Cyclopentanone Mengerahkan Aktivitas Anti-Melanogenesis Dan Anti-Kerut di Melanoma B16F10

Kontak:{0}}/ WhatsApp: 008618081934791

Hee Jin Jung 1, A Kyoung Lee 1,2, Yeo Jin Park 1,2, Sanggwon Lee 1,2, Dongwan Kang 1,2, Young Suk Jung 1,2, Hae Young Chung 1,2 dan Hyung Ryong Moon 1, 2,*

Abstrak:Paparan radiasi ultraviolet (UV) adalah penyebab utama penuaan kulit ekstrinsik, yang menyebabkan hiperpigmentasi dan kerutan kulit. Dalam penelitian ini, kami menyelidiki efek pemutihan (2E,5E)-2,5-bis(3-hidroksi-4-metoksibenzilidena)siklopentanon (BHCP) pada melanoma B16F10 dan anti- aktivitas kerut pada sel fibroblas Hs27. BHCP ditemukan berpotensi menghambat tirosinase, dengan nilai konsentrasi penghambatan 50 persen (IC50) 1,10 M dan 8,18 M formikofenolat (L-tirosin) dan difenolase (L-DOPA), dan studi kinetika enzim mengungkapkan bahwa BHCP adalah penghambat tirosinase tipe kompetitif . Lebih lanjut, BHCP secara signifikan menghambat kandungan melanin dan aktivitas tirosinase seluler dan menurunkan regulasi tingkat faktor transkripsi terkait mikroftalmia (MITF), tingkat fosforilasi protein pengikat elemen respons cAMP (CREB), dan tirosinase dalam -melanocyte-stimulating hormone (-MSH) yang diinduksi Sel melanoma B16F10. Selain itu, BHCP menghambat fosforilasi p65 dan ekspresi matriks metaloproteinase (MMP-1, MMP-9, MMP-12, dan MMP-13) di fibroblas Hs27 dirangsang dengan radiasi UV. Oleh karena itu, hasil kami menunjukkan bahwa BHCP mungkin menjadi kandidat yang baik untuk pengembangan agen terapeutik untuk penyakit yang berhubungan dengan hiperpigmentasi dan kerutan.

Kata kunci: (2E,5E)-2,5-Bis(3-hidroksi-4-metoksibenzilidena)siklopentanon (BHCP); penghambat tirosinase; anti-melanogenesis; anti-kerut

Cistanche adalahanti-kerut.

1. Perkenalan

Penuaan kulit adalah proses kompleks dan progresif yang mengarah pada perubahan fungsional dan estetika pada kulit, dengan faktor intrinsik dan ekstrinsik yang bertanggung jawab [1]. Penuaan kulit ekstrinsik disebabkan oleh agresor lingkungan, seperti radiasi ultraviolet (UV), stres, atau merokok. Namun, hal ini terutama disebabkan oleh paparan berulang terhadap sinar UV dari matahari, yang disebut photoaging. Fotoaging kulit ditandai dengan kerutan kasar dan dalam, ketebalan, kekasaran, dispigmentasi, dan perubahan histologis [2-4].

Tirosinase (EC 1.14.18.1), yang juga dikenal sebagai polifenol oksidase, adalah salah satu enzim multifungsi yang mengandung tembaga yang terlibat dalam sintesis melanin dan ditemukan secara luas di alam [5]. Tirosinase biasanya terdapat di sebagian besar mikroorganisme, tanaman, dan hewan. Pada tumbuhan, tirosinase bekerja dengan mengoksidasi monofenol menjadi difenol (aktivitas mikofenolat) dan terlibat dalam oksidasi o-difenol menjadi o-kuinon (aktivitas difenolase), diikuti dengan oksidasi kuinon menjadi pigmen coklat tua.

Melanogenesis adalah transformasi L-tirosin menjadi 3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA), dimana L-DOPA diubah menjadi DOPA kina [7]. Oleh karena itu, tirosinase memainkan peran penting dalam produksi melanin dalam melanosit, dan penghambatan tirosinase merupakan target yang menarik untuk perbaikan gangguan terkait pigmentasi dan untuk pengembangan agen pemutih [8,9]. Sintesis melanin diinduksi oleh beberapa rangsangan, seperti UV dan bahan kimia termasuk isobutylmethylxanthine (IBMX) dan alpha-melanocyte-stimulating hormone (-MSH). -MSH berikatan dengan reseptornya melanocortin 1 receptor (MC1R), selanjutnya meningkatkan level siklik AMP (cAMP) sitoplasmik. Tingkat cAMP yang meningkat mengaktifkan protein kinase A (PKA), yang menginduksi ekspresi faktor transkripsi terkait mikroftalmia (MITF) melalui fosforilasi protein pengikat elemen respons cAMP (CREB). MITF menginduksi ekspresi tirosinase, protein terkait tirosinase (TRP)-1, dan TRP-2, yang akhirnya menghasilkan peningkatan sintesis melanin [10]. MITF dianggap sebagai faktor transkripsi kunci melanogenesis; oleh karena itu, banyak penelitian telah dilakukan untuk mengontrol ekspresi MITF untuk menghambat melanogenesis [11].

Pembentukan kerutan diketahui terkait erat dengan degradasi matriks ekstraseluler kulit, dan radiasi UV mengaktifkan faktor nuklir-κB (NF-κB), sehingga meningkatkan produksi fragmentasi kolagen dan matriks metaloproteinase (MMPs) [2]. MMP adalah endopeptidase yang bergantung pada seng yang penting dalam remodeling struktur matriks ekstraseluler di kulit. Oleh karena itu, degradasi kolagen dan matriks yang berlebihan oleh MMP yang diinduksi UV merupakan ciri khas kulit yang rusak akibat foto, dan MMP digunakan sebagai penanda utama fotoaging yang diinduksi UV serta peradangan kulit [12].

Turunan kerangka diarilheptanoid seperti kurkumin telah termasuk antioksidan, antikanker yang dilaporkan, aktivitas. perancah, termasuk (2E,5E)-2,5-bis(3-hidroksi-4-metoksibenzilidena)siklopentanon (BHCP) (Gambar 1),untuk menunjukkan berbagai macam anti-inflamasi, anti-melanogenesis, Terutama, Leow et al. [19] dilaporkan dalam bioaktivitas, dan anti-tirosinase [13-18] dibenzylidene-cyclopentanone 2014 yang mungkin berkontribusi pada efek perlindungan pada osteosarcoma manusia melalui regulasi jalur Wnt/-cateninsignaling. Namun, efek anti-melanogenesis dan anti-kerut dari BHCP masih belum ditemukan, dan mekanisme molekuler yang mendasari aktivitasnya belum ditetapkan dengan jelas.

Gambar 1. Struktur (2E,5E)-bis(3-hidroksi-4-metoksibenzilidena)siklopentanon (BHCP).

Dalam penelitian ini, kami menyelidiki potensi anti-melanogenesis dan anti-kerut BHCP, dan berusaha mengidentifikasi mekanisme yang terlibat, terutama yang berkaitan dengan kandungan melanin dan aktivitas tirosinase seluler, yang dieksplorasi menggunakan uji penghambatan tirosinase dan analisis kinetika enzim. Selain itu, kami menunjukkan bahwa BHCP memberikan efek penghambatan pada melanogenesis dan kerutan yang terkait dengan penurunan regulasi CREB / MITF / tirosinase dalam sel melanoma tikus B16F10 yang diinduksi -MSH dan penghambatan fosforilasi ekspresi p65 dan MMP dalam fibroblas manusia Hs27 yang diinduksi UV.

cistanche herbal naga

2. Hasil dan Pembahasan

2.1. Sintesis (2E,5E)-2,5-Bis(3-hidroksi-4-metoksibenzilidena)siklopentanon (BHCP)

Suatu larutan {{0}}hidroksi-4-metoksibenzaldehida (100 mg, 0.66 mmol, isovanillin) dan siklopentanon (0,03 mL, 0,33 mmol) dalam 1 N larutan asam asetat HCl (0,02 mL) diaduk pada 25 C selama 2 jam. Setelah didiamkan selama 1 hari, campuran reaksi diperlakukan dengan air dingin dengan adanya sejumlah kecil metanol, disaring, dan dicuci dengan air dingin untuk menghasilkan BHCP (65,9 mg) dalam hasil 56,9 persen. BHCP diidentifikasi dengan metode spektroskopi, termasuk 1H dan 13C-NMR, serta dibandingkan dengan data spektral yang dipublikasikan dan analisis Kromatografi Lapis Tipis (KLT) [19]. Strukturnya ditunjukkan pada Gambar 1.

BHCP: bubuk amorf kuning (CHCl3); 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) : 9,25 (s, 2H, 2 × OH),7,28(s,2H,2×vinylicH), 7,14 (d, 2H , J=2.0 Hz, 2 × 2-H), 7.11 (dd, 2H, J=8.5, 2.0 Hz, 2×6- H),7.01 (d, 2H, J=8.5 Hz, 2 × 5-H), 3,81 (d, 6H, 2 × OMe), 3,01 (dt, 4H, 2 × CH2) ; 13C-NMR (100 MHz,DMSO-d6) : 195.5, 149.9, 147.2, 136.0, 133.1, 129.1, 124.3, 117.5, 112.8, 56,3, 26.6; ESI-MS: m/z 351 (M H)−.

2.2. Efek Penghambatan BHCP pada Aktivitas Tirosinase Jamur

Seperti yang ditunjukkan pada Tabel 1, BHCP menghambat tirosinase dengan nilai IC50 sebesar 1,10 ± 0,12 Mand 8,18 ± 0,44 M, sedangkan asam kojic (kontrol positif) memiliki nilai IC50 sebesar 18,68 ± 1,40 Mand 33,89 ± 1,16 M untuk monofenolase dan difenolase, masing-masing. Dalam studi kami sebelumnya tentang inhibitor potensial sintetik tirosinase, kami menemukan mekanisme melalui studi pemodelan molekul di mana gugus 3-hidroksi dan 4-metoksi dari benzilidena memiliki kecenderungan pengikatan yang besar terhadap situs aktif tirosinase [20]. Dari hasil penelitian ini ditunjukkan bahwa gugus fungsi (3-gugus hidroksi dan 4-metoksi) berhubungan dengan peningkatan aktivitas penghambatan tirosinase yang signifikan.

Tabel 1. Aktivitas penghambatan tirosinase dan analisis kinetika enzim BHCP.

Selanjutnya, mekanisme yang bertanggung jawab untuk penghambatan tirosinase oleh BHCP diselidiki oleh analisis kinetik enzim dalam penelitian ini (Tabel 1 dan Gambar 2). Plot Lineweaver-Burk digambar menggunakan data yang diperoleh dari studi kinetik, dan konstanta penghambatan (Ki) diperoleh dari plot Dixon. Plot timbal balik ganda Lineweaver-Burk menunjukkan penghambatan tipe kompetitif. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2a-c, BHCP bertindak sebagai penghambat kompetitif L-tirosin dan L-DOPA. Selain itu, penyadapan pada sumbu x plot Dixon biasanya digunakan untuk menentukan jenis konstanta penghambatan enzim (Ki) untuk kompleks enzim-inhibitor [21,22], di mana nilai sumbu x menunjukkan nilai Ki. Seperti yang digambarkan pada Gambar 2b-d, nilai Ki BHCP masing-masing adalah 1,7 Mand 10,5 M sebagai substrat untuk L-tirosin dan L-DOPA. Karena nilai Ki menunjukkan konsentrasi yang diperlukan untuk membentuk kompleks enzim-inhibitor, nilai Ki yang lebih rendah menunjukkan penghambatan yang lebih efektif terhadap tirosinase.

Gambar 2. Lineweaver-Burk (a,c) dan Dixon (b,d) plot untuk penghambatan enzim tirosinase oleh BHCP.

2.3. Pengaruh BHCP pada Viabilitas Sel Melanoma B16F10 dan Sel Fibroblast Hs27

Sebelum menentukan apakah BHCP memberikan aktivitas anti-melanogenesis dan anti-kerut, kami memeriksa sitotoksisitas BHCP ke sel B16F10 dan sel Hs27 dengan pengobatan dengan konsentrasi BHCP yang berbeda untuk interval waktu yang berbeda, dan viabilitas sel diukur dengan uji EZ-Cytox. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 3a, b, hingga 10 M BHCP selama 48 jam tidak mengurangi kelangsungan hidup sel B16F10 atau sel Hs27. Selanjutnya, studi in vitro lebih lanjut tentang aktivitas anti-melanogenesis dan anti-kerut BHCP dilakukan dengan 1, 5, dan 10 M.

2.4. Penghambatan BHCP terhadap Kandungan Melanin dan Aktivitas Tirosinase Seluler pada Sel Melanoma B16F10

Untuk menentukan apakah BHCP memberikan potensi penghambatan pada kandungan melanin sel B16F10 yang diinduksi -MSH, sel-sel diperlakukan sebelumnya dengan konsentrasi berbeda yang ditunjukkan (1, 5, dan 10 M) BHCP atau asam kojic (5 mM) selama 24 jam dan kemudian distimulasi dengan -MSH selama 48 jam. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 4a, kandungan melanin dalam sel yang diobati dengan BHCP dengan adanya -MSH menurun dengan cara yang bergantung pada konsentrasi, menunjukkan 113 persen pada 1 M, 106 persen pada 5 M, dan 102 persen pada 10 M, dibandingkan dengan kelompok kontrol diobati dengan -MSH saja (186 persen). Menariknya, BHCP (1 M) menghambat kandungan melanin lebih kuat daripada asam kojic (5 mM). Selanjutnya, uji aktivitas tirosinase seluler dilakukan untuk mengukur efek penghambatan BHCP pada sel B16F10. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 4b, BHCP menurun dengan cara yang bergantung pada konsentrasi dengan aktivitas tirosinase sebesar 120 persen pada 1 M, 116 persen pada 5 M, dan 105 persen pada 10 M, dibandingkan dengan kelompok kontrol yang diobati dengan -MSH saja (181 persen ).Efek penghambatan BHCP jauh lebih kuat daripada asam kojic; penghambatan BHCP pada 1 M lebih unggul daripada asam kojic pada 5 mM (131 persen). Hasil ini menunjukkan bahwa BHCP memiliki efek pemutihan dengan menghambat biosintesis melanin dan sintesis tirosinase intraseluler dalam melanosit B16F10.

Gambar 4. Penghambatan kandungan melanin (a) dan aktivitas tirosinase seluler (b) BHCP pada sel melanoma B16F10.

2.5. Pengaruh BHCP pada Ekspresi MITF/Tyrosinase dan CREB Fosforilasi dalam Sel B16F10

MITF, faktor transkripsi spesifik, memainkan peran penting dalam mengaktifkan melanogenicgenes secara efektif, termasuk tirosinase, mengkatalisasi langkah pembatas laju dalam biosintesis melanin: TRP-1, dan TRP-2. Ekspresi MITF dapat ditingkatkan oleh fosforilasi CREB [23]. CREB adalah promotor MITF yang penting [24,25], dan fosforilasi CREB dalam melanosit meningkatkan ekspresi MITF dengan mengikat CREB (protein pengikat elemen respons c-AMP) dalam melanosit [26]. Untuk menjelaskan jalur molekuler yang bertanggung jawab atas efek anti-melanogenik BHCP pada sel B16F10, kami memeriksa kadar protein molekul kunci, termasuk CREB dan MITF, yang memainkan peran penting dalam melanogenesis dengan analisis Western blot. Sel-sel diperlakukan dengan BHCP atau asam kojic dan kemudian distimulasi oleh -MSH selama 48 jam. Interval waktu untuk pengukuran mengikuti metodologi yang dijelaskan dalam penelitian sebelumnya [27]. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 5, kadar tirosinase dan MITF meningkat dengan -MSH, tetapi BHCP menurunkan kadar protein ini. Selanjutnya, fosforilasi CREB ditekan secara signifikan oleh BHCP. Regulasi fosforilasi CREB yang diinduksi -MSH diketahui berpotensi penting dalam mengatur pigmentasi [28]. Hasil ini menunjukkan bahwa efek anti-melanogenik BHCP dihasilkan dari penurunan regulasi MITF dan tirosinase melalui penurunan regulasi CREB terfosforilasi. Penelitian ini menunjukkan bahwa penjelasan mekanisme penghambatan BHCP pada tirosinase dan melanogenesis sangat penting dan harus diselidiki lebih lanjut di masa depan. Meskipun garis sel melanoma B16F10 umumnya lebih cocok untuk menyelidiki mekanisme pensinyalan in vitro, garis sel B16F10 adalah melanoma hewan pengerat. Oleh karena itu, studi lebih lanjut tentang melanosit manusia akan diperlukan untuk mengkonfirmasi temuan.

2.6. Pengaruh BHCP pada Aktivasi NF-κB p-p65 yang Diinduksi UV pada Sel Hs27

Kami selanjutnya menyelidiki efek BHCP pada ekspresi mediator inflamasi yang diinduksi UV menggunakan fibroblas Hs27. Telah dilaporkan sebelumnya bahwa fosforilasi p65 (Ser536) sangat penting untuk kapasitasnya untuk mentransaktivasi gen [29]. Oleh karena itu, kadar protein p-p65 (Ser536) dan p65 diperiksa dalam fraksi nukleus dengan Western blotting. Seperti ditunjukkan pada Gambar 6a,b, dalam sel Hs27, UV meningkatkan kadar protein p-p65 (Ser536) dalam nukleus, sedangkan perlakuan BHCP menurunkan kadar protein p-p65 (Ser536) nukleus. Sejalan dengan itu, jumlah total p65 berkurang di sitoplasma oleh UV dan dipulihkan oleh BHCP (Gambar 6c,d). Meskipun tingkat ekspresi protein p65 menurun di sitoplasma dan meningkat di nukleus setelah induksi UV, pra-perawatan dengan BHCP membalikkan tren ini dengan cara yang bergantung pada dosis. Dengan demikian, hasil ini menunjukkan bahwa penghambatan p-p65 oleh BHCP mungkin berkontribusi pada efek perlindungan pada pigmentasi kulit dan kerusakan kolagen terhadap UV.

Gambar 6. Pengaruh BHCP pada tingkat ekspresi p-p65 (Ser536) dalam sel humanfibroblast Hs27 yang diinduksi UV.

2.7. Pengaruh BHCP pada Ekspresi MMP di Sel Hs27

MMP memainkan peran penting dalam penuaan kulit. Iradiasi UV mengubah jaringan ikat kulit dengan meningkatkan ekspresi MMPs [30,31]. MMP-1 adalah enzim pengurai kolagen yang mempercepat pemecahan kolagen yang disintesis dari prokolagen tipe I. MMP-9 adalah enzim pengurai gelatin yang memecah serat kolagen yang dipotong oleh MMP-1, meningkatkan produksi kerutan dan hilangnya elastisitas. Untuk menguji efek anti-kerut BHCP terhadap induksi UV, kami menentukan kadar protein MMP-1 dan MMP-9 dengan Western blotting. Lebih lanjut, sel-sel yang diinduksi UV menunjukkan peningkatan kadar MMP-13 yang signifikan, yang memulai degradasi kolagen tipe I dan III daripada MMP-1 [32]. Kami menyelidiki peningkatan MMP (MMP1, MMP9, MMP12, dan MMP13) setelah pengobatan sel Hs27 yang diinduksi UV dengan BHCP pada 1 dan 10 M. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 7, tingkat ekspresi MMP-1, MMP-9, MMP-12, dan MMP-13 meningkat setelah induksi UV; namun, pengobatan BHCP menurunkan ekspresi dalam dosis -cara tergantung. Hasil kami menunjukkan bahwa BHCP mungkin berkontribusi pada pencegahan pembentukan kerutan dengan mengurangi produksi MMP abnormal yang disebabkan oleh paparan UV. Hasil ini menyiratkan bahwa BHCP menghambat ekspresi MMP dalam fibroblas Hs27 untuk mencegah dekomposisi kolagen, dan dengan demikian produksi kerutan. Oleh karena itu, BHCP menunjukkan potensi untuk digunakan sebagai obat pencegahan dan pengobatan penyakit yang berhubungan dengan kulit.

manfaat batang cistanche

3. Bahan dan Metode

3.1. Bahan Kimia dan Instrumentasi

Tirosinase jamur (EC 1.14.18.1), -MSH, L-tirosin, 3,4-dihidroksifenilalanin (L-DOPA), dimetil sulfoksida (DMSO), dan asam kojic dibeli dari Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Medium Eagle (DMEM) yang dimodifikasi Dulbecco, serum janin sapi, streptomisin, dan amfoterisin dibeli dari Gibco Life Technologies Inc. (Carlsbad, CA, USA). Antibodi terhadap MITF,CREB, p-CREB, p-p65 (Ser536), p65, tirosinase, MMP-1, MMP-9, MMP-12, MMP-13, TFIIB , dan -aktin dibeli dari Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Membran polivinilidena difluorida (PVDF) diperoleh dari Millipore Corporation (Bedford, MA, USA). Peralatan plastik steril untuk kultur jaringan dibeli dari SPL Labware (Seoul, Korea). Sumber cahaya UV disediakan oleh unit lampu seri Crosslinker 800 (UVP, CA, USA) 6 (8 watt/lampu). Kromatografi lapis tipis dan silika gel 60 (mesh 230–400) dilakukan pada silika gelF{{27} }pelat precoated dari Merck Millipore (Darmstadt, Jerman). Spektrum NMR direkam menggunakan instrumen Varian Unity INOVA 400 (400 MHz untuk 1H, 100 MHz untuk 13C) dan instrumen Varian Unity AS 500 (500 MHz untuk 1H). Nilai pergeseran kimia (δ) dilaporkan dengan mengacu pada masing-masing pelarut residu atau puncak terdeuterasi (δH 2,50 dan C 39,51 untuk DMSO). Data spektrometri massa resolusi rendah diperoleh dengan spektrometer massa Expression CMS (Advion, Ithaca, NY, USA).

3.2. Uji Penghambatan Tirosinase Jamur

Aktivitas penghambatan tirosinase jamur ditentukan menggunakan assubstrat L-tirosin dan L-DOPA, berdasarkan prosedur yang dijelaskan oleh Jung et al. [23]. Secara singkat, 190 L enzim tirosinase (1000 U diencerkan dengan buffer tirosinase jamur, termasuk 1 mM L-tirosin dan larutan L-DOPA) ditambahkan, dengan ada atau tidak adanya senyawa (konsentrasi akhir berkisar antara 1 hingga 20 M, dilarutkan dalam 100 persen DMSO), ke setiap sumur pelat sumur 96-, untuk menghasilkan volume akhir 200 L. Plate diinkubasi pada suhu 37 C selama 30 menit. Aktivitas tirosinase diukur dengan mengukur absorbansi pada 492 nm menggunakan pembaca lempeng mikro (TECAN, Salzburg, Austria) dan persentase penghambatan ( persen ) diperoleh dari persamaan berikut:

persen penghambatan=(Ac As)/Ac × 100 (1)

dimana Ac adalah absorbansi kontrol dan As adalah absorbansi sampel. Nilai IC50 dihitung dari kurva log-linier dan persamaannya. Hasil rata-rata untuk tiga determinasi ditampilkan. Asam kojic digunakan sebagai kontrol positif.

3.3. Analisis Kinetik Penghambatan Tirosinase

Untuk menentukan mekanisme kinetik, dua metode kinetik (plot Lineweaver-Burk dan Dixon) digunakan secara komplementer [21,22,33]. Untuk plot timbal balik ganda Lineweaver–Burk (plot kecepatan 1/enzim (1/V) versus konsentrasi 1/substrat (1/[S])), jenis penghambatan ditentukan menggunakan berbagai konsentrasi L-tirosin (1, 2, dan 4 mM) dan L-DOPA (0.5, 1, dan 2 mM) sebagai substrat dengan adanya konsentrasi BHCP yang berbeda. Konsentrasi BHCP adalah sebagai berikut:0, 0.5, 1.{{20}}, dan 2.0 M untuk L-tirosin; dan 0, 2.5, 5, dan 10 M untuk L-DOPA. Plot Dixon adalah metode grafis (plot kecepatan 1/enzim (1/V) terhadap konsentrasi inhibitor (I)) untuk penentuan jenis penghambatan enzim dan digunakan untuk menentukan konstanta disosiasi atau Ki untuk kompleks enzim-inhibitor. Plot dixon (plot timbal balik tunggal) dari penghambatan diperoleh dengan adanya substrat L-tirosin pada 1, 2, dan 4 mM dan {{40}}, 0.5, 1.{ {47}}, dan 2.0 M untuk BHCP; dan substrat L-DOPA pada {{50}}.5, 1.0, dan 2.0 mM dan 0, 2.5, 5.0, dan 10,0 M untuk BHCP.

tanaman cistancheadalah penghambat tirosinase.

3.4. Garis Sel dan Kultur Sel

Sel melanoma B16F10 murine diperoleh dari Korean Cell Line Bank. Garis sel fibroblas kulit manusia Hs27 dibeli dari American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Sel-sel ini dipelihara dalam DMEM yang dilengkapi dengan 10 persen fetal bovineserum, 100 U/mL penisilin, dan 100 mg/mL streptomisin dalam inkubator CO2 5 persen yang dilembabkan pada suhu 37 C. Fibroblas dermal pada piringan 100 mm dirawat dengan BHCP dan diekspos ke 50 mJ/cm2UV dalam DMEM bebas serum (sumber cahaya UV, UVP). Sel-sel Hs27 dikultur hingga 70-80 persen pertemuan dalam pelat berdiameter 100 mm dan digunakan di antara nomor bagian 5 dan 15.

3.5. Uji Viabilitas Sel

Kelangsungan hidup sel dinilai menggunakan uji kit EZ-Cytox. Singkatnya, sel B16F10 dan fibroblas Hs27 diunggulkan ke dalam pelat sumur 96-dengan kepadatan 1 × 104 sel/sumur dan diinkubasi pada 37 C selama 24 jam. Sel-sel diberi makan DMEM segar bebas serum yang mengandung konsentrasi BHCP yang berbeda (0, 1, 2, 5, dan 10 M), dan diinkubasi selama 24 dan 48 jam. Selanjutnya, 10 L larutan EZ-Cytox dimasukkan ke dalam setiap sumur dan sel diinkubasi selama 2-4 jam. Pengukuran absorbansi sel tanpa adanya pengobatan dianggap sebagai kelangsungan hidup sel 100 persen. Setiap perlakuan dilakukan rangkap tiga dan setiap percobaan diulang tiga kali.

3.6. Penentuan Kadar Melanin Assay

Pengaruh BHCP pada melanogenesis yang diinduksi -MSH dalam sel B16F10 didasarkan pada metode yang digunakan sebelumnya dengan sedikit modifikasi [34]. Secara singkat, sel B16F10 (5 × 104 sel/sumur) di 6-pelat sumur dibiarkan tumbuh hingga pertemuan 70–80 persen. Sel-sel tersebut kemudian diperlakukan dengan konsentrasi BHCP yang berbeda (1, 5, dan 10 M) atau asam kojic (5 mM) selama 24 jam, dan kemudian distimulasi dengan -MSH (5 M) selama 48 jam. Setelah perawatan, sel-sel dicuci dua kali dengan PBS dingin, dilarutkan dalam 90 L 1 M larutan NaOH termasuk DMSO (5 persen) pada 60 C selama 1 jam, dan absorbansi diukur pada 405 nm dengan spektrofotometer lempeng mikro (TECAN, Salzburg , Austria). Untuk mengukur jumlah melanin dalam percobaan, laju inhibisi pada kelompok perlakuan dihitung dari absorbansi konsentrasi melanin sintetik yang diketahui, yang dikoreksi dengan jumlah total protein yang ada dalam supernatan lisat sel. Absorbansi sel yang tidak diobati diukur dalam rangkap tiga.

3.7. Uji Aktivitas Tirosinase Seluler

Uji aktivitas tirosinase seluler dilakukan dengan mengukur laju oksidasi L-DOPA [35]. Sel B16F10 dengan kepadatan 5 × 104/sel ditempatkan dalam cawan sumur 6-dan diinkubasi semalaman. Sel-sel kemudian diperlakukan dengan berbagai konsentrasi BHCP (1, 5, dan 10 M) atau asam kojic (5 mM) selama 24 jam, dan kemudian distimulasi dengan -MSH (5 M) selama 48 jam. Sel-sel dicuci dengan PBS dan dilisiskan dalam larutan yang mengandung 100 L 50 mM dapar fosfat (pH 6,5), 0,1 mMfenilmetilsulfonilfluorida (PMSF), dan 1 persen Triton X-100. Kemudian, sel-sel ditempatkan dalam mesin deepfreezer (−80 C) selama 30 menit. Setelah mencairkan sel, ekstrak seluler dimurnikan dengan sentrifugasi pada 12,000 rpm selama 30 menit pada 4 C. Sebanyak 80 L supernatan dan 20 L L-DOPA (2 mg/mL) ditambahkan ke pelat sumur 96-, dan absorbansi pada panjang gelombang 492 nm diukur setiap 10 menit selama 1 jam pada suhu 37 C dengan pembaca pelat ELISA (TECAN, Salzburg, Austria).

3.8. Persiapan Ekstrak Sitosol dan Nuklir Sel Hs27

Sel Hs27 dicuci dengan PBS sedingin es dan dipanen. Buffer yang mengandung 10 mM Tris(pH 8.0), 1,5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0,1 persen NP-40, dan protease inhibitor digunakan untuk ekstraksi fraksi sitosol dengan sentrifugasi pada 12,000 rpm pada 4 C selama 15 menit, dan fraksi nuklir diekstraksi dari pelet menggunakan buffer yang mengandung 10 mM Tris, 50 mM KCl, 100 mM NaCl, dan proteaseinhibitor, diinkubasi di atas es selama 30 menit, dan kemudian disentrifugasi pada 13,000× g selama 30 menit pada 4 C untuk mendapatkan fraksi nuklir.

3.9. Blotting Barat

Sampel lisat direbus selama 10 menit dalam buffer pemuatan gel (125 mM Tris-HCl, 4 persen sodiumdodecyl sulfate (SDS), 10 persen 2-mercaptoethanol, dan 0,2 persen bromophenol biru; pH 6,8) pada rasio volume 1:1. Ekivalen protein total untuk setiap sampel dipisahkan dengan SDS-poliakrilamida gelelektroforesis (PAGE) menggunakan gel akrilamida berdasarkan prosedur yang dijelaskan oleh Laemmli [36] dan dipindahkan ke membran PVDF pada 80 V selama 2 jam menggunakan sistem transfer basah. Membran segera ditempatkan ke dalam buffer pemblokiran (5 persen susu tanpa lemak) dalam 10 mM Tris, pH 7,5, 100 mMNaCl, dan 0,1 persen Tween-20. Bercak diblokir untuk mencegah pengikatan nonspesifik pada 25 C selama 2 jam. Selanjutnya, membran diinkubasi dengan antibodi primer spesifik pada 4 C semalaman, diikuti dengan inkubasi dengan antibodi sekunder terkonjugasi peroksidase lobak pada 25 C selama 1 jam . Pelabelan antibodi dideteksi dengan peningkatan chemiluminescence sesuai dengan instruksi pabrik. Kuantisasi protein dilakukan menggunakan Davinch-Chemi TM.Chemiluminescence Imaging System CAS-400SM (Core Bio, Seoul, Korea). Penanda protein prestained digunakan untuk penentuan berat molekul.

3.10. Analisis statistik

Semua data disajikan sebagai mean ± SEM Data dianalisis dengan analisis varians satu arah (ANOVA) untuk perbedaan antara perlakuan diikuti dengan uji post-hoc Bonferroni. Nilai p < 0.05="" dianggap="" signifikan="" secara="">

4. Kesimpulan

Singkatnya, temuan penelitian ini menunjukkan bahwa BHCP memiliki efek memutihkan kulit melalui penghambatan tirosinase, yang merupakan enzim kunci untuk biosintesis melanin dalam melanosit B16F10 yang diinduksi MSH. Selanjutnya, BHCP menurunkan ekspresi kadar protein MMP pada fibroblas yang diinduksi UV, yang diharapkan memiliki efek anti-kerut. Penelitian lebih lanjut diperlukan untuk mengkonfirmasi efek pemutihan dan anti-kerut dari BHCP melalui studi hewan dan klinis. Akhirnya, BHCP diidentifikasi memiliki efek memutihkan dan anti-kerut, menunjukkan potensinya untuk pengembangan agen terapeutik untuk penyakit yang berhubungan dengan hiperpigmentasi dan kerutan.

apa itu cistanche?

Untuk informasi lebih lanjut, silakan klik di sini.