Profil Komprehensif Formulasi Sekretom Dari Sel Induk Cairan Ketuban Manusia Janin dan Perinatal Bagian 1

Mohon hubungi{0}}untuk informasi lebih lanjut

Abstrak:Kami sebelumnya melaporkan bahwa c-KIT plus sel punca turunan cairan ketuban htaman yang diperoleh dari sampel sisa diagnosis prenatal trimester rutin (hAFS janin) diberkahi dengan potensi parakrin regeneratif yang mendorong efek pro-survival, anti-fibrotik, dan proliferatif. juga dapat diisolasi dari sampel limbah klinis trimester III selama C-section terjadwal (hAFS perinatal), sehingga menawarkan alternatif yang lebih mudah diakses jika dibandingkan dengan hAFS janin. Meskipun demikian, sedikit yang diketahui tentang profil parakrin hAFS perinatal. Di sini kami memberikan karakterisasi terperinci dari sekretom total hAFS (yaitu, keseluruhan faktor parakrin terlarut yang dilepaskan oleh sel-sel dalam media terkondisi, hAFS-CM) dan vesikel ekstraseluler ( hAFS-EVs) di dalamnya, dari trimester fetal-versus III trimester sel perinatal. hAFS janin dan perinatal dicirikan dan tunduk pada prakondisi hipoksia untuk meningkatkan potensi parakrinnya. Formulasi hAFS-CM dan hAFS-EV dianalisis untuk kandungan protein dan kemokin/sitokin, dan muatan EV diselidiki lebih lanjut dengan pengurutan RNA. Fenotipe hAFS janin dan perinatal, bersama dengan formulasi sekretom yang sesuai, tumpang tindih; namun, hAFS janin menunjukkan aktivitas fosforilasi oksidatif yang belum matang bila dibandingkan dengan yang perinatal. Profil kargo parakrin mereka mengungkapkan beberapa perbedaan sesuai dengan tahap kehamilan dan prakondisi hipoksia. Kedua sumber sel menyediakan formulasi yang diperkaya dengan faktor perangsang neurotropik, imunomodulator, anti-fibrotik, dan endotel, dan sekretom hAFS janin yang belum matang ditentukan oleh profil pro-vaskulogenik, regeneratif, pro-penyelesaian, dan anti-penuaan yang lebih jelas. Profil RNA kecil menunjukkan pengayaan microRNA pada kargo hAFS-EV janin dan perinatal, dengan inti pro-penyelesaian yang diekspresikan secara stabil sebagai tanda tangan molekul referensi. Di sini kami mengkonfirmasi bahwa hAFS mewakili sumber faktor parakrin regeneratif yang menarik; pemilihan formulasi sekretom hAFS janin atau perinatal untuk terapi parakrin di masa depan harus dievaluasi dengan mempertimbangkan skenario klinis spesifik.

Kata kunci:air ketuban; sel induk; efek parakrin; vesikel ekstraseluler; media berkondisi sel; kemokin; sitokin; proteomik; pengurutan RNA; microRNA

Silakan klik di sini untuk tahu lebih banyak

1. Perkenalan

Pengobatan regeneratif baru-baru ini berkembang sebagai bidang yang muncul untuk memberikan pemulihan fungsional jaringan yang terluka melalui beberapa strategi. Karena pendekatan rekayasa jaringan telah maju secara signifikan dalam beberapa tahun terakhir, penyelidikan efek parakrin sel punca secara bersamaan semakin intensif. Potensi terapeutik dari sel induk yang ditransplantasikan telah terbukti secara luas sebagian besar dimediasi oleh faktor-faktor larut yang disekresikan, yang dapat mengatur lingkungan mikro pro-regeneratif dalam jaringan inang sambil memicu aktivasi mekanisme endogen pemulihan fungsional [1,2]. Oleh karena itu, sel punca mensekresikan keseluruhan molekul trofik parakrin yang dilepaskan sel, serta vesikel ekstraseluler yang terikat membran telah semakin diusulkan sebagai produk obat terapi inovatif oleh beberapa studi praklinis independen yang menargetkan kardiovaskular, neurologis, dan/atau inflamasi. penyakit. Dengan demikian, sel punca dapat dibayangkan sebagai pabrik biologis untuk eksploitasi secretome terapeutik mereka dengan menawarkan perawatan regeneratif siap pakai dan siap pakai. Dengan menerapkan strategi berbasis sel, namun bebas sel, banyak aspek pembatas yang terkait dengan terapi sel kanonik dapat diatasi, sambil tetap memastikan efek yang menguntungkan.apa itu cistanche?Dalam perspektif ini, sel stroma mesenkim (MSC) telah diuji secara ekstensif sebagai kandidat sel yang diduga? Memang, MSC dan sel induk/progenitor telah direkayasa dan/atau dirangsang oleh strategi prakondisi yang berbeda untuk meningkatkan kapasitas regeneratif dan potensi sekretorinya [3,4] dengan minat eksplisit pada relevansi biologis dari vesikel ekstraseluler (EV) yang disekresikan mereka.

EV adalah partikel berukuran nano yang dibatasi oleh lapisan ganda lipid dan secara aktif disekresikan oleh semua jenis sel. EV termasuk sangat kecil (<200 nm)="" exosomes,="" medium-sized="" (200-500="" nm)microvesicles="" or="" shedding="" vesicles,="" and="" larger-sized="" apoptotic="" bodies="" (="">500nm); mereka beroperasi sebagai konveyor biologis penting dari pensinyalan antar sel dengan mengirimkan muatan molekuler mereka dari sel induk ke responden/target satu [5,6]. Mengingat bahwa potensi parakrin mereka yang khas dalam memberikan efek menguntungkan sebanding dengan sel asalnya, EV sel induk telah muncul sebagai pilihan terapi yang menarik dalam model penyakit praklinis, seperti iskemia, peradangan, atau cedera, sebagaimana ditinjau secara ekstensif dalam [{{3 }}]. Dari perspektif translasi, di atas potensi modulasi sel, kelayakan isolasi dan peningkatan pembaruan diri adalah aspek kunci dari sumber ideal EV terapeutik dan faktor terlarut. Dalam skenario seperti itu, MSC janin dan perinatal dapat menawarkan pilihan yang menarik mengingat potensi proliferatifnya, dan profil perkembangan yang belum matang dengan fitur perantara antara progenitor somatik embrionik dan dewasa [10,11]. MSC janin dapat diisolasi dari lampiran ekstra-embrio selama kehamilan sebagai sampel sisa yang diperoleh selama skrining prenatal (yaitu, vili korionik [12-14] dan cairan ketuban [15,16]) atau diperoleh sebagai nenek moyang perinatal saat lahir, dari bahan limbah klinis (yaitu, membran amnion dan plasenta [17-21], komponen tali pusat [22-24] dan cairan amnion jangka [25,26]).

Cistanche dapat anti-penuaan

Khususnya, sel induk cairan ketuban manusia (hAFS) telah disorot sebagai strategi terapi yang menjanjikan dalam pengobatan regeneratif. dan telah terbukti multipoten secara luas in vitro dan in vivo [16,27,28], berkontribusi pada garis keturunan hematopoietik setelah transplantasi dalam rahim [29], dan tertanam di organ yang terluka sambil mengerahkan efek imunomodulator [26,30] dan mengaktifkan respon reparatif endogen, seperti yang dijelaskan secara komprehensif dalam [31]. Tim kami dan yang lainnya telah lebih lanjut menunjukkan bahwa hAFS melepaskan sekret yang sangat diperkaya dengan molekul trofik bioaktif yang mampu menargetkan mekanisme reparatif yang berbeda. Faktor parakrin hAFS telah dilaporkan memberikan rangsangan pro-survival dengan pendinginan peradangan [32], memberikan perlindungan kardio terhadap iskemia berkepanjangan [33,34], dan kardiotoksisitas [35], dan merangsang angiogenesis lokal dengan masuk kembali siklus sel kardiomiosit [ 34,36]. Karena sebagian besar efek ini telah terbukti direkapitulasi oleh pemberian hAFS-EV saja, penelitian independen telah berfokus pada membedah profil regeneratif mereka terhadap latar belakang patologis yang berbeda, termasuk cedera otot rangka dan jantung, penyakit ginjal, osteoartritis, osteoporosis, enterokolitis nekrotikans, dan neurodegeneratif. model [34,37-44].

Sementara bukti dapat mendukung terjemahan klinis hAFS-EVs untuk terapi parakrin di masa depan, penting untuk mempertimbangkan bahwa sebagian besar penelitian ini terutama menyelidiki potensi modulasi hAFS janin yang diperoleh selama skrining prenatal trimester Memang, profil lengkap sekretom dari perinatal memiliki pasangan (yaitu, dari trimester III c-section) belum dieksplorasi secara rinci. hAFS perinatal trimester ketiga telah menunjukkan sifat pengaturan imun yang berbeda dibandingkan dengan yang trimester saya dan II [26], sambil mempertahankan potensi regeneratif endotel yang relevan [25].berapa banyak cistanche yang harus diambil?Sebagai catatan, laporan terbaru tentang morfologi heterogen hAFS janin [45] telah memberikan wawasan baru tentang profil batang dan ekspresi gen mereka.bioflavonoidIni sama sekali menjelaskan nilai regeneratif dari fraksi seluler yang berbeda dari hAFS[46]. Oleh karena itu, karakterisasi komprehensif dari berbagai subpopulasi hAFS menarik perhatian yang meningkat. Kami sebelumnya melaporkan bahwa hipoksia 24 jam dan stimulasi bebas serum merupakan strategi yang efektif untuk meningkatkan potensi parakrin dari hAFS janin trimester [34,35,37]. Karena sedikit yang diketahui tentang komposisi sekretom dari hAFS trimester III, di sini kami melaporkan perbandingan komprehensif hAFS trimester versus dan fraksi sekretomnya (termasuk topi-EV), untuk mengatasi pengaruh tahap kehamilan dan sel hipoksia prasyarat pada sel dan karakteristik sekretom.

2. Hasil

2.1.HAFS Perinatal Menyajikan Kecocokan Fenotipik yang Dekat dengan Janin

Tidak ada perbedaan yang relevan secara statistik pada usia donor antara sampel cairan ketuban trimester II janin dan trimester III perinatal. c-KIT* hAFS janin (f-hAFS dari sampel cairan ketuban trimester II) dan c-KIT* hAFS perinatal (p-hAFS dari limbah klinis cairan ketuban trimester III) mengkonfirmasi fitur serupa dengan morfologi mirip fibroblas dan bulat oval (Gambar 1A) dan fenotipe stroma mesenkim (data tidak ditampilkan), seperti yang dilaporkan sebelumnya [16,25]. Baik f-hAFS dan p-hAFS yang dikultur in vitro hingga bagian 5 menunjukkan tingkat penuaan yang dapat diabaikan dari aktivasi - -galaktosidase (SA- -Gal) yang terkait dengan penuaan pada sekitar 4 persen sel (Gambar 1B) . Baik f-hAFS dan p-hAFS menunjukkan tingkat tinggi ko-ekspresi penanda mesenkim CD107a dan CD146, yang baru-baru ini dilaporkan mendefinisikan fenotipe yang sangat sekretori [47]. CD107 pada sel CD146* mewakili mayoritas populasi f-hAFS (sekitar 64 persen ,*p<0.05), while="" p-hafs="" showed="" a="" lower="" enrichment="" for="" this="" subpopulation,="" approximately="" 52%="" of="" total="" cells,="" yet="" this="" disparity="" was="" not="" statistically="" significant="" (figure="">

Gambar 1. Fenotip janin dan perinatal memiliki evaluasi fenotipik. (A) Gambar representatif hAFS janin (f-hAFS, panel kiri) dan hAFS perinatal (p-hAFS, panel kanan) yang dikultur in vitro dalam kondisi standar; bilah skala: 200 um. (B) Analisis penanda beta-galaktosidase (SA- -Gal, berwarna biru) melalui pewarnaan sitokimia pada f-hAFS dan p-hAFS setelah 5 bagian dalam kultur; gambar representatif dilaporkan di panel kiri, bilah skala: 200 um. Persentase sel/bidang -Gal-positif yang sesuai dilaporkan dalam grafik di panel kanan (f-hAFS:4,12±0,58 persen dan p-hAFS:3,88±2,10 persen ;p=0.1424,n{ {24}} percobaan).(C)Imunotipe hAFS yang mengekspresikan penanda mesenkim CD146 dan CD107a. Plot sitometri aliran representatif dari f-hAFS dan p-hAFS (panel kiri) dan nilai-nilai yang sesuai mengacu pada sel CD107a positif ganda ditambah sel CD146 plus; CD107a ditambah CD146* f-hAFS:63,68±5,82 persen ,*p=0,016dibandingkan dengan sisa 36,32±5,82 persen f-hAFS (Lainnya);CD107pada CD146 ditambah p-hAFS:52,07±6,76 persen dengan sisanya47. 93±56,76 persen p-hAFS (Lainnya); CD107a plus CD146 plus f-hAFS vs CD107a plus CD146 plus p-hAFS p=0.2403,n=4 percobaan. Lainnya: jumlah total sisa CD107a-CD146~hAFS, CD107a~CD146*hAFS dan CD107 pada CD146-hAFS. Semua nilai dinyatakan sebagai mean ± sem percobaan independen. SA- -Gal: Galaktosidase yang Terkait dengan Penuaan- -.

2.2.HAFS Janin Menunjukkan Metabolisme yang Berbeda dari hAFS Perinatal

Untuk mengevaluasi apakah tahap kehamilan dapat mempengaruhi metabolisme mitokondria, f-hAFS dan p-hAFS dianalisis dalam kondisi kultur in vitro standar dengan analisis biokimia. Evaluasi metabolisme aerobik menunjukkan bahwa tingkat konsumsi oksigen (OCR) dan sintesis ATP lebih rendah pada f-hAFS dibandingkan dengan p-hAFS, keduanya ketika distimulasi dengan piruvat plus malat (P/M;***p<0.001 for="" ocr,="" and=""><0001, for="" atp="" synthesis),="" and="" with=""><0.01 for="" ocr="" and="" atp="" synthesis,="" figure="" 2a).="" moreover,="" f-has="" displayed="" a="" lower="" oxidative="" phosphorylation="" efficiency="" when="" compared="" to="" p-hafs,="" as="" shown="" by="" thep/o=""><0.001 for="" p/m="" and=""><0001 for="" succinate).="" values="" for="" f-hafs="" were="" lower="" than="" those="" reported="" in="" the="" literature[48],="" and="" suggest="" uncoupling="" between="" oxygen="" consumption="" and="" atp="" production="" (figure="" 2a).="" by="" evaluating="" the="" relative="" contributions="" of="" glutamine,="" long-chain="" fatty="" acid="" oxidation,="" and="" glucose="" in="" oxidative="" phosphorylation="" (oxphos)metabolism,="" we="" noticed="" that="" f-hafs="" were="" sensitive="" to="" the="" addition="" of="" bptes="" (glutaminase="" inhibitor,**="">< 0.01)="" and="" etomoxir(carnitine="" palmitoyl-transferase="" 1a="" inhibitor,=""><0.01), but="" not="" to="" uk5099="" (mitochondrial="" pyruvate="" carrier="" inhibitor).="" by=""><0.0001)and><0.001),but not="" etomoxir,inhibited="" the="" metabolism="" of="" p-hafs="" (figure="" 2b,="" upper="" panel).="" this="" observation="" was="" confirmed="" by="" the="" inhibition="" percentage="" of="" the="" single="" inhibitor="" (figure="" 2b,="" lower="" panel).="" therefore,="" both="" cell="" types="" similarly="" rely="" on="" glutamine="" as="" a="" respiratory="" substrate;="" yet,="" f-hafs="" prefer="" fatty="" acids="" as="" a="" second="" substrate,="" while="" p-hafs="" are="" sustained="" by="" glucose.="" interestingly,="" f-hafs="" showed="" a="" higher="" increment="" of="" glucose="" consumption="" and="" lactate="" release="" when="" compared="" to="" p-hafs=""><0.05><0.001 respectively,="" figure="" 2c),="" which="" indicates="" the="" attempt="" to="" balance="" inefficient="" aerobic="" metabolism="" by="" lactate="" fermentation.="" this="" difference="" could="" also="" explain="" the="" reaction="" of="" f-hafs="" to="" the="" addition="" of="" etomoxir="" and="" uk5099.="" since="" f-has="" favor="" the="" use="" of="" glucose="" during="" anaerobic="" glycolysis(*=""><0.05), they="" are="" likely="" forced="" to="" use="" fatty="" acids="" and="" glutamine="" to="" supply="" the="" aerobic="">

2.3.Prakondisi Hipoksia Tidak Mempengaruhi Janin dan Perinatal Memiliki Viabilitas dan Mempertahankan Aktivitas Sekresinya

Untuk menentukan formulasi sekretom hAFS, sel dikultur dalam kondisi bebas serum untuk menghindari kontaminasi dari FBS. Kami sebelumnya menunjukkan bahwa 24 jam kondisi kultur hipoksia bebas serum (SF) dan 1 persen O2 tidak secara signifikan mengubah kelangsungan hidup hAFS janin trimester (f-hope), sementara mereka mendukung pelepasan faktor parakrin regeneratif dalam media terkondisi sel mereka (hAFS-CM) dan dalam vesikel ekstraseluler (hAFS. EVs) [34,35,37,49]. Di sini, selain membuat profil fraksi sekretom p-hAFS untuk pertama kalinya, kami mengevaluasi apakah p-telah menunjukkan perilaku serupa di bawah rezim prakondisi yang sama, menggunakan kondisi kultur normoksik sebagai kontrol. Viabilitas f-hAFS dan p-hAFS dianalisis setelah 24 jam dalam pengaturan berikut: kondisi normoksik (20 persen O2) dalam media kultur kontrol penuh (Ctrl) (Ctrlf-hAFSnormo dan Ctrl p-hAFSnormo), kondisi normal dalam media SF (SF f-hAFSnormo dan SF p-hAFSnormo), kondisi hipoksia (1 persen O2) pada media kontrol lengkap (Ctrlf-memiliki hipo dan Ctrl p-hAFSnypo), dan kondisi hipoksia pada media SF (SF f-memiliki hipo dan SF p -memiliki hipo, Gambar 3A). Kami mengkonfirmasi bahwa viabilitas f-has tidak berubah dalam kondisi Ctrl dan SF dan di bawah stimulasi hipoksia, dengan lebih dari 80 persen (hingga hampir 88 persen) dari total sel tidak terpengaruh. Sel-sel apoptosis awal dan akhir berkisar dari ca. 13 persen hingga 18 persen dalam kondisi SF, tanpa relevansi yang signifikan secara statistik. Demikian juga, perinatal memiliki kelangsungan hidup berada di kisaran 80-92 persen, dan sel-sel apoptosis awal dan akhir mewakili hingga 18 persen dalam kondisi SF. p-hAFS sedikit dipengaruhi hanya di bawah kondisi hipoksia dan SF gabungan; memang, sementara pengkondisian awal tidak mempengaruhi kelangsungan hidup sel ketika p-hAFS dikultur dalam media lengkap, kondisi SF yang sesuai menunjukkan peningkatan ca. 4-lipat (* p<0.05) of="" late="" apoptotic="" cells(figure="">

Gambar 2. Karakterisasi metabolik janin dan perinatalhAFS. (A) Tingkat konsumsi oksigen (OCR), sintesis ATP melalui F1-F.ATP sintase, dan rasio P/O pada f-have dan-have dengan adanya piruvat plus malat (P/M) atau suksinat (Berhasil);***p=0.0005,**p=0.0012,****p<><0.0001.(b)ocr and="" atp="" synthesis="" in="" presence="" of="" bptes,="" etomoxir,="" and="" uk5099(upper="" panel)="" was="" sequentially="" added="" during="" the="" experiments="" to="" evaluate="" the="" relative="" contributions="" of="" glutamine,="" long-chain="" fatty="" acid="" oxidation="" and="" glucose="" in="" oxphos="" metabolism="" in="" f-hafs="" and="" p-hafs.for="" ocr="" experiments:="" f-hafs+bptes**p="0.0014;for" f-hafs="" +="" etomoxir**p="0.0088;for" p-hafs=""><0.0001;for><0.0001. for="" atp="" experiments:="" f-hafs="" +="" bptes****=""><0.0001; for="" f-hafs＋etomoxir**p="0.0013;for"><0.0001;for p-hafs="" +="" uk5099="" **=""><0.0001).>cistanche AustraliaPerbandingan persentase penghambatan sintesis OCR dan ATP dalam f-dan-hAFS karena penghambat yang ditunjukkan di atas dilaporkan di panel bawah B. Untuk percobaan OCR: hAFS plus Etomoxir**** p<0.0001; for="" hafs="" +="" uk5099="" ****=""><0.0001. for="" atp="" experiments:=""><0.0001;for hafs="" +uk5099="" ****=""><0.0001).(c) glucose="" consumption,lactate="" release="" and="" anaerobic="" glycolysis="" yield,="" used="" as="" markers="" of="" the="" anaerobic="" glycolysis,="" in="" f-hafs="" and="" p-hafs.="" all="" values="" are="" expressed="" as="" mean="" ±="" use.m="" of="" n="4" independent="" experiments;*p="">

Kami kemudian mengevaluasi hasil fraksi sekretom yang diperoleh dari f-hAFS versus p-hAFS berdasarkan pengayaan protein. Total memiliki secretome, karena keseluruhan faktor parakrin yang disekresikan sel, di sini diwakili oleh hAFS-CM. Konsentrasi protein f-hAFS-CM dan p-hAFS-CM dalam medium SF setelah prakondisi sel hipoksia vs kondisi normal kontrol sebagai baseline (yaitu, f-hAFS-CMnormo, f-hAFS-CMNypo, P has-CMnormo, dan p -hAFS-CMHypo,) dievaluasi dengan uji BCA dan diukur per 10§ sel.tangkiHasil yang diperoleh menunjukkan bahwa f-has-CM dan p-hAFS-CM menunjukkan tren positif yang sama dalam pengayaan protein setelah hipoksia priming (f-hAFS-CMnypo'166.10±22.13 ug/10 sel derajat; p-hAFS-CMNypo∶182,30±29,71 ug/10 sel derajat） di atas rekan normoksiknya (f-hAFS-CMnormo:105,50±19,89 ug/10 sel derajat; p- hAFS-CMhypoi 91,12±24,39 ug/10 derajat sel） Demikian pula, konsentrasi protein permukaan hAFS-EVs diukur dalam f-have-EVSnormo, f-hAFS-EVShypo, p-hAFS-EVSnormo, dan p-hAFS-EVShypo EV menunjukkan hasil yang sebanding ketika diperoleh dari f-hAFS atau p-hAFS. Adapun formulasi hAFS-CM, tren positif dalam peningkatan kandungan protein pada f-hAFS-EVs dan p-hAFS. EV dihargai setelah stimulasi hipoksia selama kondisi normoksik yang sesuai f-hAFS-EVSHypo∶2.03±0.67 ug/10 sel derajat dan p-hAFS-EVSHypo∶1.85±0.47 ug/10 sel derajat;f-have-EVsnormo∶1.28±0.36ug/10 derajat sel dan p -hAFS-EVsnormo∶1.19±0.31 ug/10 derajat sel, Gambar 3C).

2.4.Fetal-dan Perinatal hAFS Melepaskan EV dengan Morfologi Analog dan Distribusi Ukuran

Analisis morfologi dengan mikroskop elektron transmisi (TEM) meningkatkan prolife sekresi EV yang tinggi dari f-hAFS dan p-hAFS (Gambar 4). Kami menyelidiki lebih lanjut ukuran dan area f-hAFS-EVs dan p-hAFS-EVs (Gambar 4B) setelah pengkondisian hipoksia dibandingkan dengan baseline normoksik. Janin dan perinatal telah melepaskan EV yang berukuran heterogen, dalam kisaran 40-250 nm, karenanya termasuk eksosom/EV kecil dan mikrovesikel/vesikel penumpahan. Ukuran rata-rata EV/bidang dalam kelompok yang berbeda sebanding, hAFS-EV janin diukur 90-100 nm (f-hAFS-EVsnormo:104.00 ±3.00 nm;f -have-EVSHvpo:97.10±10.10 nm) dan perinatal diukur 70-114 nm (p-hAFS-EVsnormo:94.60±19.53 nm; p-hAFS-EVShypo:76.43±4.86 nm, Gambar 4B, panel kiri). Adapun hasil, hAFS yang distimulasi di bawah hipoksia menunjukkan tren positif dalam peningkatan jumlah EV kecil, meskipun peningkatan ini tidak signifikan secara statistik. f-hAFS-EVStypo mengukur 40-70 nm yang hampir dua kali lipat dibandingkan dengan rekan normoksik mereka. Perinatal-memiliki-EVSHypo yang mengukur 40-70 nm,70-100 nm dan 100-130 nm hampir tiga kali lipat jumlah yang diperoleh dalam kultur normoksik (Gambar 4B).

Analisis pelacakan partikel nano (NTA) menunjukkan peningkatan jumlah partikel dalam persiapan f-hAFS-EV dan p-hAFS-EV, dan mengkonfirmasi peningkatan EV dalam sampel hipoksia, seperti juga diamati dari analisis sebelumnya (f-hAFS- EVsnormo:182±0.10'particles/10 sel derajat; f-have-EVshypo: 3,30±0,22×10 partikel derajat/10 sel derajat ;p-hAFS-EVsnormo:2.43±0.80×10 derajat partikel/10 derajat sel;p-hAFS-EVshypo:3.05±0.62×10 derajat partikel/10 derajat sel, Gambar 4C).

Gambar 4. Karakterisasi morfologi EV janin dan perinatal. (A) Gambar representatif dari mikroskop elektron transmisi (TEM) dari f-hAFS dan p-hAFS (panel kiri atas dan bawah, masing-masing, dengan panah hitam yang menunjukkan badan multi-vesikular intracytoplasmic dengan EV/eksosom kecil di dalamnya), dan f -hAFS-EVs dan p-hAFS-EVs (masing-masing panel kanan atas dan bawah) dilepaskan dalam kondisi bebas serum dan di bawah prakondisi normoksik versus hipoksia (f-hAFS-EVSnormo; f-have-EVSHypoi p-hAFS-EVSnormo; dan f-hAFS-EVshypo, masing-masing), bilah skala: 200 nm. (B) Panel kiri: Analisis TEM dari distribusi ukuran hAFS-EVs; panel kanan: distribusi jumlah f-hAFS-EVs dan p-hAFS-EVs per interval ukuran bidang dari 40 nm hingga 250 nm dipertimbangkan; nilai dinyatakan sebagai mean±sem dari n=3 eksperimen independen. (C) Analisis pelacakan partikel nano untuk ukuran dan distribusi hAFS. Panel kiri: gambar representatif dari output grafis; panel kanan: konsentrasi hAFS-EV diukur sebagai partikel 10 derajat per 10 derajat sel yang mensekresi; nm: nanometer; ml: mililiter.

2.5.Karakterisasi Proteomik hAFS Janin vs. Perinatal Menyoroti Perbedaan Komposisi Sekresinya Menurut Usia Gestasional dan Prakondisi Hipoksia

Karakterisasi proteomik dari formulasi sekretom f-hAFS dan p-hAFS dilakukan dengan menggunakan platform bebas label shotgun, berdasarkan penggabungan kromatografi cair nano dan spektrometri massa resolusi tinggi (nLC-HRMS). Empat puluh delapan profil proteomik diperoleh dengan analisis duplikat dari tiga ulangan biologis hAFS-CM dan memiliki-EV dari f-hAFS dan p-hAFS yang menjalani prakondisi sel hipoksia dibandingkan dengan kondisi normoksik sebagai kontrol. Sebanyak 4179 kelompok protein berbeda diidentifikasi dengan setidaknya satu peptida unik dan dengan berat molekul berkisar antara 2 hingga 3900 kDa dan titik isoelektrik dari 3,6 hingga 13. Ekspresi protein rata-rata yang lebih tinggi dalam hAFS-EV diamati bila dibandingkan dengan hAFS-CM . Penyelarasan semua daftar protein yang diperoleh dilakukan berdasarkan protein yang diidentifikasi. Untuk setiap kondisi eksperimental, daftar unik dibuat untuk menormalkan dan meratakan [50] nilai kecocokan spektrum peptida (PSM) yang dikaitkan dengan protein, yang mewakili jumlah spektrum massa yang ditetapkan untuk masing-masing dan secara tidak langsung mewakili kelimpahannya dalam sampel. Daftar lengkap protein yang diidentifikasi dalam formulasi hAFS-CM dan have-EV dilaporkan dalam Tabel S1.

Penerapan analisis diskriminan linier (LDA[51]) pada daftar induk ini memungkinkan ekstraksi protein yang signifikan secara statistik (Fratio Lebih Besar dari atau sama dengan 4,5 dan** p<0.001)to be="" processed="" by="" hierarchical="" clustering.="" figure="" sla="" shows="" a="" clear="" separation="" and="" different="" behavior="" between="" hafs-cm="" and="" have-ev="" fractions="" generating="" two="" main="" branches,="" as="" highlighted="" by="" the="" heatmap="" color="" code.="" a="" further="" subgrouping="" was="" also="" observed="" according="" to="" the="" gestational="" age="" and="" the="" hypoxic="" preconditioning="" adopted.="" the="" fact="" that="" each="" analyzed="" condition="" presented="" a="" unique="" identity="" is="" confirmed="" by="" the="" venn="" diagrams="" (figures="" 5a="" and="" 6a,="" tables="" s1-s3)="" that="" report="" the="" distribution="" of="" proteins="" identified="" with="" a="" frequency="">1 dalam formulasi hAFS-CM dan memiliki-EV dipertimbangkan secara terpisah. Sementara sekitar 69,5 persen dan 69,9 persen protein dibagikan di antara masing-masing kondisi hAFS-EV dan hAFS-CM, konten yang tersisa tampak eksklusif dalam proporsi yang berbeda, mulai dari 3,7 persen hingga 13,4 persen , di antara formulasi.

Untuk menguji secara kuantitatif perubahan proteomik, analisis diferensial bebas label dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak MAProMa buatan sendiri dan menerapkan dua algoritma, DAve (Differential Average) dan DCI (Differential Confidence Index, yang mewakili rasio dan keyakinan dalam ekspresi diferensial, masing-masing), pada PSM setiap protein tunggal antara dua istilah yang dibandingkan. Menggunakan filter ketat untuk DAve dan DCI untuk memaksimalkan keyakinan identifikasi dan untuk mempertimbangkan protein dengan variasi lebih besar dari perubahan lipat 1,5, perbandingan berpasangan f-hAFS-CM versus p-hAFS-CM dan f-hAFS-EVs versus p-hAFS-EVs dibuat sesuai dengan tahap kehamilan sel. Sebanyak 58 dan 109 protein ditemukan secara berbeda diekspresikan dalam kompartemen has-CM dan have-EV di atas, masing-masing, (Gambar S1B, C untuk detail yang dipilih dan Tabel S2-S3 dalam bentuk yang diperluas). Di antaranya, 30 protein menghasilkan up-regulated dalam f-hAFS-CM dan 28 up-regulated dalam p-hAFS-CM (Gambar S1B); demikian juga, 44 protein berbeda menghasilkan peningkatan regulasi dalam f-have-EVs dan 65 peningkatan regulasi dalam p-hAFS-EVs (Gambar S1C). Khususnya, protein yang menghasilkan up-regulated di f-have harus dianggap down-regulated di p-has dan sebaliknya.

nilai dilaporkan; lihat Tabel S2 untuk daftar lengkap dan parameter rinci dari protein yang dilaporkan. (C) Analisis pengayaan proses biologis protein yang diidentifikasi dengan frekuensi setidaknya 2 pada hAFS-CM janin (panel kiri) dan CM memiliki-CM perinatal (panel kanan) menurut prakondisi hipoksia sel. Berdasarkan alat FunRich, istilah ontologi gen ditampilkan dalam diagram batang yang melaporkan persentase gen yang diperkaya untuk setiap kategori (batang merah muda untuk-memiliki-CMnormo, batang ungu untuk f-hAFS-CMhypor batang biru muda untuk p-hAFS-CMnormo, dan bola biru untuk p-hAFS-CMhypo).beli cistancheHanya istilah ontologi gen dengan Bonferroni yang dikoreksi dengan *p<0.05 are="">

Artikel ini diambil dari Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 3713. https://doi.org/10.3390/ijms22073713 https://www.mdpi.com/journal/ijms