEM), penisilin-streptomisin, dan serum janin sapi yang tidak diaktifkan panas (HI FBS) dibeli dari Gibco (Thermo Fisher Scientific Korea Ltd., Seoul, Korea Selatan). Cell Counting Kit-8 (CCK-8) dibeli dari Dojindo (Kumamoto, Jepang). Garis sel makrofag tikus RAW264.7 dan CCD-986Fibroblas manusia Sk dibeli dari Korean Cell Line Bank (Seoul, Korea Selatan). Lipopolisakarida (LPS, Escherichia coli, serotipe O11:B4), sulfanilamide, naftil etilendiamin dihidroklorida, tirosinase jamur, elastase pankreas babi, l-tirosin, asam askorbat, arbutin, N-Succ-(Ala)3-p-nitroanilide , 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT), kolagen tipe I, Tween 20, tetramethylbenzidine (TMB ), tetraetil orto-silikat (TEOS), pluronic P-123 (poli(etilena glikol)-blok-poli(propilen glikol)-blok-poli(etilena glikol); PEG-PPG-PEG), dan -melanosit -stimulating hormone (-MSH) dibeli dari Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). 1,1-Difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH) dan asam oleanolat dibeli dari Aldrich (St. Louis, MO, USA). COL1A1 (Kolagen, tipe I, alfa 1) antibodi primer dan antibodi sekunder terkonjugasi dengan HRP (Horseradish peroxidase) dibeli dari Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Pembaca Microplate SpectraMax 340PC384 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) digunakan untuk 96-pembacaan pelat sumur.

2.2. Strain Bakteri Patogen

Staphylococcus epidermidis KACC 13234 dan Pseudomonas aeruginosa KACC 10185 dibeli dari Koleksi Budaya Pertanian Korea (KACC, Jeonju, Korea Selatan); Bacillus subtilis KEMB 51201-001, Escherichia coli KEMB 212-234, dan Staphylococcus aureus KEMB 7301-069 diperoleh dari Korea Environmental Microorganisms Bank (KEMB, Suwon South Korea); dan Propionibacterium acnes KCTC 3314 dibeli dari Koleksi Korea untuk Kultur Tipe (KCTC, Jeongeup, Korea Selatan).

2.3. Isolasi dan Pelestarian

Sampel tanah yang berbeda dikumpulkan dari padang rumput reklamasi di Hwaseong (37◦16′10" N 126◦45′43" E), dan hutan Universitas Kyonggi (37◦18′1" N 127◦2′20" E) di Korea. Bakteri diisolasi menggunakan metode yang telah dijelaskan sebelumnya [9]. Koloni digoreskan pada pelat R2A setiap 1 minggu untuk pengawetan jangka pendek dan disimpan pada suhu -80 C sebagai suspensi dalam kaldu R2A yang dilengkapi dengan 20 persen (v/v) gliserol untuk pengawetan jangka panjang.

2.4. Penyaringan, Identifikasi, dan Posisi Filogenetik dari Strain Terisolasi

Skrining untuk kosmetik dan aktivitas antimikroba dari strain terisolasi diselesaikan seperti yang dijelaskan sebelumnya [9]. Bakteri yang memiliki fungsi diidentifikasi menggunakan sekuensing gen 16S rRNA. DNA genom strain diekstraksi menggunakan kit Matrix InstaGene (Bio-Rad, Hercules, CA, USA), dan gen 16S rRNA diamplifikasi dengan PCR menggunakan primer bakteri universal 27F dan 1492R [32]. Produk PCR dimurnikan dengan pelat multiscreen-filter (Millipore Corp., Bedford, MA, USA), dan diurutkan dengan penganalisis DNA Applied Biosystems 3770XL menggunakan kit pengurutan siklus BigDye Terminator v.3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA, AS). Urutan yang hampir lengkap sesuai dengan perangkat lunak SeqMan (DNASTAR Inc., Madison, WI, USA). Strain terdekat dari strain fungsional terisolasi diidentifikasi menggunakan EzBioCloud [33] dan database NCBI GenBank [34]. Urutan 16S rRNA terkait diperoleh dari GenBank, dan analisis filogenetik dilakukan dengan menggunakan MEGA7 [35].

2.5. Kultur Bakteri

P. acnes dibiakkan dengan inkubasi pada suhu 37 C selama 3-4 hari secara anaerob dalam kaldu anaerob Schaedler (Oxoid). Untuk kultur anaerobik, tabung anaerobik BBL dengan Sistem Wadah Pembangkit Gas GasPak EZ (Becton Dickinson, NJ, USA) digunakan. S. epidermidis dan S. aureus dikultur dalam media TSB (Tryptic soy broth) (Oxoid) pada suhu 37 C selama 24 jam secara aerobik. E. coli, P. aeruginosa, dan B. subtilis dikultur dalam media LB (Luria-Bertani) (Oxoid). Strain bakteri yang diisolasi dikultur dalam R2A pada suhu 28 C selama 4-5 hari.

2.6. Fermentasi

Untuk proses fermentasi, inokulum disiapkan dalam kaldu R2A pada suhu 28 C selama 4-5 hari pada pukul 150 sore. Strain T65 difermentasi menggunakan inokulum 1-2 persen dalam medium ISP2 (International Streptomyces Project 2) pada suhu 28 C selama 1 minggu pada pukul 140 malam.

2.7. Ekstraksi

Kaldu kultur yang dipanen disentrifugasi pada 11.305 × g selama 20 menit pada 4 C dengan centrifuge berkapasitas besar 1736R (LABOGENE, Seoul, Korea). Supernatan kultur disaring dengan kertas saring ukuran 150 mm (Whatman 1001-150, GE Healthcare, Maidstone, UK) untuk menghilangkan puing-puing sel dan dipekatkan dengan rotary evaporator pada 40 C. Produk kasar pekat kemudian diekstraksi dua kali dengan volume yang sama menggunakan lima pelarut yang berbeda (n-heksana, di-etil eter, diklorometana, kloroform, dan etil asetat). Etil asetat ditemukan sebagai pelarut terbaik, dan analisis lebih lanjut dilakukan dengan menggunakan ekstrak etil asetat. Lapisan organik dipisahkan dengan corong pemisah dan diuapkan sampai kering. Akhirnya, produk mentah kering dilarutkan dalam metanol untuk penilaian lebih lanjut.

ekstrak cistanche

2.8. Pengumpulan Fraksi Aktif dengan HPLC Preparatif (Prep-HPLC)

Fraksi aktif ekstrak kultur kasar T65 dikumpulkan menggunakan HPLC preparatif (seri Agilent 1200). Shim-pack-PREP-ODS (K) C18 kolom terbalik (30 mm id × 25 cm) dengan ukuran partikel 15 m digunakan sebagai fase diam. Untuk fase gerak, digunakan air HCHOOH 0,1 persen (pelarut A) dan asetonitril (pelarut B). Konsentrasi pelarut B adalah 10 persen sampai 100 persen dari 0 menit sampai 60 menit dan 100 persen dari 60 menit sampai 75 menit digunakan. Kecepatan aliran adalah 15 mL/menit. Detektor multi-gelombang (MWD) digunakan dengan 208, 230, 254, dan 280 nm. Fraksi yang dikumpulkan dari 14 menit hingga 21 menit diuapkan hingga kering dan dilarutkan dalam metanol (produk mentah T65) untuk penilaian lebih lanjut.

2.9. Viabilitas Sel Sel HaCaT

Viabilitas sel sel HaCaT ditentukan dengan uji CCK-8 (Cell Counting Kit-8) sesuai dengan instruksi pabrik. Sel-sel HaCaT diunggulkan dalam 96-pelat sumur pada 104 sel per sumur dan kemudian diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam dalam medium Eagles' (DMEM) yang dimodifikasi Dulbecco yang mengandung 10 persen serum janin sapi (FBS). Sel diperlakukan dengan konsentrasi yang berbeda dari produk kasar T65 (10 mg/mL, 1 mg/mL, 100 ug/mL, 10 ug/mL, 1 ug/mL, 100 ng/ml, dan 1 ng/mL), dan diinkubasi pada suhu kamar selama 2 jam dalam suasana lembab yang mengandung 5 persen CO2 dengan penambahan 10 L reagen CCK-8. Absorbansi campuran reaksi diukur dengan spektrofotometer lempeng mikro pada 450 nm dan persentase viabilitas sel dihitung.

2.10. Evaluasi Aktivitas Antioksidan

2.10.1. Evaluasi Toksisitas dalam Sel RAW264.7

Sel RAW264.7 dipertahankan dalam DMEM yang mengandung 10 persen FBS, 100 U/mL penisilin, dan 100 ug/mL streptomisin pada 37 C dalam inkubator CO2 5 persen. Sel RAW264.7 diunggulkan dalam pelat mikrotiter dasar datar 96-dengan kepadatan 104 sel per sumur dengan konsentrasi berbeda (0-1 mg/mL) produk mentah T65 dan diinkubasi pada 37 C selama 24 jam dalam inkubator CO2 5 persen. Setelah inkubasi 24 jam, sel dicuci dua kali dengan phosphate-buffered saline (PBS), dan 190 L medium segar dan 10 L larutan kerja MTT (5 mg/mL) ditambahkan ke setiap sumur, dan plate kemudian diinkubasi pada 37 C selama 4 jam dalam inkubator CO2 5 persen. Kemudian, supernatan dibuang, dan kristal formazan yang terbentuk dilarutkan dengan menambahkan 150 L DMSO (dimetil sulfoksida) di setiap sumur selama 10 menit pada suhu 37 C dalam inkubator CO2 5 persen. Intensitas kristal formazan terlarut diukur menggunakan pembaca lempeng mikro pada 570 nm.

2.10.2. Penentuan Nitrat Oksida

Sel RAW264.7 (105 sel/mL) diberi perlakuan awal dengan berbagai konsentrasi produk kasar T65 (15,5–125 ug/mL) selama 30 menit, diikuti dengan stimulasi dengan 1 ug/mL LPS selama 24 jam. Konsentrasi NO yang dilepaskan dari sel ditentukan dengan reagen Griess menggunakan kurva standar NO2- [36]. Seratus mikroliter supernatan kultur diinkubasi dengan 100 L reagen Griess (campuran N-1-naftil etilendiamin dihidroklorida (NEDHC) dan sulfanilamide) pada suhu kamar selama 20 menit dalam gelap. Absorbansi diukur pada 540 nm.

2.10.3. Uji Pemulungan Radikal Bebas DPPH

Aktivitas penangkal radikal bebas DPPH dilakukan sesuai dengan metode yang telah dijelaskan sebelumnya [9]. Produk kasar ekstrak kultur T65 diencerkan dengan konsentrasi 600, 200, 100, 20, dan 4 ug/mL dalam metanol. Campuran reaksi 180 L dibuat dengan 90 L 0,1 mM DPPH (dilarutkan dalam MeOH) dan 90 L larutan sampel dengan konsentrasi berbeda (Tabel S1). Reaksi uji dicampur secara menyeluruh dalam 96-piring sumur, diinkubasi pada 37 C selama 30 menit, dan penyerapan diukur pada 516 nm dengan spektrofotometer. Persentase penghambatan DPPH dihitung sebagai berikut:

Penghambatan( persen )=[1 (ODexp ODcon) / (ODstd ODbln)] × 100 (1)

di mana ODexp adalah absorbansi sampel eksperimen; ODcon adalah absorbansi dari kontrol; ODstd, absorbansi standar; dan ODbln, absorbansi blanko.

2.11. Evaluasi Aktivitas Anti-Penuaan

2.11.1. Evaluasi Sitotoksisitas dalam CCD-986Sel Sk

Sitotoksisitas sel dari berbagai konsentrasi (0-1 mg/mL) produk kasar T65 dalam sel fibroblas kulit manusia (CCD-986Sk) ditentukan dengan uji MTT seperti yang dijelaskan sebelumnya untuk uji MTT RAW264.7 sel.

2.11.2. Proliferasi Fibroblas Manusia Menggunakan CCD-986Sel Sk

Proliferasi sel fibroblas dermal manusia (HDF) ditentukan dalam sel CCD{{0}}Sk menggunakan uji CCK-8. CCD-986Sel Sk diunggulkan di 96-piring sumur pada 5 × 103 sel/sumur dan kemudian diinkubasi pada 37 C selama 24 jam dalam DMEM yang mengandung 10 persen FBS. Sel diperlakukan dengan konsentrasi yang berbeda dari produk mentah T65 (0-1 mg/mL) dan diinkubasi pada suhu kamar selama 2 jam dalam atmosfer yang dilembabkan yang mengandung 5 persen CO2 dengan penambahan 10 L reagen CCK-8. Absorbansi campuran reaksi diukur dengan pembaca lempeng mikro pada 450 nm dan persentase sel yang hidup ditentukan dibandingkan dengan absorbansi sel yang tidak diberi perlakuan.

Cistanche adalah anti-penuaan.

2.11.3. Uji Sintesis Kolagen Tipe I

Sintesis kolagen tipe I diuji dengan enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). CCD-986Sel sk diunggulkan dalam 96-piring sumur dengan kepadatan 5 × 103 sel/sumur dalam DMEM yang mengandung 10 persen FBS dan diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam. Berbagai konsentrasi produk mentah T65 (31,25-25{{30}} pg/mL) ditambahkan dalam media bebas FBS selama 24 jam. Kemudian, 100 L media kultur dan kolagen tipe I ditambahkan ke dalam well plate 96-berlapis kolagen dan diinkubasi pada suhu 37 C selama 24, 48, dan 72 jam. Setiap sumur dicuci dengan 0,05 persen saline buffer fosfat dengan 0,1 persen Tween 20 (PBST) dan antibodi primer COL1A1 ditambahkan dan diinkubasi selama 1 jam. Sekali lagi, sumur dicuci dengan 0,05 persen PBST, dan antibodi sekunder terkonjugasi dengan HRP (horseradish peroxidase) ditambahkan dan diinkubasi selama 1 jam. Setiap sumur dicuci dengan 0,05 persen PBST, dan TMB (tetramethylbenzidine) ditambahkan. Setelah diperoleh intensitas warna yang diinginkan (biru), reaksi dihentikan dengan menambahkan 0,5N H2SO4, yang mengubah warna larutan menjadi kuning. Absorbansi diukur pada 450 nm dengan pembaca lempeng mikro, dan produksi kolagen tipe I ditentukan.

2.11.4. Uji Penghambatan Elastase

Aktivitas penghambatan elastase pankreas babi (PPE) diuji sesuai dengan prosedur yang dijelaskan sebelumnya [9]. Produk mentah T65 diencerkan hingga konsentrasi 30{{10}}0, 1000, 500, dan 100 ug/mL dalam metanol. Campuran reaksi dibuat dengan 0,2 M buffer Tris-HCl (pH 8,0), 0,5 mM N-Succ-(Ala)3-ρ-nitroanilide (SANA) sebagai substrat, elastase pankreas babi (3,5 U/mL dalam 0.2 M Tris-HCl buffer; pH 8.0), dan inhibitor (sampel). Setiap sampel diinkubasi pada suhu 37 C selama 15 menit, dan campuran reaksi total diinkubasi pada suhu 37 C selama 20 menit. Penyerapan diukur pada 400 nm. Campuran reaksi total 150 L dibuat seperti yang ditunjukkan pada Tabel S2. Konsentrasi akhir sampel dalam campuran reaksi adalah 300, 100, 50, dan 10 ug/mL. Persentase penghambatan PPE dihitung menggunakan Rumus (1).

2.12. Evaluasi Kegiatan Pemutihan

2.12.1. Evaluasi Sitotoksisitas dalam Sel B16F1

Sitotoksisitas produk mentah T65 ke sel melanoma B16F1 ditentukan oleh uji MTT. Sel B16F1 diunggulkan di 96-piring sumur pada 104 sel per sumur dan kemudian diinkubasi pada 37 C selama 24 jam dalam DMEM yang mengandung 10 persen FBS. Sel diperlakukan dengan konsentrasi yang berbeda dari produk mentah T65 (0-1 mg/mL) dan diinkubasi pada suhu kamar selama 2 jam dalam atmosfer yang dilembabkan yang mengandung 5 persen CO2. Absorbansi campuran reaksi diukur dengan spektrofotometer lempeng mikro pada 450 nm dan persentase viabilitas sel dihitung.

2.12.2. Penghambatan Sintesis Melanin dalam Sel B16F10

Sel B16F10 diberi perlakuan awal dengan -MSH di 6-pelat sumur pada 105 sel per sumur dan diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam dalam DMEM yang mengandung 10 persen FBS untuk mendorong sintesis melanin. Sel-sel diinkubasi dengan berbagai konsentrasi produk kasar T65 (31,25-125 ug/mL) dan 100 ug/mL arbutin sebagai kontrol positif dengan ada atau tidak adanya -MSH selama 48 jam. Penghambatan sintesis melanin dalam sel melanoma B16F10 diamati.

Cistanche menghambat pembentukan melanin.

2.12.3. Uji Penghambatan Tirosinase Jamur

Aktivitas penghambatan tirosinase jamur ditentukan seperti yang dijelaskan sebelumnya [9]. Produk mentah T65 diencerkan hingga konsentrasi 3000, 1000, 500, dan 100 ug/mL dalam metanol. Campuran reaksi dibuat dengan buffer kalium fosfat 0,1 M (pH 6,8), larutan 3 mM l-tirosin [dilarutkan dalam DW (air suling)], dan 2000 U/mL tirosinase jamur (dilarutkan dalam buffer kalium fosfat 0,05 M, pH 6,8 ; Sigma) di 96-pelat sumur. Campuran uji total 150 L (120 L buffer fosfat, 10 L l-tirosin, 15 L larutan sampel, dan 5 L jamur tirosinase; Tabel S3) diinkubasi pada 37 C selama 10 menit dan absorpsi diukur pada 475 nm. Konsentrasi akhir sampel dalam campuran reaksi adalah 300, 100, 50, dan 10 ug/mL. Standar tanpa larutan sampel, kontrol tanpa l-tirosin, dan blanko tanpa l-tirosin dan larutan sampel. Persentase penghambatan tirosinase dihitung dengan menerapkan Formula (1).

2.13. Analisis Asam Amino

Asam amino bebas dari produk mentah T65 ditentukan dengan metode GC-FID (kromatografi gas –detektor ionisasi api) di Korea Polymer Testing and Research Institute (Koptri). Untuk metode GC-FID, mesin yang digunakan adalah Agilent 6890N GC-FID; kolom, ZB-AAA (10 m × 0,25 mm); suhu bagian injeksi, 250 C; kolom injeksi, 2 L; rasio split, 5:1; kondisi suhu, 110 C → 32 C/menit → 320 C; detektor, FID @ 320 C; pembawa, gas nitrogen, 1,5 mL/menit; pembuat, Fenomena; standar asam amino; dan konsentrasi, 200 mol/L.

Asam amino komposit produk mentah T65 ditentukan dengan metode GC-FID (gas chromatography-flame ionization detector) di Korea Polymer Testing and Research Institute (Koptri). Untuk GC-FID, mesin yang digunakan adalah Agilent 6890N GC-FID; kolom, ZB-AAA (10 m × 0,25 mm); suhu bagian injeksi, 250 C; kolom injeksi, 2 L; rasio split, 5:1; kondisi suhu, 110 C → 32 C/menit → 320 C; detektor, FID @ 320 C; pembawa, gas nitrogen, 1,5 mL/menit; pembuat, Fenomena; standar asam amino; dan konsentrasi, 200 mol/L.

2.14. Asam lemak

Asam lemak produk mentah T65 ditentukan dengan metode GC-FID (gas chromatography-flame ionization detector) di Korea Polymer Testing and Research Institute (Koptri). Untuk GC-FID, mesin yang digunakan adalah Agilent 6890N GC-FID; kolom, Supelco SP–2500 (100 m × 0,25 mm × 0,20 m); suhu bagian injeksi, 250 C; kolom injeksi, 1 L; rasio split, 50:1; kondisi suhu, 100 C (4 menit) → 3 C/menit → 240 C (15 menit); detektor, FID @ 285 C; pembawa, gas nitrogen, 0,8 mL/menit; pembuat, SUPELCO 37 Component FAME Mix; dan konsentrasi, 0,5 mg/mL.

2.15. Aktivitas Antimikroba

Penghambatan bakteri patogen dilakukan dengan metode difusi cakram. Seratus mikroliter kultur P. acnes pada 108 CFU (colony-forming unit)/mL disebarkan dan diinkubasi pada 35 C secara anaerob selama 2-3 hari pada pelat agar Schaedler bersama dengan cakram 6 mm (Whatman) yang berisi 15 ug ekstrak kasar dilarutkan dalam metanol, dan zona hambat diukur. Demikian pula, 100 L S. epidermidis, S. aureus, B. subtilis, E. coli, dan P. aeruginosa pada 108 CFU/mL disebarkan dan diinkubasi pada 35 C secara aerobik pada pelat R2A atau LBA selama 1-2 hari dan zona hambat diukur.

2.16. Sintesis Partikel Silika Mesopori

Polimer penginduksi struktur dilarutkan dalam air deionisasi untuk menyiapkan larutan misel. Bahan silika mesopori disintesis menurut metode yang dijelaskan dalam literatur [37]. Untuk sintesis partikel silika mesopori (SBA-15), 10 g Pluronic P123 (EO20PO70EO20, BASF Corporation, Florham Park, NJ, USA), dilarutkan dalam 55 mL HCl 2 M, diikuti dengan pengadukan di ruang suhu selama 30 menit. Selanjutnya ditambahkan 22 g tetraethylorthosilicate (TEOS) ke dalam larutan dan diaduk selama 30 menit dan ditempatkan pada 36 C selama 24 jam kemudian dimasukkan ke dalam oven, di mana suhu dipertahankan pada 100 C, dan dibiarkan selama 4 hari di bawah kondisi statis. Setelah 4 hari, larutan berubah menjadi larutan keruh di dalam botol. Larutan yang keruh disaring dengan dua lapis kertas saring selulosa dan dicuci dengan EtOH (dua kali) dan air DI (dideionisasi) (dua kali). Serbuk hasil penyaringan dikeringkan dalam oven konveksi 120 C dan dimasukkan ke dalam tungku peredam (Hanyang Scientific Equipment Co., Ltd., Seoul, Korea Selatan). Enam sampel disintesis dengan kondisi yang sama tetapi dalam batch yang berbeda. Mikrograf elektron transmisi (TEM) dari SBA yang disintesis-15 diambil di Universitas Nasional Seoul dengan mikroskop elektron transmisi (Talos L120C; FEI).

2.17. Analisis Area Permukaan BET

Ukuran partikel silika diukur dengan Mastersizer 2000 (Malvern Instruments Lt., Malvern, United Kingdom). Untuk preparasi sampel analisis BET (Brunauer–Emmett–Teller), 5 g P-123 ditambahkan ke 76 g HCl 2M dan diaduk pada 250 rpm selama 24 jam. Setelah 24 jam, ketika P-123 benar-benar larut, 160 mL air DI (deionisasi) dan TEOS ditambahkan secara merata (15 mL/menit) dan diaduk pada 750 rpm selama 24 jam. Setelah itu, serbuk yang terbentuk dipisahkan dengan cara disaring dan serbuk yang telah dipisahkan dimasukkan ke dalam thimble dan dicuci dengan soxhlet selama 24 jam. Kemudian dicuci dengan air DI dan dibakar dalam tungku peredam (Hanyang Scientific Equipment Co., Ltd., Korea Selatan). Analisis luas permukaan BET dilakukan untuk mengkonfirmasi kinerja serbuk yang dihasilkan oleh sintesis SBA-15. Analisis BET diselesaikan oleh Universitas Inha dan Universitas Nasional Changwon.

Penganalisis penyerapan gas (Autosorb iQ, Quantachrome Instruments, Ashland, OR, USA) digunakan untuk memeriksa luas permukaan dan distribusi ukuran pori dari bahan silika mesopori yang disiapkan. Luas permukaan dan distribusi ukuran pori dihitung menggunakan perangkat lunak ASiQwin (Anton Paar Quanta Tech Inc., Boynton Beach, FL, USA) berdasarkan isoterm adsorpsi-desorpsi. Partikel murni hasil sintesis dihilangkan gasnya pada 300 C/3h, kemudian isoterm adsorpsi dan desorpsi N2 diukur pada suhu 196 C. Analisis BET multipoint diterapkan untuk perhitungan luas permukaan total.

2.18. Penilaian Keberlanjutan

Untuk mengkonfirmasi keberadaan T65 dalam SBA tertanam-15, kinerja berikut dilakukan sebagai berikut: 12 g SBA-15 dan 1,2 g produk mentah T65 dicampur dalam 500 mL asetonitril. Larutan diaduk selama 18 jam pada suhu 30 C. Setelah penyaringan, campuran disaring dan partikel yang disaring dikeringkan dalam oven konveksi 100 C. Untuk menemukan partikel T65 itu sendiri dalam SBA-15, 1 g T65 kering yang dibenamkan dalam SBA-15 dilarutkan dalam asetonitril dan ditambahkan 25 mL asam fluorat 3 M. Campuran diaduk pada suhu kamar selama 24 jam sampai larutan menjadi jernih. Kemudian larutan disaring, dan larutan filtratnya digunakan sebagai sampel. Sampel yang diperoleh dari percobaan di atas dianalisis dengan HPLC.

Untuk menentukan sifat pelepasan terkontrol, 35 mL SBA tertanam-15 dituangkan ke dalam 50 mL minyak mineral (M3516; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) dan dicampur dengan baik. Kemudian, 50 mL air DI ditambahkan ke dalam campuran dan dikocok pada suhu kamar selama 6 jam, dan kemudian dibiarkan di atas meja selama 12 jam. Setelah lapisan cair dipisahkan, lapisan air dibuang, dan diambil 1 mL lapisan minyak sebagai sampel untuk analisis HPLC. Percobaan yang sama diulang pada hari kedua dan ketiga dan sampel dianalisis kembali dengan menggunakan HPLC.

2.19. Formulasi dan Aplikasi Kosmetik

2.19.1. Formulasi dan Uji Stabilitas

Sebuah produk kosmetik diformulasikan dari krim tipe emulsifier. Stabilitas formulasi kosmetik ditentukan dengan menjaga produk kosmetik pada berbagai suhu (37, 45, dan 60 C) termasuk di dalam freezer, lemari es, dan pada suhu kamar hingga 28 hari. Stabilitas krim kosmetik diamati pada minggu pertama, kedua, ketiga, dan keempat.

2.19.2. Uji Klinis, Relawan, dan Metode Aplikasi

Krim kosmetik fungsional yang mengandung produk kasar T65 diaplikasikan pada 21 sukarelawan wanita untuk menentukan perbaikan kerutan dan kemanjuran pemutihan melalui kekasaran kulit dan kecerahan kulit. Semua prosedur eksperimental untuk keterlibatan manusia untuk penelitian ini telah disetujui oleh Elad Institutional Review Board (IRB) (EL-P-7400). Informed consent diperoleh dari semua peserta individu. Pengujian dilakukan sebelum aplikasi produk, setelah 2 minggu dan setelah 4 minggu. Sekitar 5 mg produk kosmetik dioleskan dua kali sehari (pagi dan sore) pada wajah setelah membersihkan wajah, dan dioleskan dengan lembut sesuai dengan tekstur kulit. Para sukarelawan tidak diizinkan untuk menggunakan krim atau produk lain 1 minggu sebelum uji coba dan selama uji coba.

2.19.3. Metode Pengambilan dan Pemrosesan Gambar

Gambar diambil oleh VISIA-CR. Kekasaran gambar dianalisis dengan perangkat lunak PRIMOS (PRIMOS versi 5.8E, Canfield Scientific, Inc., Parsippany-Troy Hills, NJ, USA). Kekasaran rata-rata (Ra) dan kedalaman kekasaran maksimum (Rmax) dihitung dengan menggunakan rumus berikut:

Tingkat Ra atau Rmax ( persen )=(nilai sebelum perlakuan nilai setelah perlakuan)/nilai sebelum perlakuan × 100 (2)

Kecerahan gambar dianalisis dengan Chromameter CR-400. L* adalah parameter kecerahan dan diukur dengan rumus berikut:

Laju peningkatan L* ( persen )=(nilai sebelum perlakuan nilai setelah perlakuan)/nilai sebelum perlakuan × 100 (3)

2.20. Analisis statistik

Perhitungan statistik dari nilai IC50 dilakukan oleh perangkat lunak statistik OriginPro 8.5 (OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA). Semua percobaan dilakukan dalam rangkap tiga, dan semua hasil disajikan sebagai mean ± SD dari tiga percobaan terpisah. Data dianalisis dengan independent sample t-test one-way analysis of variance (one-way ANOVA), dilanjutkan dengan uji post-hoc Tukey menggunakan OriginPro 8.5. Perbedaan dianggap signifikan pada p <>

3. Hasil dan Diskusi

3.1. Isolasi, Seleksi, dan Filogeni dari Strain Aktif Terpilih

Sebanyak 2285 strain bakteri diisolasi dari sampel tanah yang dikumpulkan. Hasil penapisan menunjukkan 102 strain bakteri memiliki fungsi yang dapat diterapkan pada kosmetik (Tabel S4). Berdasarkan skrining primer, Streptomyces sp. T65 ditemukan memiliki aktivitas yang lebih tinggi untuk semua aplikasi kosmetik, yaitu, anti-oksidan, anti-elastase, anti-tirosinase, dan aktivitas antimikroba. Akhirnya, strain T65 dipilih untuk penilaian lebih lanjut untuk mengidentifikasi aplikasi potensialnya dalam kosmetik. Analisis filogenetik menunjukkan bahwa strain T65 membentuk clade dengan Streptomyces bungoensis DSM 41781T (strain terdekat berdasarkan urutan gen 16S rRNA) dengan nilai bootstrap yang kuat (Gambar S1).

3.2. Deteksi dan Pengumpulan Bahan Bioaktif

Campuran bahan bioaktif dari ekstrak kultur etil asetat T65 dikumpulkan dari Prep-HPLC. Bahan bioaktif diukur pada 208, 230, 254, dan 280 nm dengan detektor. Fraksi dikumpulkan berdasarkan waktu (dari 14 menit hingga 21 menit). Fraksi yang dikumpulkan diuapkan hingga kering dan dilarutkan dalam metanol (produk kasar T65) dan digunakan untuk semua penilaian, termasuk aktivitas antimikroba.

3.3. Sitotoksisitas dalam Sel HaCaT

Viabilitas sel dalam garis sel keratinosit manusia (sel HaCaT) tetap tidak terpengaruh oleh produk kasar T65 hingga 10 mg/mL. Di sisi lain, viabilitas sel meningkat dengan cara yang bergantung pada dosis ketika konsentrasi 10 ng/mL sampai 10 mg/mL dari produk mentah T65 diterapkan (Gambar S2). Rentang konsentrasi ini menghasilkan lebih dari 100 persen viabilitas sel, menunjukkan bahwa hal itu mendorong proliferasi sel HaCaT dan, dengan demikian, tidak beracun bagi garis sel HaCaT.

3.4. Aktivitas Antioksidan

3.4.1. Sitotoksisitas dalam Sel RAW264.7

Sitotoksisitas produk mentah T65 dinilai dengan viabilitas sel dalam makrofag RAW264.7 dengan metode uji MTT. Produk mentah T65 tidak menunjukkan efek sitotoksik pada garis sel RAW264.7.

Sebaliknya, produk kasar T65 membantu memperbanyak sel RAW264.7 dengan cara yang bergantung pada dosis bila diobati dengan 13,5 hingga 1000 ug/mL. Ketika 1000 ug/mL produk kasar T65 digunakan, viabilitas sel RAW264.7 sel adalah 118,7 persen (p <0,05). hasil="" ini="" menunjukkan="" bahwa="" senyawa="" mentah="" t65="" tidak="" beracun="" hingga="" 1="" mg/ml="" dan="" dapat="" digunakan="" dalam="" formulasi="">

3.4.2. Penghambatan Produksi Nitric Oxide (NO)

Reagen Griess digunakan untuk menentukan kadar NO. Untuk menentukan penghambatan NO, RAW264.7sel diperlakukan dengan 1 ug/mL LPS (lipopolisakarida) bersama dengan berbagai konsentrasi produk kasar T65. Sel RAW264.7 diaktifkan oleh LPS, dan produksi NO diukur sebagai konsentrasi nitrit dalam media kultur. Dibandingkan dengan LPS saja, produk kasar T65 secara signifikan (p < 0.001)="" menghambat="" konsentrasi="" nitrit="" dalam="" sel="" raw264.7="" yang="" dirangsang="" lps="" dengan="" cara="" yang="" bergantung="" pada="" konsentrasi="" bila="" digunakan="" dari="" 15,5="" hingga="" 125="" ug/ml="" (gambar="" 2).="" makrofag="" adalah="" ekspresi="" mirip="" lps-toll="" dari="" no="" sintase="" (inos)="" yang="" dapat="" diinduksi="" dengan="" memberi="" sinyal="" aktivasi="" sel="" melalui="" reseptor="" [38].="" lps="" merupakan="" aktivator="" makrofag="" dan="" berperan="" penting="" dalam="" produksi="" no="" pada="" sel="" mamalia="" [39].="" no="" merupakan="" radikal="" bebas="" yang="" dihasilkan="" oleh="" sel="" imunokompeten="" seperti="" makrofag.="" produksi="" no="" memiliki="" efek="" fagositosis="" pada="" makrofag.="" dengan="" demikian,="" garis="" sel="" makrofag="" raw264.7="" dipilih="" untuk="" pengujian="" antioksidan.="" untuk="" waktu="" yang="" lama,="" perhatian="" besar="" telah="" diberikan="" pada="" pencarian="" antioksidan="" alami="" untuk="" menghambat="" produksi="" no="" [41].="" pada="" 125="" ug/ml,="" produk="" mentah="" t65="" cukup="" menurunkan="" kadar="" no="" sebesar="" 57,4="" persen="" dibandingkan="" dengan="" no="" yang="" dihasilkan="" oleh="" 1="" ug/ml="" lps.="" atas="" dasar="" penghambatan="" no="" yang="" diproduksi="" dalam="" garis="" sel="" makrofag="" raw264.7="" yang="" diinduksi="" lps,="" ekstrak="" kultur="" t65="" dapat="" dianggap="" sebagai="" antioksidan="">

DPPPHrRaaddiciacal lsScacvaveenggininggpAerccteivnitayges pada konsentrasi yang berbeda dan nilai IC50 produk mentah T65 diberikan pada Tabel S5. Asam askorbat (vitamin C) digunakan sebagai standar karena digunakan dalam lotion, krim, serum, dan patch, yang dikenal memiliki aktivitas antioksidan kuat untuk aplikasi topikal [42]. IC50 untuk aktivitas penangkapan radikal DPPH untuk produk sekunder vitamin C dan T65 ditemukan masing-masing 5,01 dan 6,31 ug/mL (Gambar 3).

Hanya ada sedikit penelitian tentang aktivitas antioksidan dari isolat bakteri dibandingkan dengan yang berasal dari bahan tanaman dan sebagian besar penelitian berfokus pada produk tanaman yang sudah mapan [43-49]. Produk konsentrasi 10 ug/mL mampu menangkap 68,66 ± 2,83 persen radikal bebas DPPH. IC50 produk kasar T65 hampir sebanding dengan antioksidan vitamin C terkuat, yang menunjukkan dapat digunakan sebagai agen antioksidan dalam formulasi kosmetik.

3.5.1. Sitotoksisitas dalam CCD-986Sel Sk

Sitotoksisitas senyawa kasar T65 dalam sel fibroblas kulit manusia (HDF) dievaluasi dalam garis sel CCD-986Sk menggunakan uji MTT. Ketika konsentrasi produk kasar T65 dari 0 sampai 1 mg/mL diberikan, sel-sel HDF berproliferasi dengan cara yang bergantung pada dosis sampai konsentrasi 500 ug/mL. Hasil ini menunjukkan bahwa senyawa kasar dari T65 tidak bersifat sitotoksik terhadap sel HDF. Namun, konsentrasi lebih dari 1 mg/mL ditemukan bersifat sitotoksik, dan hanya 81,34 persen sel yang bertahan dibandingkan dengan kontrol (Gambar 4).

3.5.2. Proliferasi HDF

Proliferasi sel HDF ditentukan menggunakan garis sel CCD{{0}}Sk. Produk mentah T65 memperbanyak sel HDF dengan cara yang bergantung pada konsentrasi dari 0 hingga 500 ug/mL (Gambar 5). Namun, itu sitotoksik pada konsentrasi 1 mg/mL. Pertumbuhan sel epitel kulit manusia mengkonfirmasi kemampuan perbaikan kerutan melalui perubahan sel kultur primer yang diisolasi dari sel kulit manusia dan kolagen yang disekresikan [50,51].

3.5.3. Sintesis Kolagen Tipe I

Sintesis kolagen tipe I dideteksi dengan ELISA. Produk kasar T65 pada 250 pg/mL meningkatkan konsentrasi kolagen tipe I secara tergantung dosis hingga 145,91 persen ± 9,11 persen (rata-rata ± SD; rata-rata 24, 48, dan 72 jam). Hasil dari tiga percobaan pada 24, 48, dan 72 jam menunjukkan sintesis kolagen tipe I (Gambar 6).. Dengan demikian, sekresi kolagen sel dermal disertai dengan pertumbuhan sel epitel dermal manusia mengkonfirmasi kemampuan perbaikan kerutan senyawa T65.

3.6. Kegiatan Pemutihan

3.6.1. Sitotoksisitas dalam Sel B16F1

Hasil sitotoksisitas produk kasar T65 pada sel melanoma B16F1 dengan uji MTT ditunjukkan pada Gambar 8. Hasil inkubasi produk kasar T65 dalam sel B16F1 menunjukkan efek nontoksik hingga konsentrasi 1 mg/mL. Sel B16F1 berkembang biak dengan cara yang bergantung pada dosis hingga konsentrasi 62,5 ug/mL, tetapi penurunan yang signifikan (p < 0.05)="" bergantung="" pada="" dosis="" dalam="" viabilitas="" sel="" dievaluasi="" dari="" 125="" menjadi="" 1000="" ug/ml.="" namun,="" pada="" konsentrasi="" 1="" mg/ml,="" 99,12="" persen="" ±="" 4,16="" persen="" sel="" yang="" hidup="" diamati="" (gambar="" 8).="" hasil="" percobaan="" menunjukkan="" bahwa="" ekstrak="" etil="" asetat="" kultur="" strain="" t65="" bersifat="" non-sitotoksik="" terhadap="" sel="" melanoma="" b16f1="" dan="" dapat="" digunakan="" dalam="" formulasi="" produk="" kosmetik="" untuk="" memutihkan="" kulit="">

3.6.2. Penghambatan Sintesis Melanin dalam Sel B16F10

Untuk konfirmasi efek pemutihan, sel B16F10, garis sel yang mengeluarkan dan memproduksimelanin dalam sel, digunakan. Untuk mempromosikan sintesis melanin, B16F10 dilengkapi dengan 1 ug -MSH. Arbutin (100 ug/mL; bahan pemutih yang dikomersialkan) digunakan sebagai kontrol positif. Pengamatan mikroskopis dari percobaan ini menunjukkan penghambatan melanin yang hampir lengkap dengan penerapan 125 ug/mL ekstrak kultur T65 dalam 48 jam (Gambar 9A, B). Eksperimen ini membuktikan bahwa ekstrak kultur T65 berpotensi menghambat sintesis melanin dengan cara yang bergantung pada dosis dan dapat digunakan sebagai zat pemutih untuk formulasi produk kosmetik untuk aplikasi topikal.

3.7. Bahan Silika Mesopori

Material mesopori adalah material yang mengandung pori-pori dengan diameter 2 sampai 50 nm menurut nomenklatur IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry), sehingga material silika mesopori merupakan material silika yang memiliki pori-pori yang berdiameter 2–50 nm. Bahan ini dilaporkan pertama kali pada tahun 1970-an dalam paten AS, tetapi tidak diperhatikan dengan baik di bidang terkait, dan dengan demikian bahan serupa diteliti dan disintesis secara independen oleh Jepang lagi pada tahun 1990 [69]. Penelitian yang lebih rinci diikuti oleh Mobil Corporation Laboratories, dan mereka menamakan material ini MCM (Mobil crystalline material), dengan contoh seperti MCM-41 atau MCM-48, yang diameter mesoporinya berkisar antara 2 hingga 6 nm [70,71]. Kelompok penelitian lain di University of California, Santa Barbara, berhasil mensintesis silika mesopori dengan ukuran pori yang lebih besar (5–30 nm) 6 tahun kemudian, dan mereka menamakannya SBA (Santa Barbara amorphous material)-15 [72] . Bahan silika mesopori pada awalnya dirancang untuk digunakan sebagai saringan molekuler karena karakter strukturalnya sendiri, tetapi baru-baru ini telah ditemukan berbagai aplikasi dalam penghantaran obat, katalis, biosensor, penyimpanan energi, dan sebagainya.

Ada berbagai perbedaan dalam material mesopori SBA-15 dan MCM-41. Namun, cara paling sederhana untuk membedakan keduanya adalah ketebalan dinding silika. SBA-15 dengan dinding silika yang lebih tebal memiliki struktur yang lebih stabil dan kaku dibandingkan dengan MCM-41 yang memiliki ketebalan dinding yang lebih tipis. Selain itu, metode sintetis SBA-15 lebih sederhana daripada MCM-41. Karena perbedaan ini, SBA-15 dipilih untuk membawa produk kasar T65 bioaktif di dalam mesopori bahan silika.

3.8. Sintesis Partikel Silika Mesopori

Setelah proses kalsinasi dilakukan pada suhu 200 C selama 2 jam dan 600 C selama 3 jam terus menerus, diperoleh serbuk mesopori silika putih yang dihasilkan. SBA-15 dari pori 8 nm disintesis dalam proses ini. Ukuran partikel SBA-15 ditemukan berdiameter 11.539-13.630 mm (Gambar S4) dan ditentukan oleh dua fasilitas berbeda: Laboratorium Universitas Inha dan Laboratorium Universitas Nasional Changwon. Selain itu, keenam sampel pada Gambar S4 disintesis dengan metode yang sama tetapi batch yang berbeda.

Ketika campuran dipertahankan pada 60 C dan dibiarkan selama 4 hari di bawah kondisi statis mengikuti metode di atas, SBA-15 pori 5 nm diperkenalkan. Selain itu, ketika suhu dikontrol pada 120 C, SBA-15 dari 10 nm disintesis. Menurut hasil, ukuran mesopori dapat dikontrol tergantung pada proses penuaan [73]. SBA-15 dari 10 nm pori (Gambar 11) digunakan untuk pemrosesan lebih lanjut karena nanomaterial silika mesopori pori besar memiliki tindakan pengiriman yang lebih baik untuk biomolekul daripada pori sempit [74].

3.9. Evaluasi Kinerja Berkelanjutan

Untuk menentukan apakah SBA mesopori-15 memiliki kemampuan pelepasan terkontrol, SBA-15 dan produk kasar T65 digabungkan bersama dalam pelarut DI air, metanol, asetonitril, atau etilena glikol. Ketika SBA-15 dan air dicampur, larutan menjadi bubur karena koagulasi antara permukaan silika dan air. Metanol adalah pelarut yang baik untuk silika dan produk mentah T65. Namun, karena toksisitas, metanol diganti dengan asetonitril. Partikel untuk rasio perendaman T65 ditentukan oleh nilai PV (Tabel S13). Seperti terlihat pada Tabel S13, nilai PV SBA-15 menurun setelah perendaman dengan produk mentah T65. Hal ini menunjukkan bahwa material T65 terendam dengan baik di dalam partikel silika mesopori.

Untuk menentukan apakah ada T65 di dalam partikel, T65 sendiri diselidiki dengan HPLC (Gambar S5). Seperti yang ditunjukkan oleh data, ada dua puncak spesifik (di dalam kotak merah) yang selalu terlihat dalam kasus ekstrak kultur T65, meskipun batch persiapan T65 diubah. Kedua puncak ini memiliki waktu retensi 10 menit dan 12 menit pada 230 nm. Sampel filtrat diselidiki dalam HPLC untuk menentukan apakah T65 ada di dalam SBA tertanam-15. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar S6, dua puncak spesifik diamati di dekat 10 menit dan 12 menit. Selanjutnya, puncak kecil diamati mendekati waktu retensi 18 menit, yang sangat penting untuk melacak produk T65 yang dilepaskan waktu.

Gambar 12 menunjukkan rilis terkontrol dari uji berkelanjutan SBA tertanam T65-15 dari 0 hingga 3 hari. Puncak spesifik T65 terlihat dekat 15 dan 20 menit dari hari 0 hingga 3. Produk mentah T65 direndam dengan benar dan secara bertahap dikeluarkan dari waktu ke waktu. Selain itu, bahan mesopori silika (SBA-15) yang diusulkan dalam penelitian ini dapat membawa zat aktif fisiologis dalam produk mentah T65 dan menegaskan bahwa zat aktif fisiologis dilepaskan dalam cara pelepasan berkelanjutan setelah pemuatan. Selain itu, bahan mesopori silika yang diusulkan dalam penelitian ini, di masa depan, dapat digunakan sebagai pembawa yang baik untuk menghamili berbagai bahan fungsional dan sebagai bahan lepas lambat dengan mendukung berbagai zat aktif fisiologis.

4. Kesimpulan

Bahan bioaktif sekunder yang diekstraksi dari mikroorganisme tanah menarik untuk aplikasi kosmetik karena aktivitas antimikroba, antioksidan, anti-kerut, pemutih kulit, dan antimikrobanya. Penelitian ini menjelaskan aktivitas baru ekstrak etil asetat kultur strain T65 untuk bahan fungsional dalam formulasi kosmetik. Produk kasar T65 tidak beracun untuk berbagai lini sel, seperti HaCaT (keratinosit manusia), RAW264.7 (sel makrofag), CCD-986Sk (sel fibroblas kulit manusia), dan sel melanoma B16F1 dan B16F10 . Selain itu, produk mentah T65 menunjukkan peningkatan regulasi sintesis kolagen tipe I, yang sangat penting untuk mengurangi kerutan pada kulit. Selanjutnya, produk kasar T65 cukup menghambat bakteri patogen manusia seperti B.subtilis, E. coli, P. acnes, S. aureus, dan S. epidermidis, yang dapat membantu mencegah pembusukan produk kosmetik dan kolonisasi bakteri patogen. membentuk acne vulgaris pada kulit manusia. Selain itu, produk kasar T65 menghambat tirosinase jamur untuk efek pemutihan dan elastase pankreas babi untuk aktivitas anti-penuaan, dan menghambat NO dan radikal DPPH untuk aktivitas antioksidan. Sintesis partikel silika mesopori, SBA-15, membuktikan bahwa produk mentah T65 akan efektif dalam formulasi kosmetik dengan sifat pelepasan terkontrol yang efektif. Akhirnya, aplikasi in vivo produk kosmetik yang diformulasikan bersama dengan produk mentah T65 pada wajah relawan membuktikan efek pemutihan dan anti-kerut dari T65. Namun, kimia senyawa bioaktif yang berbeda dan mekanisme molekuler yang terkait dengan aktivitas penghambatan enzim dan penghambatan patogen yang berbeda masih harus ditemukan. Sebagai kesimpulan, penelitian kami sangat mendukung gagasan bahwa sumber daya bakteri dapat ditambahkan ke produk kosmetik yang dioleskan untuk efek pemutihan, pembentukan anti-kerut, efek anti-oksidan, dan aktivitas antimikroba.

cistanche pharma khusus

Untuk lebih jelasnya, silakan klik di sini.