Kloning, Identifikasi Fungsional Dan Analisis Ekspresi Kalkon Sintase Dari Cistanche Tubulosa
Mar 25, 2024
Abstrak: Tujuan Untuk mempelajari fungsi kalkon sintase dari Guanhuaroucongrong (Cistanche tubulosa) dan pola ekspresi gen CtCHS pada bunga berwarna putih, merah dan ungu.
Metode Gen CtCHS diklon dengan RT-PCR dan dilakukan analisis bioinformatika. Plasmid pET-28a-CtCHS dipindahkan ke Escherichia coli untuk menginduksi ekspresi protein oleh IPTG. Protein rekombinan CtCHS diinkubasi dengan substrat p-coumaroyl CoA dan malonyl CoA, dan produknya dideteksi oleh HPLC dan MS. Plasmid pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS dipindahkan ke protoplas Arabidopsis thaliana untuk mengamati lokalisasi subseluler protein CtCHS. Pola ekspresi gen CtCHS pada bungaC.tubulosadengan tiga warna terdeteksi oleh qRT-PCR.
Hasil Sebuah gen CtCHS diklon. Panjang kerangka pembacaan terbuka (ORF) adalah 1173 bp, mengkode 390 asam amino, dan berat molekul protein adalah 42 8000. CtCHS mengandung residu katalitik Cys164, His303, Asn336, yang disimpan dalam chalcone synthase. Protein CtCHS diekspresikan dalam E. coli dan dimurnikan untuk mendapatkan protein rekombinan. Protein CtCHS dapat mengkatalisis p-coumaroyl CoA dan malonyl CoA menghasilkan naringenin chalcone. Protein CtCHS terutama terlokalisasi di sitoplasma. Gen CtCHS terekspresi tinggi pada bunga ungu dan merah, dan tingkat ekspresi relatifnya masing-masing 8,44 dan 3,21 kali lebih tinggi dibandingkan bunga putih.
Kesimpulan Sebuah gen CtCHS diklon dari bungaC.tubulosadan protein diekspresikan. CtCHSprotein memiliki fungsi chalcone synthase, dan ekspresi gen CtCHS lebih tinggi pada bunga yang lebih gelap, menunjukkan bahwa gen CtCHS dapat mengatur warna bunga C. tubulosa, yang menjadi landasan untuk penelitian lebih lanjut mengenaimekanisme pengaturan warna bunga C. tubulosa.
Kata kunci:Cistanche tubulosa (Schenk) Wight; sintase kalkon; analisis aktivitas enzim; lokalisasi subseluler; analisis ekspresi
KLIK DI SINI UNTUK MENDAPATKAN EKSTRAK CISTANCHE ORGANIK ALAMI DENGAN 30% ECHINACOSIDE DAN 12% ACTEOSIDE
Layanan Pendukung Wecistanche-Ekspor cistanche terbesar di Cina:
Surel:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Telp:+86 15292862950
Belanja Untuk Detail Spesifikasi Lebih Lanjut:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-toko
Biosintetikjalur flavonoiddimulai dengan jalur fenilpropanoid.Fenilalaninpertama-tama diubah menjadi asam sinamat di bawahaksi fenilalanin amonialyase(PAL), dan asam sinamat 4-dihidroksilasi oleh asam sinamat. Enzim (asam sinamat-4-hidroksilase, C4H) dan 4-coumaratecoenzyme A ligase (4-coumaratecoenzyme A ligase, 4CL) mengkatalisis reaksi untuk menghasilkan 4-coumaroyl-CoA [11 ]. Satu molekul 4-coumaroyl-CoA dan tiga molekul malonyl-CoA dikatalisis oleh chalcone synthase (CHS) untuk menghasilkan naringenin chalcone, yang memiliki senyawa flavonoid. Kerangka dasar chalcone isomerase, flavanone-3-hydroxylase, dihydroflavonol 4-reduktase, dll. menghasilkan berbagai flavonoid seperti isoflavon, flavonol, antosianin, dll. [12]. Sebagai enzim kunci dalam jalur biosintetik flavonoid, CHS mengatur kandungan flavonoid pada tanaman dan juga berperan penting dalam mengatur warna bunga tanaman [13]. Misalnya, pembungkaman gen pasca-transkripsi Gentiana scabra Bunge CHS dapat menghambat biosintesis antosianin dan menyebabkan pemutihan spesifik pada lobus corolla [14]. Pembungkaman gen CHS dari Actinidia erianthaBenth. CHS mengurangi kandungan antosianin pada kelopak bunga dan membuat kelopak menjadi merah. Warna kelopaknya menjadi lebih terang [15]. Oleh karena itu, dalam penelitian ini, gen CtCHS diklon dari bunga Cistanche tubulosa, dan analisis bioinformatika, ekspresi dan pemurnian prokariotik, analisis aktivitas enzim, analisis lokalisasi subseluler, dan analisis ekspresi dalam tiga warna bunga dilakukan untuk mengeksplorasi fungsi CtCHS. protein dan pola ekspresi gen CtCHS digunakan untuk mengeksplorasi hubungan antara CtCHS dan warna bunga Cistanche tubulosa, yang meletakkan dasar untuk studi mekanisme pengaturanWarna bunga Cistanche tubulosa.
1 Bahan dan instrumen
1.1 Bahan
Bunga Cistanche tubulosa dikumpulkan dari Kabupaten Yutian, Prefektur Hotan, Xinjiang pada Mei 2018. Prinsip acak diikuti selama pengambilan sampel, dan dipilih bunga Cistanche tubulosa dengan status fisiologis yang baik dan tinggi tanaman yang konsisten. Tiga strain Cistanche tubulosa dengan tiga warna bunga putih, merah dan ungu diambil dan diidentifikasi sebagai Cistanche tubulosa (Schenk) Wight oleh Profesor Tu Pengfei dari Fakultas Farmasi Universitas Peking. Mereka dengan cepat dibekukan dalam nitrogen cair dan kemudian diangkut ke Beijing dalam penyimpanan es kering. Sel kompeten secara kimia E. coli DH5 dibeli dari Nanjing Novezan Biotechnology Co., Ltd., dan sel kompeten secara kimia E. coli BL21 (DE3) dibeli dari Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd.; pET-28a, pCAMBIA1300-35S-GFP Vektor dibeli dari Wuhan Transduction Biology Laboratory Co., Ltd. Malonyl-CoA dibeli dari Sigma Company, 4-coumaroyl-CoA, naringenin -kalkon dibeli dari Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., dan naringenin dibeli dari Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd.
1.2 Instrumen
Spektrofotometer Nanodrop 2000C (Thermo Fisher Company, AS); instrumen PCR gradien (Perusahaan Eppendorf, Jerman); Instrumen PCR kuantitatif fluoresensi CFX 96, imager gel UVP, instrumen elektroforesis gel, instrumen elektroforesis protein (Perusahaan BioRad, AS); EnSpire
Pembaca pelat mikro (PerkinElmer Company, AS); inkubator suhu konstan (Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.); Osilator suhu penuh berkapasitas besar DHZ-D (Pabrik Peralatan Eksperimental Taicang); THZ-82Osilator suhu konstan penangas air (Jiangsu Kexi Instrument Co., Ltd.); meja kerja ultra-bersih AIRTECH (Suzhou Antai Air Technology Co., Ltd.); alat sterilisasi uap bertekanan tinggi (TOMY Company, Jepang); Instrumen air murni Milli Q (Millipore, Amerika Serikat); LC-20Kromatografi Fase cair efisiensi tinggi (Perusahaan Shimadzu, Jepang); Spektrometri massa resolusi tinggi UPLC-Q-Exactive-Orbitrap (Thermo Fisher Company, AS); Mikroskop confocal laser FV1200 (Perusahaan Olympus, Jepang).
2 Metode eksperimental
2.1 Ekstraksi RNA dan sintesis cDNA.
Bunga Cistanche tubulosa digiling dalam nitrogen cair dan kemudian dilakukan uji ekstraksi RNA.
Total RNA diekstraksi menggunakan kit (Norgen, Cat 17200), konsentrasi dan kualitas RNA dideteksi oleh NanoDrop 2000C, dan sampel RNA dengan rasio A260/A280 antara 1,8 dan 2,1 dipilih untuk transkripsi terbalik guna mensintesis cDNA. Transkriptase balik M-MLV (Promega, M170B) digunakan untuk mentranskripsikan balik total RNA yang memenuhi syarat menjadi cDNA. Operasi eksperimental dilakukan sesuai dengan instruksi.
2.2 Kloning gen CtCHS
Berdasarkan data transkriptom bunga Cistanche tubulosa dari kelompok penelitian kami (16), CtCHS dengan kerangka pembacaan terbuka lengkap disaring, dan perangkat lunak SnapGene digunakan untuk merancang primer spesifik berdasarkan urutan gen (Tabel 1). Amplifikasi PCR dilakukan dengan menggunakan cDNA bunga Cistanche tubulosa sebagai template. Sistem amplifikasi yang digunakan adalah 2×Phanta Max Buffer 25 μL, dNTPMix (10 mmol/L) 1 μL, primer hulu dan hilir (10 μmol/L) masing-masing 2 μL, cDNA 2 μL, Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1 μL, ddH2O 17 μL. Kondisi reaksinya adalah: pra-denaturasi pada suhu 95 derajat selama 3 menit; 25 siklus denaturasi pada 95 derajat selama 15 detik, anil pada 55 derajat selama 15 detik, dan ekstensi pada 72 derajat selama 1 menit; ekstensi reaksi pada 72 derajat selama 5 menit. Produk PCR dideteksi dengan elektroforesis gel agarosa 1%, dan kit pemurnian DNA (Novizan, Cat DC301-01) digunakan untuk pemulihan gel, dan kemudian DNA yang diperoleh dimurnikan dengan kit kloning cepat (Novizan, Cat C601-01). Fragmen DNA diikat dengan vektor pCE2TA/Blunt-Zero, diubah menjadi sel kompeten Escherichia coli DH5, dan setelah dikultur semalaman pada suhu 37 derajat, strain klon tunggal dipilih dan dikirim ke perusahaan untuk diurutkan.
Tabel 1 Urutan primer
2.3 Analisis bioinformatika
Gunakan perangkat lunak online ProtParam untuk menganalisis sifat fisik dan kimia protein; menggunakan alat online Prot Scale untuk menganalisis hidrofilisitas/hidrofobisitas protein; menggunakan alat online SOPMA untuk memprediksi struktur sekunder protein; menggunakan perangkat lunak analisis online SWISS-MODEL untuk memprediksi struktur tersier protein; gunakan perangkat lunak online TMHMM Memprediksi struktur transmembran protein; menggunakan perangkat lunak DNAMAN untuk membandingkan homologi CtCHS dengan rangkaian asam amino CHS spesies lain; menggunakan software MEGA-X untuk membuat pohon filogenetik, menggunakan neighbour-joining (NJ) dan koreksi Poisson. Jarak evolusi dihitung menggunakan metode Bootstrap, dan jumlah pengulangan Bootstrap adalah 1000 kali.
2.4 Ekspresi dan pemurnian prokariotik CtCHS
Rancang primer dengan situs restriksi BamHⅠ dan XhoⅠ berdasarkan urutan CtCHS, dan PCR memperkuat fragmen target yang sesuai. Vektor pET-28a dan fragmen target dicerna menggunakan endonuklease BamHI dan Strain hasil kloning diurutkan, dan plasmid diekstraksi setelah pengurutan yang benar. Plasmid pET-28a-CtCHS yang diverifikasi melalui pengurutan dipindahkan ke sel kompeten Escherichia coli BL21 (DE3). Lihat metode Ding Ning dkk. [17] dengan isopropil
-D-thiogalactopyranoside (IPTG) digunakan untuk menginduksi ekspresi protein pada suhu rendah dan dimurnikan melalui kolom kromatografi afinitas Ni2+ (Cytiva, Cat 17531901). Protein dipekatkan dengan sentrifugasi dalam tabung ultrafiltrasi (Millipore, 30 000) dan dihilangkan garamnya. Simpan dalam buffer KPB 20 mmol/L (pH 8,0, mengandung 1 mmol/LEDTA) dan simpan dalam lemari es −80 derajat untuk penyimpanan jangka panjang.
2.5 Analisis aktivitas enzim CtCHS
Sistem reaksi enzim CtCHS: 100 mmol/L KPB (pH 7,5) 468 μL, 1 mmol/L malonyl-CoA 10 μL, 5 mmol/L 4-coumaroyl-CoA 2 μL, CtCHS rekombinan protein 20 μL, in Setelah direaksikan dalam penangas air pada suhu 37 derajat selama 12 jam, campuran diekstraksi tiga kali dengan 800 μL etil asetat, dikeringkan dengan aliran nitrogen, dan kemudian dilarutkan dalam 100 μL metanol. Gunakan kromatografi cair kinerja tinggi untuk mendeteksi produk. Kondisinya adalah kolom Ultimate LP-C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm), suhu kolom 30 derajat, volume sampel 10 μL, dan air (A) dan asetonitril (B) sebagai aliran. Fase, gradien elusi: 0~10
min, 30% B; 10~20 menit, 30%~60%B; 20~25 menit, 60%~70%B; 25~30 menit, 70%~80%B; 30~35 menit, 80%~100 %B; 35-40 menit, 100% B; 40-46 mnt, 100%-30% B. Laju aliran volumetrik adalah 1 mL/menit dan deteksi dilakukan pada panjang gelombang 290 nm.
UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS digunakan untuk deteksi lebih lanjut. Kondisi fase cair adalah kolom Waters Acquity UPLC BEH SheildRP18 (100 mm × 3.0 mm, 1,7 μm), suhu kolom 40 derajat, naringenin- kontrol chalcone dan naringenin. Volume pemuatan produk adalah 4 μL, dan volume pemuatan produk reaksi enzim adalah 7 μL. Air (A)-asetonitril (B) digunakan sebagai fase gerak. Gradien elusi adalah: 0 hingga 5 menit, 30% B; 5 hingga 15 menit, 30 %-60% B; 15-20 mnt, 60%-100%B; 20-25 menit, 100%B; 25-31 mnt, 100%-30% B. Laju aliran volumetrik adalah 0,3 mL/menit. Kondisi spektrometri massa adalah sumber ion elektrospray, nitrogen sebagai gas pembawa, tekanan gas selubung 3,5 MPa, tekanan gas tambahan 1,0 MPa, tekanan semprot 3500 V, suhu kapiler 350 derajat, suhu pemanasan gas tambahan 200 derajat, mode ion positif dan negatif, pemindaian rentang ion m/z adalah 100-1500, resolusi MS penuh adalah 35 000, resolusi dd-MS2 adalah 17 500, (N)
CE/melangkah setelah disetel ke 35, 60.
2.3 Analisis bioinformatika
Gunakan perangkat lunak online ProtParam untuk menganalisis sifat fisik dan kimia protein; menggunakan alat online Prot Scale untuk menganalisis hidrofilisitas/hidrofobisitas protein; menggunakan alat online SOPMA untuk memprediksi struktur sekunder protein; menggunakan perangkat lunak analisis online SWISS-MODEL untuk memprediksi struktur tersier protein; gunakan perangkat lunak online TMHMM Memprediksi struktur transmembran protein; menggunakan perangkat lunak DNAMAN untuk membandingkan homologi CtCHS dengan rangkaian asam amino CHS spesies lain; menggunakan software MEGA-X untuk membuat pohon filogenetik, menggunakan neighbour-joining (NJ) dan koreksi Poisson. Jarak evolusi dihitung menggunakan metode Bootstrap, dan jumlah pengulangan Bootstrap adalah 1000 kali.
2.4 Ekspresi dan pemurnian prokariotik CtCHS
Rancang primer dengan situs restriksi BamHⅠ dan XhoⅠ berdasarkan urutan CtCHS, dan PCR memperkuat fragmen target yang sesuai. Vektor pET-28a dan fragmen target dicerna menggunakan endonuklease BamHI dan Strain hasil kloning diurutkan, dan plasmid diekstraksi setelah pengurutan yang benar. Plasmid pET-28a-CtCHS yang diverifikasi melalui pengurutan dipindahkan ke sel kompeten Escherichia coli BL21 (DE3). Lihat metode Ding Ning dkk. [17] dengan isopropil
-D-thiogalactopyranoside (IPTG) digunakan untuk menginduksi ekspresi protein pada suhu rendah dan dimurnikan melalui kolom kromatografi afinitas Ni2+ (Cytiva, Cat 17531901). Protein dipekatkan dengan sentrifugasi dalam tabung ultrafiltrasi (Millipore, 30 000) dan dihilangkan garamnya. Simpan dalam buffer KPB 20 mmol/L (pH 8,0, mengandung 1 mmol/LEDTA) dan simpan dalam lemari es −80 derajat untuk penyimpanan jangka panjang.
2.5 Analisis aktivitas enzim CtCHS
Sistem reaksi enzim CtCHS: 100 mmol/L KPB (pH 7,5) 468 μL, 1 mmol/L malonyl-CoA 10 μL, 5 mmol/L 4-coumaroyl-CoA 2 μL, CtCHS rekombinan protein 20 μL, in Setelah direaksikan dalam penangas air pada suhu 37 derajat selama 12 jam, campuran diekstraksi tiga kali dengan 800 μL etil asetat, dikeringkan dengan aliran nitrogen, dan kemudian dilarutkan dalam 100 μL metanol. Gunakan kromatografi cair kinerja tinggi untuk mendeteksi produk. Kondisinya adalah kolom Ultimate LP-C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm), suhu kolom 30 derajat, volume sampel 10 μL, dan air (A) dan asetonitril (B) sebagai aliran. Fase, gradien elusi: 0~10
min, 30% B; 10~20 menit, 30%~60%B; 20~25 menit, 60%~70%B; 25~30 menit, 70%~80%B; 30~35 menit, 80%~100 %B; 35-40 menit, 100% B; 40-46 mnt, 100%-30% B. Laju aliran volumetrik adalah 1 mL/menit dan deteksi dilakukan pada panjang gelombang 290 nm.
UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS digunakan untuk deteksi lebih lanjut. Kondisi fase cair adalah kolom Waters Acquity UPLC BEH SheildRP18 (100 mm × 3.0 mm, 1,7 μm), suhu kolom 40 derajat, naringenin- kontrol chalcone dan naringenin. Volume pemuatan produk adalah 4 μL, dan volume pemuatan produk reaksi enzim adalah 7 μL. Air (A)-asetonitril (B) digunakan sebagai fase gerak. Gradien elusi adalah: 0 hingga 5 menit, 30% B; 5 hingga 15 menit, 30 %-60% B; 15-20 mnt, 60%-100%B; 20-25 menit, 100%B; 25-31 mnt, 100%-30% B. Laju aliran volumetrik adalah 0,3 mL/menit. Kondisi spektrometri massa adalah sumber ion elektrospray, nitrogen sebagai gas pembawa, tekanan gas selubung 3,5 MPa, tekanan gas tambahan 1,0 MPa, tekanan semprot 3500 V, suhu kapiler 350 derajat, suhu pemanasan gas tambahan 200 derajat, mode ion positif dan negatif, pemindaian rentang ion m/z adalah 100-1500, resolusi MS penuh adalah 35 000, resolusi dd-MS2 adalah 17 500, (N)
CE/melangkah setelah disetel ke 35, 60.
2.6 Lokalisasi subseluler protein CtCHS
Berdasarkan urutan CtCHS dan prinsip kloning mulus, primer dengan situs pemotongan enzim Kpn Ⅰ dan BamH Ⅰ dirancang, dan fragmen target yang sesuai diamplifikasi dengan PCR. Plasmid pCAMBIA1300-35S-GFP dicerna dengan endonuklease restriksi Kpn Ⅰ dan BamH Ⅰ, dan fragmen target serta vektor dihubungkan melalui kit kloning yang mulus (Novizan, Cat C115-01), dan kemudian ditransfer menjadi sel kompeten E. coli DH5. , pilih strain klon tunggal untuk diurutkan, dan ekstrak plasmid dari strain yang benar. Plasmid pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS dan pCAMBIA 1300-35S-GFP diubah menjadi protoplas Arabidopsis thaliana menggunakan PEG4000, dan dikultur dalam cahaya redup selama 8 hingga 10 jam. Lokalisasi subseluler protein CtCHS diamati di bawah mikroskop confocal laser.
2.7 Analisis pola ekspresi CtCHS
Primer kuantitatif fluoresen waktu nyata dirancang menggunakan DNAMAN berdasarkan urutan CtCHS, dengan F-box sebagai gen referensi internal. Urutan primer ditunjukkan pada Tabel 1. Ekspresi relatif CtCHS pada bunga Cistanche tubulosa dengan warna berbeda dideteksi dengan PCR kuantitatif fluoresen waktu nyata. Gunakan TransStart Green qPCR SuperMix (emas penuh, AQ101-02) untuk mengukur dengan metode pewarna fluoresen SYBRGreen. Sistem reaksi: 2×TransStartGreen qPCR SuperMix 5 μL, primer hulu dan hilir (10 μmol/L) 0masing-masing 2 μL, templat cDNA 0,5 μL, 4,1 μL air bebas nukleotidase digunakan untuk reaksi menggunakan metode dua langkah. Prosedur reaksi didasarkan pada metode Dong Xianjuan et al. [18]. Setiap sampel berisi 3 ulangan biologis, dan percobaan diulangi tiga kali. Data eksperimen dianalisis menggunakan Excel, ekspresi relatif CtCHS dihitung menggunakan metode 2−ΔΔCt, dan GraphPadPrism 8 digunakan untuk melakukan analisis signifikansi dan menggambar histogram.
