Ekspresi Clr‑f Mengatur Homeostasis Imun dan Metabolik Ginjal Ⅲ
Nov 24, 2023
Diskusi
Peradangan dan diperantarai sel imunKerusakan ginjal memainkan peran utama dalam perkembangan dan perkembangan cedera dan disfungsi ginjal. Dalam penelitian ini, kami melaporkan persyaratan Clr-f dalam pemeliharaankesehatan ginjaldan fungsisebagai kontrol homeostatis intrinsik terhadapkerusakan ginjal yang dimediasi oleh imun dan metabolik. Temuan kami menunjukkan infiltrasi sel kekebalan, dan imunoglobulin serta pengendapan protein komplemen di ginjal tikus yang kekurangan Clr-f. Ciri-ciri kekebalan tikus yang kekurangan Clr-f ini dipasangkan dengan munculnya lesi tubular dan glomerulus yang berkaitan dengan usia, akumulasi lipid ektopik, dan disregulasi berbagai proses transkripsi.
Klik cistanche herba untuk penyakit ginjal
Protein Clr yang dikodekan dalam NKC di antara reseptor NKR-P1 yang terhubung secara genetis telah menjadi fokus penelitian sebagai mediator independen MHC kelas I yang tidak berlebihan dalam pengenalan diri yang hilang oleh NKR-P1 yang mengekspresikan sel imun9,27-31. Peningkatan ekspresi protein Clr terpilih sebagai respons terhadap stres sel juga dilaporkan secara fungsional menahan respons imun sel imun yang berada di jaringan7,12,32. Oleh karena itu, Clr-f usus dianggap berkontribusi terhadap toleransi imun dalam lingkungan usus yang sangat imunogenik melalui interaksinya dengan limfosit intraepitel yang mengekspresikan reseptor NKR-P1G yang menghambat. Pekerjaan yang dilakukan oleh Leibelt dkk. menunjukkan bahwa tikus yang ditantang dengan poli(I:C) menunjukkan peningkatan ekspresi Clr-f dan bahwa interaksi Clr-f/NKR-P1G secara in vitro sangat menghambat sel pengekspres NKR-P1G. Bersama-sama temuan ini dapat diinterpretasikan sebagai mekanisme potensial dimana Clr-f dapat mencegah reaktivitas subset positif NKR-P1G intraepitel usus terhadap penghalang epitel yang terus-menerus dipicu oleh rangsangan mikroba7.
Generasi tikus yang kekurangan Clr-f memberi kita kesempatan pertama untuk menilaiimplikasi fungsionalekspresi Clr-f in vivo dan memungkinkan kami untuk menyelidiki potensi peran homeostatis imun Clr-f di ginjal. Kerusakan ginjal yang diamati pada tikus Clr-f−/− sejalan dengan model bahwa downregulasi Clr-f berfungsi sebagai indikator stres dan cedera sel yang melepaskan kendala pada sel efektor yang mengekspresikan NKR-P1G. Peningkatan NKR-P1G pada sel T di ginjal tikus Clr-f−/− menunjukkan bahwa ekspresi NKR-P1G meningkat di antara sel T yang tinggal di ginjal tanpa adanya Clr-f, atau bahwa ginjal Clr- tikus f−/− menjadi sasaran infiltrasi sel T yang mengekspresikan NKR-P1G. Tidak adanya perubahan yang terdeteksi pada keberadaan atau distribusi sel pengekspres NKR-P1G di usus tikus Clr-f−/− mungkin menunjukkan bahwa konsekuensi fungsional dari NKR-P1G: Interaksi Clr-f di usus terbatas untuk mengendalikan reaktivitas imun dalam konteks infeksi daripada toleransi imun. Alternatifnya, interaksi berlebihan juga dapat mengontrol aktivitas sel pengekspres NKR-P1G. Hal ini didukung oleh temuan bahwa NKR-P1G tidak hanya berikatan dengan Clr-f tetapi juga dengan Clr-d dan Clr-g33, yang terakhir ini diekspresikan secara moderat di jaringan ginjal dan usus6. Sementara temuan kami mengungkapkan persyaratan Clr-f untuk melindungi terhadap kerusakan ginjal autoimun, peran yang dimediasi NKR-P1G dalam patologi ginjal autoimun tikus Clr-f−/− tidak lengkap. Khususnya, meskipun ada peningkatan sel T yang mengekspresikan NKR-P1G di ginjal tikus Clr-f−/−, perbedaannya tidak terlalu besar. Ada kemungkinan bahwa reseptor alternatif berpartisipasi dalam pengawasan Clr-f di ginjal. Untuk sepenuhnya mengatasi poros kontrol homeostasis ginjal ini, diperlukan penyelidikan lebih lanjut
Kerusakan ginjal yang diperantarai imun ditandai dengan infiltrasi sel-sel inflamasi ke dalam ruang interstisial atau ke glomerulus34. Akumulasi monosit, sel B dan T di ginjal, antibodi anti-glomerulus, peningkatan sitokin IL-12 dan IFN, dan berbagai patologi glomerulus pada tikus Clr-f−/− sangat mirip dengan lanskap autoimun model tikus LN ( yaitu, MRL-Faslpr)35–37. Meskipun ginjal Clr-f−/− menunjukkan endapan mesangial dominan IgA dengan deposisi IgM dan IgG terkait, dan pengelompokan profil transkripsional Clr-f−/− dan IgAN, kemungkinan terlalu dini untuk menyatakan bahwa fenotipe ini merupakan indikasi suatu jenis CKD dengan IgAN38. Sebaliknya, cedera ini, bersama dengan adanya mesangiolisis, penebalan GBM, dan kematian podosit pada ginjal Clr-f−/− serta perubahan tubulointerstisial, akumulasi lemak, dan disregulasi signifikan dalam jalur metabolisme adalah elemen yang umum terjadi pada berbagai patologi. berasal dari cacat metabolisme yang diperburuk oleh sistem kekebalan37,39,40. Terlepas dari penyebab yang mendasari atau jenis penyakit disfungsi ginjal tikus Clr-f−/−, Clr-f tampaknya memainkan peran mitigasi terhadap perkembangan autoimunitas dengan patologi terkait glomerulonefritis yang jelas.
Pemeriksaan kami terhadap tikus Rag1−/−Clr-f−/− menunjukkan kontribusi yang besar dari mediator independen sel T dan B terhadap respons autoimun tikus Clr-f−/−. Secara khusus, akumulasi sel CD11c+ periglomerular, sel F4/80+, dan sel NKp46+ bahkan lebih jelas lagi tanpa adanya sel T dan B dan berkorelasi dengan adanya kerusakan glomerulus yang signifikan. Hal ini menunjukkan bahwa meskipun sel T dan B dapat berkontribusi terhadap peradangan yang merusak ginjal dan kompleks autoantibodi, pada tikus Clr-f−/− hal ini mungkin bukan merupakan penentu utama patologi, namun merupakan kontributor sekunder terhadap aktivitas inflamasi sel imun lain atau berpotensi menyebabkan peradangan. melayani peran imunoregulasi pada tikus yang kekurangan Clr-f. Hal ini kontras dengan bukti dari model IgAN tikus ddY yang menunjukkan respon terpolarisasi T1 yang kuat, dengan sel T yang memproduksi IFN meningkat seiring bertambahnya usia dan perkembangan cedera glomerulus41. Infiltrasi ginjal sel B pada tikus yang kekurangan Clr-f juga telah ditunjukkan pada model tikus SLE42. Sampai saat ini, masih belum jelas apakah sel B di ginjal berkontribusi terhadap peradangan yang merusak pada CKD atau memainkan peran yang lebih mengatur43. Bukti terbaru mengenai CKD pada pasien usia lanjut menemukan bahwa penurunan populasi sel B berhubungan dengan perkembangan penyakit ginjal44. Bukti dari sel T dan B telah terbukti memiliki aktivitas penekan kekebalan pada penyakit ginjal autoimun45,46, dan oleh karena itu sejauh mana mereka berkontribusi atau mengatur patologi tikus Clr-f−/− memerlukan penyelidikan lebih lanjut.
Temuan kami bersama-sama menunjukkan kebutuhan untuk ekspresi Clr-f dalam epitel tubulus tubulus berbelit-belit proksimal, podosit, dan/atau epitel usus. Hilangnya ekspresi Clr-f menyebabkan kaskade autoimun dan inflamasi yang menyebabkan kerusakan ginjal dan adipositas terkait. Respon imun yang ditimbulkan oleh hilangnya Clr-f tampaknya tidak bergantung pada sel T dan B. Secara keseluruhan, peran fungsional Clr-f di ginjal dapat dibayangkan sebagai molekul penghambat sel imun efector pengawasan di ginjal seperti yang ditempatkan di usus, atau sebagaipengatur intrinsik fungsi sel tubular.
Bahan dan Metode Tikus.
Semua tikus dipelihara di lingkungan khusus yang bebas patogen. Tikus C57BL/6 (WT) dan B6.129S7- Rag1tm1Mom /J (Rag1−/−) diperoleh dari Laboratorium Jackson (Bar Harbor, ME, USA). Tikus yang membawa gabungan mutasi nol pada Rag1 dan Clr-f (Rag1−/−;Clr-f −/−) dihasilkan dengan menyilangkan tikus yang kekurangan Clr-f (Clr f −/−) dengan tikus (Rag1−/−) . Semua pembiakan dan manipulasi yang dilakukan pada hewan telah sesuai dengan pedoman universitas dan disetujui oleh Komite Etika Hewan Universitas Dalhousie dan Komite Perawatan dan Penggunaan Hewan Institusional (IACUC) dari Universitas Ottawa. Semua desain penelitian pada hewan, percobaan dan pelaporan dilakukan sesuai dengan pedoman ARRIVE.
Generasi tikus yang kekurangan Clr‑f. Tikus yang kekurangan Clr-f (Clr-f -/−) dihasilkan oleh rekombinasi homolog dari konstruksi penargetan yang mengandung kaset fosfogliserat kinase (PGK) –neomycin dan urutan genom yang mencakup ekson 3, 4, dan bagian dari ekson 5 dari gen Clr-f. Konstruk penargetan lengkap dikonfirmasi dengan pengurutan di Ottawa Hospitals Research Institute (OHRI) sebelum elektroporasi ke dalam sel batang embrionik (ES) C57BL/6 Bruce-4. Seleksi klon ES berdasarkan resistensi G{{10}} dilakukan oleh Fasilitas Inti Transgenik IRCM (Montreal Clinical Research Institute) (Montreal, QC, Kanada). Sementara itu, probe 5′ dan 3′ Clr-f diuji dalam analisis polimorfisme panjang fragmen restriksi (RFLP) menggunakan DNA genom timus dari tikus WT B6, yang masing-masing dicerna dengan BamHI dan PstI. Fragmen DNA yang dicerna diselesaikan pada gel agarosa 1% dan dipindahkan ke noda membran nilon. Probe cDNA Clr-f diberi label dengan radioaktif 32P-dCTP (Perkin Elmer, Guelph, ON, Kanada) menggunakan lot kit NEB (New England Biolabs, USA). Bercak diperiksa dengan probe cDNA Clr-f berlabel 32P dalam larutan hibridisasi (10% (b/v) dekstran sulfat; 1 M NaCl; 1% SDS). Hibridisasi dilakukan semalaman pada suhu 65 derajat dan pencucian pasca-hibridisasi dilakukan dengan larutan yang mengandung 2× SSC dan 1% SDS yang dipanaskan hingga 65 derajat. Bercak-bercak tersebut dipaparkan pada film fotografi untuk mengungkap sinyal hibridisasi (Gambar. S1A, S3B). Membran dikupas dengan 0.2% SSC/0.2% SDS selama 30 menit pada suhu 85 derajat antara hibridisasi yang berbeda. Klon yang resisten terhadap neomisin disaring dengan analisis Southern blot, dan efisiensi penargetan ~15% diamati. Klon ES yang dipilih disuntikkan secara mikro ke dalam blastokista di Fasilitas Layanan Injeksi Mikro IRCM untuk menghasilkan tikus pendiri Clr-flox yang chimeric. Tikus disaring dengan analisis Southern blot dan kemudian dikawinkan dengan betina B6 untuk menghasilkan tikus heterozigot Clr-fwt/lox. Tikus heterozigot dikawinkan untuk mendapatkan tikus Clr-flox/lox. Untuk menghilangkan kaset neomycin, tikus Clr-flox/lox dikawinkan dengan tikus transgenik CMV-cre homozigot dengan latar belakang B6 (Laboratorium Jackson). CMV-CreTg/0 heterozigot ganda yang dihasilkan; Tikus Clr-f−/+ dikawinkan untuk menghasilkan tikus Clr-f−/− yang tidak memiliki transgen CMV-cre. Tikus di-genotipe menggunakan primer spesifik (Tabel 1, Gambar. S1B,C, dan Gambar. S3C,D). Amplifikasi PCR dilakukan menggunakan AccuStart II Taq DNA polimerase (Quanta Biosciences, Gaithersburg, MD, USA). Campuran PCR disiapkan mengikuti instruksi pabriknya. DNA telinga yang diekstraksi Fenol/Kloroform digunakan sebagai templat. Parameter siklus PCR berikut digunakan: 30 siklus amplifikasi 94 derajat selama 40 detik, 60 derajat selama 45 detik, 72 derajat selama 60 detik. WT dan Clr-f -/− teman serasah digunakan dalam semua percobaan kecuali dinyatakan lain.
Hibridisasi in situ.
Analisis hibridisasi in situ dari Clr-f dicapai dengan mengkloning CDS untai indera full-length dan untai antisense yang mencakup Clr-f ke dalam vektor pGEM-T Easy seperti dijelaskan sebelumnya. Probe antisense dan sense RNA berlabel genin digoxi ditranskripsi dari plasmid linier yang mengkode gen Clr-f dengan T7 polimerase menggunakan campuran pelabelan DIG RNA (Roche, Basel, Swiss). Jaringan dikumpulkan dari tikus B6 dewasa dan difiksasi dalam formalin 10% di RT atau dalam paraformaldehyde 4% pada suhu 4 derajat dengan pengocokan lembut hingga 24 jam. Jaringan kemudian ditanamkan dalam parafin dan bagian 4 µm disiapkan pada slide kaca. Slide jaringan didekarbonasi dengan perlakuan dengan 0.2 N HCl selama 15 menit dan 30 µg/mL proteinase K pada suhu 37 derajat selama 20 menit. Jaringan difiksasi dalam PFA 4% selama 10 menit diikuti dengan perlakuan dengan anhidrida asetat 0,25% dalam trietanolamin 0,1 M dua kali masing-masing selama 5 menit. Slide kemudian dihibridisasi sebelumnya dengan larutan hibridisasi (50% (v/v) formamida/5×SSC, pH 4,5; 2% (b/v) bubuk pemblokiran (Roche); 0,05% (b/v) CHAPS; 5 mM EDTA; 50 µg/mL heparin; 1 µg/mL yeast RNA) dalam oven bersuhu 58 derajat selama minimal 1 jam, dan kemudian diinkubasi dengan larutan hibridisasi yang mengandung 500 ng/mL probe berlabel digoxigenin semalaman pada suhu 58 derajat. Pencucian pasca-hibridisasi dilakukan dengan 50% formamida/2× SSC, pH 4,5 pada 55 derajat 3× masing-masing selama 20 menit, dan slide diwarnai dengan antibodi terkonjugasi alkali fosfatase anti-digoksigenin domba pada pengenceran 1:1000 dalam larutan pemblokiran ( Roche). Pengembangan warna dilakukan dengan menambahkan substrat nitro blue tetrazolium/5-Bromo, 4-chloro, dan 3-indoylphosphate (NBT/ BCIP, Roche) ke slide. Slide disimpan dalam kegelapan di RT sampai sinyal optimal muncul. Pelabelan kontrol dilakukan dengan menggunakan probe sense-strand dan studi pengikatan kompetitif dengan probe sense dan antisense mengkonfirmasi spesifisitasnya. Slide kemudian diwarnai dengan warna hijau muda atau hijau metil dan divisualisasikan di bawah mikroskop cahaya.
RT‑PCR. Jaringan ginjal dari tikus WT dan Clr-f -/− yang sesuai usia dan jenis kelamin dipotong, dibilas dengan PBS, dan dibekukan pada suhu -80 derajat. RNA diisolasi dari jaringan beku menggunakan reagen ekstraksi RiboZol RNA (AMRESCO Inc., West Chester, PA, USA) mengikuti instruksi pabrik. Sekitar 1 μg RNA ditranskripsi menjadi cDNA menggunakan kit cDNA Verso (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). Amplifikasi PCR dilakukan pada 1 μL produk cDNA menggunakan primer spesifik (Tabel 1). Kondisi PCR yang digunakan adalah 94 derajat selama 30 detik, 58 derajat selama 30 detik, 72 derajat selama 60 detik, dan 35 siklus amplifikasi. Produk PCR divisualisasikan pada gel agarosa 1% yang diwarnai dengan etidium bromida (Gambar 1C, Gambar. S3A).
Imunohistokimia.
Jaringan ginjal tikus WT dan Clr-f −/− yang sesuai usia dan jenis kelamin dideparafinasi dengan tiga inkubasi 5 menit dalam xilena, dua inkubasi 5 menit dalam etanol 100%, diikuti oleh 90 % etanol, kemudian 80% etanol, dan terakhir 70% etanol. Slide direhidrasi dengan mencuci dalam air suling (20 dips), dan pengambilan epitop yang diinduksi panas dilakukan menggunakan pressure cooker dalam buffer sitrat (pH 6.0). Peroksidase endogen diblokir dengan hidrogen peroksida 3% dalam air steril selama 10 menit, dan protein diblokir menggunakan Background Sniper (Biocare Medical, Pacheco, CA, USA). Bagian-bagian tersebut kemudian diinkubasi dengan antibodi monoklonal anti-Clr-f anti-tikus7 pada suhu 4 derajat semalam. Keesokan harinya, slide dibilas dengan PBS 0,1 M dan diinkubasi selama 1 jam dalam antibodi sekunder. Pewarnaan dikembangkan menggunakan kit HRP-Polymer Goat-on-Rodent (Biocare Medical) dan Betazoid DAB Bufer (Biocare Medical), diikuti dengan counter-staining hematoxylin. Proses yang sama digunakan untuk menodai bagian jaringan ginjal untuk pelabelan IHC sel NKp46+ dan CD3+, menggunakan anti-NKp46 (eBioscience, Santa Clara, CA, USA, clone 29A1.4, CAT# 48-3351-82) dan anti-CD3 (BioLegend CAT#100,327) masing-masing sebagai antibodi primer. Pelabelan IHC pada F4/80 dilakukan pada bagian ginjal beku menggunakan antibodi monoklonal BM8 tikus anti-F4/80. Antibodi sekunder terkonjugasi IgG H&L HRP anti-tikus kambing (Abcam, Cambridge, UK CAT#ab97057) digunakan seperti di atas dan IHC dikembangkan dengan, substrat lobak kuda peroksidase (HRP) digunakan DAB Substrat Kit (Abcam, CAT# ab64238).
Imunofluoresensi.
Jaringan ginjal dan/atau usus tikus WT dan Clr-f −/− yang sesuai usia dan jenis kelamin dikriopreservasi dalam sukrosa 30% pada suhu −80 derajat dalam senyawa suhu pemotongan optimal Tissue-Tek (Fisher Scientific, Pittsburg, PA, AS). Bagian cryostat 20 μm difiksasi dengan aseton dalam lemari asam pada suhu kamar selama 16 menit dan dikeringkan di udara selama minimal 30 menit, setelah dicuci dalam PBS 0,01 M, pH 7,4. Ikatan nonspesifik diblokir dengan 10% serum keledai. Bagian diinkubasi semalaman pada suhu 4 derajat dengan antibodi primer: anti-Clr-f7, anti-NKR-P1G (antibodi monoklonal anti-tikus tikus yang dijelaskan sebelumnya7), anti-IgA (rantai alfa IgA anti-tikus kambing (Abcam, Cambridge , UK CAT#ab97235), anti-IgG-PE (BioLegend, San Diego, CA, USA CAT#405324, anti-IgM-FITC (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA CAT#A21042), Pelengkap C3 Anti body (11H9 ) (Novus Biologicals, Littleton, CO, USA Cat# NB200-540), anti-IFN -PE (BD-Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA CAT#554411), anti-IL-12-PE (BD-Pharmingen CAT# 554479), anti-CD45-FITC (BioLegend CAT#103108), anti-CD11c-FITC (eBioscience CAT#11-0114-85), anti-F4/80- APC (BioLegend CAT#123116), dan anti-NKp46-eFluor 450 (eBioscience, CAT#48-3351-82) pada konsentrasi 1:100 dalam serum normal 5% dalam ruangan yang dilembabkan. Pelabelan antibodi sekunder pada anti Antibodi -Clr-f dan anti-NKR-P1G menggunakan antibodi poliklonal terkonjugasi FITC dilakukan di RT selama inkubasi 1 jam.Sampel diwarnai dengan nuklir DAPI di RT selama 5 menit, dicuci dengan PBS, dan dipasang pada slide kaca dengan satu tetes VECTASHIELD PLUS media pemasangan antipudar (Vector Laboratories, San Francisco, CA, USA) dan ditutup dengan kaca penutup. Slide diperiksa menggunakan mikroskop confocal pemindaian laser Zeiss LSM 510.
Penilaian histologi dan patologi.
Bagian ginjal dari tikus WT, Clr-f −/−, Rag1−/− dan Rag1−/−Clr-f −/− yang cocok dengan usia dan jenis kelamin (3 μm) diwarnai dengan Periodic acid-Schif (PAS). Jaringan ginjal dinilai untuk seluleritas mesangial (didefinisikan sebagai 4 atau lebih inti per area mesangial), proliferasi endokapiler, bulan sabit, dan sklerosis glomerulus. Bagian juga dinilai untuk mengetahui adanya tubulopati, fibrosis interstitial, atrofi tubular, dan infiltrat sel tubulointerstitial. Untuk patologi glomeruli, skor semi-kuantitatif digunakan untuk mengevaluasi tingkat kerusakan glomerulus. Minimal 50 glomeruli di setiap kelompok diperiksa dan tingkat keparahan lesi dinilai dari 0 hingga+3: lesi+1 mewakili keterlibatan Kurang dari atau sama dengan 30% glomerulus,+2 sebesar 30–60%, sedangkan+3 lesi menunjukkan lebih besar dari atau sama dengan 60% glomerulus terlibat. Pengukuran ketebalan GBM dilakukan pada mikrograf elektron glomerulus WT dan Clr-f -/− menggunakan Gambar J V1.53a47. Jaringan ginjal yang diwarnai PAS dari dua tikus Rag1−/− dan dua tikus Rag1−/−Clr-f -/− juga diberi skor secara membabi buta untuk mengetahui adanya ciri-ciri patologis di atas, dan ciri-ciri yang diukur dihitung dari rata-rata empat bagian ginjal per mouse.
Mikroskop elektron.
Pemrosesan jaringan untuk mikroskop elektron transmisi mengikuti protokol yang dipublikasikan48. Secara singkat, potongan kecil jaringan ginjal dari tikus WT dan Clr-f −/− berumur 12-minggu difiksasi dalam larutan glutaraldehid 2,5% dan kemudian diproses menggunakan metode osmium tetroksida/uranil asetat 1%. Sampel ditanam dalam resin Epon Araldite sebelum dipotong menggunakan ultramicrotome ultra cut E Reichert-Jung. Sampel divisualisasikan pada mikroskop elektron transmisi JEOL JEM 1230 dan gambar diambil menggunakan kamera digital Hamamatsu ORCA-HR.
Pengukuran limbah kimia dan elektrolit urin dan plasma.
Sekitar 150 μL urin dikumpulkan setiap hari dari tikus WT jantan berumur 12-minggu dan Clr-f −/− pada waktu yang sama selama 5 hari berturut-turut. Urine disentrifugasi pada kecepatan 10,000 rpm untuk menghilangkan kotoran dan kemudian disimpan pada suhu −80 derajat. Darah vena wajah dikumpulkan dari tikus yang sama dalam tabung heparinisasi dan diisolasi dengan sentrifugasi pada 3000g selama 5 menit dan disimpan pada suhu −80 derajat. Sampel urin dan plasma dikirim ke Laboratorium Idexx (Markham, Ontario) untuk pengukuran konsentrasi protein, kreatinin, dan elektrolit.
Pengukuran tekanan darah pada tikus berumur 12 dan 24 minggu. Tekanan darah sistolik dan diastolik (BPs) diukur dengan plethysmography tail-cuff pada tikus WT dan Clr-f −/− jantan berusia 12 dan 24-minggu dalam kondisi stabil menggunakan model Visitech BP2000. BP diukur setiap hari di ruangan yang sama dan pada jam yang sama selama 5 hari berturut-turut. Nilai BP dari 3 pengukuran berturut-turut terakhir digunakan untuk menghitung nilai rata-rata BP karena 2 hari pertama dianggap penting untuk adaptasi tikus.
Kidney RNA sequencing. For kidney RNA-seq, total RNA was isolated from freshly frozen kidneys of three age- and sex-matched WT and Clr-f −/− mice at 7, 13, and 24 weeks of age using TRIzol (Thermo Fisher Scientific) and RNA Clean & Concentrator-5 kit (Zymo Research, Irvine, CA, USA). RNA samples were sent to Genome Quebec Innovation Centre, McGill University, Montreal, QC for library preparation and RNA-seq. RNA-seq was performed on the Illumina HiSeq 4000 platform, with paired-end reads, at>30× 106 kedalaman baca per sampel.
RNA‑seq analysis. Te quality of the sequencing reads was inspected using FastQC tool V0.11.5 (http:// www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) and reads with a Phred quality score of 30 over 90% of the reads were retained utilizing the Fastx-toolkit V0.0.13 (http://hannonlab.cshl.edu/). Next, the high-quality reads were mapped to the mouse GENCODE M25 annotation database (GRCm38.p6)49 using the STAR aligner V2.7.5a50. STAR aligner was then used to remove duplicates, create transcriptome hits count tables, and generate wiggle fles. Subsequently, DESeq2 package V1.28.151 was used to remove hits with CPM values less than 1 and calculate differentially expressed genes with FDR-transformed P-value>{{0}}.05 dan batas perubahan lipatan log sebesar 1,5. Nilai FPKM untuk semua titik waktu dan sampel disediakan (File Kumpulan Data Tambahan 1). Analisis pengayaan fungsional. Ontologi gen dan Analisis Pengayaan Fungsional dilakukan menggunakan g: Profiler (versi e102_eg49_p15_7a9b4d6) dengan metode koreksi pengujian berganda g: SCS yang menerapkan ambang batas signifikansi 0,05 (https: //biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost) 52 dan Sistem Klasifikasi PANTHER dengan pengujian Fisher's Exact dan ambang batas FDR sebesar<0.05 (http://pantherdb.org/citePanther.jsp) 53.
Jaringan pengayaan fungsional dibuat menggunakan set gen Proses Biologis GO (GO: BP) untuk Mus Musculus (GRCm38. p6) Rilis BioMart: 2020-12-08 diunduh dari g: Profiler (https://biit.cs.ut.ee /gprofiler/gost). Analisis Pengayaan Gene Set (GSEA) dilakukan menggunakan GSEA V4.0354,55 menggunakan pengayaan Jaringan berdasarkan FDR<0.05. Networks were assembled, curated, and visualized using Cytoscape V3.7.156. Heatmaps were generated and clustered by Euclidian distance using Morpheus (https://sofware.broadinstitute.org/morpheus).
Analisis lipid perut dan ektopik. Akumulasi lemak ditentukan oleh berat lemak perut yang dibedah dari masing-masing tikus. Pengukuran berat badan dilakukan sebelum ekstraksi lemak. Untuk pewarnaan Oil Red O (ORO), bagian ginjal beku dipotong pada ukuran 10 μm menggunakan cryostat dan kemudian dikeringkan di udara selama 30 menit. Pewarnaan ORO dilakukan dengan memfiksasi bagian dengan 3 kali pencucian isopropanol 60%, menginkubasinya dengan konsentrasi kerja (66%) larutan ORO (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) pewarnaan selama 15 menit. Slide kemudian dicuci dengan cepat dengan 60% isopropanol, dengan cepat diwarnai dengan hematoxylin Mayer untuk menyorot inti, dan kemudian dipasang menggunakan Media Pemasangan Berair VectaMount AQ (Laboratorium Vektor).
Analisis patotipe. Analisis patotipe dilakukan menggunakan Diferensial Expressed Genes (DEGs) dengan q<0.05 identified from RNA-seq of WT and Clr-f −/− 13-week-old mouse kidneys. Signifcant Clr-f −/− DEGs with identifiable ENSEMBL human orthologs were compared with DEGs of 15 human kidney disease expression sets (disease versus healthy kidney)57–64 downloaded from Nephroseq database at (http://www.nephroseq.org) (Supplementary Dataset File 2)65. Clr-f −/− mouse and human kidney disease DEG sets were hierarchically clustered by Euclidean distance and graphed in a similarity matrix using the Morpheus software (https://sofware.broad institute.org/morpheus). Functional enrichment using g: Profler, (using parameters described above) was performed on four groups of expression clusters with corresponding increased and decreased DEGs and non-corresponding DEGs from the compared expression profiles of Clr-f −/− and IgA nephropathy (IgAN) kidney disease. Flow cytometry. Kidneys from age- and sex-matched WT and Clr-f −/− mice were harvested, homogenized in a Petri dish on ice with RPMI media containing collagenase type 4 (2 mg/mL) (Fisher), and incubated at 37 °C for 30 min with gentle agitation.
Jaringan yang dicerna dilewatkan melalui filter nilon berukuran 70-μm, dicuci dengan PBS, dan sel darah merah yang tersisa dilisiskan dengan buffer pelisis ACK selama 5 menit di atas es. Sel imun ginjal diisolasi dengan sentrifugasi RT pada 2000 rpm selama 30 menit dalam Percoll 40%. Pelet sel diresuspensi dalam PBS dan jumlah sel diperoleh dengan hemositometer. Berbagai mAb digunakan untuk memverifikasi ekspresi protein permukaan sel, sel diwarnai untuk analisis sitometri dengan antibodi tikus berlabel fluorokrom: anti-CD45 (eBioscience, clone 30-F11), anti-TCR (eBioscience, clone H{ {12}}), anti-NK1.1 (eBioscience, klon PK136), anti-CD19 (BioLegend, klon 1D3/CD19), anti-CD11b (BioLegend, klon M1/70), anti-F4/80 (BioLegend, clone BM8), anti-MHCII(IA/IE) (BioLegend, clone M5/114.15.2), anti-Ly6G (BioLegend, clone 1A8), anti-NKp46 (eBioscience, clone 29A1.4), dan kontrol isotipe. Viabilitas sel ditentukan menggunakan Fixable Viability Dye (eBioscience, Cat# 65-0865-14). Untuk mengidentifikasi dan mengukur populasi sel imun di ginjal WT dan Clr-f -/−, analisis sitometri aliran multiparametrik menggunakan antibodi terhadap penanda spesifik sel digunakan untuk mengidentifikasi neutrofil (CD11b+Ly6G+), makrofag (CD11b+Ly6G−F4/{ {57}}MHCII+), sel NK (CD11bloLy6G−TCR −NK1.1+), dan sel NKp46+ (CD11bloLy6G−TCR −NKp46+), sel T (Ly6G−NK1 .1−TCR +) dan sel B (CD11b−Ly6G−TCR −CD19+). Semua sampel diperoleh pada sitometer BD-Fortessa.
Referensi
1. Hato, T. & Dagher, PC Bagaimana sistem kekebalan bawaan merasakan masalah dan menyebabkan masalah.Klinik. Selai. sosial. Nefrol.10, 1459–1469 (2015).
2. Kruger, T.dkk.Identifikasi dan karakterisasi fungsional sel dendritik pada ginjal murine yang sehat dan secara eksperimentalglomerulonefritis.Selai. sosial. Nefrol.15, 613–621 (2004).
3. Weisheit, CK, Engel, DR & Kurts, C. Sel dendritik dan makrofag: Penjaga di ginjal.Klinik. Selai. sosial. Nefrol.10, 1841–1851 (2015).
4.Woltman, SAYAdkk.Kuantifikasi subset sel dendritik dalam jaringan ginjal manusia dalam kondisi normal dan patologis.Ginjal Int.71, 1001–1008 (2007). 5. Gottschalk, C.dkk.Sel dendritik yang bergantung pada batf3-di kelenjar getah bening ginjal menginduksi toleransi terhadap antigen yang bersirkulasi.Selai.sosial. Nefrol.24, 543–549 (2013).
6.Zhang, Q.dkk.Analisis ekspresi dan urutan cluster gen Nkrp tikus1-Clr mengungkap konservasi MHC spesifik jaringanpengawasan imun independen.PLoS Satu7, e50561 (2012).
7. Leibelt, S.dkk.Imunosensing khusus pada epitel usus tikus yang difasilitasi oleh sepasang sel mirip lektin yang digabungkan secara genetikreseptor.Imunol Mukosa.
8, 232–242 (2015). 8. Rahim, MMAdkk.Tikus NKR-P1B: Sistem pengenalan Clr-b adalah pengatur negatif respon imun bawaan.Darah125, 2217–2227 (2015).
9. Carlyle, JRdkk.Hilangnya pengenalan diri terhadap Ocil/Clr-b oleh penghambat reseptor sel pembunuh alami NKR-P1.Proses. Natal. Akademik. Sains.U.S.A. 101, 3527–3532 (2004).
10. Rutkowski, E.dkk.Clr-a: Molekul mirip lektin tipe C terkait kekebalan yang secara eksklusif diekspresikan oleh epitel usus tikus.J. imunol.198, 916–926 (2017).
11. Balaji, GRdkk.Pengenalan host Clr-b oleh reseptor penghambat NKR-P1B memberikan dasar untuk pengenalan diri yang hilang.Nat.Komunitas.9, 4623 (2018)
12. Friede, ME, Leibelt, S., Dudziak, D. & Steinle, A. Pilih ekspresi Clr-g pada sel dendritik yang diaktifkan memfasilitasi interaksi serumpundengan sebagian kecil sel NK limpa yang mengekspresikan reseptor penghambat Nkrp1g.J. Imunol.200, 983–996 (2018).
13. Abou-Samra, E.dkk.Ekspresi NKR-P1B dalam sel limfoid bawaan terkait usus diperlukan untuk mengontrol saluran cernainfeksi saluran.Sel. mol. imunol.16, 868–877 (2019).
14. Germain, C.dkk.Karakterisasi varian transkrip gen CLEC2D yang disambung secara alternatif.J.Biol. kimia.285, 36207–36215 (2010).
Layanan Pendukung Wecistanche-Ekspor cistanche terbesar di Cina:
Surel:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Telp:+86 15292862950
Belanja Untuk Detail Spesifikasi Lebih Lanjut:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-toko
