Penyerapan Sitokin Selama Perfusi Ginjal Manusia Mengurangi Tanda Tangan Gen Peradangan Terkait Fungsi Cangkok Tertunda

Kontak: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:{0}}

John R. Ferdinand1,2|Sarah A. Hosgood2,3|Tom Moore2,3|Ashley Ferro1|Christopher J. Ward1|Tomas Castro-Dopico1|Michael L. Nicholson2,3|Menna R. Clatworthy1,2

1 Unit Kekebalan Molekuler, Departemen Kedokteran Universitas Cambridge, Laboratorium Biologi Molekuler, Cambridge, Inggris

2 Unit Penelitian Darah dan Transplantasi Institut Kesehatan Nasional di Donasi Organ, Cambridge, Inggris

3 Departemen Bedah Universitas Cambridge, Cambridge, Inggris

Transplantasi adalah pengobatan optimal untuk sebagian besar pasien dengan stadium akhirginjalpenyakittetapi kekurangan organ merupakan tantangan utama. Perfusi mesin normotermik (NMP) telah digunakan untuk merekondisi organ marginal; namun, mekanisme di mana NMP mungkin bermanfaat bagi organ tidak dipahami dengan baik. Menggunakan pasangan ginjal manusia yang diperoleh dari donor yang sama, kami membandingkan efek NMP dengan efek penyimpanan dingin di duniaginjaltranskriptom. Kami menemukan bahwa penyimpanan dingin menyebabkan penurunan global dalam ekspresi gen, termasuk gen jalur inflamasi dan yang diperlukan untuk proses pembangkit energi, seperti fosforilasi oksidatif (OXPHOS). Sebaliknya, selama NMP, ada peningkatan regulasi gen OXPHOS, tetapi juga sejumlah gen jalur imun dan inflamasi. Menggunakan biopsi dari ginjal yang menjalani NMP yang kemudian ditransplantasikan, kami menemukan bahwa ekspresi gen inflamasi yang lebih tinggi terjadi pada organ dengan fungsi cangkok tertunda yang berkepanjangan (DGF). Oleh karena itu, kami menggunakan hem-adsorber (HA) untuk menghilangkan sitokin pro-inflamasi. Ekspresi gen inflamasi yang dilemahkan ini meningkatkan gen jalur OXPHOS dan berpotensi memiliki efek penting secara klinis dalam mengurangi ekspresi tanda tangan gen terkait DGF. Bersama-sama, data kami menunjukkan bahwa adsorpsi mediator pro-inflamasi dari perfusat merupakan intervensi potensial yang dapat meningkatkan viabilitas organ.

KATA KUNCI:penelitian / praktik klinis, fungsi cangkok tertunda (DGF), donor dan donasi: almarhum,ginjal(alograft) fungsi / disfungsi,ginjalpenyakit: imun / inflamasi, ginjal

Ramuan Cistanche meningkatkan fungsi ginjal

1. PERKENALAN

Ginjaltransplantasi merupakan pengobatan yang optimal untuk sebagian besar pasien dengantahap akhirginjalpenyakit, dengan manfaat baik untuk kualitas dan kuantitas hidup.1 Kekurangan organ merupakan tantangan besar, dan beberapa strategi telah digunakan untuk meningkatkan jumlah ginjal yang tersedia, termasuk penggunaan donor kematian peredaran darah (DCD) dan donor kriteria diperpanjang (ECD). ), keduanya terkait dengan tingkat yang lebih tinggi dari fungsi cangkok tertunda (DGF) dibandingkan dengan kematian batang otak yang meninggal (DBD) donor.2,3 Pada ginjal DCD, paparan iskemia hangat selama proses penghentian peredaran darah memberikan kontribusi yang signifikan terhadap DGF . DGF terjadi karena kerusakan atau kematian sel tubulus iskemik, yang dapat merangsang aktivasi imun bawaan melalui perakitan inflammasome NLRP3 yang mengarah ke generasi interleukin (IL)1 dan IL18.4-6 Memang, kehadiran sitokin inflamasi dalam urin telah digunakan sebagai biomarker dariakutginjalcederadan DGF.7-9

Perfusi mesin normothermic (NMP) memungkinkan organ yang ditransplantasikan diperfusi dengan sel darah merah yang hangat dan teroksigenasi, tanpa adanya komponen imun yang bersirkulasi, termasuk komplemen dan neutrofil.10-14 Proses ini telah digunakan untuk menilai organ marginal15 dan untuk " rekondisi" organ untuk memfasilitasi transplantasi ginjal yang awalnya ditolak menyusul tawaran melalui layanan alokasi organ nasional.16 Pengalaman kami sebelumnya menggunakan NMP memberikan alasan untuk uji coba terkontrol secara acak untuk menilai kemanjurannya dalam mencegah DGF pada ginjal DCD,17 tetapi mekanisme dimana NMP mungkin menguntungkan transplantasi ginjal tidak sepenuhnya dipahami. Selanjutnya, pertanyaan apakah manipulasi tambahan dariginjalselama NMP, misalnya dengan menghilangkan sitokin dan kemokin pro-inflamasi dari perfusate, mungkin menawarkan manfaat tambahan dalam mengoptimalkan organ sebelum transplantasi belum dibahas pada ginjal manusia, tetapi penelitian kami tentang NMP babi menunjukkan hasil yang menjanjikan.18

Di sini kami mengambil pendekatan yang tidak bias untuk menjawab dua pertanyaan ini menggunakan analisis transkriptomik manusiaginjalbiopsi yang diambil pada awal dan akhir NMP untuk menilai perubahan global dalam ekspresi gen. Kami menggunakan pasangan ginjal manusia dari donor tunggal yang memungkinkan perbandingan efek intervensi yang berbeda pada organ dengan latar belakang genetik yang identik dan mampu menilai dampak perubahan tersebut pada prediksi hasil cangkok.

Manfaat ekstrak Cistanche: mencegah akutginjalcedera

2. HASIL

2.1. Pasangan ginjal secara genetik serupa dan model yang berguna untuk menilai intervensi

Kami menyelidiki perubahan transkripsi yang terkait dengan pelestarian organ dan NMP dalam dua studi independen, masing-masing dengan lima pasang ginjal, membuat total 10 pasang/20 ginjal manusia. Dari jumlah tersebut, dua berasal dari DBD dan delapan dari donor DCD (Tabel S1, S2, dan Gambar S1). Dalam studi ini, kami mengambil biopsi kortikal sebelum dan sesudah intervensi (penyimpanan dingin atau NMP) dan menyelidiki lanskap transkripsi menggunakan pengurutan RNA (RNA-Seq). Penggunaan ginjal berpasangan dan biopsi berpasangan dari yang samaginjalmemungkinkan kami untuk mengontrol variasi biologis dan untuk menghilangkan perancu ini dari analisis (Gambar S2A). Kami mengkonfirmasi ituginjalpasangan mulai dengan lanskap transkripsi umum (Gbr. S2B) dan dengan menerapkan intervensi yang berbeda untuk masing-masingginjalberpasangan, kami dapat mempelajari efek intervensi yang tidak bergantung pada variasi biologis.

GAMBAR 1 Ginjal yang terpapar cold storage menunjukkan perubahan ekspresi gen yang terbatas dibandingkan dengan yang menjalani NMP. Sepasang ginjal diperoleh yang telah ditolak untuk digunakan dalam transplantasi. Satuginjaldipertahankan dalam penyimpanan dingin statis dan yang lainnya menjalani perfusi mesin normotermik (NMP). Biopsi diambil dari korteks luar pada awal dan setelah 2 jam. B, plot Volcano menunjukkan perubahan ekspresi gen pada 2 jam untuk kelompok yang ditunjukkan dibandingkan dengan awal. Titik merah menunjukkan gen yang diekspresikan secara berbeda dengan nilai P yang disesuaikan<0.05 and="" the="" experimental="" group="" is="" indicated="" above="" the="" plot.="" c,="" gene="" set="" enrichment="" analyses="" of="" the="" differential="" expressions="" from="" b="" against="" the="" hallmarks="" pathways.="" only="" significant="" pathways="" (fdr="" q="" value=""><0.05) are="" plotted.="" red="" dots="" indicate="" positive="" enrichment="" and="" blue="" negative,="" the="" size="" of="" the="" dot="" is="" inversely="" correlated="" with="" the="" fdr="" q="" value="" and="" the="" position="" indicates="" the="" normalized="" enrichment="" score="" (nes).="" d,="" heatmap="" of="" the="" top="" 20="" significantly="" upregulated="" genes="" during="" nmp,="" genes="" are="" ranked="" by="" log2="" fold="" change.="" e,="" string="" analysis="" of="" the="" top="" 50="" genes="" upregulated="" during="" nmp.="" the="" color="" of="" each="" node="" indicates="" membership="" of="" each="">

GAMBAR 2 Korelasi transkriptom berikut NMP dengan panjang fungsi cangkok tertunda. Ekspresi gen berkorelasi dengan panjang DGF dalam biopsi yang diambil setelah NMP sebagai bagian dari uji klinis acak. Tingkat ekspresi dari 1000 gen dengan korelasi terbesar dengan hasil telah diplot. B, GSEA dilakukan untuk korelasi dari A terhadap kumpulan data keunggulan. Hanya jalur yang signifikan (nilai FDR q<0.05) are="" plotted.="" red="" dots="" indicate="" positive="" enrichment="" and="" blue="" negative,="" the="" size="" of="" the="" dot="" is="" inversely="" correlated="" with="" the="" fdr="" q="" value="" and="" the="" position="" indicates="" the="" normalized="" enrichment="" score="">

2.2. NMP menghasilkan peningkatan OXPHOS dan gen jalur inflamasi dibandingkan dengan penyimpanan dingin

Untuk menyelidiki mekanisme potensial di mana NMP dapat berdampak pada ginjal, kami awalnya mengambil limaginjalpasangan (n {{0}} donor DCD dan n=1 donor kematian batang otak [DBD] yang telah meninggal, Gambar S1, Tabel S1) dan melakukan biopsi kortikal waktu 0 (0 jam) . Pada titik ini, ginjal diacak ke penyimpanan dingin statis atau NMP, seperti yang dijelaskan sebelumnya 10 (Gambar 1A). Setelah 2 jam, biopsi kedua diambil dari kedua ginjal dan RNA-Seq dilakukan. Ketika membandingkan ekspresi gen antara waktu 0- dan 2-biopsi jam, kami menemukan bahwa ginjal yang ditempatkan dalam penyimpanan dingin statis tidak memiliki perubahan yang signifikan secara statistik dalam ekspresi gen individu mana pun ketika dikoreksi untuk beberapa pengujian (Gambar 1B , panel kiri). Sebaliknya, selama 2 jam NMP, 956 gen diregulasi dan 353 gen diturunkan regulasi (Gambar 1B, panel kanan). Kami selanjutnya menilai perubahan dalam ekspresi kelompok gen dalam jalur umum, membandingkan puluhan atau ratusan gen daripada gen individu mana pun, sehingga semakin mengurangi efek variasi antarindividu biologis pada analisis. Ini mengungkapkan perubahan dalam jalur penting secara fungsional, di mana ekspresi setiap gen individu dalam jalur itu tidak diubah dengan besaran yang cukup untuk mencapai signifikansi statistik. Analisis pengayaan set gen (GSEA) ini menunjukkan bahwa penyimpanan dingin memiliki dampak besar pada sejumlah jalur metabolisme (Gambar 1C, panel kiri). Secara khusus, ada pengurangan yang nyata pada gen yang terlibat dalam fosforilasi oksidatif (OXPHOS), jalur utama yang diperlukan untuk menghasilkan ATP.19 Sebaliknya, OXPHOS adalah salah satu jalur yang diregulasi secara signifikan selama NMP (Gambar 1C, panel kanan), dengan potensi manfaat untuk kelangsungan hidup sel dan pemulihan homeostasis seluler. Selain itu, sejumlah jalur yang terlibat dalam proses imun atau inflamasi diinduksi selama NMP, dengan "pensinyalan TNF melalui NFkB" menunjukkan peningkatan terbesar. Sesuai dengan ini, TNF, serta IL1B dan kemokin perekrutan neutrofil CXCL8 (IL8) dan CXCL2, adalah di antara gen yang paling diregulasi dalam 2-jam biopsi NMP (Gambar 1D). Analisis string dari 50 gen teratas yang diregulasi mengungkapkan peningkatan regulasi gen terkait biokimia yang dikelompokkan menjadi empat simpul utama; IL8 dan kemokin perekrutan neutrofil, gen terkait Inflammasome, pensinyalan NFkB, dan regulasi transkripsi (Gambar 1E). Sebagai catatan, ginjal DBD dan DCD secara transkripsi serupa pada awal (Gambar S2C), dan jalur gen yang berubah selama NMP serupa pada ginjal DBD dan DCD (Gambar S2D). Bersama-sama, analisis kami menunjukkan bahwa selama NMP, ada peningkatan ekspresi gen yang mempromosikan pembangkitan energi, dengan efek yang berpotensi menguntungkan bagi organ, tetapi induksi simultan gen pro-inflamasi, yang mungkin merusak.

Ekstrak Cistanche tubulosa: meningkatkan fungsi ginjal

2.3. Gen jalur inflamasi pada ginjal NMP yang terkait dengan fungsi cangkok tertunda yang berkepanjangan

Untuk menghubungkan perubahan transkripsi yang terjadi selama penyimpanan dingin dan NMP dengan hasil klinis, kami melakukan RNA-Seq pada biopsi yang diambil dari 33 ginjal DCD yang telah menjalani NMP sebagai bagian dari uji klinis acak yang saat ini menilai kemanjurannya.17 Sampel tersedia di subset ginjal yang diacak pada kelompok penelitian NMP yang kemudian ditransplantasikan (Tabel S3, Gambar S1). DGF lebih sering terjadi pada ginjal DCD dan secara klasik didefinisikan sebagai persyaratan untuk dialisis pada minggu pertama pasca transplantasi. Namun, dalam periode pasca-transplantasi segera, beberapa pasien menerima satu episode dialisis untuk hiperkalemia, yang tidak selalu mencerminkan adanya nekrosis tubular akut yang signifikan. Oleh karena itu, kami menggunakan model yang menghubungkan ekspresi gen dengan waktu antara operasi transplantasi dan sesi dialisis terakhir (yaitu, durasi DGF). Ini menunjukkan perubahan transkripsi yang lebih nyata dalam transplantasi yang membutuhkan dialisis di luar 24 jam pertama pascatransplantasi (Gambar 2A), serta korelasi positif yang signifikan antara ekspresi gen jalur inflamasi termasuk jalur "pensinyalan TNFA melalui NFkB" dan "respon inflamasi" dan panjang DGF, dengan pengayaan yang lebih besar dari jalur ini pada ginjal yang mengalami pascatransplantasi DGF yang lebih lama (Gambar 2B). Sebaliknya, panjang DGF berkorelasi negatif dengan besarnya ekspresi gen jalur "OXPHOS" (Gambar 2B). Secara keseluruhan, data ini menunjukkan bahwa setelah NMP, ginjal yang memiliki ekspresi gen jalur inflamasi yang lebih rendah dan ekspresi gen jalur "OXPHOS" yang lebih tinggi kurang rentan terhadap pascatransplantasi DGF yang berkepanjangan. Ini akan mendukung kesimpulan bahwa perubahan molekuler yang terjadi selama NMP mungkin memiliki efek menguntungkan (induksi gen jalur OXPHOS) dan merusak (induksi gen jalur inflamasi).

2.4. Output urin dan aliran darah ginjal selama NMP menunjukkan hubungan yang berbeda dengan OXPHOS dan gen jalur inflamasi

Kuantitas urin yang dihasilkan selama NMP adalah salah satu dari sejumlah parameter yang termasuk dalam skor penilaian kualitas bedah yang digunakan untuk memandu keputusan pemanfaatan organ,15 tetapi apakah output urin yang tinggi selama NMP benar-benar menandakan prognosis yang baik untuk ginjal dan jalur molekuler yang mendasari diaktifkan pada ginjal dengan output urin yang tinggi tidak jelas. Dalam total 10 ginjal yang menjalani NMP (ginjal hanya NMP, Tabel S1 dan S2, Gambar S1), kami mengamati kisaran keluaran urin dari 0 hingga 340 ml selama periode 2-jam perfusi (Gambar 3A panel kiri). Sebagai catatan, ketika kami membandingkan jalur yang berubah selama NMP di lima ginjal dalam dua percobaan independen, kami menemukan bahwa jalur serupa diinduksi (Gambar S3A) yang mengkonfirmasi reproduktifitas desain eksperimental kami dan kegunaan membandingkan jalur daripada gen individu. Dalam 2-jam biopsi pascaperfusi, ekspresi 11 gen secara signifikan berkorelasi dengan volume urin yang dihasilkan selama periode ini. Ini termasuk protein kejutan panas (HSP), HSPA1A, HSPA1B, dan HSPH1, yang berkorelasi positif dengan peningkatan output urin (Gambar 3A panel kanan). Analisis pengayaan set gen menunjukkan bahwa keluaran urin juga berkorelasi positif dengan gen jalur "pensinyalan TNF melalui NFkB", dan berkorelasi negatif dengan gen OXPHOS dalam biopsi pascaperfusi (Gambar 3B, S3C). Demikian pula, dalam biopsi pra-perfusi, OXPHOS berkorelasi negatif dengan keluaran urin di ginjal ini sementara jalur yang terkait dengan aktivasi kekebalan termasuk "pensinyalan TNF melalui NFkB" dan "penolakan allograft" berkorelasi positif dengan keluaran urin, menunjukkan bahwa NMP memiliki sedikit efek pada proses ini. , atau pada jalur lain yang dianalisis, pada ginjal dengan keluaran urin yang tinggi (Gambar 3B, S3C-D). Karena induksi gen jalur inflamasi diamati dalam sampel klinis kami dengan DGF yang berkepanjangan (Gambar 2B), data ini menantang dogma bahwa keluaran urin yang tinggi terjadi pada ginjal "sehat" yang lebih layak dan menunjukkan bahwa pada kenyataannya, ginjal ini mungkin memiliki lebih banyak potensi inflamasi, kurang mampu menghasilkan energi dan ini tidak berubah secara substansial selama NMP.

Aliran darah ginjal selama perfusi juga telah dinilai sebagai parameter yang mungkin mencerminkan fungsi transplantasi selanjutnya.15 Dalam 10 ginjal yang diteliti, aliran darah ginjal pada perfusi 2 jam bervariasi dari 14,1 hingga 168,8 ml/menit (Gambar 3C panel kiri). Dalam 2-jam biopsi pascaperfusi, delapan gen secara signifikan berkorelasi positif dengan peningkatan aliran darah ginjal (Gambar 3C panel kanan), termasuk HSPA1L, tetapi tidak ada tumpang tindih langsung antara daftar gen ini dan yang berkorelasi dengan keluaran urin (Gambar 3A ). Analisis pengayaan set gen menunjukkan bahwa aliran darah ginjal yang tinggi berkorelasi positif dengan gen OXPHOS dalam 0-jam biopsi, tetapi berbeda dengan mereka dengan keluaran urin tertinggi, perfusi memiliki dampak yang signifikan, menghasilkan korelasi negatif dengan "OXPHOS" gen jalur dengan 2 jam (Gambar 3D, Gambar S4A-B). Aliran darah ginjal berkorelasi negatif dengan sejumlah jalur gen imun dan inflamasi di kedua 0- dan 2-biopsi jam (Gambar 3D, Gambar S4B), berbeda dengan keluaran urin (Gambar 3B, Gambar S3C). Bersama-sama data ini menunjukkan bahwa aliran darah ginjal dan keluaran urin mungkin bukan indikator yang setara dari ginjal yang lebih layak, tetapi yang pertama mungkin lebih tepat mengidentifikasiginjalcenderung memiliki DGF yang berkepanjangan.

manfaat dan efek samping cistanche: anti-inflamasi

2.5. Penambahan hem-adsorber ke sirkuit perfusi tidak berpengaruh pada parameter perfusi tetapi secara signifikan mengurangi ekspresi gen inflamasi, termasuk NLRP3 dan IL1B

Analisis dariginjalperfusate telah menunjukkan peningkatan substansial dalam konsentrasi sitokin dan kemokin pro-inflamasi selama hipotermia dan NMP.20,21 Molekul bioaktif ini bersirkulasi kembali ke ginjal, dengan potensi untuk menginduksi peradangan lebih lanjut. Mengingat bahwa analisis kami tentang transplantasiginjalsampel menunjukkan bahwa induksi gen yang bergantung pada TNF pada ginjal NMP dikaitkan dengan DGF (Gambar 2B), kami berhipotesis bahwa penghapusan sitokin dan kemokin dari sirkuit perfusi dapat melemahkan induksi gen inflamasi, dengan potensi efek menguntungkan untuk ginjal. Pendekatan semacam itu telah menunjukkan beberapa kemanjuran pada pasien dengan sindrom respons inflamasi sistemik, 22,23, dan dikaitkan dengan peningkatan aliran darah ginjal pada ginjal babi yang menjalani NMP.18 Untuk menguji ini pada ginjal manusia, kami mengambil lima pasang ginjal tambahan dan melakukan NMP selama 4 jam dengan biopsi yang diambil pada 0, 2, dan 4 jam (Gambar S1). Dalam setiap kasus, sitosol hem-adsorber (HA) yang menghilangkan molekul dengan berat molekul 10-50 kDa ditambahkan ke sirkuit perfusi satu ginjal dalam setiap pasangan (NMP plus HA) (Gambar 4A). Seperti yang diantisipasi, penambahan HA menghasilkan konsentrasi yang lebih rendah dari berbagai sitokin dalam perfusat (Gambar 4B) tetapi tidak berpengaruh pada aliran darah ginjal, keluaran atau komposisi urin, konsumsi oksigen, dan homeostasis asam-basa (Gambar 4C, Tabel S4, S5). Jadi, lebih dari 4 jam NMP, HA tidak berdampak pada parameter perfusi yang saat ini digunakan secara klinis untuk menghasilkan skor penilaian kualitas tetapi memiliki efek substansial pada ekspresi gen; Mengikuti NMP, 1794 dan 4026 gen diregulasi pada 2 dan 4 jam, masing-masing, termasuk TNF dan IL6 (Gambar 4D, E). tetapi hanya setengah dari jumlah ini (n=898 dan n=2606) meningkat ketika HA hadir (Gambar 4D, Gambar S5A dan B). Jumlah gen yang diturunkan regulasinya juga berkurang dengan penambahan HA (Gambar 4D). Setelah 4 jam NMP, 46 gen secara signifikan diregulasi dan 181 diturunkan dengan penambahan HA (Gambar 4F). Respons transkripsi yang dilemahkan ini termasuk gen terkait aktivasi inflammasome NLRP3, seperti IL1B, NLRP3, dan CASP1 (Gambar 4G, Gambar S4B) dan beberapa kemokin yang merekrut neutrofil (Gambar S5C), yang sebelumnya terkait dengan cedera ginjal pada model hewan.24,25 Ini menunjukkan bahwa mediator terlarut dilepaskan dariginjalmensirkulasi ulang dan mendorong ekspresi de novo gen inflamasi di dalam organ, tetapi hal ini dapat dikurangi dengan pemindahan gen tersebut dari sirkuit perfusi.

GAMBAR 4 Penambahan hem-adsorber ke sirkuit perfusi mesin normotermik memiliki efek substansial pada tingkat sitokin dalam perfusat dan transkriptom tetapi tidak pada parameter fisik yang direkam pada rig. Sepasang ginjal manusia diambil dari donor yang sama, salah satunya menjalani protokol standar perfusi mesin normotermik (NMP) selama 4 jam dan yang lainnyaginjalmenjalani NMP dengan penambahan hem-adsorber ke sirkuit. Sampel diambil untuk RNA-Seq sebelum perfusi (0 jam), setelah 2 jam, dan di akhir (4 jam). B, Konsentrasi sitokin kunci dalam perfusat setelah 4 jam NMP. Garis menunjukkan pasangan ginjal. Pengukuran sitokin dinormalisasi dengan kandungan protein perfusat total. Nilai P yang dinyatakan adalah dari uji t berpasangan untuk reduksi sitokin dengan penambahan HA. C, Produksi urin dan aliran darah ginjal (RBF) sepanjang perjalanan waktu perfusi. Garis hijau menunjukkan NMP saja dan oranye dengan penambahan hem-adsorber. D, Diagram Venn menunjukkan jumlah gen yang diekspresikan secara signifikan berbeda ketika membandingkan sampel 2-jam atau 4-jam dengan sampel sebelum(0-jam). Diagram merah adalah gen yang diregulasi dan biru diregulasi. Perpotongan adalah gen yang diekspresikan secara berbeda pada kedua titik waktu dalam arah yang sama. E, log2 nilai ekspresi yang dinormalisasi untuk gen yang ditunjukkan di seluruh perfusi dari transkriptom jaringan, bilah kesalahan standar ditunjukkan. F, Plot gunung berapi untuk perbandingan berpasangan NMP saja dengan NMP plus HA pada 4 jam. Merah menunjukkan gen yang diekspresikan secara berbeda dengan nilai P yang disesuaikan<0.05. g,="" as="" for="">

mengobati penyakit ginjal ekstrak cistanche

2.6. HA terkait dengan pengurangan tanda tangan gen terkait fungsi cangkok yang tertunda

Analisis pengayaan set gen menunjukkan penurunan yang signifikan dalam jalur "pensinyalan TNF melalui NFkB" pada ginjal NMP plus HA dibandingkan dengan NMP saja (Gambar 5A-B). Khususnya, kehadiran HA tidak hanya mengurangi ekspresi gen inflamasi di dalamginjaltetapi juga meningkatkan jalur metabolisme OXPHOS dan asam lemak, yang keduanya berkontribusi pada pembangkitan energi (Gambar 5A-B). Oleh karena itu, perubahan jalur ekspresi gen yang terjadi dengan HA akan mendukung kesimpulan bahwa efeknya bermanfaat secara klinis, karena mengurangi gen jalur "pensinyalan TNFA melalui NFkB" dan meningkatkan gen jalur "OXPHOS", yang keduanya dikaitkan dengan durasi DGF (Gambar 2B).

Untuk mengeksplorasi lebih lanjut hubungan antara perubahan transkripsi dalam NMP dan hasil klinis, kami berusaha untuk mengkurasi tanda tangan gen yang ada di ginjal dengan DGF. Kami mengidentifikasi 100 gen teratas yang diatur secara positif (NAIK) dan negatif (BAWAH) (diurutkan berdasarkan perubahan lipatan log) yang berkorelasi dengan panjang DGF dalam 33 sampel uji klinis (Gambar 5C, Data S1). Kami menemukan pengayaan yang signifikan dari tanda tangan gen yang terkait dengan peningkatan panjang DGF dalam sampel dengan keluaran urin yang lebih tinggi (Gambar 5D), menunjukkan bahwa keluaran urin yang tinggi selama NMP mengidentifikasi ginjal pada risiko DGF yang lebih lama. Tidak ada korelasi yang signifikan secara statistik antara tanda tangan DGF dan gen yang terkait dengan aliran darah ginjal yang lebih tinggi (Gambar 5E). Kami selanjutnya menilai apakah dan bagaimana penambahan HA ke sirkuit NMP memengaruhi ekspresi tanda tangan gen DGF "UP" dan "DOWN". Hebatnya, ini menunjukkan bahwa ekspresi tanda tangan gen yang terkait dengan peningkatan panjang DGF berkurang secara signifikan dengan penambahan HA, dan tanda tangan yang terkait dengan penurunan panjang DGF meningkat secara signifikan dengan penambahan HA (Gambar 5F).

Secara keseluruhan, perubahan transkripsi yang telah kami identifikasi menunjukkan bahwa NMP memiliki manfaat potensial dibandingkan penyimpanan dingin dalam hal efeknya pada pembangkit energi di ginjal. Namun, selama perfusi, beberapa molekul bioaktif dilepaskan dari ginjal ke sirkuit perfusi, menghasilkan loop amplifikasi yang mendorong peradangan ketika mereka masuk kembali ke ginjal. Penghapusan molekul-molekul ini mengganggu loop ini dan mungkin berguna untuk mengurangi peradangan dan meningkatkan pembangkitan energi, lebih lanjut meningkatkan efek menguntungkan dari NMP dan mengurangi kerentanan terhadap DGF (Gambar 6).

GAMBAR 5 Penambahan ham-adsorber mengurangi tanda tangan gen terkait DGF. Analisis GSEA tentang efek penambahan HA ke transkriptom setelah 4 jam NMP terhadap jalur tanda gen. Hanya jalur signifikan yang diplot. Titik merah menunjukkan pengayaan positif dan biru negatif, ukuran titik berkorelasi terbalik dengan nilai FDR q dan posisi menunjukkan skor pengayaan ternormalisasi (NES). B, Plot pengayaan dari GSEA untuk jalur kunci dari database Hallmark untuk perbandingan dari A. Garis menunjukkan skor pengayaan berjalan dan plot biola menunjukkan distribusi gen anggota dari gen di seluruh daftar gen peringkat yang digunakan dalam setiap analisis. C, Heatmap dari empat besar korelasi positif (UP) dan negatif (DOWN) terbesar dengan panjang DGF dan digunakan sebagai bagian dari tanda ekspresi gen untuk DGF. Tanda tangan DGF lengkap diberikan dalam data tambahan. Tanda tangan gen terkait DF, DGF digunakan dengan GSEA untuk menyelidiki ekspresi tanda tangan dalam korelasi 2-jam keluaran urin dengan 2-jam transkriptom (D), korelasi 2-jam RBF dengan 2-jam transkriptom (E), dan efek penambahan HA pada transkriptom pada 4 jam (F). Plot untuk A

GAMBAR 6 Ringkasan grafis. A, Selama penyimpanan dingin, terjadi penurunan transkripsi secara global. Selama NMP, ekspresi gen di sejumlah jalur diregulasi termasuk fosforilasi oksidatif (OXPHOS) dan gen jalur inflamasi seperti TNF, IL8, dan NFkB. B panel kiri, Selama NMP, mediator inflamasi (lingkaran kuning) dilepaskan dariginjalke dalam larutan perfusi. Mereka mensirkulasi ulang dan merangsang transkripsi gen pro-inflamasi di ginjal, dan terkait dengan pengurangan gen produksi jalur energi, mengurangi ATP. Panel kanan, Kehadiran hem-adsorber (HA) memutus lingkaran amplifikasi inflamasi ini

Ramuan Cistanche meningkatkan fungsi ginjal

3. DISKUSI

Data kami menunjukkan bahwa penyimpanan dingin efektif dalam membatasi perubahan substansial dalam ekspresi gen. Ini sesuai dengan model hewan pengerat, di mana ginjal yang disimpan hingga 18 jam dalam penyimpanan dingin menunjukkan sedikit perubahan dalam ekspresi sitokin pro-inflamasi, termasuk IL1, TNF, dan IL6.26 Kami menggunakan profil transkripsi global yang tidak bias daripada pengukuran sejumlah kecil gen kandidat memungkinkan kami untuk menganalisis ekspresi kelompok gen yang ditemukan dalam jalur tertentu. Hal ini mengungkapkan penurunan yang signifikan dalam ekspresi gen OXPHOS dan jalur glikolisis pada ginjal yang disimpan dalam suhu dingin, yang berpotensi mengurangi kapasitas ginjal ini untuk menghasilkan ATP, sejalan dengan penelitian sebelumnya yang menunjukkan penurunan ATP pada ginjal manusia yang disimpan dalam suhu dingin.27 Sejumlah jalur pro-inflamasi juga diturunkan regulasinya selama penyimpanan dingin, termasuk aktivasi TNF melalui NFkB dan jalur spesies oksigen reaktif yang mungkin berpotensi bermanfaat. Namun, mungkin penyimpanan dingin hanya menahan sementara jalur ini, dan bahwa setelah reperfusi pada penerima, perubahan serupa dalam ekspresi gen inflamasi seperti yang diamati pada NMP akan terjadi.

NMP memiliki efek yang berlawanan dengan penyimpanan dingin pada gen jalur OXPHOS dan glikolisis, meningkatkan ekspresinya, dengan potensi untuk meningkatkan kapasitas seluler untuk menghasilkan ATP dan memulihkan homeostasis. Sebagai catatan, perfusi teroksigenasi hipotermik ginjal manusia juga telah terbukti meningkatkan kadar ATP dibandingkan dengan penyimpanan dingin 27, oleh karena itu pemulihan oksigenasi mungkin merupakan stimulus utama untuk proses ini daripada normotermia. Meskipun demikian, perubahan ini cenderung bermanfaat bagi organ mengingat pengamatan kami tentang korelasi negatif antara peningkatan ekspresi gen jalur OXPHOS dan DGF yang berkepanjangan.

Sebuah makalah baru-baru ini oleh Hameed et al28 juga melakukan analisis transkriptomik NMP pada tiga ginjal yang menjalani NMP. Sayangnya, penulis tidak membuat data mereka tersedia untuk umum, sehingga perbandingan mendalam dengan dataset kami tidak mungkin dilakukan. Namun, manuskrip mereka menunjukkan induksi gen terkait respons imun selama NMP, termasuk IL1B, CXCL2, dan TNF, yang sesuai dengan temuan kami.

Dalam analisis kami terhadap ginjal yang menjalani NMP dalam konteks uji klinis, kami menghubungkan tanda-tanda ekspresi gen dengan panjang DGF daripada insiden DGF (didefinisikan sebagai kebutuhan untuk dialisis dalam minggu pertama pascatransplantasi). Khususnya, ginjal dengan durasi DGF 1 hari atau kurang secara transkripsi sangat mirip dengan ginjal tanpa DGF, kemungkinan mencerminkan kebutuhan dialisis karena hiperkalemia terkait peri-operatif daripada DGF yang bonafid. Kami menemukan bahwa DGF yang lebih lama dikaitkan dengan ekspresi pensinyalan TNFA yang lebih tinggi melalui gen jalur NFkB dan ekspresi gen yang lebih rendah yang terkait dengan OXPHOS. Data ini menunjukkan bahwa ginjal dengan peningkatan OXPHOS dan penurunan sinyal kekebalan dapat menunjukkan potensi yang lebih baik sebagai ginjal donor, tetapi kesimpulan ini memerlukan validasi dalam studi prospektif yang lebih besar.

Kami juga menilai proses molekuler yang berkorelasi dengan keluaran urin dan darah ginjal selama NMP. Parameter ini sebelumnya telah digunakan, bersama dengan sejumlah ukuran lain, untuk menghasilkan skor penilaian kualitas ginjal perfusi. Nilai keluaran urin dan aliran darah ginjal yang tinggi telah dianggap mencerminkan pencangkokan yang lebih layak.15 Data kami mengungkapkan bahwa jalur yang berhubungan dengan keluaran urin yang tinggi dan aliran darah ginjal yang tinggi berbeda, dan pada kenyataannya, parameter ini menunjukkan hubungan yang berlawanan dengan jalur inflamasi. . Output urin yang tinggi dikaitkan dengan ekspresi gen jalur imun yang lebih tinggi sementara aliran darah ginjal yang tinggi berkorelasi negatif dengan jalur ini. Kami juga menemukan bahwa tanda tangan gen DGF yang kami hasilkan diperkaya pada ginjal dengan keluaran urin yang tinggi selama NMP, menunjukkan bahwa parameter ini dapat mengidentifikasi ginjal yang berisiko mengalami DGF yang lebih lama, berbeda dengan dogma saat ini. Salah satu penjelasan potensial adalah bahwa keluaran urin yang sangat tinggi mencerminkan ginjal dengan kerusakan tubulus yang lebih banyak yang tidak memiliki kemampuan untuk memekatkan urin. Dengan demikian, mungkin ada "efek Goldilocks" sehubungan dengan haluaran urin, di mana ginjal dengan keluaran urin rendah/sedikit adalah mereka yang memiliki kelainan substansial dalam pembentukan filtrat, ginjal dengan keluaran urin yang sangat tinggi memiliki kerusakan tubulus substansial yang menghalangi konsentrasi urin. Hipotesis ini perlu diuji pada sejumlah besar ginjal yang kemudian ditransplantasikan.

Selama 4 jam NMP, terjadi induksi gen inflamasi di ginjal. Namun, perlu dicatat bahwa praktik klinis saat ini hanya melibatkan 1 jam NMP, dan efek ini mungkin tidak terlihat pada waktu perfusi yang lebih pendek. Namun, perfusi yang lebih lama mungkin memiliki manfaat dalam hal pemulihan oksigenasi dan pembangkitan energi, dan dalam percobaan kami, efek negatif dari induksi gen imun dapat secara substansial dinegasikan dengan pengenalan sitosol HA ke sirkuit perfusi. Data ini menunjukkan bahwa mediator inflamasi yang dihasilkan oleh ginjal selama NMP memasuki sirkuit perfusi dan mampu memperburuk peradangan steril dan penghapusannya memperbaiki induksi gen jalur peradangan yang diamati selama NMP. Yang penting, kami menunjukkan bahwa penambahan HA mempengaruhi ekspresi gen yang terkait dengan hasil yang lebih buruk secara klinis. Tanda tangan gen DGF kami berasal dari sampel yang menjalani NMP sebagai bagian dari uji klinis yang menilai kemanjurannya, memungkinkan kami untuk secara kuat menghubungkan perubahan yang kami amati dalam studi ginjal berpasangan kami dengan titik akhir klinis pada ginjal yang menjalani transplantasi. Namun, penerapannya dalam konteks uji klinis akan diperlukan untuk membuktikan secara definitif kegunaan penerapannya pada pratransplantasi ginjal. HA tidak spesifik dan dapat menghilangkan molekul yang bermanfaat, selain yang merusak organ. Kami menemukan bahwa efek bersih HA pada transkriptom ginjal tampak bermanfaat, tetapi mungkin penyempurnaan untuk secara khusus menghilangkan mediator yang terbukti dan merusak mungkin bahkan lebih efektif.

Pasangan ginjal yang kami gunakan berasal dari individu yang sama dan karena itu secara genetik identik dan telah mengalami lingkungan yang sama sepanjang hidup pendonor. Kami mengkonfirmasi bahwa waktu mereka 0 transkriptom sangat mirip (Gambar S2 A, B). Namun, biopsi ini mengambil sampel sebagian kecil dari ginjal, dan pasangan ginjal dapat dipengaruhi secara asimetris oleh patologi, misalnya, kista, atau penyakit pembuluh darah kecil. Peringatan tambahan adalah bahwa semua ginjal yang digunakan dalam eksperimen intervensi yang disajikan di sini ditolak untuk transplantasi dan beberapa mewakili organ yang ditransplantasikan di ujung bawah spektrum kualitas. Namun demikian, kami mengamati hasil yang sangat dapat direproduksi ketika membandingkan jalur gen dalam kelompok lima ginjal. Kami juga dapat menunjukkan bahwa ginjal dari DCD dan DBD memiliki respons yang serupa terhadap perfusi. Dengan menggabungkan ini dengan tanda tangan DGF pasca-NMP kurasi kami, kami dapat memprediksi potensi manfaat klinis. Pendekatan eksperimental ini dapat digunakan sebagai alat praklinis untuk menyaring intervensi masa depan untuk kemanjuran terapi potensial untuk memungkinkan pemilihan intervensi kandidat yang rasional untuk uji klinis.

Singkatnya, penelitian kami memberikan profil transkripsi global pertama ginjal manusia yang menjalani NMP, menyelesaikan berbagai jalur molekuler yang diaktifkan dalam NMP dibandingkan dengan penyimpanan dingin, dan menunjukkan bahwa efek merusak dari molekul bioaktif yang dihasilkan atau dilepaskan dari ginjal selama NMP dapat dibalik dengan penambahan HA. Lebih lanjut, intervensi ini mengurangi ekspresi gen yang terkait dengan DGF yang berkepanjangan memberikan alasan mekanistik yang kuat untuk menerapkan intervensi semacam itu pada uji klinis di masa depan. Data kami juga memiliki implikasi untuk strategi perfusi di luar ginjal, termasuk dalam transplantasi hati dan paru-paru, menunjukkan bahwa penghilangan molekul bioaktif dari perfusat harus diselidiki dalam konteks ini di mana NMP semakin banyak digunakan. Akhirnya, penelitian kami menyoroti kegunaan profil transkripsi global secara berpasanganginjaluntuk menilai intervensi baru pada organ perfusi; perubahan transkripsi mendahului perubahan kelimpahan protein (secara tradisional digunakan sebagai biomarkerginjalcedera) dan puluhan ribu transkrip gen dapat dengan mudah diukur. Dengan demikian, pengukuran RNA memiliki potensi untuk memberikan pembacaan awal yang sensitif dari fungsi seluler organ manusia yang diambil untuk transplantasi yang dapat diterapkan pada penelitian di masa depan.

UCAPAN TERIMA KASIH

Penulis berterima kasih kepada semua donor organ dan keluarganya. Lab Clatworthy berterima kasih atas fasilitas inti yang disediakan oleh Laboratorium Biologi Molekuler MRC. Pekerjaan ini dilakukan menggunakan sumber daya yang disediakan oleh Cambridge Service for Data-Driven Discovery (CSD3) yang dioperasikan oleh University of Cambridge Research Computing Service, yang disediakan oleh Dell EMC dan Intel menggunakan pendanaan Tier-2 dari Engineering and Physical Sciences Research Council (hibah modal EP/P020259/1), dan pendanaan DiRAC dari Science and Technology Facilities Council (www. Dirac. ac. UK).

PENYINGKAPAN

Para penulis tidak memiliki konflik kepentingan untuk diungkapkan seperti yang dijelaskan oleh American Journal of Transplantation.

KONTRIBUSI PENULIS

JRF, SH, MLN, dan MRC merancang studi dan menginterpretasikan data. JRF, SH, TM, CJW, AF, dan TCD melakukan percobaan. JRF, SH, dan MRC membuat gambar dan tabel. MRC menulis naskah utama. JRF dan SH membuat metode dan tokoh legenda, JRF, SH, dan MLN mengedit naskah.

Manfaat Cistanche: meningkatkan fungsi ginjal

Referensi:
1. Methven S, Steenkamp R, Fraser S. UK Renal Registry 19th Annual Report: Bab 5 Kelangsungan Hidup dan Penyebab Kematian pada Pasien Dewasa Inggris yang Menggunakan Terapi Penggantian Ginjal pada tahun 2015: Analisis Khusus Nasional dan Pusat. Nefron. 2017;137(1):117–150.
2. Summers DM, Johnson RJ, Allen J, dkk. Analisis faktor yang mempengaruhi hasil setelah transplantasi ginjal yang disumbangkan setelah kematian jantung di Inggris: studi kohort. Lanset. 2010;376(9749)::1303–1311.
3. Summers DM, Johnson RJ, Hudson A, Collett D, Watson CJ, Bradley JA. Pengaruh usia donor dan waktu penyimpanan dingin pada hasil pada penerima ginjal yang disumbangkan setelah kematian peredaran darah di Inggris: sebuah studi kohort. Lanset. 2013;381(9868):727–734.
4. Friedewald JJ, Rabb H. Sel inflamasi pada gagal ginjal akut iskemik.GinjalInt. 2004;66(2):486–491.
5. Kono H, Rock KL. Bagaimana sel-sel yang sekarat memperingatkan sistem kekebalan terhadap bahaya. Nat Rev Immunol. 2008;8(4):279–289.
6. Berry M, Clatworthy MR. Imunoterapi untuk akutginjalcedera. Imunoterapi. 2012;4(3):1–12.
7. Parikh CR, Coca SG, Thiessen-Philbrook H, dkk. Biomarker pasca operasi memprediksi akutginjalcedera dan hasil yang buruk setelah operasi jantung dewasa. J Am Soc Nephrol. 2011;22(9):1748–1757.
8. Hall IE, Yarlagadda SG, Coca SG, dkk. IL-18, dan NGAL urin memprediksi dialisis dan pemulihan cangkok setelahginjaltransplantasi. J Am Soc Nephrol. 2010;21(1):189–197.
9. Malyszko J, Lukaszyk E, Glowinska I, Durlik M. Biomarker fungsi cangkok tertunda sebagai bentuk akutginjalcedera diginjaltransplantasi. Sci Rep. 2015;5:11684.
10. Hosgood SA, Nicholson ML. Transplantasi ginjal pertama pada pria setelah perfusi normotermik ex vivo. Transplantasi. 2011;92(7):735–738.
11. Yong C, Hosgood SA, Nicholson ML. Perfusi normotermik ex-vivo dalam transplantasi ginjal: masa lalu, sekarang, dan masa depan. Transplantasi Organ Curr Opin. 2016;21(3):301–307.
12. Fisher A, Andreasson A, Chrysos A, dkk. Sebuah studi observasional Donor Ex Vivo Lung Perfusion di transplantasi paru-paru Inggris: DEVELOP-UK. Penilaian Teknologi Kesehatan. 2016;20(85)::1–276.
13. Slama A, Schillab L, Barta M, dkk. Pengadaan paru donor standar dengan perfusi paru ex vivo normotermik: Uji klinis prospektif acak. J Transplantasi Jantung Paru-Paru. 2017;36(7):744–753.
14. Nasralla D, Coussios CC, Mergental H, dkk. Percobaan acak pelestarian normotermik dalam transplantasi hati. Alam. 2018;557(7703):50–56.
15. Barlow AD, Hamed MO, Mallon DH, dkk. Penggunaan Perfusi Normothermic Ex Vivo untuk Penilaian Kualitas Pankreas Donor Manusia yang Dibuang. Apakah Transplantasi J. 2015;15(9):2475–2482.

16. Hosgood SA, Saeb-Party K, Hamed MO, Nicholson ML. Transplantasi Ginjal Manusia yang Berhasil Dianggap Tidak Dapat Ditransplantasikan tetapi Diresusitasi oleh Perfusi Mesin Normothermic Ex Vivo. Apakah Transplantasi J. 2016;16(11):3282–3285.
17. Hosgood SA, Saeb-Party K, Wilson C, Callaghan C, Collett D, Nicholson ML. Protokol uji coba label terbuka terkontrol secara acak dari perfusi normotermik ex vivo versus penyimpanan dingin statis dalam donasi setelah kematian peredaran darah transplantasi ginjal. BMJ Terbuka. 2017;7(1):e012237.
18. Hosgood SA, Moore T, Kleverlaan T, Adams T, Nicholson ML. Haemoadsorption mengurangi respon inflamasi dan meningkatkan aliran darah selama perfusi ginjal ex vivo dalam model eksperimental. J Transl Med. 2017;15(1):216.
19. Krebs HA. Sejarah siklus asam trikarboksilat. Perspektif Biol Med. 1970;14(1):154–170.
20. Hoogland ER, de Vries EE, Christiaans MH, Winkens B, Snoeijs MG, van Heurn LW. Nilai konsentrasi biomarker perfusi mesin di DCDginjaltransplantasi. Transplantasi. 2013;95(4):603–610.
21. van Balkom BWM, Gremmels H, Ooms LSS, dkk. Protein dalam Cairan Pengawetan sebagai Prediktor Fungsi Cangkok Tertunda pada Ginjal dari Donor Setelah Kematian Peredaran Darah. Clin J Am Soc Nephrol. 2017;12(5):817–824.
22. Kogelmann K, Jurczak D, Scheller M, Druner M. Hemoadsorption oleh CytoSorb pada pasien septik: seri kasus. Perawatan Kritis. 2017;21(1):74.
23. David S, Thamm K, Schmidt BMW, Falk CS, Kielstein JT. Pengaruh penghapusan sitokin ekstrakorporeal pada fungsi penghalang vaskular pada pasien syok septik. J Perawatan Intensif. 2017;5:12.
24. Li L, Huang L, Vergis AL, dkk. IL-17 yang diproduksi oleh neutrofil mengatur migrasi neutrofil yang dimediasi IFN-gamma pada tikusginjalcedera iskemia-reperfusi. J Clin Invest. 2010;120(1):331–342.
25. Hayama T, Matsuyama M, Funao K, dkk. Efek menguntungkan dari inhibitor elastase neutrofil pada cedera ginjal iskemia-reperfusi hangat pada tikus. Transplantasi Proc. 2006;38(7):2201–2202.
26. Saat TC, Susa D, Roest HP, dkk. Perbandingan profil ekspresi gen inflamasi, sitoprotektif, dan cedera pada ginjal dari donor kematian otak dan kematian jantung. Transplantasi. 2014;98(1):15–21.
27. Ravaioli M, Baldassare M, Vasari F, dkk. Strategi Mengembalikan Kadar Adenosin Trifosfat (ATP) Setelah Lebih dari 20 Jam Waktu Iskemia Dingin pada Marginal ManusiaGinjalCangkok. Ann Transplantasi. 2018;23:34–44.
28. Hamid AM, Lu DB, Patrick E, dkk. Perfusi Mesin Normothermic Singkat Meremajakan Ginjal Manusia yang Dibuang. Transplantasi Langsung. 2019;5(11):e502.