Aktivitas Pelengkap Diatur dalam Glomerulopati C3 Oleh Protein Fusi IgG-faktor H Dengan Dan Tanpa Domain Penargetan Properdin

Kontak:{0}}/ WhatsApp: 008618081934791

Alyssa C. Gilmore, Yuchun Zhang, H. Terence Cook', Deborah P. Lavin, Suresh Katti, YiWang2, Krista K. Johnson, SungKwon Kim², dan Matthew C. Pickering

'Pusat Penyakit Peradangan, Imperial College London, Inggris; and²Alexion Pharmaceuticals, New Haven, Connecticut, AS

C3 glomerulopatiditandai dengan akumulasi komplemen C3 dalam glomerulus. Penyebabnya termasuk namun tidak terbatas pada, kelainan pada faktor H, regulator negatif utama dari jalur alternatif komplemen. Tikus yang kekurangan faktor H (Cfh-/-) mengembangkan C3glomerulopatibersamaan dengan penurunan kadar C3 plasma. Dengan menggunakan model ini, kami menilai kemanjuran dua protein fusi yang mengandung domain regulasi jalur alternatif faktor H (FH1-5)

terkait dengan imunoglobulin tikus yang tidak menargetkan (IgG-FH1-5) atau antibodi anti-tikus yang tepat (Anti-P-FH1-5). Kedua protein meningkatkan C3 plasma dan mengurangi deposisi C3 glomerulus ke tingkat yang setara, menunjukkan bahwa penargetan yang tepat tidak diperlukan untuk FH1-5 untuk mengubah aktivasi C3 dalam plasma atau glomeruli. Setelah pemberian IgG-FH1-5, kadar C3 plasma sementara berkorelasi dengan perubahan kadar faktor B sedangkan kadar C5 plasma berkorelasi dengan perubahan kadar properdin plasma. Khususnya, peningkatan plasma

Tingkat C5 dan properdin bertahan lebih lama daripada peningkatan C3 dan faktor B. Pada tikus Cfh-/- IgG-FH1-5 mengurangi cedera ginjal selama nefritis nefrotoksik serum yang dipercepat. Jadi, data kami menunjukkan bahwa IgG-FH1-5 memulihkan aktivitas jalur alternatif yang bersirkulasi dan mengurangi deposisi C3 glomerulus pada tikus Cfh-/- dan bahwa kadar properdin plasma adalah penanda sensitif aktivitas konvertase C5 pada defisiensi faktor H. Protein FH1-5 terkonjugasi imunoglobulin, melalui waktu paruh plasma yang relatif lama, dapat menjadi terapi potensial untuk C3glomerulopati.

Cistanche dapat membantu dengan Glomerulopati

Pernyataan Terjemahan

C3 glomerulopati(C3G) adalah penyakit ginjal yang ditandai dengan akumulasi abnormal komplemen C3 dalam glomerulus dan kerusakan glomerulus. Hal ini disebabkan oleh aktivasi jalur alternatif komplemen yang tidak terkontrol. Protein fusi, terdiri dari domain fungsional regulator jalur alternatif, faktor H (FH), terkait dengan antibodi, regulasi komplemen yang dipulihkan, dan C3 glomerulus tereduksi dalam model tikus C3G. Konjugasi antibodi non-target menghasilkan waktu paruh plasma protein fusi yang relatif lama, dan ini, atau metode konjugasi serupa, dapat digunakan untuk meningkatkan fungsi FH dalam terapi C3G.

C3 glomerulopati(C3G) adalah gangguan ginjal yang dimediasi komplemen yang ditandai dengan jumlah C3 yang abnormal dalam glomeruli.1 Ini dapat berkembang menjadi gagal ginjal dan tidak memiliki pengobatan yang pasti.2 C3G dikaitkan dengan aktivasi abnormal dari jalur alternatif komplemen (AP). Aktivasi AP menghasilkan produksi C3bBb (C3 convertase), suatu enzim yang memotong C3. Setelah penambahan molekul C3b lain, kompleks C3bBbC3b yang dihasilkan (C5 convertase) dapat membelah komplemen C5. Tidak terkendali

Aktivasi AP di C3G dapat dikaitkan dengan penurunan sirkulasi C3, C5, faktor B (FB), dan properdin. Penyebab aktivasi AP yang tidak terkontrol termasuk hilangnya perubahan fungsi pada regulator komplemen dan perolehan perubahan fungsi pada aktivator komplemen.2 Pengatur AP negatif utama adalah faktor H (FH), dan defisiensi FH pada manusia, babi, dan tikus dikaitkan dengan C3G. 3 Faktor nefritik C3, antibodi yang menstabilkan AP C3 convertase sering terjadi pada C3G.4 Faktor nefritik C3 dapat mengakibatkan penurunan pada C3 saja (faktor nefritik C3 yang tepat-independen) atau pengurangan pada C3 dan C5 (faktor nefritik C3 yang tepat). tergantung faktor nefritik C3).5,6

Meskipun defisiensi properdin tidak memperbaiki kadar C3 plasma, kadar C5 meningkat, menunjukkan bahwa properdin diperlukan untuk aktivitas C5 tetapi tidak C3 convertase.8,9

Pemberian tikus10 atau FH11,12 manusia ke tikus Cfh–/– mengurangi pewarnaan C3 glomerulus dan meningkatkan kadar C3 yang bersirkulasi. Konstruksi yang hanya berisi domain regulasi dan penargetan FH (molekul mini-FH) juga efektif dalam model ini.13 Pendekatan lain termasuk protein yang menargetkan situs aktivasi komplemen. Ini termasuk TT30,14 protein yang mengandung domain regulasi komplemen FH (FH1-5) yang terkait dengan domain pengikat komplemen reseptor 2, dan molekul FH homodimer,15 molekul mini-FH yang mengandung domain pengikat komplemen protein terkait faktor H1.

Karena kegunaan terapeutik dari penghambatan aktivasi C3 komplemen sedang diselidiki di C3G,2 penting untuk memahami kinetika deposisi C3 glomerulus dan hubungannya dengan aktivasi AP dalam glomerulus dan sirkulasi. Dalam model glomerulonefritis yang dimediasi kompleks imun, C3c glomerulus dibersihkan dalam waktu 24 jam untuk mencegah aktivasi komplemen, sedangkan C3d glomerulus bertahan selama berminggu-minggu.16 Demikian pula, pada tikus Cfh–/–, FH eksogen menghasilkan pengurangan pewarnaan C3c glomerulus pada 24 jam , sedangkan C3d glomerulus tetap tidak berubah.11

Dalam penelitian ini, kami menyelidiki kemanjuran 2 protein fusi baru dengan aktivitas regulasi komplemen dalam model tikus Cfh–/– dari C3G. Protein mengandung domain regulasi FH tikus (FH1-5), yang dikonjugasikan ke Ig tikus untuk memperpanjang waktu paruh biologis. Salah satu protein fusi, disebut IgG-FH1-5, dikonjugasikan ke antibodi monoklonal tikus yang tidak menargetkan. Yang lain, disebut anti-P-FH1-5, dikonjugasikan ke antibodi monoklonal untuk properdin tikus. Hal ini dilakukan untuk menguji hipotesis bahwa menargetkan protein fusi ini ke situs aktivasi komplemen, dengan berinteraksi dengan deposisi properdin, akan meningkatkan regulasi komplemen jaringan. Data kami menunjukkan bahwa protein non-penargetan (IgG-FH1-5) dan penargetan yang tepat (anti-P-FH1-5) memulihkan regulasi C3 plasma dan glomerulus pada tikus Cfh–/–. Studi timecourse menunjukkan bahwa pemulihan tingkat C3 dan FB mencerminkan tingkat protein fusi dalam sirkulasi. Sebaliknya, peningkatan C5 plasma bertahan setelah protein fusi dibersihkan dari sirkulasi. Kami menunjukkan bahwa IgG-FH1-5 memperbaiki cedera glomerulus selama nefritis nefrotoksik serum yang dipercepat pada tikus Cfh–/–.

cistanche dapat mengobati penyakit ginjal meningkatkan fungsi ginjal

HASIL

Generasi protein fusi dan penilaian aktivitas in vitro dan in vivo Protein fusi dibuat dengan menghubungkan 5 domain short konsensus repeat (SCR) pertama FH tikus (FH1-5) ke salah satu antibodi anti-mouse properdin (anti -P-FH1-5) atau antibodi dengan domain Ig yang tidak menargetkan (IgG-FH1- 5, Gambar Tambahan S1). Aktivitas protein dinilai menggunakan uji hemolitik spesifik AP (Gambar 1a). Anti-P-FH1-5 dan IgG-FH1-5 menghambat hemolisis dengan cara yang bergantung pada dosis dengan potensi anti-P-FH yang lebih besar1-5. Anti-properdin (anti-P) juga mengurangi hemolisis dengan cara yang bergantung pada dosis, tetapi kontrol IgG- tidak berpengaruh. Setelah injeksi equimolar protein ke tikus Cfh–/–, protein IgG-FH1-5 terdeteksi hingga 11 hari setelah injeksi, sedangkan anti-P-FH1-5 terdeteksi hingga 4 hari setelah injeksi. injeksi (Gambar Tambahan S2). Untuk menentukan apakah IgG-FH1-5 dan anti-P-FH1-5 dapat mengembalikan regulasi AP plasma pada tikus Cfh–/–, pertama-tama kami mengukur kadar C3 plasma setelah injeksi protein fusi (Gambar 1b) . Pemberian baik IgG-FH1-5 atau anti-P-FH1-5 secara signifikan meningkatkan C3 plasma pada 24 jam dan, pada tingkat lebih rendah, pada 96 jam setelah injeksi (Gambar 1b). Data ini menunjukkan bahwa baik IgG-FH1-5 dan anti-P-FH1-5 untuk sementara dapat memulihkan regulasi AP plasma pada tikus Cfh–/–. Kami selanjutnya melakukan analisis terperinci dari perubahan ini dengan mengkarakterisasi perjalanan waktu perubahan tidak hanya plasma C3 tetapi juga plasma C5 dan protein jalur alternatif FB dan properdin. Peningkatan kadar C5 dan properdin yang bersirkulasi bertahan lebih lama daripada peningkatan C3 dan FB setelah pemberian IgG-FH1-5 dan anti-P-FH1-5 pada tikus Cfh–/–

Kami membandingkan kinetika perubahan C3, C5, FB, dan properdin dengan mengukur protein pada interval hingga 27 hari setelah injeksi tunggal baik IgG-FH1-5 atau anti-P-FH1-5 ( Gambar 2). Setelah pemberian IgG-FH1-5, puncak kenaikan C3, C5, FB, dan properdin semua terjadi pada hari ke-1 pasca injeksi. Waktu untuk perubahan ini turun ke tingkat pra-perawatan berbeda. Kembali ke tingkat pretreatment terjadi antara hari 1 dan 4 untuk FB, antara hari 7 dan 11 untuk C3, dan antara hari 14 dan 21 untuk properdin dan C5 (Gambar 2a, c, e, dan g). Setelah pemberian anti-P-FH1-5, kadar puncak C3 terjadi pada hari ke-1 tetapi turun ke tingkat pra-perawatan antara hari ke-4 dan ke-7 (Gambar 2b). Kadar puncak C5 terjadi pada hari ke-4 dan kembali ke kadar sebelum perlakuan antara hari ke-7 dan hari ke-11 (Gambar 2d). Kenaikan puncak FB terjadi pada hari 1 dan turun ke tingkat pretreatment antara hari 1 dan 4 (Gambar 2f). Seperti yang diharapkan, properdin plasma bebas habis setelah injeksi anti-P-FH1-5 atau anti-P (Gambar 2h). Kadar properdin plasma bebas tetap rendah hingga 7 hari setelah anti-P-FH1-5 dan hingga 14 hari setelah anti-P (Gambar 2h). Meskipun kedua protein fusi untuk sementara memulihkan regulasi AP plasma, durasi peningkatan level C3, FB, dan C5 mencerminkan durasi deteksi mereka dalam plasma, yang lebih pendek untuk anti-P-FH1-5 (Tambahan Gambar S2) . Singkatnya, perubahan kadar C3 dan FB setelah injeksi kedua protein lebih pendek daripada C5 dan properdin. Data ini menunjukkan bahwa FB plasma adalah penanda sensitif aktivitas C3 convertase dalam pengaturan ini, sedangkan properdin adalah penanda aktivitas C5 convertase. Khususnya, setelah injeksi anti-P, terjadi peningkatan C5 pada 24 dan 96 jam dan hari ke-7

Gambar 1| (a) Melengkapi uji hemolisis yang bergantung pada jalur alternatif. Antibodi dititrasi dalam 2-dilusi lipat dari 60 nM hingga 0.5 nM. Reagen IgG-FH1-5, anti-P-FH1-5, dan anti-P mengurangi hemolisis eritrosit kelinci dengan cara yang bergantung pada dosis. Tidak ada penghambatan yang digunakan protein kontrol IgG. Bilah horizontal menunjukkan nilai rata-rata, dan bilah kesalahan mewakili SD. (b) Komplemen plasma C3 pada tikus Cfh–/– setelah injeksi protein fusi. Plasma C3 diukur sebelum dan 24 jam dan 96 jam setelah pemberian IgG-FH1-5 (segitiga merah, n 5) Anti–P–FH1-5 (segitiga ungu, n 6), Anti -P (titik hijau, n 5), dan kontrol IgG (titik biru, n 5). Batang horizontal menunjukkan nilai rata-rata, dan kumis menunjukkan SD. ***P#0.001 versus nilai pretreatment dan diturunkan dari 2-way ANOVA dengan uji perbandingan berganda Bonferroni. FH, faktor H; P, tepat.

(Gambar 2d). Seperti yang dilaporkan,8,9 menunjukkan bahwa konvertase C5 bergantung pada properdin pada tikus Cfh–/–.

IgG-FH1-5 dan anti-P-FH1-5 mengurangi C3c glomerulus tetapi tidak mengubah pewarnaan C3d pada tikus Cfh–/–

Kami selanjutnya menilai pengaruh IgG-FH1-5 dan anti-P-FH1-5 pada protein C3b/iC3b/C3c, C3d, properdin, dan terkait FH (FHR) glomerulus. Pada 96 jam setelah injeksi IgG-FH1-5, pewarnaan C3b/iC3b/C3c glomerulus berkurang tetapi pewarnaan C3d glomerulus (Gambar 3a) dan FHR (Gambar 3b) tidak. Glomerulus C3b/iC3b/C3c tetap tidak berubah dengan kontrol IgG atau anti-P. Pola linier abnormal pewarnaan glomerulus properdin pada tikus Cfh-/- yang tidak diobati9 tetap 96 jam setelah kontrol IgG. Pada tikus Cfh–/– yang disuntik dengan anti-P atau IgG-FH1-5, kadar properdin glomerulus hampir tidak terdeteksi pada 96 jam (Gambar 3b). Tanpa diduga, injeksi anti-P-FH1-5 menghasilkan pola pewarnaan glomerulus granular menggunakan antibodi anti-properdin, anti-FH/FHR, dan anti-IgG (Gambar 3b). Temuan ini menunjukkan bahwa protein anti-P-FH1-5 disimpan di glomeruli. Injeksi protein anti-P-FH1-5 ke tikus tipe liar menghasilkan pewarnaan glomerulus dengan antibodi anti-properdin, anti-FH/FHR, dan anti-IgG pada 96 jam (Tambahan Gambar S3), menunjukkan bahwa ini reagen berinteraksi dengan glomerulus normal. Namun, kami berspekulasi bahwa protein anti-P-FH1-5 juga dapat berinteraksi dengan properdin glomerulus yang sudah ada sebelumnya pada tikus Cfh–/–. Ketika kami menyuntikkan reagen ke tikus Cfh–/– yang telah diberi anti-P untuk menghilangkan properdin glomerulus, terjadi pengurangan pola pewarnaan granular menggunakan antibodi anti-properdin, anti-FH/FHR, dan anti-IgG ( Gambar Tambahan S4). Pengamatan ini menunjukkan bahwa interaksi glomerulus protein anti-P-FH1-5 pada tikus Cfh–/– sebagian bergantung pada properdin glomerulus.

IgG-FH1-5 memperbaiki cedera ginjal selama nefritis nefrotoksik serum yang dipercepat pada tikus Cfh–/–

Pada pasien dengan C3G, cedera ginjal akut dapat berkembang dalam konteks infeksi penyerta. Misalnya, hilangnya fungsi ginjal pada nefropati FHR5 dikaitkan dengan episode hematuria makroskopik synpharyngitic. Disregulasi C3 yang mendasari pada pasien C3G kemungkinan menghasilkan peningkatan cedera ginjal yang diperantarai komplemen setelah pemicu yang menyebabkan peradangan ginjal. Untuk memodelkan ini, kami menginduksi nefritis nefrotoksik serum yang dipercepat, kompleks imun

Gambar 2| Kursus waktu profil komplemen plasma pada tikus Cfh–/– yang disuntik dengan IgG-FH1-5 dan anti-P-FH1-5. Plasma C3 (a,b), C5 (c,d), FB (e,f), dan properdin (P; g,h) dari awal percobaan hingga 27 hari setelah injeksi tunggal IgG-FH{{1{{21 }}}} (a,c,e,g; segitiga merah, n 5) atau anti-P- FH1-5 (b,d,f,h; segitiga ungu, n 6). Kontrol termasuk anti-P (titik hijau, n 5) dan antibodi monoklonal yang cocok dengan isotipe (kontrol IgG; titik biru, n 5). Batang horizontal menunjukkan nilai rata-rata, dan kumis menunjukkan SD. *P # 0.05, **P # 0,01, ***P # 0,001 versus nilai pretreatment dan diturunkan dari 2-analisis varians dengan uji perbandingan berganda Bonferroni. FB, faktor B; FH, faktor H.

model glomerulonefritis yang melibatkan komplemen dan jalur yang diperantarai reseptor Fc,18,19 pada tikus Cfh–/–. Kami sebelumnya menunjukkan bahwa tikus Cfh–/– hipersensitif terhadap cedera ginjal dalam pengaturan ini7 dan berhipotesis bahwa protein FH1-5, dengan meningkatkan regulasi AP, dapat memperbaiki cedera ginjal yang dimediasi komplemen dalam model ini. Karena data kami menunjukkan bahwa protein anti-P-FH1-5 disimpan di glomeruli normal, kami menggunakan IgG-FH1-5 selama nefritis nefrotoksik serum yang dipercepat. Dua puluh empat jam sebelum injeksi serum nefrotoksik domba, tikus menerima injeksi ip dari kontrol IgG (n 7) atau IgG-FH1-5 (n 8). Protokol eksperimental digambarkan pada Gambar 4a. Tikus dimusnahkan 6 hari setelah pemberian serum nefrotoksik domba. Semua 3 ukuran histologis patologi glomerulus (skor keparahan, jumlah sel total, dan jumlah makrofag) secara signifikan lebih rendah pada kelompok IgG-FH1-5 (Gambar 4b). Cedera tubulointerstitial juga lebih rendah pada kelompok IgG-FH1-5 (Gambar 4b). Urea serum secara signifikan meningkat pada

Gambar 3| Imunostaining komplemen glomerulus pada tikus Cfh–/– 96 jam setelah injeksi IgG-FH1-5 atau anti-P-FH1-5. (a) Gambar representatif bersama dengan kuantifikasi glomerulus C3b/iC3b/C3c dan C3d dalam 4 kelompok eksperimen: IgG-FH1-5 (segitiga merah, n 5), anti-P-FH1-5 (segitiga ungu, n 6), anti-P (titik hijau, n 5), dan kontrol-IgG (titik biru, n 5).Tingkat plasmaC3 pada waktu culla ditunjukkan pada Gambar 1. (b) Titik data merepresentasikan nilai median, dan kumis menunjukkan rentang interkuartil. Nilai P diperoleh dari uji Kruskal-Wallis dengan uji perbandingan berganda Dunn. (b) Gambar representatif dari IgG glomerulus, FHR, dan, pewarnaan dalam 4 kelompok eksperimen. Batang 100 mm. AFU, unit fluoresen sewenang-wenang; FH, faktor H; P, tepat. Untuk mengoptimalkan tampilan gambar ini, silakan lihat versi online artikel ini diwww.ginjal-internasional.org.

kelompok kontrol IgG, tetapi perubahan albumin serum dan rasio albumin terhadap kreatinin urin tidak berbeda (Gambar 4b). Seperti yang diharapkan, C3b/iC3b/C3c glomerulus berkurang secara signifikan pada kelompok IgG-FH1-5 (Gambar 4b), tetapi IgG tikus glomerulus (Gambar 4b) dan IgG domba (data tidak ditampilkan) tidak berbeda antara kelompok .

Gambar 4| Pretreatment dengan IgG-FH1-5 memperbaiki cedera ginjal selama nefritis nefrotoksik serum yang dipercepat pada tikus Cfh–/–. (a) Skema protokol nefritis nefrotoksik serum yang dipercepat. Tikus yang diimunisasi sebelumnya dengan IgG domba menerima IgG-FH1-5 (kelompok perlakuan, n 8) atau IgG-kontrol (kelompok kontrol, n 7) 24 jam sebelum pemberian serum nefrotoksik domba. (b) Fungsi ginjal dan histologi 6 hari setelah induksi nefritis nefrotoksik serum yang dipercepat pada tikus yang diobati dengan IgG-FH1-5 (pengobatan; segitiga merah, n 8) atau kontrol-IgG (kontrol; lingkaran biru, n 7). Batang horizontal menunjukkan nilai median, dan kumis menunjukkan rentang interkuartil. *P # 0.05, **P # 0.01, ***P # 0,001 versus kontrol dan diturunkan dari uji Mann-Whitney. FH, faktor H; P, tepat.

DISKUSI

Baik IgG-FH1-5 dan anti-P-FH1-5 menormalkan kadar C3, FB, dan C5 pada tikus Cfh–/–. Temuan ini konsisten dengan fakta bahwa domain regulasi komplemen FH tikus terletak di dalam domain SCR 1 sampai 5 (situs pengikatan C3b dan aktivitas kofaktor untuk pembelahan C3b yang dimediasi faktor I).20 Domain pengenalan permukaan, yang mempengaruhi pengikatan ke heparin dan sel endotel dan termasuk situs pengikatan C3b kedua, hadir dalam domain SCR 18 melalui

20 (FH18-20) dan oleh karena itu tidak ada dalam protein fusi.20 Namun demikian, kedua protein tersebut mereduksi iC3b/C3b/C3c glomerulus, yang menunjukkan bahwa FH18-20 tidak diperlukan dalam pengaturan ini. Temuan ini konsisten dengan data sebelumnya yang menunjukkan bahwa tikus Cfh–/– yang mengekspresikan protein FH mutan yang terdiri dari domain SCR 1 hingga 15 (Cfh–/– .FHD16-20) tidak mengembangkan deposisi C3 glomerulus abnormal.21,22 Namun, hewan Cfh–/–.FH D16-20 tidak dapat mengatur aktivasi C3 di sepanjang endotel ginjal dan mengembangkan mikroangiopati trombotik. Ada kemungkinan bahwa, karena kurangnya permukaan yang menargetkan domain FH18-20, pemberian protein fusi yang mengandung FH1-5 pada defisiensi FH dapat mengakibatkan kerentanan terhadap mikroangiopati trombotik. Mungkin juga bahwa peningkatan aviditas untuk pengikatan C3b, di bawah struktur dimer dari protein fusi, cukup untuk mengkompensasi tidak adanya permukaan yang menargetkan domain FH18-20. Namun, pengenalan permukaan C3b juga dipengaruhi oleh perubahan konformasi pada FH.23 Protein pengikat FH Streptococcus pneumoniae (PspCN, yang mengikat domain SCR 9), memicu perubahan konformasi FH, dan kompleks FH-PSpCN telah meningkatkan pengikatan C3b dan meningkatkan aktivitas percepatan peluruhan. Situs pengikatan FH20 C3d tidak terpapar di FH tetapi menjadi terpapar di kompleks FH-PspCN. Ini mungkin menjelaskan mengapa FH19-20 berinteraksi dengan permukaan C3d tetapi FH tidak.24,25 Kami berspekulasi bahwa agen kami, melalui perubahan konformasi, dapat secara efisien berinteraksi dengan fase-cairan dan permukaan C3b. Khususnya, baik IgG-FH1-5 dan anti-P-FH1-5 melindungi eritrosit dari lisis dalam uji hemolisis yang bergantung pada AP.

Baik protein fusi tidak mengurangi pewarnaan C3d glomerulus, mungkin karena sifat persisten C3d glomerulus. Pada nefritis kompleks imun eksperimental, C3c glomerulus sembuh dalam 24 jam setelah penghentian aktivasi komplemen tetapi C3d bertahan selama berminggu-minggu.16 Selain itu, C3d glomerulus menetap pada nefritis lupus.26 Hal ini kemungkinan mencerminkan interaksi kovalennya dengan permukaan glomerulus. Injeksi berulang FH manusia pada tikus Cfh–/– memang menunjukkan penurunan C3d glomerulus selama 10 hari.11 Kemungkinan dosis berulang IgG-FH1-5 dapat mengurangi C3d glomerulus dalam model ini. Juga tidak ada perubahan pada pewarnaan FHR glomerulus. Sedikit yang diketahui tentang fungsi protein FHR tikus, tetapi mereka dapat berinteraksi dengan C3b27,28 dan C3d.27 Faktanya, afinitas FHR-A dan FHR-B untuk C3d lebih kuat daripada FH.27 Kami berspekulasi bahwa protein FHR glomerulus cenderung dibersihkan dari glomeruli hanya ketika C3d telah dihilangkan. Dalam konteks ini, perlu dicatat bahwa pada C3G manusia, protein terkait faktor H 5 berasosiasi dengan C3d glomerulus.29

Protein anti-P-FH1-5 menghabiskan kadar properdin plasma bebas seperti yang diharapkan karena bagian anti-properdin dari protein fusi ini dapat memblokir aktivitas AP (karena deplesi properdin) selama 8 hari setelah injeksi tunggal.30 Namun, data kami menunjukkan bahwa kemanjuran FH1-5 dalam meningkatkan kadar C3 plasma dan mengurangi pewarnaan C3b/iC3b/C3c glomerulus sebanding antara 2 protein fusi (yaitu, tidak tergantung pada penargetan properdin). Selain itu, pewarnaan glomerulus properdin yang abnormal berkurang secara signifikan setelah pemberian anti-P atau IgG-FH1-5. Jelas, berbeda dengan protein C3d dan FHR, properdin glomerulus siap dibersihkan setelah pemulihan regulasi C3. Properdin glomerulus berubah polanya setelah pemberian protein anti-P-FH1-5, tetapi hal ini diperumit dengan pengamatan bahwa kami mendeteksi pengendapan protein fusi ini di Cfh–/– dan glomeruli tipe liar. Hal ini sebagian disebabkan oleh interaksi dengan properdin glomerulus, tetapi deposisi pada glomeruli tipe liar mengindikasikan bahwa ia juga sebagian sepenuhnya bergantung pada komplemen glomerulus dan kemungkinan terkait dengan sifat fisikokimia protein fusi.

Data kinetik kami menunjukkan temuan baru mengenai perubahan temporal pada FB, C5, dan properdin yang menyertai peningkatan C3 pada tikus Cfh–/– setelah injeksi protein fusi. Level FB naik dengan cepat setelah injeksi

dan kembali ke level dasar pada saat level C5 dan properdin tetap tinggi. Tingkat Properdin pada tikus Cfh–/– berkurang pada awal dan meningkat ke tingkat normal (20 mg/ml30) setelah injeksi IgG-FH1-5 dan tetap pada tingkat ini selama setidaknya 14 hari. Sebuah kursus waktu yang sama terlihat untuk kenaikan kadar C5 plasma. Yang mengejutkan, IgG-FH1-5 sebagian besar tidak ada dalam sirkulasi pada 11 hari, menunjukkan bahwa pembentukan C5 convertase pada tikus Cfh–/– lebih lambat daripada C3 convertase (karena kadar C3 kembali ke baseline antara 7 dan 11 hari). Plasma C5 meningkat setelah pengobatan anti-P dan meningkat lebih lanjut dengan protein anti-P-FH1-5. Oleh karena itu, baik penargetan properdin dan efek FH1-5 berkontribusi pada peningkatan level C5 dan menunjukkan bahwa C5 convertase sebagian bergantung pada properdin pada tikus Cfh–/–. Temuan ini konsisten dengan perbaikan disregulasi C5 pada tikus dengan defisiensi gabungan FH dan properdin.8,9 Kadar properdin yang bersirkulasi dapat dikurangi pada C3G dan tampaknya berkorelasi dengan aktivitas konvertase C5 permukaan berbeda dengan C5 plasma atau C5b yang larut. {30}}.31,32 Data kami mendukung hubungan erat antara kadar properdin dan aktivitas convertase C5 dan mendukung penggunaan kadar properdin sebagai biomarker aktivasi C5 glomerulus yang sedang berlangsung.

Khususnya, protein IgG-FH1-5 masih dapat dideteksi dalam sirkulasi hingga 11 hari setelah injeksi tunggal. Ini jauh lebih lama dari apa yang kami laporkan sebelumnya untuk protein FH1-5 tikus yang tidak terkonjugasi, yang dikeluarkan dari sirkulasi dalam waktu 24 jam.14 Temuan ini menunjukkan bahwa waktu paruh plasma IgG-FH yang lebih lama. {9}} protein berasal dari konjugasi antibodi. Waktu paruh plasma protein IgG-FH1-5 juga lebih lama dari apa yang kami amati sebelumnya untuk FH panjang penuh.10,11 Misalnya, FH manusia dikeluarkan dari sirkulasi 96 jam setelah injeksi tunggal pada tikus Cfh–/–.11 Dikombinasikan dengan data kami yang menunjukkan kemanjuran protein IgG-FH1-5 dalam regulasi komplemen, kami menganggap bahwa konjugasi protein FH1-5 untuk memperpanjang profil farmakokinetiknya memiliki potensi terapi utilitas di C3G.

Singkatnya, kami menunjukkan bahwa, meskipun tidak memiliki domain pengenalan permukaan, protein fusi FH1-5 efektif dalam mengurangi aktivasi C3 glomerulus dan memulihkan regulasi komplemen plasma pada defisiensi FH. Tidak ada keuntungan nyata dalam mengkonjugasikan domain FH1-5 menjadi antiproperdin, dan protein IgG-FH1-5 mengurangi cedera ginjal pada nefritis eksperimental. Berbeda dengan tantangan dalam memproduksi sediaan FH skala besar untuk penggunaan terapeutik, produksi skala besar terapi berbasis antibodi sudah mapan, yang menjadikan IgG-FH1-5 sebagai terapi potensial yang menarik untuk C3G.

METODE

Protein fusi

IgG-FH1-5. 5 domain FH SCR tikus pertama (mFH1-5) terhubung

ke Ig tikus IgG1 yang tidak menargetkan (antibodi anti-idiotipik yang dibangkitkan terhadap antibodi monoklonal tikus).

Anti-P-FH1-5. Murine FH1-5 terkait dengan antibodi anti-properdin tikus (anti-P),30 diberikan kepada Alexion oleh W. Song, University of Pennsylvania).

Kontrol. Kontrol adalah Ig tikus non-penargetan yang cocok dengan isotipe (kontrol IgG) dan anti-properdin tikus (anti-P) (Gambar Tambahan S1). Protein dihasilkan menggunakan vektor pVEK dan sel Expi293 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), dimurnikan menggunakan protein A (MabSelect SuRe, Cytiva, Marlborough, MA).

Uji hemolitik spesifik AP

Dua puluh persen serum tikus normal yang dititrasi dari 60 nM menjadi 0,5 nM diinkubasi dengan eritrosit kelinci (1,5 106 sel/ml) pada suhu 37 C selama 30 menit. Pelepasan heme diukur secara spektrofotometri (kerapatan optik 415 nm); 100 persen lisis adalah serum tanpa inhibitor.

FB plasma dan FH

Plasma diperoleh setelah sentrifugasi darah dikumpulkan ke dalam tabung yang mengandung asam etilendiamin tetraasetat (Sarstedt, Nordrhein-Westfalen, Jerman). Protein diukur dengan immunoassay elektroforesis kapiler (WES, ProteinSimple, San Jose, CA). Antibodi yang digunakan adalah antibodi FH anti-tikus poliklonal (Alexion Pharmaceuticals, Boston, MA) dan antibodi FB anti-tikus (Abcam, Cambridge, UK); Modul deteksi anti-kelinci WES (ProteinSimple, San Jose, CA) digunakan. Sinyal chemiluminescent dianalisis dengan perangkat lunak Compass for SW (ProteinSimple, versi 5.0.1), dikuantifikasi sebagai area puncak, dan dinormalisasi ke kontrol pengujian.

tikus

Semua tikus ditempatkan dalam kondisi bebas patogen tertentu; prosedur dilakukan sesuai dengan pedoman institusional dan disetujui oleh United Kingdom Home Office. Tikus tipe liar C57BL/6 dibeli dari Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME), dan tikus Cfh–/– dihasilkan seperti yang dijelaskan sebelumnya.7 Tikus dicocokkan untuk usia dan jenis kelamin; dosis equimolar protein diberikan melalui injeksi ip (1 mg untuk anti-properdin dan kontrol IgG; 1,4 mg untuk IgG-FH1-5 dan anti-P-FH1-5). Nefritis nefrotoksik serum yang dipercepat diinduksi dengan injeksi iv serum nefrotoksik domba ke dalam tikus yang telah diimunisasi dengan IgG.7 domba Pemberian protein fusi dilakukan 24 jam sebelum induksi serum nefrotoksik domba (Gambar 4a).

C3, C5, dan properdin bebas Plasma C3 diukur dengan uji imunosorben terkait-enzim.14 Kadar properdin dan C5 plasma "bebas" diukur menggunakan immunoassay elektrokimia (Meso Scale Discovery [MSD], Meso Scale Diagnostics, Rockville, MD) dengan anti - properdin atau C5 anti-murine khusus yang dilapisi pada pelat MSD berikat tinggi. Properdin dan C5 terikat "bebas" dideteksi dengan anti-properdin (dari W. Song) atau anti-C5 monoklonal terbiotinilasi (Alexion) yang dikombinasikan dengan streptavidin-SULFO (MSD, Meso Scale Diagnostics). Sinyal chemiluminescent diperoleh menggunakan imager SECTOR S 6000 (MSD, Meso Scale Diagnostics) dan dianalisis dengan perangkat lunak MSD Discovery Workbench (Meso Scale

Diagnostik, versi 4.0.12.1). Properdin murine rekombinan dan C5 digunakan sebagai standar.

Fungsi ginjal dan histologi

Hematuria dan proteinuria dinilai menggunakan Hema-Combistix (Bayer, Reading, UK); urea plasma diukur dan jaringan ginjal diproses seperti yang dijelaskan sebelumnya.9 Kreatinin urin ditentukan pada sampel urin spot menggunakan uji Protokol Pendamping Kreatinin (#1012; Excell, Philadelphia, PA), dan urin spot/ albumin plasma diukur dengan uji imunosorben terkait-enzim (#E99-134; Bethyl Laboratories, Montgomery, TX). Bagian ginjal yang diwarnai asam-Schiff secara periodik dinilai secara buta dan diberi peringkat menurut tingkat keparahan cedera glomerulus dan tubulointerstitial (0 [tidak ada], 1 [ringan], 2 [sedang]). Sepuluh glomeruli per bagian dinilai untuk menentukan jumlah sel glomerulus rata-rata. Pewarnaan imunofluoresensi dilakukan pada cryosection 5-mm yang dipasang menggunakan media Vectashield dengan DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Antibodi yang digunakan adalah fluorescein isothiocyanate (FITC)-terkonjugasi poliklonal kambing anti-tikus C3b/C3c/ iC3b (1:200; #55500; MP Biomedical, Santa Ana, CA)9; Fig-chain-spesifik FITC-terkonjugasi poliklonal kambing anti-tikus IgG (1:400; #F5387; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO); IgG anti-kambing/domba monoklonal terkonjugasi FITC (1:100; #F5137; Sigma-Aldrich); atau Properdin anti-manusia kambing terkonjugasi FITC (1:50; #GAHu/PPD/FITC, Nordic Immu- no logic Laboratories, Copenhagen, Denmark).9 C3d anti-tikus kambing terbiotinilasi (1:10; # BAF2655; Sistem R&D , Minneapolis, MN) digunakan pada bagian yang diblokir biotin (Sistem Pemblokiran Biotin; Agilent Dako, Santa Clara, CA), dengan antibodi sekunder streptavidin AF488 (1:200; #S-32354; Thermo Fisher Scientific). FH divisualisasikan dalam bagian terblokir CD16/CD 32-tikus murni yang diblokir (1:100; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) menggunakan FH anti-manusia kambing (1:1000; #A312; Quidel, San Diego , CA) dan antibodi sekunder IgG-FITC anti-kambing monoklonal (1:100; clone GT-34; F4891; Sigma-Aldrich). Makrofag glomerulus diidentifikasi menggunakan FITC-conjugated anti-mouse CD68 (FA-11 clone GTX43518; GeneTex, Irvine, CA). Analisis imunofluoresensi kuantitatif dilakukan menggunakan mikroskop optik Leica DM4B yang digabungkan dengan kamera digital Leica DFC700T (Leica Microsystems, Wetzlar, Jerman) dan perangkat lunak Image-Pro Plus (Media Cybernetics, Rockville, MD, versi 7). Sepuluh glomeruli diperiksa per bagian, dan intensitas rata-rata dinyatakan dalam unit ilmu fluoresensi yang berubah-ubah.

Analisis statistik

GraphPad Prism, versi 8.0 (GraphPad, San Diego, CA) digunakan untuk analisis statistik. Analisis varians 2-cara berulang dengan uji perbandingan berganda Bonferroni (faktor adalah waktu dan perlakuan) digunakan untuk analisis waktu-kursus. Kruskal-Whitney dengan uji perbandingan ganda Dunn digunakan ketika membandingkan beberapa kelompok, dan pengujian Mann-Whitney digunakan untuk 2 kelompok.

PENYINGKAPAN

MCP telah menerima biaya konsultasi dari Alexion, ChemoCentryx, Novartis, Gyroscope, dan Achillion Pharmaceuticals. HTC telah menerima biaya konsultasi dari Alexion, Novartis, Aurinia, dan Achillion Pharmaceuticals. YZ, YW, KKJ, dan SK-K adalah karyawan Alexion Pharmaceuticals. SK adalah mantan karyawan Alexion Pharmaceuticals dan saat ini bekerja di Gemini Pharmaceuticals. Semua penulis lain menyatakan tidak ada kepentingan bersaing.

UCAPAN TERIMA KASIH

MCP adalah Rekan Senior Wellcome Trust dalam Ilmu Klinis (referensi hibah 212252/Z/18/Z), dan ACG dan DPL didukung oleh persekutuan ini. YZ, SK, YW, KKJ, dan SK-K didanai oleh Alexion Pharmaceuticals.

MATERI TAMBAHAN

File Tambahan (PDF)

Gambar S1. Fusionproteinsusedinthisstudy.IgG-FH1-5 berisi 5 domain pertama dari faktor tikus H (FH1-5) terkait dengan non-targeting mouse Ig. Anti-P-FH1-5 terdiri dari mFH1-5 yang terkait dengan antibodi anti-tikus yang menetralkan tikus (anti-P; lihat Miwa et al.30). Protein kontrol termasuk Ig tikus non-penargetan yang cocok dengan isotipe (kontrol IgG) dan antibodi anti-tikus yang menetralkan tikus (Anti-P). Gambar S2. Analisis WES blot untuk mendeteksi FH1-5 dalam sampel plasma dari tikus yang kekurangan FH yang disuntik dengan (A) IgG-FH1-5 atau (B) Anti-P-FH1-5. 94-kDaIgheavychainlinkedtomouseFH1-5 (HC-FH1-5)terdeteksi hingga 11 hari setelah injeksi IgG-FH1-5 dan hingga 4 hari setelah injeksi protein anti-P-FH1-5 (kotak merah ). Kontrol termasuk plasma dari tikus tipe liar di mana protein H faktor panjang penuh terdeteksi (FH, kotak hitam, jalur C1) dan tikus defisiensi FH yang tidak disuntikkan, di mana tidak ada FH yang terlihat (kotak hitam, jalur C2). Seperti yang diharapkan, baik FHnorFH1-5 tidak terdeteksi dalam sampel plasma dari tikus yang disuntik dengan kontrol Anti-P atau IgG.

Gambar S3. Imunostaining komplemen glomerulus 96 jam setelah injeksi kontrol IgG atau anti-P-FH1-5 pada tikus tipe liar. Gambar glomerulus representatif ditampilkan (bar 100 mm).

Gambar S4. Peran properdin pada deposisi anti-P-FH1-5 di glomeruli mencit yang kekurangan FH. Tikus Cfh–/– disuntik dengan kontrol IgG atau anti-P (perlakuan 1) diikuti 24-jam kemudian dengan kontrol IgG- atau anti-P-FH1-5 (perlakuan 2). Hewan dimusnahkan 120 jam setelah perawatan satu dan pewarnaan glomerulus untuk IgG, properdin, dan FH / FHR dinilai. Gambar representatif ditampilkan. Injeksi anti-P secara nyata mengurangi properdin (baris 1, kolom 2) tetapi tidak pewarnaan FH/FHR (tetap tidak berubah) atau IgG (tetap tidak ada). Pemberian anti-P-FH1-5 24-jam setelah kontrol IgG mengakibatkan munculnya pewarnaan granular dengan antibodi anti-IgG, anti-FH/FHR, dan anti-P seperti yang terlihat setelah injeksi anti-P-FH 1-5 saja (lihat Gambar 3b). Pewarnaan granular ini berkurang ketika injeksi anti-P-FH1-5 didahului oleh injeksi anti-P, yang menghabiskan baik sirkulasi (lihat Gambar 1h) dan glomerulus (lihat Gambar 3b). Pewarnaan glomerulus dengan anti-IgG terbukti hanya pada tikus yang disuntik dengan anti-P-FH1-5 (baris 3, kolom 3 dan 4) dan secara signifikan lebih rendah pada tikus yang menerima anti-P-FH1-5 didahului oleh anti-P. Kami menyimpulkan bahwa deposisi anti-P-FH1-5 di glomeruli tikus Cfh–/– sebagian bergantung pada properdin. Batang horizontal menunjukkan nilai median, dan kumis menunjukkan rentang interkuartil. Nilai-P diturunkan dari uji Mann-Whitney. Batang 100 mm.

REFERENSI

1.FakhouriF, Frémeaux-Bacchi V, Nool LH, dkk C glomerulopati∶ dassifikasi baru. Nat Rev Nephrol.20106:494-499.

2 SmithRH.AppeG8.BlomAMet aLC3gkomeripathy—memahami penyakit nyata yang didorong oleh komplemen yang langka. Nat ReyNephrol.201915129-143

3. Pickering MC, Cook HT. Seri ulasan mini terjemahan tentang faktor pelengkap H: penyakit ginjal yang terkait dengan faktor pelengkap H wawasan baru dari manusia dan hewan. Cin Exp Immunol.2008;151:210-230.

4. Daha MR Fearon DT Austen KF, C3nechritic factor C3NeF）∶stabilisasi fase cairan dan jalur alternatif terikat sel convertase. J Immunol 1976;116:1-7.

5. Mollnes TE, Ng YC, Peters DK, efek et al dari faktor nefritik pada C3 dan pada jalur terminal komplemen in vivo dan in vitro. Oin Exp Imunol. 1986;65:73-79.

6. Nq YC, Peters DK. Faktor nefritik G3 (C3NeF): disosiasi sel-terikat dan stabilisasi fase cairan jalur alternatif C3 convertase. Cn Exp Imunol.19865:450-457.

7. Pickering MC, Cook HT, Warren J, dkk Aktivasi C3 yang tidak terkontrol menyebabkan glomerulonefritis membranoproliferatif pada tikus yang kekurangan faktor komplemen H. Nat Genert.2002:31;424-428.

8. Lesher AM, Zhou L, Kimura Y, dkk. Kombinasi mutasi faktor H dan defisiensi properdin menyebabkan glomerulonefritis C3 berat. J Am Soc Nephrol. 2013;24:53–65.

9. Ruseva MM, Veron KA, Lesher AM, dkk. Hilangnya properdin memperburuk glomerulopati C3 akibat defisiensi faktor H. J Am Soc Nephrol. 2013;24:43-52.

10. Paixao-Cavalcante D, Hanson S, Botto M, dkk. Faktor H memfasilitasi pembersihan GBM terikat iC3b dengan mengontrol aktivasi C3 dalam fase fluida. Mol Immunol.2009;46:1942-1950.

11Fakhouri F, de Jorge EG. Brune F, dkk Pengobatan dengan faktor komplemen manusia H dengan cepat membalikkan deposisi komplemen ginjal pada tikus yang kekurangan faktor H. Ginjal Int.2010:78:279-286.

12. Michelfelder S, Parsons J, Bohlender Ll, dkk. Faktor manusia H yang diproduksi oleh lumut, yang dioptimalkan glikosilasi untuk aplikasi terapeutik pada gangguan komplemen. JAm Soc Nephrol.201728:1462-1474.

13. Nichols EM, Barbour TD, Pappworth Y, dkk Sebuah molekul H faktor pelengkap mini yang diperluas memperbaiki glomerulopati C3 eksperimental. Ginjal Int. 201588:1314-1322.

14. Ruseva MM, Peng T, Laser MA, dkk. Khasiat penghambatan komplemen yang ditargetkan pada glomerulopati C3 eksperimental. J Am Soc Nephrol. 2016;27:405-416.

15. Yang Y, Denton H, Davies OR, et al Faktor pelengkap yang direkayasa H membangun untuk pengobatan glomerulopati C3. J Am Soc Nephrol. 2018;29:1649-1661.

16. Schulze M, Pruchno CJ, Burns M, et all Glomerular C3clocalization menunjukkan pembentukan deposit imun yang sedang berlangsung dan aktivasi komplemen pada glomerulonefritis eksperimental. Am J PatholL. 1993:142179-187.

17. Athanasiou Y, Voskarides K Gale DP, et al Familial C3 glomerulopathy terkait dengan karakteristik klinis mutasi CHRS dari 91 pasien di 16 silsilah. CTn JAm Soc Nephrol.20116:1436-1446.

18. Kaneko Y, Nimmer动hn F, Madaio MP, dkk Patologi dan perlindungan pada nefritis nefrotoksik ditentukan oleh keterlibatan selektif reseptor Fc spesifik. J Exp Med.2006;203:789-797.

19. Sheerin NS, Springall T, Carroll MC, dkk. Perlindungan terhadap membran basal anti-glomerulus (nefritis yang dimediasi GBM pada tikus yang kekurangan C3-dan C4-. C Exp Immunol. 1997;110:403-409.

20. Cheng ZZ Hellwae J, Seeberger H et al. Perbandingan pengenalan permukaan dan sifat pengikatan C3b tikus dan faktor pelengkap manusia H.Mol Immunol.2006;43.972-979.

21dp telur EG. Macor P.Paixao-Caakante D. et al Perkembangan sindrom uremik hemolitik yang khas tergantung pada komplemen C5.J Am Soc Nephrol.2011;22:137-145.

22.Pdkering MC, de Jorge EG.Martinez-Barricarte Ry et al Sindrom uremik hemolitik spontan dipicu oleh faktor komplemen H yang tidak memiliki domain pengenalan permukaan. J Exp Med.2007;204:1249-1256.

23Herbert AP. Mike E, Chen ZAet aL Komplemen penghindaran dimediasi oleh peningkatan ditangkap faktor H: implikasi untuk perlindungan self-permukaan dari komplemen.J Immunol. 2015;195:4986-4998.

24. Goicoechea de Jorge E Caesar JJ, Malik TH, dkk Dimerisasi protein terkait faktor H memodulasi aktivasi komplemen dengan. Proc Natl Acad Sci US A.2013;110:4685-4690.

25. Schmidt CQ, Bai H Lin Z, dkk. Rekayasa rasional dari penghambat kekebalan yang diminimalkan dengan sifat penargetan rangkap tiga yang unik. J Imun. 2013;190:5712-5721.

26. Wilson HR, Medjera-Thomas NR, Gilmore AC, dkk. Kompleks serangan membran glomerulus bukanlah penanda yang dapat diandalkan untuk aktivasi C5 yang sedang berlangsung pada lupus nephritis. Ginjal Int. 2019.95655-665.

27. Antonioli AH White J, Crawford F, dkk Modulasi jalur alternatif komplemen oleh protein terkait faktor H murine. J Imun. 2018;200:316-326.

28. Cserhalmi M, CsincsiALMezei Z, dkk. Faktor murine protein terkait H FHR-B mempromosikan aktivasi komplemen. Immunol Depan.20178:1145.

29. Medjeral-Thomas NR, Moffett H, Lomax-Browne HJ et al Faktor komplemen glomerulus H-related protein 5 (FHR5) sangat lazim pada glomerulopati C3 dan terkait dengan gangguan ginjalKdney Int Ren. 2019;4:1387-1400.

30. Miwa T, Sato S, Gullipalli D, dkk. Memblokir properdin, jalur alternatif, dan reseptor anafilatoksin memperbaiki cedera iskemia-reperfusi ginjal pada faktor percepatan peluruhan dan tikus KO ganda CD59. J Imun. 2013;190:3552-3559.

31. Corillo F, Bravo Garcia-Morato M, Nozal P, dkk Konsumsi properdin serum sebagai biomarker disregulasi C5 convertase pada glomerulopati C3. Clin Exp Immunol.2016;184:118-125.8. Lesher AM, Zhou L Kimura Y, dkk. Kombinasi mutasi faktor H dan defisiensi properdin menyebabkan glomerulonefritis C3 berat.JAm Soc Nephrol.2013;2453-65.

32. zhang Y, Nester OM Martin B.et al Mendefinisikan profil biomarker komplemen dari glomerulopati C3. Clin J Am Soc Nephvol.20149:186-1882.