Clec12a Meredakan Peradangan Sambil Membatasi Perluasan Kolitogenik Komensal
Dec 29, 2023
RINGKASAN
Regulasi mikrobiota sangat penting untuk kesehatan usus namun mekanisme yang digunakan oleh imunitas bawaan masih belum jelas. Di sini kami menunjukkan bahwa tikus yang kekurangan reseptor C-Type-lectin, Clec12a mengembangkan kolitis parah, yang bergantung pada mikrobiota. Studi transplantasi mikrobiota tinja (FMT) pada tikus bebas kuman mengungkapkan mikrobiota kolitogenik yang terbentuk di dalam tikus Clec12a-/- yang ditandai dengan perluasan organisme gram positif, hewan pengerat Faecalibaculum. Pengobatan dengan F. rodentium cukup untuk memperburuk kolitis pada tikus tipe liar. Makrofag di dalam usus mengekspresikan tingkat Clec12a tertinggi. Analisis sitokin dan sekuensing pada makrofag Clec12a-/- menunjukkan peningkatan peradangan tetapi penurunan nyata pada gen yang terkait dengan fagositosis. Memang benar, makrofag Clec12a-/- mengalami gangguan dalam kemampuannya menyerap F. rodentium. Clec12a yang dimurnikan memiliki ikatan yang lebih tinggi dengan organisme Gram positif seperti F. rodentium. Dengan demikian, data kami mengidentifikasi Clec12a sebagai mekanisme pengawasan kekebalan bawaan untuk mengendalikan perluasan komensal yang berpotensi berbahaya tanpa peradangan yang nyata.
manfaat cistanche untuk pria-memperkuat sistem kekebalan tubuh
PERKENALAN
Komposisi dan fungsi mikrobiota dapat berdampak besar terhadap kesehatan dan penyakit mamalia (Fassarella et al., 2021). Hal ini telah terdokumentasi dengan baik untuk penyakit radang usus (IBD), di mana sebagian besar model IBD tikus sensitif terhadap perubahan komposisi mikrobiota (Gkouskou et al., 2014). Memahami faktor-faktor yang mempengaruhi dan menentukan stabilitas mikrobiota akan menjadi penting seiring dengan dikembangkannya terapi berbasis mikrobiota (Sharma et al., 2020; Sorbara dan Pamer, 2022). Mikrobiota dipengaruhi oleh berbagai parameter termasuk pola makan, obat-obatan, dan sistem kekebalan. Dalam beberapa tahun terakhir, komponen imun adaptif, terutama IgA, telah terbukti mempengaruhi komposisi mikrobiota (Nakajima et al., 2018; Okai et al., 2016; Yang dan Palm, 2020). Namun, masih sedikit yang diketahui tentang bagaimana reseptor imun bawaan spesifik mempengaruhi komposisi mikrobiota homeostatis.
Polimorfisme genetik pada gen yang mengatur pengenalan mikroba dan imunitas mukosa merupakan alel risiko yang signifikan untuk IBD, termasuk protein autophagy ATG16L1 (Cadwell et al., 2008; Liu et al., 2015; Rioux et al., 2007; Wellcome Trust Case Control, 2007 ). Dalam penelitian baru-baru ini yang mengeksplorasi perubahan ekspresi gen myeloid pada individu dengan polimorfisme ATG16L1T300A, penghambat reseptor lektin tipe C (CLR), Clec12a, diidentifikasi secara signifikan ditekan dalam sel-sel ini (Begun et al., 2015). Penelitian yang sama menunjukkan bahwa Clec12a berfungsi dalam pertahanan infeksi patogen melalui hubungan dengan jalur autophagy. Data ini menunjukkan bahwa penurunan regulasi Clec12a pada individu dengan IBD mungkin memengaruhi tingkat keparahan dan/atau perkembangan penyakit. Meskipun ada bukti ini, sedikit yang diketahui tentang mekanisme pengaturan kekebalan yang dilakukan oleh Clec12a selama kolitis.
Lektin tipe C adalah kelompok beragam molekul larut atau terikat membran yang mampu mengikat lipid, protein, dan karbohidrat yang berasal dari inang atau mikroba (Brown et al., 2018). Mincle (Clec4e) dan Dectin-1 (Clec7a) adalah dua CLR yang memengaruhi anggota mikrobiota tertentu untuk mempertahankan homeostasis usus (Iliev et al., 2012; Martinez-Lopez et al., 2019). Namun, dengan lebih dari 1,{12}} lektin tipe C yang berbeda, masih banyak yang harus ditemukan dalam kelompok protein ini. Clec12a termasuk dalam keluarga reseptor pembunuh alami dan merupakan salah satu dari hanya dua lektin tipe C yang mengandung motif penghambatan imuno-tirosin (ITIM) yang mampu membatasi jalur sinyal inflamasi (Brown et al., 2018; Marshall et al., 2004) . Clec12a mengenali asam urat yang merupakan sinyal kerusakan sel (Neumann et al., 2014). Clec12a paling banyak diekspresikan dalam sel imun bawaan, dan dalam neutrofil ia bertindak untuk mengurangi aktivasi dan menurunkan regulasi produksi sitokin inflamasi setelah pengenalan asam urat (Neumann et al., 2014). Sebaliknya, Clec12a mendorong peradangan dengan memungkinkan transmigrasi fagosit mono-nuklir (MNPs) melintasi sawar darah-otak selama model autoimun multiple sclerosis dan mempotensiasi sinyal interferon tipe I sebagai respons terhadap infeksi virus (Li et al., 2019; Sagar et al. ., 2017). Clec12a juga mampu mengenali produk plasmodial, hemozoin, yang telah terbukti meningkatkan sel T CD8+ di otak setelah infeksi Plasmodium (Raulf et al., 2019). Dengan demikian, Clec12a mewakili CLR promiscuous dengan berbagai peran dalam imunitas dan kemampuan sinyal yang unik, namun perannya dalam usus masih belum diketahui.
cistanche tubulosa-meningkatkan sistem kekebalan tubuh
Kami sebelumnya telah menunjukkan bahwa jamur usus tertentu memperburuk kolitis dengan menginduksi metabolit purin, asam urat (Chiaro et al., 2017). Selain itu, metabolisme purin baru-baru ini dikaitkan dengan penyakit usus manusia (Zhu et al., 2019). Data ini secara kolektif menunjukkan bahwa deteksi asam urat mungkin relevan dengan IBD. Berdasarkan hal ini, kami mulai mengeksplorasi fungsi Clec12a di usus. Kami menemukan bahwa hewan yang kekurangan Clec12a sangat rentan terhadap kolitis yang bergantung pada komposisi mikrobiota yang terbentuk tanpa adanya Clec12a. FMT mikrobiota Clec12a-/- menjadi hewan bebas kuman WT cukup untuk memperburuk kolitis dan pembentukan mikrobiota kolitogenik pada hewan Clec12a-/- tidak tergantung pada imunitas adaptif. Untuk mengidentifikasi mikroba relevan yang mungkin memperburuk kolitis, hewan Clec12a-/- diobati dengan berbagai antibiotik, dan antibiotik yang menargetkan bakteri gram positif dapat memperbaiki penyakit. Urutan 16S rDNA mengidentifikasi Faecalibaculum rodentium secara signifikan lebih melimpah pada hewan Clec12a-/- dan oral gavage F. rodentium cukup untuk memperburuk patologi penyakit pada hewan WT. Profil kekebalan hewan Clec12a-/- menunjukkan penurunan yang nyata dalam sel myeloid homeostatis di usus besar. Urutan RNA makrofag yang diobati dengan F. rodentium mengungkapkan bahwa Clec12a mendorong fagositosis. Karena Clec12a telah terbukti mengikat banyak ligan, kami bertanya apakah Clec12a akan mengikat beragam anggota mikrobiota. Dengan menggunakan protein fusi Clec12a-Fc, kami mengidentifikasi bahwa Clec12a berikatan paling tinggi dengan anggota mikrobiota gram positif. Secara kolektif, data ini menunjukkan model di mana Clec12a mengontrol anggota mikrobiota kolitogenik melalui pengikatan langsung dan fagositosis sekaligus mencegah respons inflamasi. Dalam skenario di mana ekspresi Clec12a berkurang, patobion gram positif dapat meluas dan memicu peradangan. Oleh karena itu, penelitian kami mengidentifikasi Clec12a sebagai penekan inflamasi yang penting untuk memastikan homeostasis dan pemeliharaan mikrobiota yang sehat.
HASIL
Hewan Clec12a-/- sangat rentan terhadap kolitis terlepas dari sistem kekebalan adaptif
Penurunan ekspresi Clec12a telah dilaporkan pada individu dengan IBD dan kami telah menunjukkan bahwa memblokir produksi salah satu ligan untuk Clec12a, asam urat, dapat memperbaiki kolitis (Begun et al., 2015; Chiaro et al., 2017; Liu et al. ., 2015). Namun, Clec12a belum diteliti pada model hewan kolitis. Untuk tujuan ini, tikus WT dan Clec12a-/- C57BL/6 ditantang dengan kolitis DSS akut. Hewan Clec12a-/- mengalami penurunan berat badan yang jauh lebih banyak, menunjukkan titik dua yang lebih pendek, dan mengalami peningkatan penanda inflamasi LCN2 yang signifikan dalam tinja jika dibandingkan dengan hewan WT, yang menunjukkan memburuknya peradangan dan penyakit (Gambar 1A-C). Mendukung hal ini, analisis histologis menunjukkan peningkatan kerusakan epitel, kehilangan ruang bawah tanah, dan masuknya sel imun pada hewan Clec12a-/- dibandingkan dengan WT (Gambar 1D, E). Konsisten dengan hasil model kolitis DSS, transfer sel CD4+ CD45RBhi ke TCRb-/-; Tikus knockout ganda Clec12a-/- menyebabkan penambahan berat badan yang lebih sedikit dari waktu ke waktu dan titik dua yang lebih pendek jika dibandingkan dengan sel T yang ditransfer ke tikus TCRb-/- (Gambar 1F, G). Secara kolektif, hasil ini menunjukkan bahwa hilangnya Clec12a menyebabkan penyakit usus yang memburuk.
Clec12a dilaporkan sebagian besar diekspresikan dalam sel imun bawaan dengan ekspresi sangat rendah dilaporkan dalam sel T CD8+. Oleh karena itu, untuk menentukan apakah imunitas adaptif terlibat dalam memburuknya penyakit yang diamati pada hewan Clec12a-/-, hewan Clec12a-/- disilangkan dengan hewan Rag-/- untuk menghilangkan sel T dan B. Sekali lagi, hewan Clec12a-/- mengembangkan penyakit yang lebih buruk jika dibandingkan dengan hewan WT karena mereka kehilangan lebih banyak berat badan dan memiliki usus yang lebih pendek dibandingkan kontrol WT (Gambar 1H, I). Demikian pula, Clec12a-/-; Rag-/- mengembangkan penyakit usus yang lebih buruk jika dibandingkan dengan kontrol Rag-/- dan kehilangan banyak berat badan serta memiliki usus besar yang lebih pendek dibandingkan WT dan Rag-/- seperti Clec12a-/- (Gambar 1H, I). Kami sebelumnya telah melaporkan bahwa pengobatan oral dengan S. cerevisiae meningkatkan kadar asam urat sehingga memperburuk kolitis. Namun, tidak ada perbedaan yang diamati pada kadar asam urat serum atau feses pada hewan WT versus Clec12a-/-, menunjukkan bahwa peningkatan penyakit yang diamati pada Clec12A-/- bukanlah akibat dari peningkatan asam urat (Gbr. S1). Dengan demikian, perkembangan kolitis yang memburuk yang diamati pada hewan Clec12a-/- tidak bergantung pada sistem kekebalan adaptif.
cistanche tubulosa-meningkatkan sistem kekebalan tubuh
Klik di sini untuk melihat produk Cistanche Meningkatkan Imunitas
【Minta lebih lanjut】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Aplikasi WhatsApp: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Kolitis yang memburuk pada hewan Clec12a-/- bergantung pada mikrobiota
Kolitis diketahui sebagian disebabkan oleh perubahan komposisi mikrobiota (Kubinak et al., 2015; Ray dan Dittel, 2015). Untuk menentukan apakah hewan Clec12a-/- mengandung mikrobiota yang menyebabkan kolitis memburuk, FMT dilakukan dari tikus WT atau Clec12a-/- menjadi hewan WT bebas kuman. Empat minggu setelah transplantasi, separuh dari hewan-hewan tersebut ditempatkan bersama-sama, sementara separuh lainnya tetap ditempatkan secara terpisah. Kolitis DSS akut kemudian diinduksi pada masing-masing kelompok (Gambar 2A). Hewan yang menerima Clec12a-/- FMT dan hewan yang dipelihara bersama mengalami penurunan berat badan yang jauh lebih banyak (Gambar 2B) dan memiliki titik dua yang jauh lebih pendek (Gambar 2C) dibandingkan hewan yang menerima FMT dari tikus WT. Lebih lanjut, analisis histologis menunjukkan kerusakan epitel yang lebih besar dan masuknya inflamasi setelah transplantasi dengan mikrobiota Clec12a-/- (Gambar 2D, E). Komunitas mikroba yang terbentuk berbeda di antara kelompok-kelompok sebagaimana ditentukan oleh sekuensing gen 16S rRNA menggunakan Bray-Curtis (PERMANOVA, p=0.0001), tidak berbobot (PERMANOVA, p=0.0062), dan berbobot- Jarak unifrac (PERMANOVA, p=0.0001). Ketidaksamaan mikrobiota dalam kelompok paling besar terjadi pada hewan yang dipelihara bersama dengan metrik yang sama yang menunjukkan perolehan mikroba dari setiap genotipe FMT (Gambar 2 FH). Data ini menunjukkan bahwa kolitis yang memburuk pada hewan Clec12a-/- didorong oleh mikroba tertentu yang diperkaya tanpa adanya Clec12a; dan mikroba ini menjadi pendorong dominan fenotip kolitogenik, bahkan dengan adanya mikrobiota WT yang sudah mapan.
Komposisi mikrobiota yang terbentuk pada hewan Clec12a-/- tidak bergantung pada imunitas adaptif
Sistem kekebalan tubuh penting untuk menentukan komposisi mikrobiota. Eksperimen FMT menunjukkan bahwa Clec12a-/- menyebabkan perubahan komposisi mikrobiota yang memperburuk perkembangan kolitis. Kami pertama-tama ingin menentukan apakah defisiensi Clec12a-/- dalam kompartemen imun mampu membentuk kembali mikrobiota usus. Untuk tujuan ini, sumsum tulang dari tikus WT atau Clec12a-/- dipindahkan ke tikus penerima WT SPF yang diiradiasi secara mematikan untuk menstandarisasi mikrobiota yang diikuti dengan periode pemulihan kekebalan selama 8-minggu (Gambar 3A). Selama masa ini, sistem kekebalan yang ditransplantasikan memiliki waktu untuk berkembang di dalam tubuh penerima, sehingga membentuk komposisi mikrobiota yang berbeda-beda. Untuk menentukan apakah perubahan prokolitogenik pada mikrobiota dihasilkan dari pembentukan kekebalan ini, kami melakukan FMT menggunakan kotoran dari tikus WT atau Clec12a-/- chimeric dan menginduksi kolitis DSS (Gambar 3A). Meskipun tidak ada perubahan signifikan dalam penurunan berat badan (Gambar 3B), titik dua dari hewan yang menerima FMT dari tikus Clec12a-/- chimeric secara signifikan lebih pendek bila dibandingkan dengan hewan yang menerima FMT dari tikus WT (Gambar 3C), yang menunjukkan penyakit yang memburuk. Selain itu, ketika penerima WT dan Clec12a-/- FMT ditempatkan bersama, titik dua secara signifikan lebih pendek jika dibandingkan dengan hewan yang menerima WT FMT (Gambar 3C). Dengan demikian, defisiensi Clec12a-/- dalam kompartemen hematopoietik menyebabkan pembentukan mikrobiota kolitogenik yang dominan.
Untuk lebih mendukung bahwa sistem kekebalan adaptif dapat digunakan untuk pembentukan mikrobiota kolitogenik pada hewan Clec12a-/-, kami melakukan FMT menggunakan kotoran dari Rag-/- atau Rag-/-; Clec12a-/- - seperti dijelaskan sebelumnya. Hewan yang menerima Rag-/-; Clec12a-/- FMT kehilangan lebih banyak berat badan dan memiliki usus yang jauh lebih pendek dibandingkan hewan yang menerima FMT dari hewan Rag-/-, terlebih lagi hewan yang dipelihara bersama juga mengalami penyakit yang lebih buruk (Gambar 3D, E). Data ini menunjukkan bahwa kekurangan Clec12a dalam sistem kekebalan bawaan cukup untuk menyebabkan pembentukan mikrobiota yang mampu memperburuk kolitis.
Clec12a menekan perluasan rodentium Faecalibaculum
Kami menggunakan serangkaian antibiotik berbeda untuk mengidentifikasi organisme relevan yang mendorong penyakit pada hewan Clec12a-/-. Pertama, pengobatan dengan kombinasi antibiotik spektrum luas yang mencakup eritromisin, ampisilin, neomisin, dan gentamisin, secara signifikan mengurangi keparahan penyakit pada hewan Clec12a-/- dan WT, menunjukkan bahwa populasi bakteri dalam mikrobiota relevan dengan penyakit ( Gambar 4A;Gambar S2). Selanjutnya, kami mempersempit populasi bakteri mana yang paling relevan dengan penyakit dengan menggunakan antibiotik berbeda yang menargetkan taksa bakteri unik. Secara khusus, kami memilih gentamisin, suatu aminoglikosida yang menargetkan bakteri gram negatif, dan sefalotin, suatu sefalosporin yang terutama menargetkan bakteri gram positif. Obat-obatan ini diberikan kepada hewan Clec12a-/- selama kolitis DSS. Meskipun pengobatan dengan gentamisin tidak memberikan perbedaan dalam tingkat keparahan penyakit, hewan yang menerima sefalotin mempertahankan berat badannya dan memiliki usus yang jauh lebih panjang dibandingkan hewan yang diberi perlakuan tiruan (Gambar 4B, C), yang menunjukkan bahwa organisme gram positif yang berada dalam mikrobiota Clec12a-/- berperan penting dalam hal ini. peran penting dalam memperburuk patologi penyakit.
Kami selanjutnya melakukan pengurutan gen 16S rRNA dari SPF WT dan Clec12a-/- feses untuk membuat profil perubahan komposisi mikrobiota. Hewan WT dan Clec12a-/- dikelompokkan secara berbeda secara signifikan berdasarkan metrik tertimbang kelimpahan non-filogenetik dan filogenetik, masing-masing Bray-Curtis dan tertimbang-UniFrac (Gambar S3A-C). Metrik keanekaragaman alfa menunjukkan tidak ada perbedaan kekayaan yang signifikan (fitur yang diamati), yang menunjukkan bahwa Clec12a-/- tidak menampung lebih banyak spesies (Gambar 4D). Namun, indeks kemerataan dan keanekaragaman Shannon meningkat dengan tidak adanya Clec12a yang menunjukkan bahwa distribusi proporsional bakteri pada tikus Clec12a-/- telah diubah (Gambar 4E, F) dan selanjutnya mendukung bahwa Clec12a penting untuk mengatur struktur mikrobiota di dalam usus.
Analisis komposisi mikrobioma (ANCOM) mengungkapkan bahwa, di antara ASV (varian urutan amplikon) yang melimpah secara berbeda, ASV yang diklasifikasikan dalam genus Faecalibaculum (keluarga Erysipelotrichaceae), secara signifikan diperluas dalam tinja Clec12a-/- dibandingkan dengan WT (Gambar 4G, H). BLAST menggunakan urutan perwakilan ASV dari analisis kami menunjukkan identitas 100% terhadap urutan dari bakteri Faecalibaculum rodentium. Data ini memberikan bukti bahwa bakteri gram positif pada hewan Clec12a-/- bertanggung jawab atas fenotip kolitogenik, dan secara khusus mengimplikasikan organisme gram positif, F. rodentium, dalam memperburuk penyakit.
Berdasarkan hal ini, kami menguji hipotesis bahwa F. rodentium dapat memperburuk kolitis. Kami melakukan pra-perawatan pada hewan WT SPF dengan 1 x 108 CFU baik F. rodentium hidup atau tetap dengan gavage oral dan melanjutkan perawatan setiap hari selama model DSS akut untuk memastikan tingkat kolonisasi F. rodentium yang tinggi. Hewan yang menerima F. rodentium hidup dan tetap mengalami penurunan berat badan lebih banyak dan memiliki usus besar yang jauh lebih pendek dibandingkan hewan yang diobati dengan kendaraan (Gambar 4I, J), yang menunjukkan bahwa peningkatan kadar F. rodentium dapat memperburuk penyakit.
Clec12a membatasi respon inflamasi makrofag sekaligus meningkatkan fagositosis
Untuk menentukan ekspresi seluler Clec12a tanpa adanya penyakit, kami membuat profil sel imun bawaan dan adaptif dalam lamina propria (LP) menggunakan sitometri aliran multi-warna. Konsisten dengan laporan sebelumnya, Clec12a sebagian besar terbatas pada garis keturunan myeloid dengan sedikit atau tanpa ekspresi pada limfosit (Gambar 5A) (Han et al., 2004; Pyz et al., 2008; Sobanov et al., 2001). Neutrofil usus, makrofag, dan sel dendritik menunjukkan tingkat ekspresi Clec12a yang serupa (Gambar S4A), sedangkan makrofag memiliki persentase sel terbesar dalam jaringan usus yang mengekspresikan Clec12a (Gambar 5A). Mengingat peran ganda makrofag untuk meningkatkan peradangan melalui aktivasi klasik tetapi juga untuk memulai mekanisme reparatif sebagai respons terhadap kerusakan jaringan, kami bertanya bagaimana Clec12a dapat mempengaruhi dikotomi ini selama kolitis. Meskipun makrofag cukup beragam, makrofag secara umum dapat dibagi menjadi makrofag inflamasi M1 dan makrofag reparatif M2 berdasarkan ekspresi CD38 dan EGR2. Kami menunjukkan hewan Clec12a-/- mengalami peningkatan makrofag M1 dan penurunan makrofag M2 di LP kolon selama kolitis (Gambar 5 B, C, Gambar. S4B). Data ini menunjukkan bahwa Clec12a mengatur respons makrofag di usus.
Untuk lebih memahami bagaimana Clec12a mempengaruhi biologi makrofag dalam menanggapi ligan mikroba, makrofag yang berasal dari sumsum tulang (BMDM) yang diisolasi dari hewan WT atau Clec12a-/- diobati dengan berbagai ligan mikroba umum termasuk LPS, Pam3CysK, dan Flagellin. Analisis sitokin dilakukan pada semua sampel ini. Banyak sitokin yang diuji tidak diinduksi dalam kondisi ini, namun, MCP-1, IL-27, IFN-b, TNF-a, dan IL-6 secara konsisten terdeteksi dalam kultur ini ( Gambar 5D). Clec12a-/- BMDM memiliki ekspresi sitokin yang jauh lebih tinggi sebagai respons terhadap banyak ligan mikroba dan respons diferensial terbesar terlihat pada respons terhadap agonis TLR2 Pam3CysK. Data ini konsisten dengan peran Clec12a yang diketahui dalam meredam respons inflamasi selama inflamasi steril (Neumann et al., 2014).
tanaman cistanche meningkatkan sistem kekebalan tubuh
RNA-seq dilakukan pada BMDM dari WT atau Clec12a-/- yang diobati dengan F. rodentium untuk menentukan bagaimana Clec12a mengatur respons sel-sel ini terhadap organisme bakteri spesifik ini. Kami menilai respons diferensial dengan membandingkan Clec12a-/- BMDM yang terpapar F. rodentium pada kontrol kendaraan dengan BMDM WT. Analisis pengayaan gen yang diekspresikan secara berbeda menunjukkan bahwa makrofag yang kekurangan Clec12a mengalami peningkatan signifikan pada gen yang terlibat dalam kontrol siklus sel ketika ditantang dengan F. rodentium (Gambar S5A). Siklus sel secara intrinsik terkait dengan fagositosis dan terdapat juga penurunan signifikan pada gen yang terkait dengan fagositosis dan respons inflamasi (Gambar 5E) (Luo et al., 2005). Konsisten dengan penelitian terbaru tentang Clec12a dan Salmonella, data ini menunjukkan bahwa fagositosis menjadi rusak karena tidak adanya Clec12a sebagai respons terhadap F. rodentium yang tinggal di usus normal (Begun et al., 2015). Untuk mengujinya, makrofag peritoneum dikumpulkan dari hewan WT dan Clec12a-/- dan dikultur bersama dengan Sybr®-green berlabel F. rodentium. Makrofag Clec12a-/- memiliki mikroba per sel yang jauh lebih sedikit (Gambar 5F, G; Gambar S5B), menunjukkan bahwa defisiensi Clec12a menyebabkan penyerapan organisme lebih sedikit dan konsisten dengan berkurangnya fagositosis dalam kumpulan data RNA-seq. Secara kolektif, data ini menunjukkan bahwa Clec12a memainkan peran ganda dalam mengurangi respons inflamasi terhadap ligan mikroba umum sekaligus meningkatkan serapan bakteri makrofag.
Clec12a lebih disukai berikatan dengan komensal gram positif
Karena fagositosis dimulai dengan pengikatan mikroba yang diikuti dengan internalisasi dan pembunuhan, kami berhipotesis bahwa Clec12a mampu mengikat anggota mikrobiota tertentu, seperti F. rodentium. Untuk mengatasi kemungkinan ini, protein fusi yang mengandung domain pengikatan ekstraseluler murine Clec12a dan bagian Fc dari IgG1 manusia (Clec12a-Fc) telah dibuat (Gambar 6A) (Maglinao et al., 2014; Neumann et al., 2014; Raulf dkk., 2019). Protein tersebut dimurnikan dan disaring untuk mengikat panel beragam bakteri gram positif dan gram negatif yang diketahui ada dalam usus homeostatis, termasuk F. rodentium, Roseburia spp., Bifidobacteria animalis, Akkermansia muciniphila, Bacteriodes Uniformis, dan jamur komensal Candida albicans, dengan flow cytometry. Salmonella enterica juga dimasukkan karena penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa Clec12a dapat dikaitkan dengan masuknya S. enterica ke dalam sel (Begun et al., 2015). Clec12a terikat pada tingkat yang berbeda-beda dengan beberapa bakteri yang berbeda secara filogenetik, termasuk F. rodentium, tetapi tidak dengan jamur, C. albicans (Gambar 6B). Clec12a terikat paling tinggi pada organisme gram positif F. rodentium dan anggota famili Lachnospiraceae Roseburia sp., dan paling sedikit berinteraksi dengan B. animalis, B. Uniformis, dan S. enterica (Gambar 6B), yang menunjukkan bahwa Clec12a dapat mengikat anggota mikrobiota tertentu dengan preferensi untuk organisme gram positif. Secara keseluruhan, data kami mengidentifikasi Clec12a sebagai mekanisme yang digunakan oleh sistem kekebalan untuk mensurvei komunitas mikroba usus dan memangkas mikrobiota melalui pengikatan langsung dan fagositosis sekaligus mencegah respons inflamasi terbuka terhadap mikroba gram positif yang melimpah yang sangat penting untuk menjaga kesehatan usus.
DISKUSI
Homeostasis di dalam usus memerlukan mekanisme untuk membatasi mikroba komensal tanpa memulai peradangan yang merusak (Macpherson et al., 2000). IgA, dalam beberapa tahun terakhir, telah muncul sebagai salah satu cara penting di mana kekebalan usus dapat mengendalikan mikrobiota (Pabst dan Slack, 2020). Memang benar, IgA mampu secara langsung berikatan dengan mikroba dan/atau produknya dan menghilangkannya dari usus tanpa menimbulkan peradangan yang khas. Molekul kekebalan lain yang memiliki sifat ganda ini belum diteliti sampai saat ini. Lektin tipe C terdiri dari beragam kelas protein yang dapat mengenali beragam molekul protein, karbohidrat, dan lipid dari mikroba dan produk inang (Brown et al., 2018; Drouin et al., 2020). Namun, hanya sedikit yang diteliti dalam konteks imunitas usus dan mikrobiota (Iliev et al., 2012; Martinez-Lopez et al., 2019). Jadi, sepengetahuan kami, ini adalah demonstrasi pertama bahwa defisiensi Clec12a mengubah komposisi mikrobiota yang menyebabkan keparahan penyakit.
manfaat cistanche-memperkuat sistem kekebalan tubuh
Clec12a sebagian besar telah dipelajari dalam konteks pengenalan monosodium urat (MSU) atau asam urat, yang sering menjadi indikasi kematian sel (Kono et al., 2010; Neumann et al., 2014). Asam urat mampu mengaktifkan respon inflamasi melalui inflammasome NLRP3, sehingga untuk mencegah kerusakan jaringan selama kematian sel, inflamasi ini harus dikontrol (Martinon et al., 2006). Clec12a terbukti menyeimbangkan respons inflamasi ini melalui penurunan regulasi pensinyalan Syk (Marshall et al., 2004). Konsisten dengan hal ini, penghapusan Clec12a pada model inflamasi steril dan model arthritis autoinflamasi menyebabkan peningkatan aktivasi neutrofil dan memperburuk penyakit, menjadikan Clec12a sebagai penghambat inflamasi yang penting (Redelinghuys et al., 2016). Namun, baru-baru ini Clec12a juga terbukti meningkatkan sinyal interferon tipe I sebagai respons terhadap infeksi virus dan memediasi penyerapan Salmonella melalui jalur autophagy antibakteri (Begun et al., 2015; Li et al., 2019). Hal ini menunjukkan bahwa Clec12a tidak hanya berfungsi untuk membatasi peradangan, namun dapat memainkan berbagai peran tergantung pada konteksnya. Usus berbeda karena terdapat sejumlah besar sel kekebalan meskipun tidak ada penyakit. Hal ini disebabkan adanya mikrobiota yang berperan penting dalam mengarahkan perkembangan kekebalan tubuh dan mencegah kolonisasi organisme patogen. Mikrobiota memiliki pola permukaan yang sama yang terdeteksi oleh TLR yang juga mengenali patogen, dan oleh karena itu sistem kekebalan usus harus memiliki mekanisme pengaturan yang ketat untuk menahan peradangan pada organisme asing tersebut (Blander et al., 2017).
Kami awalnya tertarik pada Clec12a karena kami mengidentifikasi bahwa jamur usus, Saccharomyces cerevisiae menginduksi asam urat sehingga memperburuk kolitis (Chiaro et al., 2017). Selain itu, penelitian lain telah mengidentifikasi bahwa mikrobiota dapat mempengaruhi penyakit usus melalui induksi metabolisme purin, yang produk akhirnya pada mamalia adalah asam urat (Zhu et al., 2019). Data ini menunjukkan bahwa mekanisme untuk merasakan asam urat, seperti Clec12a, dapat mempengaruhi homeostasis usus. Namun, kami mengamati tidak ada perubahan kadar asam urat dalam serum atau feses, yang menunjukkan bahwa peningkatan keparahan penyakit pada hewan Clec12a-/- tidak didorong oleh peningkatan asam urat. Namun, peningkatan keparahan kolitis pada Clec12a-/- didorong oleh komposisi mikrobiota. Jadi, berdasarkan data kami, penurunan ekspresi Clec12a-/- dapat mempengaruhi komposisi mikrobiota pada pasien IBD (Jason L. Kubinak, 2015; Rehman et al., 2011; Vijay Kumar et al., 2010). Menariknya, kami menemukan bahwa antibiotik yang menargetkan organisme gram positif mampu memperbaiki keparahan kolitis pada hewan Clec12a-/-. Hal ini berbeda dengan beberapa laporan yang mengidentifikasi perluasan Enterobacteriaceae gram negatif selama peradangan usus, oleh karena itu, ini adalah salah satu dari sedikit penelitian yang mengidentifikasi perluasan organisme gram positif yang berhubungan dengan perkembangan kolitis. Meskipun, kemungkinan bukan satu-satunya organisme yang mempengaruhi tingkat keparahan kolitis dalam model ini, perluasan dramatis F. rodentium diamati pada hewan Clec12a-/-. F. rodentium adalah anggota filum Firmicutes (Bacillota) gram positif, oksidase, dan katalase (Chang et al., 2015). Pengenalan F. rodentium setiap hari bahkan pada tikus WT meningkatkan kolitis, mendukung bahwa peningkatan kadar F. rodentium di dalam usus berbahaya dan kemungkinan menyebabkan keparahan kolitis pada Clec12a-/-. Sebuah laporan baru-baru ini menunjukkan bahwa F. rodentium dapat meningkatkan pergantian epitel dan menekan ekspresi enzim di dalam epitel yang menurunkan regulasi respon inflamasi dan dengan demikian sejalan dengan memburuknya penyakit yang kita lihat ketika F. rodentium berkembang di usus (Cao et al., 2022). Karena manusia dijajah dengan organisme yang mirip dengan F. rodentium (Zagato et al., 2020), penelitian lebih lanjut harus menjelaskan pengaruh bakteri mirip F. rodentium ini pada aspek fisiologi manusia terkait kolitis.
Mendukung peran Clec12a di antara sel imun bawaan, kami mengamati bahwa mikrobiota kolitogenik masih terbentuk pada hewan Clec12a-/- yang tidak memiliki sistem kekebalan adaptif. Persentase sel tertinggi di dalam usus yang mengekspresikan Clec12a adalah makrofag sehingga membuat kami fokus pada fungsi Clec12a dalam sel-sel ini. Penelitian sebelumnya telah menunjukkan bahwa Clec12a merupakan mediator penting produksi interferon tipe I sebagai respons terhadap infeksi virus (Li et al., 2019). Namun, bagaimana Clec12a berdampak pada respons terhadap spektrum ligan bakteri yang luas belum dinilai; ini sangat relevan di usus di mana terdapat banyak ligan TLR. Di sini, kami menunjukkan bahwa Clec12a berfungsi untuk meredam reaksi makrofag di usus dan kemungkinan berfungsi untuk memastikan homeostasis sebagai respons terhadap mikrobiota. RNA-seq makrofag yang diinkubasi dengan F. rodentium menyoroti bahwa defisiensi Clec12a menyebabkan siklus sel dan cacat fagositosis sebagai respons terhadap bakteri komensal ini. Sebuah penelitian baru-baru ini menunjukkan bahwa makrofag Clec12a-/- telah mengurangi autophagy sebagai respons terhadap Salmonella (Begun et al., 2015). Data kami melengkapi dan memperluas temuan ini dengan memasukkan bahwa Clec12a juga berfungsi untuk mengendalikan organisme komensal non-invasif. F. rodentium telah terbukti mempengaruhi biologi epitel, yang menunjukkan bahwa F. rodentium terletak dekat dengan inang dan karenanya harus dikontrol secara ketat oleh sistem kekebalan. Data kami mendukung bahwa Clec12a mengendalikan F. rodentium melalui regulasi fagositosis. Fagositosis dimulai oleh pengikatan fisik suatu ligan atau mikroba, dan lektin tipe C dapat berasosiasi dengan banyak ligan, yang mengarahkan kami untuk menguji apakah Clec12a dapat berasosiasi langsung dengan bakteri yang tinggal di usus. Menariknya, Clec12a terikat paling tinggi pada organisme gram positif F. rodentium dan Roseburia dan lebih sedikit lagi pada organisme gram negatif A. muciniphila dan B. Uniformis dan sama sekali tidak terikat pada C. albicans. Data ini menunjukkan bahwa Clec12a memiliki kecenderungan untuk mengikat anggota mikrobiota tertentu. Hal ini memungkinkan kami untuk membangun model di mana keterlibatan Clec12a dan fagositosis selanjutnya dapat mengendalikan anggota mikrobiota tertentu dan mencegah dampak yang berpotensi merugikan dari perluasannya. Hal ini menyoroti fungsi ganda Clec12a yang dapat menahan peradangan terhadap ligan mikroba sekaligus mengenali dan mengendalikan anggota mikrobiota tertentu. Dengan demikian, Clec12a mewakili cara unik yang digunakan sistem kekebalan bawaan untuk memastikan homeostasis dalam saluran pencernaan.
LEGENDA GAMBAR
Gambar 1. Clec12a menahan penyakit usus yang tidak bergantung pada sistem kekebalan adaptif
(A) Untuk menilai tingkat keparahan kolitis, tikus WT atau Clec12a-/- C57BL/6 bebas patogen spesifik (SPF) diobati dengan 2,5% dekstran natrium sulfat (DSS) ad libitum selama 7 hari dalam air minum. Persen penurunan berat badan dinilai setiap hari. Mean +/- SEM, data dikumpulkan dari tiga percobaan independen menggunakan ANOVA dua arah dan uji perbandingan berganda Śídák.
(B) Panjang usus (cm) hewan yang ditunjukkan diukur pada saat pengorbanan. Plot sebar adalah mean +/- SEM, data dikumpulkan dari tiga eksperimen independen menggunakan uji t tidak berpasangan. Setiap titik mewakili satu tikus
(C) Lipocalin-2 tinja (ng/mL) hewan yang diindikasikan diukur sebagai pembacaan peradangan. Grafik batang adalah mean +/- SEM, data dikumpulkan dari dua eksperimen independen menggunakan uji t tidak berpasangan. Setiap titik mewakili satu tikus
(D) Perwakilan H&E menodai bagian usus besar dari hewan yang diindikasikan setelah kolitis yang diinduksi DSS.
(E) Skor histologi untuk hewan yang diindikasikan dihasilkan dari bagian usus besar
(D). Grafik batangnya adalah mean +/- SEM, dibandingkan menggunakan uji t tidak berpasangan. Setiap titik mewakili satu tikus.
(F) Model kolitis transfer sel T dilakukan untuk menilai kolitis kronis. Berat hewan TCRb-/- dan Clec12a-/- ;TCRb-/- diukur setiap minggu. Grafik tersebut menggambarkan persentase penurunan berat badan hewan yang ditunjukkan selama percobaan. Rata-rata +/- SEM, dibandingkan dengan 2-way ANOVA.
(G) Panjang koloni hewan yang ditunjukkan dari (I) diukur pada saat pengorbanan. Grafik batangnya adalah mean +/- SEM, dibandingkan menggunakan uji t tidak berpasangan. Setiap titik mewakili satu tikus.
(H) Tikus WT, Clec12a-/- , Rag-/- atau Rag-/- ;Clec12a-/- C57BL/6 SPF dinilai untuk kolitis akut. Hewan yang diindikasikan diberikan DSS 2,5% ad libitum selama 7 hari. Persen penurunan berat badan dinilai setiap hari. Mean +/- SEM, data mewakili dua eksperimen independen. ANOVA dua arah dan uji perbandingan berganda Śídák.
(I) Panjang usus besar (cm) hewan yang ditunjukkan diukur pada saat pengorbanan. Grafik batang adalah mean +/- SEM, data mewakili dua eksperimen independen menggunakan uji t tidak berpasangan. Setiap titik mewakili satu mouse * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0,001; **** p < 0,0001
Gambar 2. Mikrobiota yang terbentuk pada hewan Clec12a-/- memperburuk kolitis
A) Transplantasi mikrobiota tinja (FMT) dilakukan dengan mentransfer supernatan tinja dari hewan WT atau Clec12a ke tikus WT bebas kuman. Mikrobiota dibiarkan homogen selama empat minggu, setelah itu, setengah dari tikus WTFMT dan setengah dari tikus Clec12a-/-FMT ditempatkan bersama dan dibiarkan bercampur selama empat minggu lagi. Semua kelompok kemudian menerima 2,5% DSS ad libitum dalam air minum mereka dan dikorbankan pada hari ke 7.
B) Persen penurunan berat badan hewan yang diindikasikan dinilai setiap hari. Grafik menggambarkan mean +/- SEM, data dikumpulkan dari dua eksperimen independen menggunakan ANOVA dua arah dan uji perbandingan berganda Śídák.
C) Panjang usus besar (cm) dari hewan yang ditunjukkan diukur pada saat pengorbanan. Plot sebar adalah mean +/- SEM, dibandingkan menggunakan ANOVA Satu Arah Biasa dengan uji perbandingan berganda Dunnett. Setiap titik mewakili satu tikus.
D) Perwakilan H&E menodai bagian usus besar hewan yang diindikasikan setelah kolitis yang diinduksi FMT dan DSS.
E) Skor histologi dihasilkan dari bagian usus besar di (D). Grafik batangnya adalah mean +/- SEM, dibandingkan menggunakan uji t tidak berpasangan. Setiap titik mewakili satu tikus.
F) Jarak Unifrac tertimbang dari sekuensing gen 16S rRNA WTFMT, Clec12a-/- FMT, atau hewan yang dipelihara bersama. Plot kotak dan kumis menunjukkan semua titik (perbandingan jarak berpasangan) dan dibandingkan menggunakan uji Kruskal-Wallis.
G) Jarak Unifrac tak tertimbang dari pengurutan gen 16S rRNA pada WTFMT, Clec12a-/- FMT, atau hewan yang dipelihara bersama. Plot kotak dan kumis menunjukkan semua titik (perbandingan jarak berpasangan) dan dibandingkan menggunakan uji Kruskal-Wallis.
H) Jarak Bray-Curtis dari sekuensing gen 16S rRNA WTFMT, Clec12a-/- FMT, atau hewan yang dipelihara bersama. Plot kotak dan kumis menunjukkan semua titik (perbandingan jarak berpasangan) dan dibandingkan menggunakan uji Kruskal-Wallis.
Gambar 3: Komposisi mikrobiota yang terbentuk pada hewan Clec12a-/- tidak bergantung pada imunitas adaptif
A) Diagram skema yang menunjukkan pemulihan sumsum tulang dengan FMT berikutnya. Tikus C57Bl/6 WT diiradiasi secara mematikan dan dibentuk kembali dengan sumsum tulang WT atau Clec12a-/-. Setelah 8 minggu, feses diambil dari tikus tersebut dan dipindahkan ke tikus WT bebas kuman seperti dijelaskan pada (A). Hewan chimeric yang awalnya dibentuk kembali kemudian diberikan 2,5% DSS ad libitum dalam air minum mereka.
B) Persen penurunan berat badan tikus FMT dari (F) dinilai setiap hari. Mean +/- SEM, menggunakan uji perbandingan berganda Two-way ANOVA dan Tukey.
C) Panjang usus besar (cm) dari hewan yang ditunjukkan diukur pada saat pengorbanan. Plot sebar adalah mean +/- SEM, uji-t tidak berpasangan. Setiap titik mewakili satu tikus
D) FMT untuk menilai peran sistem kekebalan adaptif terhadap pembentukan mikroba dan keparahan kolitis dilakukan dengan mentransfer supernatan tinja dari Rag-/- atau Rag-/-; Clec12a-/- SPF hewan menjadi tikus bebas kuman WT seperti dijelaskan dalam (A). Tikus diberi DSS 2,5% selama 7 hari. Persen penurunan berat badan dinilai setiap hari. Grafiknya adalah mean +/- SEM, menggunakan uji perbandingan berganda Two-way ANOVA dan Tukey.
E) Panjang usus besar (cm) dari hewan yang ditunjukkan dalam (F) diukur pada saat pengorbanan. Mean +/-, SEM dibandingkan menggunakan Ordinary One-way ANOVA dan uji perbandingan berganda Dunnet. Setiap titik mewakili satu tikus. * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0,001; **** p < 0,0001
Gambar 4. Clec12a membatasi perluasan hewan pengerat Faecalibaculum, mikroba yang memperburuk kolitis
A) Tikus WT atau Clec12a-/- C57BL/6 SPF diberi campuran antibiotik (A) (neomisin, gentamisin, ampisilin, eritromisin), sefalotin, atau gentamisin (B, C) dengan konsentrasi 0. 5g/L selama empat belas hari. Setelah tujuh hari hewan diberi 2,5% DSS dalam air minumnya sampai dikorbankan. Panjang usus besar (cm) dari hewan yang ditunjukkan diukur pada saat pengorbanan. Plot sebar adalah mean +/- SEM, uji-t tidak berpasangan. Setiap titik mewakili satu tikus.
B) Persen penurunan berat badan hewan yang diindikasikan dinilai setiap hari. Grafiknya adalah mean +/- SEM, menggunakan uji perbandingan berganda Two-way ANOVA dan Tukey
C) Panjang usus besar (cm) hewan yang ditunjukkan diukur pada saat pengorbanan. Plot sebar adalah mean +/- SEM, uji-t tidak berpasangan. Setiap titik mewakili satu tikus.
D) Fitur yang diamati dari kotoran WT atau Clec12a-/-, keragaman alfa sekuensing 16S rRNA. Mean +/- SEM, dibandingkan dengan menggunakan uji Mann-Whitney.
E) Pielou Evenness dari WT atau Clec12a-/- feses, keragaman alfa sekuensing 16S rRNA. Mean +/- SEM, dibandingkan dengan menggunakan uji Mann-Whitney.
F) Shannon Entropy Mean +/- SEM, dibandingkan dengan menggunakan uji Mann-Whitney.
G) Analisis ANCOM dari feses WT dan Clec12a-/-. Nama taksonomi adalah klasifikasi ASV terbaik menggunakan Genome Taxonomy Database (GTDB).
H) Kelimpahan relatif ASV Faecalibaculum rodentium. Dibandingkan menggunakan Mann Whitney * p < {{0}}.05; ** hal < 0.01; *** p < 0,001; **** p < 0,0001
I) Tikus SPF C57Bl/6 WT diberi perlakuan awal dengan 1x108 CFU F. rodentium secara oral selama tiga hari. Hewan kemudian menerima 2,5% DSS dalam air minumnya selama 7 hari sambil terus menerima asupan harian F. rodentium. Persen penurunan berat badan dinilai setiap hari. Mean +/- SEM, Data dikumpulkan dari empat percobaan terpisah menggunakan ANOVA dua arah dan uji perbandingan berganda Tukey.
J) Panjang usus besar (cm) hewan yang ditunjukkan diukur pada saat pengorbanan. Grafik batang adalah mean +/- SEM, Data dikumpulkan dari empat percobaan terpisah dibandingkan menggunakan ANOVA Satu Arah Biasa dengan uji koreksi berganda Dunnet. Setiap titik mewakili satu tikus. * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0,001; **** p < 0,0001
Gambar 5. Clec12a membatasi peradangan dan mendorong fagositosis pada makrofag.
A) Immunophenotyping dilakukan melalui flow cytometry pada sel yang diisolasi dari lamina propria kolon (cLP) pada hewan WT dan Clec12a-/-. Peta panas menunjukkan frekuensi ekspresi Clec12a pada sel imun bawaan dan adaptif
B) Grafik batang menunjukkan frekuensi sel CD38+ pre-gate (makrofag M1) dari cLP hewan yang ditunjukkan. Mean +/- SEM, dibandingkan dengan menggunakan uji t tidak berpasangan. Setiap titik mewakili satu tikus.
C) Grafik batang menunjukkan frekuensi sel EGR2+ pre-gate (makrofag M2) dari cLP hewan yang ditunjukkan. Mean +/- SEM, dibandingkan dengan menggunakan uji t tidak berpasangan. Setiap titik mewakili satu tikus.
D) BMDM dipanen dari tulang panjang WT dan Clec12a-/- dan dikultur dengan adanya M-CSF (20ng/mL) selama 7 hari. Pada hari ke 8 BMDM diberi pulsa dengan LPS (100ng/mL), MDP (10mg/mL), Pam3cysk (1mg/mL), atau Flagellin (1mg/mL) selama 24 jam. Media dikumpulkan dan diuji untuk produksi sitokin. Peta panas menunjukkan perubahan lipatan Log2 dari sitokin yang ditunjukkan dari Clec12a-/- melalui WT.
E) BMDM dari tikus WT dan Clec12a-/- diisolasi dan dikultur seperti pada (A) dan kemudian dikultur bersama dengan F. rodentium pada MOI 10 selama 24 jam. Setelah BMDM dicuci, RNA dikumpulkan dan disiapkan untuk pengurutan RNA. 10 kategori istilah GO (Proses biologis) teratas yang disederhanakan diperkaya di antara Clec12a-/- yang diturunkan regulasi
F) Makrofag peritoneum diisolasi dari tikus WT dan Clec12a-/- dan kemudian dikultur bersama dengan F. rodentium berwarna hijau Sybr untuk menilai fagositosis. Kiri: makrofag WT. Kanan: Clec12a-/- makrofag. Gambar representatif dari bidang terang (kolom kiri), fluoresensi (kolom tengah), dan gabungan (kolom kanan) digambarkan. Panah kuning menunjukkan contoh sel F. rodentium yang ditelan makrofag. bilah skala=20 µm. Gambar mewakili dua eksperimen terpisah.
G) Grafik batang menunjukkan organisme per sel, seperti terlihat pada (F). 250 sel WT dan 269 sel Clec12a-/- dihitung untuk mengukur jumlah F. rodentium per sel.
Gambar 6: Clec12a berikatan langsung dengan anggota mikrobiota tertentu.
A) Diagram skema yang menggambarkan protein fusi Clec12a-manusia IgG1-Fc atau vektor kosong (hanya bagian Fc) B) Histogram analisis aliran sitometri yang mewakili pengikatan diferensial Clec12a-Fc ke berbagai bakteri atau C. albicans.
LEGENDA GAMBAR TAMBAHAN
Gambar Tambahan 1. Tidak adanya Clec12a tidak mengganggu kadar asam urat.
A) Asam urat serum (µM) hewan terindikasi diukur untuk menilai metabolisme purin antara tikus WT dan Clec12a-/- C57Bl/6. Plot sebar adalah mean +/- SEM, data dikumpulkan dari tiga eksperimen independen menggunakan uji t tidak berpasangan. Setiap titik mewakili satu tikus.
B) Asam urat tinja (µM) dari hewan yang ditunjukkan diukur untuk menilai ekskresi asam urat usus antara tikus WT dan Clec12a-/- C57Bl/6. Plot sebar adalah mean +/- SEM, data dikumpulkan dari tiga eksperimen independen menggunakan uji t tidak berpasangan. Setiap titik mewakili satu tikus.
Gambar Tambahan 2. Mikrobiota WT dan Clec12a-/- mendorong penyakit yang berbeda
Persentase penurunan berat badan hewan WT dan Clec12a-/- yang diobati dengan campuran antibiotik yang terdiri dari neomycin, gentamisin, ampisilin, dan eritromisin.
Gambar Tambahan 3. Komposisi mikrobiota dipengaruhi oleh Clec12a.
A) Plot PCoA dari 3 sumbu pertama berdasarkan jarak Bray-Curtis menunjukkan hubungan mikrobiota secara keseluruhan dan plot kotak dan kumis yang sesuai mengukur ketidaksamaan dalam masing-masing kelompok dan dibandingkan dengan uji Mann-Whitney.
B) Plot PCoA berdasarkan jarak Unifrac tertimbang dan plot kotak dan kumis yang sesuai mengukur ketidaksamaan dalam kelompok dibandingkan dengan menggunakan uji Mann-Whitney tidak berpasangan.
C) Tabel yang menunjukkan hasil uji PERMANOVA untuk mikrobiota WT vs. Clec12a-/- fecal dengan Bray-Curtis dan jarak Unifrac tertimbang.
Gambar Tambahan 4: Clec12a pada makrofag membatasi peradangan.
A) Plot biola menggambarkan intensitas fluoresen rata-rata geometrik (MFI) sel imun yang ditunjukkan pada (A). Mean +/- SEM, uji Kruskal-Wallis dengan koreksi Dunn untuk beberapa perbandingan. Huruf menunjukkan kelompok yang berbeda nyata.
B) Plot aliran sitometri representatif makrofag M1 dan M2 dari cLP tikus WT atau Clec12a-/- setelah kolitis DSS. Sel sudah dipra-gating pada live, CD45+, Ly6C-, CD11b+, MHCII+, dan CD64+. Dari Gambar 5A
Gambar Tambahan 5. Clec12a menstabilkan kontrol siklus sel dan mengatur fagositosis pada makrofag.
A) 10 kategori istilah GO (Proses biologis) teratas yang disederhanakan yang diperkaya di antara gen Clec12a-/- yang diatur lebih tinggi dibandingkan dengan WT sebagai respons terhadap F. rodentium. BMDM dari tikus WT dan Clec12a-/- yang dikultur bersama dengan F. rodentium diisolasi dan dianalisis seperti pada Gambar 7A.
B) Peritoneal macrophages were prepared as described and co-cultured with Sybr®-green stained F. rodentium. Bacteria cells were counted inside macrophages. >200 makrofag dihitung. Grafik batang menunjukkan jumlah rata-rata F. rodentium dari 4 sumur untuk menunjukkan konsistensi penghitungan dan pengaruh di seluruh sumur. Mean +/- SEM dibandingkan menggunakan uji t tidak berpasangan.
UCAPAN TERIMA KASIH
Kami ingin mengucapkan terima kasih kepada Gordon Brown yang telah menyediakan hewan Clec12a-/- untuk proyek ini. Pekerjaan ini didukung oleh Helen Hay Whitney Foundation (KSO), Hibah Pelatihan T32 Patogenesis Mikroba NRSA Universitas Utah (KSO), Penghargaan Penelitian Senior CCFA (JLR), NIDDK R01DK124336, NIDDK R01124317 dan NCCAM R01AT011423 (JLR), Edward Mallinckrodt Jr. Foundation (JLR), NSF CAREER award (IOS-1253278) (JLR), Packard Fellowship in Science and Engineering (JLR), Burroughs Welcome Investigator in Pathogenesis Award (JLR), American Asthma Foundation (JLR), Margolis Foundation (JLR), hibah MS Society Center (JLR), dan WM Keck Foundation (JLR) NIH New Innovator Award DP2GM111099-01 (RMO), NHLBI R00HL102228-05 ( RMO), Hibah Penelitian Masyarakat Kanker Amerika (RMO), Kimmel Scholar Award (RMO), R01AG047956 (RMO), dan NIAID R01AI141202 (ASI). Pekerjaan ini didukung oleh Fasilitas Sitometri Aliran Universitas Utah serta Institut Kanker Nasional melalui Penghargaan Nomor 5P30CA042014-24. Dukungan dan sumber daya dari Center for High-Performance Computing di Universitas Utah sangat kami hargai.
KONTRIBUSI PENULIS
TRC membantu menyusun penelitian ini, melakukan sebagian besar percobaan pada tikus dan imunologi, menggabungkan data menjadi gambar, dan membantu menulis naskah. RB mengadakan eksperimen bebas kuman dan memelihara semua hewan bebas kuman. ESV membantu eksperimen imunologi lamina propria usus. KSO membantu panen tikus serta memberikan wawasan dan arahan. KMB membantu pengambilan tikus dan flow cytometry. MCN membantu panen tikus. WV memberikan bantuan dalam membangun konstruksi untuk protein fusi dan pemurnian. TJ memberikan bantuan dengan tes fagositosis. JH menganalisis slide mikroskop fagositosis. MH memberikan bantuan dalam pemurnian dan penggunaan protein fusi. KAK menyediakan isolat bakteri. ROC memberikan keahlian dan wawasan imunologi. WZS membantu menyusun penelitian, melakukan analisis bioinformatika, membantu persiapan angka dan statistik, serta membantu penulisan naskah. JLR membantu menyusun dan mengarahkan penelitian, mengawasi desain dan hasil eksperimen, mengatur kolaborator dan reagen, mengumpulkan dana untuk penelitian, dan membantu menulis naskah.
METODE
Strain tikus
Semua garis mouse yang digunakan di sini berada pada latar belakang C57BL/6. Tikus Clec12a-/- disediakan oleh Gordon Brown (Pusat Dewan Penelitian Medis untuk Mikologi Medis, Universitas Exeter) dan diberi genotipe sesuai dengan protokol yang dijelaskan sebelumnya (Redelinghuys, dkk. 2016). Rag2-/- dan TCRb-/- (Laboratorium Jackson, 002118) diperoleh dari Laboratorium Jackson dan dipelihara di koloni tikus kami selama beberapa generasi. Untuk semua percobaan kolitis in vivo, digunakan tikus berumur 8 hingga 12-minggu dengan jenis kelamin yang sama. Tikus jantan dan betina digunakan. Tikus dipelihara dalam kondisi bebas patogen tertentu.
Strain bakteri dan jamur
Organisme berikut diperoleh dari DSMZ-Jerman Collection of Microorganism and Cell Cultures GmbH: Faecalibaculum rodentium (DSM# 103405); Akkermansia mucinophilia DSMZ (DSM#26127); Bifidobacterium animalis DSMZ (DSM#26074). Bacteroides Uniformis diperoleh dari American Type Culture Collection (ATCC® 8492™). Roseburia sp (strain penunjukan JLR.KK002) diisolasi pada agar Schaedler dari tikus C57BL/6 yang menyimpan mikrobiota yang diperkaya dengan spora. Pengayaan bekas spora dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya dan tikus dipelihara selama beberapa generasi dengan mikrobiota ini di fasilitas gnotobiotik kami sebelum JLR.KK002 diisolasi dari kotoran (Browne et al., 2016). Kami diamplifikasi dengan PCR dan Sanger mengurutkan gen 16S rRNA dan kemudian mengklasifikasikannya dengan layanan SILVA ACT dan database SILVA (Pruesse et al., 2012). Strain Salmonella typhimurimum ST2 digunakan. Candida albicans strain sc5314 digunakan. Strain bakteri yang digunakan dalam komunitas sintetik PhyLo11b dijelaskan di bawah.
Kolitis eksperimental yang diinduksi DSS
Kolitis diinduksi dengan penambahan 2,5% atau 3% (b/v) 36,000-50,000MW Dextran sodium sulfate (DSS) (MP Biomedicals) dalam air minum selama 7 hari. Tingkat keparahan kolitis dipantau setiap hari melalui perubahan berat badan, konsistensi tinja, dan darah tinja. Untuk percobaan penyelamatan monosit, semua tikus menerima DSS 2,5% selama 5 hari, setelah itu diberikan air biasa; pemantauan berat badan dilanjutkan hingga hari ke 10 saat hewan dipanen. Batas keparahan penurunan berat badan lebih dari 20% diberlakukan sebagai ambang batas keparahan. Pada titik akhir eksperimental, MLN dan titik dua telah dihapus. Usus besar diukur dari sekum hingga rektum untuk menentukan panjangnya. Jaringan kemudian diproses untuk histologi, ekstraksi RNA, atau analisis aliran sitometri.
Histologi dan Penilaian Usus Besar
Colons were fixed within histology cassettes O/N at RT in 10% buffered formalin phosphate solution after removal of fecal contents and then transferred to 70% EtOH at 4 C until staining. Sectioning and H&E staining were done at the HCI Biorepository and Molecular Pathology Resource core in the ARUP-operated Research Histology division. Colon scoring was done in a blinded manner with the following rubric scales: percentage of colon crypt loss (0.5 (5%) - 7 (>75%)), crypt loss severity (1 (partial loss) – 5 (full loss)) and inflammatory aggregates (1 (1-3) – 3 (>7)).
Lipokalin-2 (LCN-2) ELISA
Protokol dilakukan sesuai dengan protokol pabrikan (Fischer Scientific DY1857-05). Secara singkat feses dikumpulkan, ditimbang, dan dihaluskan dalam HBSS 1X dengan konsentrasi 100mg/mL. Sampel kemudian diputar pada 50 xg selama 5 menit untuk menghilangkan puing-puing besar. Supernatan kemudian dikeluarkan dan ditempatkan dalam tabung baru dan diputar pada kecepatan 8000 xg selama 5 menit untuk membuat pelet bakteri. Supernatan ini kemudian diencerkan sesuai dengan penyakit hewan tetapi umumnya berkisar antara 1:100- 500 (sehat) – 1:500-1000 (diolah dengan DSS). Pengukuran asam urat Konsentrasi asam urat dilakukan sesuai dengan instruksi pabriknya (Invitrogen™ Amplex™Red Uric/Uricase Activity Assay Kit, cat# A22181). Secara singkat, darah dikumpulkan dari tikus WT atau Clec12a-/- dengan tusukan jantung ke dalam tabung pemisah serum emas. Tabung dibiarkan menggumpal selama 30 menit dan kemudian diputar pada kecepatan 1300 xg selama 10 menit. Serum telah dikeluarkan dan ditempatkan dalam tabung Eppendorf 1,5 ml, dibekukan, dan disimpan pada suhu -80 derajat Celcius hingga pengujian. Asam urat tinja dilakukan dengan memperoleh pelet tinja segar dari tikus WT dan Clec12-/-. Pelet ditimbang dan dicatat kemudian dihaluskan dalam 1mL buffer reaksi 1x. Setelah tumbukan fisik, tabung diputar pada kecepatan 50 xg selama 5 menit untuk menghilangkan serpihan besar. Bubur tinja yang tersisa diuji asam uratnya.
Kolitis eksperimental transfer sel T
Limpa WT diisolasi dan dihaluskan dalam RPMI yang mengandung 10% serum janin sapi, penisilin, dan streptomisin. Sel diputar pada 367 xg untuk mengisolasi sel. Pelet yang dihasilkan kemudian disuspensikan dalam 1x buffer lisis RBC selama 5 menit, dalam gelap, pada suhu kamar. Sel darah putih yang dihasilkan kemudian dilewatkan melalui kolom Miltenyi CD4+ MACS untuk mengisolasi sel T CD4+. Sel T kemudian diwarnai dengan CD4 dan CDRB dan disortir pada FACS Aria Fusion (BD Biosciences). Sel CD4+ CDRBhi dikumpulkan dan diberikan ke TCRb-/- atau TCRb-/-; Clec12a-/- tikus secara intraperitoneal (IP). Setiap tikus menerima 5 x 105 sel. Tingkat keparahan dan perkembangan kolitis dipantau setiap minggu dengan menilai penurunan berat badan. Pada titik akhir percobaan, MLN dan titik dua dihilangkan dan titik dua diukur dari sekum hingga rektum untuk menilai tingkat keparahan penyakit.
Isolasi leukosit dari lamina propria kolon
Kolon murine dengan ceca yang menempel dipanen dan ditempatkan dalam 1X PBS di 6-piring sumur di atas es. Jaringan lemak dan ikat yang masih tersisa telah dibuang dan sekum dipotong dari titik dua. Usus besar dibentangkan dan lendir serta feses dikeluarkan dengan hati-hati dari usus besar sebelum dimasukkan kembali ke dalam 6-well plate. Setelah semua titik dua disebar dan dikikis, setiap titik dua dipotong dadu di atas tutup cawan petri menggunakan silet dan ditempatkan dalam tabung terpisah berukuran 50 mL. 10 mL larutan disosiasi yang telah dipanaskan sebelumnya (1X HBSS tanpa Ca+ dan Mg+, 1,5 mM DTT, 10 mM HEPES, dan 30 mM EDTA) ditambahkan dan tabung divorteks sebentar. Titik dua diinkubasi selama kurang lebih 25 menit. pada suhu 37 derajat dengan pengocokan pada kecepatan 150 rpm hingga larutan menjadi keruh dari pemisahan IEC. Sampel dikocok 3X dan divorteks selama 15 detik kemudian dituangkan ke dalam filter 100 mM pada kerucut 50 ml untuk menghilangkan sel non-imun seperti IEC, dan filter dibilas sebentar dengan 2 mL PBS 1X dingin. Jaringan yang tersisa dikumpulkan pada filter dengan tang dan dipindahkan ke wadah berbentuk kerucut 50 mL yang baru. 15 mL larutan pencernaan yang telah dihangatkan sebelumnya (1X HBSS dengan Ca+ dan Mg, 5% FBS, 50 U/ml Dispase II [Millipore-Sigma, cat # 4942078001], 0,5 mg/ml DNAse I [Worthington Biochemical, cat # LS002139] dan 0,5 mg/mL Kolagenase D [Millipore-Sigma, cat #11088866001]) ditambahkan, sampel divorteks sebentar, dan selanjutnya diinkubasi selama 45 menit. pada suhu 37 derajat dengan pengocokan pada kecepatan 150 rpm, atau hingga larutan menjadi keruh. Sampel kemudian dikocok 3X dan divorteks selama 15 detik. Untuk mengumpulkan sisa sel cLP imun, jaringan yang dicerna kemudian dituangkan ke dalam filter 40 mM pada tabung berbentuk kerucut 50 mL yang berisi 10 mL 1X PBS. Sampel selanjutnya dibilas dan disaring dengan 2 mL PBS 1X dingin dan diputar pada 800 xg selama 10 menit pada suhu 4 derajat. Selanjutnya supernatan dibuang dan dibuang dengan vakum. Sel kemudian diresuspensi dalam 500 ml RPMI lengkap, dan dihitung dengan pewarnaan eksklusi Trypan blue.
Aliran sitometri
Leukosit yang diisolasi dari cLP diwarnai untuk viabilitasnya menggunakan pewarna zombie 510 (AmCyan) selama 10 menit di RT dalam gelap. Sampel kemudian Fc Receptor diblokir dengan CD-16/32 selama 20 menit pada suhu 4 derajat dalam gelap. Setelah diputar pada 367 xg selama 5 menit, sel-sel yang dituang diwarnai selama 30 menit dalam gelap pada suhu 4 derajat. Semua antibodi digunakan pada pengenceran 1:250 kecuali dinyatakan lain. Panel myleloid terdiri dari CD45-BV421, CD11b-PerCpCy5.5, MHCII-BV605, CD64-BV711, CX3CR1-BV785, Ly6C-FITC, CD38-PE- Cy7, Ly6G-CF-594, Clec12a-PE (1:500), EGR2-APC (intraseluler, 1:50). Sel T dibedakan berdasarkan: Zombie dye 510 (AmCyan), CD45-BV421, CD3e-BV711, CD4-FITC, Foxp3-APC (intraseluler 1:50), IL{{ 50}}PE (intraseluler 1:50), IFN-g (BV605) (intraseluler 1:50), RORgt-PE610 (intraseluler 1:50), IL-17A-BV785 (intraseluler 1:50). Setelah pewarnaan, sel dicuci 2 kali selama 5 menit masing-masing dengan buffer kolom (1X HBSS tanpa Ca2+, Mg2+ dan HEPES, EDTA, FBS). Sel difiksasi O/N dengan PFA 2% jika tidak diperlukan pewarnaan intraseluler dan kemudian dicuci dalam buffer kolom 2X sebelum dijalankan pada flow cytometer. Jika pewarnaan intraseluler diperlukan, kit Buffer Pewarnaan Faktor Transkripsi / FoxP3 (Tonbo Biosciences) dan protokolnya diikuti. Semua sampel kemudian diresuspensi dalam 300 ul buffer kolom dan dijalankan pada BD LSR Fortessa setelah dikompensasi dengan UltraComp eBeads (ThermoFisher Scientific) dan menggunakan kontrol noda tunggal.
Bakteri pewarnaan IgA
Bakteri diisolasi dari pelet tinja dengan cara menumbuknya menjadi HBSS dengan Ca2+ dan Mg2+, pada konsentrasi 100 mg feses per mL HBSS. Kotoran yang dihaluskan kemudian diputar dengan kecepatan 50 xg selama 5 menit untuk menghilangkan kotoran besar. Supernatannya dibuang dan dimasukkan ke dalam tabung baru. Ini kemudian diputar pada 8000 xg selama 5 menit untuk membuat pelet bakteri. Supernatan dihilangkan dan pelet dicuci dalam HBSS dengan Ca2+ dan Mg2+. Terakhir, pelet diresuspensi dalam HBSS dengan konsentrasi 100mg/mL, dan 10uL ditempatkan dalam pelat sumur 96-dan diblokir dengan HBSS dengan Ca2+ dan Mg2+ yang mengandung 10% FBS selama 20 menit di RT. 100uL anti-IgA (PE) kemudian ditambahkan langsung ke sampel dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu 4 C dalam gelap. Sel kemudian dicuci dalam larutan HBSS+FBS 2x dan terakhir diresuspensi dalam HBSS+1x Sybr®-green dan diinkubasi selama 20 menit dalam gelap di RT. Sampel kemudian langsung dibaca pada flow cytometer.
Isolasi sumsum tulang
Sumsum tulang diisolasi seperti dijelaskan sebelumnya. Secara singkat, tulang panjang dari hewan tipe C57Bl/6 Wild atau Clec12a-/- diekstraksi dan dibersihkan dengan handuk kertas dengan cara digosok perlahan. Tulang bersih disimpan di es sementara hewan diproses. Ujung tulangnya dipotong sedikit agar sumsumnya terlihat. Tulang dimasukkan (ujung terbuka menghadap ke bawah) ke dalam tabung Eppendorf 0.5mL yang telah ditusuk dengan jarum 18g. Tabung Eppendorf 0.5mL ini kemudian ditempatkan di dalam tabung Eppendorf 1.5mL dan diputar pada kecepatan 13,000 xg selama 1 menit. Dipintal melalui sumsum tulang kemudian dilisiskan RBC, menggunakan buffer lisis RBC (Biolegend) sesuai dengan rekomendasi pabrik. Setelah lisis sel darah merah, sel diresuspensi dalam Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) lengkap yang mengandung: 10% FBS, 1mg/mL Pen/Strep, HEPES 10mM, 1x asam amino non-esensial, Sodium Pyruvate 1mM. Sel kemudian diputar pada 367 xg selama lima menit menjadi sel pelet. Sel yang terisolasi kemudian digunakan untuk mengembangkan BMDM, atau untuk mengisolasi monosit lebih lanjut.
Makrofag yang berasal dari sumsum tulang
Leukosit diisolasi dari isolasi sumsum tulang, disuspensikan dalam DMEM lengkap, dan dihitung melalui pewarnaan eksklusi tripan biru pada hemositometer. Sel-sel disepuh pada cawan 10 cm yang telah diberi perlakuan kultur jaringan dengan konsentrasi 5-8 x 106 sel/pelat dalam 10 mL media lengkap + M-CSF (20ng/mL). Media segar, termasuk M-CSF, ditambahkan ke media yang ada pada hari ke 4 dan hari ke 7. BMDM yang terdiferensiasi sepenuhnya digunakan untuk penggunaan eksperimental antara hari 7-9.
Isolasi Monosit
Sumsum tulang dipanen dari hewan WT dan Clec12a-/- seperti yang dijelaskan sebelumnya. Monosit diisolasi dengan Monosit Isolation Kit (BM), tikus (Miltenyi Biotec), dan kolom LS MACS sesuai dengan instruksi pabrik.
Kultur bersama F. rodentium BMDM dan RNAseq
Kultur F. rodentium dikuantifikasi dengan OD 600nm (menggunakan 1 OD 600nm=1 x 10^8 sel/mL), dicuci 2x dalam PBS steril, dan dikultur bersama dengan 1 x 106 sel/mL BMDM yang terdiferensiasi penuh pada suhu yang sama. MOI 10 dalam 6-pelat kultur jaringan sumur. Setelah 24 jam kultur bersama, media dikumpulkan dan disimpan pada suhu -20 C hingga digunakan lebih lanjut. BMDM dicuci dengan PBS dingin dan steril sebanyak 2x. Qiazol (Qiagen cat# 79306) Reagen stabilisasi RNA, kemudian ditambahkan langsung ke setiap sumur. Sumur dikikis dengan pengikis sel yang dikumpulkan ke dalam tabung 1,5 Eppendorf dan dibekukan pada suhu -20 derajat hingga ekstraksi RNA. Ekstraksi RNA dilakukan menggunakan, kit miniprep Direct-zol RNA (Zymo Research cat# R2070) sesuai dengan instruksi pabrik dan perpustakaan pengurutan disiapkan oleh fasilitas inti Genomics throughput Tinggi Huntsman Cancer Institute. Total RNA pertama kali dihibridisasi dengan NEBNext rRNA Depletion kit v2 (NEB, cat# E7400) untuk mengurangi rRNA dari sampel. Pustaka pengurutan RNA terdampar disiapkan menggunakan Kit Persiapan Perpustakaan RNA Terarah NEBNext Ultra II untuk Illumina (NEB, cat# E7760L). Perpustakaan yang dimurnikan memenuhi syarat pada Agilent Technologies 4150 TapeStation menggunakan uji D1000 ScreenTape (Agilent, cat# 5067-5582 dan 5067-5583). Molaritas molekul yang dimodifikasi adaptor ditentukan oleh PCR kuantitatif menggunakan Kapa Biosystems Kapa Library Quant Kit (Roche, cat#07960140001). Pustaka individual dinormalisasi ke 5 nM sebagai persiapan untuk analisis rangkaian Illumina dan diurutkan pada NovaSeq 6000 dengan rangkaian pengurutan siklus 150-berpasangan.
Analisis sitokin
BMDM diisolasi dan ditanam seperti dijelaskan sebelumnya. BMDM yang berdiferensiasi penuh disepuh pada 1 x 105 sel/sumur di 12-piringan kultur jaringan sumur. BMDM distimulasi dengan LPS 100ng/mL; 1 ug/mL Pam3Cysk; atau 1ug/mL flagelin. Sel distimulasi selama 24 jam, media dikumpulkan dan disimpan pada suhu -20 C untuk dianalisis. Sitokin dianalisis dengan LEGENDplex™ Mouse Inflammation Panel (13-plex) (Biolegend, cat# 740150). Data dianalisis menggunakan perangkat lunak analisis data LEGENDplex™.
sekuensing gen rRNA 16s
Pelet tinja atau isi ileum dikumpulkan dari masing-masing tikus dan segera dibekukan pada suhu {{0}} derajat dalam tabung tutup ulir 2mL yang berisi 250 mg manik-manik garnet 0,15 mm (MoBio, cat# {{5 }}). DNA diekstraksi menggunakan Power Fecal DNA Isolation Kit (MoBio atau QIAGEN), per instruksi kit, dan termasuk 2 siklus pemukulan manik selama 1 menit pada suhu 4 derajat pada Mini-Bead-Beater 16 (Produk BioSpec). Wilayah V3 dan V4 dari gen 16S rRNA diamplifikasi dengan satu putaran PCR menggunakan primer yang mengandung (dijelaskan 3' hingga 5') urutan penargetan gen 16S rRNA wilayah V3/4, diikuti dengan 2-bantalan nukleotida oleh urutan primer Illumina, urutan indeks nukleotida 8- dan urutan adaptor Illumina yang tersisa. Urutan penargetan V3/4 16S diambil dari Takahashi (Takahashi et al., 2014), dan Indeks diambil dari Kozich (Kozich et al., 2013). Urutan oligonukleotida lengkap yang digunakan adalah (indeks dilambangkan dengan Xs): Prok16SV34_Untuk: AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACXXXXXXXXACACTCTTTCCCTACACGACGCTC TTCCGATCTTGCCTACGGGNBGCASCAG; Prok16SV34_Rev: CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATXXXXXXXXGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCC GATCTGCGACTACNVGGGTATCTAATCC. Kondisi siklus PCR sebagai berikut: denaturasi awal 98 derajat selama 2 menit; 26 siklus denaturasi 20 detik 98 derajat, anil 20 detik 51,5 derajat, ekstensi 20 detik 72 derajat; dan satu perpanjangan akhir 72 derajat selama 2 menit. Setiap PCR (dilakukan dalam rangkap tiga untuk setiap sampel) dilakukan dalam volume 25 ul menggunakan Q5 High-Fidelity 2X Master Mix (NEB, cat# M0492L), 5 pmol setiap primer dan 50 ng templat DNA. Setelah amplifikasi, PCR rangkap tiga dari masing-masing sampel dikumpulkan, 5 ul dijalankan pada gel agarosa untuk mengkonfirmasi amplifikasi, dan volume yang tersisa dibersihkan menggunakan manik-manik pembersih PCR Axygen AxyPrep MAG (Corning, cat# MAG-PCR-CL{{53 }}) diencerkan hingga 62,5% dalam air untuk menghilangkan secara efisien semua dimer primer yang akan diurutkan secara istimewa. Manik-manik encer ditambahkan pada 1,8X volume reaksi PCR, dibersihkan sesuai pedoman pabrikan dan amplikon yang telah dibersihkan dielusi dengan 25 ul 10 mM Tris-Cl, pH 8,0. Amplikon kemudian dikuantifikasi dengan uji dsDNA pico green (ThermoFisher, cat #P11495) pada pembaca lempeng mikro, dan kemudian perpustakaan pengurutan individu yang dibersihkan dan diindeks dimultipleks secara merata (dengan ng DNA) dan diurutkan pada instrumen Illumina MiSeq secara berpasangan. Mode siklus 300 di fasilitas sumber daya bersama High-Throughput Genomics di Huntsman Cancer Institute.
Pengolahan bioinformatika data sekuens
Pembacaan mentah gen 16S rRNA didemultipleks sehingga memungkinkan ketidakcocokan 0 dalam indeks, kemudian diproses dan dianalisis dalam kerangka QIIME2 (Bolyen et al., 2019) seperti yang telah kami jelaskan sebelumnya (Stephens et al., 2021). Singkatnya, sekuens yang didemultipleks dan difilter kualitas pertama-tama dipangkas dari sekuens primer dan linker dengan plugin Cutadapt, kemudian di-noise dengan DADA2 (Callahan et al., 2016; Martin, 2011). Taksonomi kemudian ditugaskan ke ASV dengan metode classifysklearn di plugin pengklasifikasi fitur, terhadap kumpulan referensi GTDB (rilis89) yang dipangkas ke wilayah V3/4 yang diperkuat dan dilatih dengan metode fit-classifier-naive-bayes (Bokulich et al. , 2018; Parks dkk., 2018; Pedregosa dkk., 2011). Metrik keanekaragaman, jarak, dan signifikansi statistik pengelompokan keanekaragaman beta oleh permanova dihitung dalam QIIME2 (Anderson, 2001).
Untuk RNA-seq BMDM, bacaan mentah adalah kualitas pertama dan dipangkas dengan adaptor menggunakan trim berlimpah kemudian jumlah transkrip dihitung menggunakan Salmon terhadap transkriptom dari rakitan GRCm38 (mm10) (Patro et al., 2{{ 16}}17). Kuantifikasi tingkat transkrip dibaca ke dalam R menggunakan paket waktu dan diringkas ke jumlah tingkat gen sebelum analisis ekspresi diferensial dengan DESeq2 menggunakan rumus desain '~ Genotipe + Perawatan + Genotipe: Perawatan' (Love et al., 2014; Love et al., 2020). Respons yang berbeda terhadap F. rodentium mewakili perbedaan antara respons masing-masing genotipe terhadap perlakuan F. rodentium hidup dibandingkan sel yang diberi perlakuan kontrol kendaraan. Gen yang diekspresikan berbeda secara signifikan didefinisikan sebagai gen dengan nilai p yang disesuaikan <0,05 dan perubahan lipat log2 > |0,58| (1,5 kali lipat-perubahan). Daftar gen yang diatur ke bawah dan diatur ke atas secara signifikan kemudian digunakan untuk menguji pengayaan istilah ontologi gen (GO) menggunakan paket clusterProfiler termasuk fungsi penyederhanaan untuk mengurangi redundansi istilah GO dan mengidentifikasi proses biologis utama (S, 2020; Wu dkk. ., 2021).
F. tantangan DSS rodentium
F. rodentium ditanam seperti yang dijelaskan sebelumnya dan diukur menjadi 1 x 109 CFU/mL dalam PBS steril. F. rodentium difiksasi dengan cara dicuci terlebih dahulu 2x dalam PBS steril kemudian disuspensikan kembali dalam 1mL Fomalin-PBS 10% selama 10 menit. Sel kemudian dicuci dua kali lagi dalam 10mL PBS steril untuk mempersiapkan oral gavage. Non-fixed dicuci seperti sel fixed dan disimpan di dalam es sampai gavage. Tikus WT C57BL/6 SPF diberi dosis oral dengan 100uL larutan yang mengandung PBS saja (kendaraan), F. rodentium (hidup), atau F. rodentium (tetap) dari hari -3 hingga 10. Hewan diberi 3,0% DSS pada hari 0-7; air DSS segar diganti setiap dua hari sekali. Batas keparahan penurunan berat badan lebih dari 20% diberlakukan sebagai ambang batas keparahan. Pada titik akhir eksperimental, MLN dan titik dua telah dihapus. Usus besar diukur dari sekum hingga rektum untuk menentukan panjangnya. Jaringan kemudian diproses untuk histologi, ekstraksi RNA, atau analisis aliran sitometri.
Uji fagositosis
Makrofag peritoneum diisolasi dengan menyuntikkan 5mL PBS Steril ke dalam rongga peritoneum. PBS diaduk perlahan saat berada di dalam rongga setiap beberapa detik. Setelah 2 menit, PBS ditarik menggunakan jarum ukuran 28 dan disalurkan ke DMEM lengkap yang dingin. Sel dipintal pada 367 xg dan dicuci dalam media lengkap. Sel kemudian dihitung dengan hemositometer dan dimasukkan ke dalam 12-piring kultur jaringan sumur pada konsentrasi 2,5 x 105 sel/mL. Sel dibiarkan menempel semalaman. Keesokan harinya, sumur dicampur perlahan dengan cara diputar dan media disedot. Sel-sel yang melekat kemudian dicuci dua kali dengan 500uL PBS dingin, steril. DMEM lengkap yang telah dipanaskan sebelumnya yang mengandung F. rodentium pada MOI 10 kemudian ditambahkan ke perekat (makrofag). Pelat kemudian diputar perlahan pada 200 xg, pada suhu kamar selama tiga menit dan kemudian diinkubasi dalam kondisi kultur sel standar (37 C, 5% CO2) selama 90 menit. F. rodentium disiapkan seperti yang dijelaskan untuk kultur bersama BMDM untuk sekuensing RNA saja, setelah dicuci, sel diresuspensi dalam 1x Sybr® green (Sigma-Aldrich CAS: 163795-75-3), di RT selama 20 menit. Sel-sel bakteri kemudian dipelet pada 4000 rpm selama 5 menit, diresuspensi dengan DMEM lengkap dan dipanaskan terlebih dahulu untuk makrofag peritoneum. Setelah 90 menit kultur bersama, media disedot, dan sel dicuci dua kali dengan PBS dingin dan steril. Sel-sel yang melekat mengandung F. rodentium berwarna hijau Sybr® difiksasi dengan paraformaldehyde (PFA) 2% selama 10 menit. PFA disedot dan PBS steril ditempatkan pada sel. Sel kemudian dicitrakan untuk fagositosis F. rodentium
Analisis Gambar Makrofag
Gambar Brightfield dan fluoresensi dari kultur makrofag yang diberi perlakuan F. rodentium diambil menggunakan Sistem Pencitraan EVOS m7000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Tiga hingga lima gambar acak terpisah diambil untuk setiap budaya, yang dilakukan dalam rangkap tiga.
Images were blinded and quantified using the software Fiji (Schindelin et al., 2012). Individual bacteria and macrophages were easily distinguished based on size. The total number of bacteria that were associated with (touching or overlapping with) single macrophages was quantified for a randomized subset of cells within the image. Equal numbers of cells were quantified between genotypes (n>200).
Konstruksi protein fusi CLEC12A-Fc adan pemurnianpada
CDNA yang mengkode domain ekstraseluler Clec12a tikus diamplifikasi dengan PCR dari sel darah putih yang diisolasi dari sumsum tulang C57Bl/6 WT SPF dan dikonfirmasi melalui pengurutan. CDNA digabungkan ke terminal C IgG1-Fc manusia dalam vektor ekspresi pFuse-hIgG1- Fc2 (InvivoGen). Konstruksi yang mengandung Clec12a atau vektor kosong ditransfusikan ke dalam sel Lx293 yang dikultur dengan DMEM +10% FBS dan Pen/strep (1mg/mL). Protein fusi yang disekresikan diambil dari media 24-48 setelah transfeksi. Media diputar pada suhu 367 xg selama 5 menit untuk menghilangkan serpihan/sel mati, dan supernatan dibekukan pada suhu -20 C hingga digunakan. Protein fusi Clec12a-Fc atau Fc saja diisolasi dengan Pierce™ Classic Magnetic IP/Co-IP Kit (Thermo Fisher Scientific, Nomor katalog: 88804), dikuantifikasi dengan Pierce™ BCA Protein Assay Kit (Nomor Katalog Ilmiah Thermo Fisher: 23227) dan dikonfirmasi dengan western blot menggunakan antibodi antiClec12a (Novus Biologicals NBP2-27346SS).
Uji pengikatan Clec12a-Fc
Konstruksi yang dimurnikan diencerkan menjadi 0,4 mg/mL dalam HBSS dengan Ca2+ dan Mg2+. Bakteri ditumbuhkan di media dan kondisi aerobik masing-masing dan dinormalisasi dengan OD 600nm. Bakteri dicuci dengan HBSS w/ Ca2+ dan Mg2+ dan diblokir dengan HBSS w/ Ca2+ dan Mg2+ +10% FBS selama 20 menit di RT. Semua prosedur pewarnaan dilakukan dalam kondisi atmosfer. 1 x 107 sel bakteri ditempatkan dalam 96-pelat sumur beralas bundar, diputar pada 3,000 xg, dan dituang. 50uL konstruksi ditempatkan pada sel bakteri, dicampur perlahan, dan diinkubasi pada suhu 4 C selama 1 jam. Sel bakteri dicuci dengan HBSS dengan Ca2+ dan Mg2+ + 10% FBS, 2x. 50uL kambing anti-manusia Fc (PE) (Katalog ebioscience # 12-4998-82) ditambahkan ke sel dan diinkubasi pada suhu 4 C selama 1 jam, dalam gelap. Sel kemudian dicuci seperti sebelumnya dan ditempatkan dalam HBSS dengan Ca2+ dan Mg2+ yang mengandung 1x Sybr® green (Sigma-Aldrich CAS: 163795-75-3). Sel diinkubasi di RT selama 20 menit dalam gelap dan segera dibaca pada sitometer aliran BD LSR Fortessa.
Iradiasi dan pemulihan sumsum tulang
Sumsum tulang dipanen dari hewan WT dan Clec12a-/- seperti yang dijelaskan sebelumnya. Tikus penerima yang diterima diiradiasi secara mematikan dengan 500 Rad pada hari -1, diikuti oleh 400 Rad pada hari 0. Empat jam setelah iradiasi terakhir, tikus penerima ditempatkan di bawah anestesi isofluran, dan 100uL diisolasi sel sumsum tulang yang tersuspensi dalam PBS steril (1 x 108 sel/mL) dikirim melalui jarum ukuran 28,5 ke ruang retro-orbital. Kami tertarik pada mikrobiota sehingga hewan tidak diberikan antibiotik, dan setelah 8 minggu pelet tinja dikumpulkan untuk transfer mikrobiota ke hewan GF.
REFERENSI
Anderson, MJ (2001). Sebuah metode baru untuk analisis varians multivariat non-parametrik. Ekol Australia. 26, 32-46. DOI 10.1111/j.1442-9993.2001.01070.pp.x.
Dimulai, J., Lassen, KG, Jijon, HB, Baxt, LA, Goel, G., Heath, RJ, Ng, A., Tam, JM, Kuo, SY, Villablanca, EJ, dkk. (2015). Genomik terpadu varian risiko penyakit Crohn
mengidentifikasi peran CLEC12A dalam autophagy antibakteri. Perwakilan Sel 11, 1905-1918. 10.1016/j.celrep.2015.05.045.
Blander, JM, Longman, RS, Iliev, ID, Sonnenberg, GF, dan Artis, D. (2017). Regulasi peradangan oleh interaksi mikrobiota dengan inang. Nat. imunol. 18, 851-860. 10.1038/ni.3780.
Bokulich, NA, Kaehler, BD, Rideout, JR, Dillon, M., Bolyen, E., Knight, R., Huttley, GA, dan Caporaso, JG (2018). Mengoptimalkan klasifikasi taksonomi rangkaian amplikon gen penanda dengan plugin pengklasifikasi fitur QIIME 2 ''sq2-. Mikrobioma 6. ARTN 90 10.1186/s40168-018-0470-z.
Bolyen, E., Rideout, JR, Dillon, MR, Bokulich, N., Abnet, CC, Al-Ghalith, GA, Alexander, H., Alm, EJ, Arumugam, M., Asnicar, F., dkk. (2019). Ilmu data mikrobioma yang dapat direproduksi, interaktif, terukur, dan diperluas menggunakan QIIME 2. Nat. Bioteknologi. 37, 852-857. 10,1038/dtk41587-019-0209-9.
Brown, GD, Willment, JA, dan Whitehead, L. (2018). Lektin tipe C dalam imunitas dan homeostasis. Nat. Pendeta Imunol. 18, 374-389. 10,1038/dtk41577-018-0004-8.
Browne, HP, Forster, SC, Anonye, BO, Kumar, N., Neville, BA, Stares, MD, Goulding, D., dan Lawley, TD (2016). Kultur mikrobiota manusia yang 'tidak dapat dikultur' mengungkap taksa baru dan sporulasi yang luas. Alam 533, 543-+. 10.1038/alam17645.
Cadwell, K., Liu, JY, Brown, SL, Miyoshi, H., Loh, J., Lennerz, JK, Kishi, C., Kc, W., Carrero, JA, Hunt, S., dkk. (2008). Peran kunci untuk autophagy dan gen autophagy Atg16l1 pada sel Paneth usus tikus dan manusia. Alam 456, 259-263. 10.1038/alam07416.
Callahan, BJ, McMurdie, PJ, Rosen, MJ, Han, AW, Johnson, AJA, dan Holmes, SP (2016). DADA2: Inferensi sampel resolusi tinggi dari data amplikon Illumina. Nat. Metode 13, 581-+. 10.1038/Nmeth.3869.
Cao, YG, Bae, S., Villarreal, J., Moy, M., Chun, E., Michaud, M., Lang, JK, Glickman, JN, Lobel, L., dan Garrett, WS (2022). Faecalibaculum rodentium merombak sinyal asam retinoat untuk mengatur homeostasis epitel usus yang bergantung pada eosinofil. Inang sel & mikroba 30, 1295- 1310 e1298. 10.1016/j.chom.2022.07.015.
Chang, DH, Rhee, MS, Ahn, S., Bang, BH, Oh, JE, Lee, HK, dan Kim, BC (2015). Faecalibaculum rodentium gen. November, sp. nov., diisolasi dari kotoran tikus laboratorium. Antonie Van Leeuwenhoek 108, 1309-1318. 10,1007/dtk10482-015-0583-3.
Chiaro, TR, Soto, R., Stephens, WZ, Kubinak, JL, Petersen, C., Gogokhia, L., Bell, R., Delgado, JC, Cox, J., Voth, W., dkk. (2017). Salah satu anggota mikobiota usus memodulasi metabolisme purin inang yang memperburuk kolitis pada tikus. Sains. Terjemahan. medis. 9, .
Drouin, M., Saenz, J., dan Chiffoleau, E. (2020). Reseptor mirip lektin Tipe C: Kepala atau ekor dalam imunitas kematian sel. Depan. imunol. 11.ARTN 251 10.3389/fimmu.2020.00251.
Fassarella, M., Blaak, EE, Penders, J., Nauta, A., Smidt, H., dan Zoetendal, EG (2021). Stabilitas dan ketahanan mikrobioma usus: menjelaskan respons terhadap gangguan untuk memodulasi kesehatan usus. Usus 70, 595-605. 10.1136/gutjnl-2020-321747.
Gkouskou, KK, Deligianni, C., Tsatsanis, C., dan Eliopoulos, AG (2014). Mikrobiota usus pada model tikus penyakit radang usus. Perbatasan dalam Mikrobiologi Seluler dan Infeksi 4. ARTN 28 10.3389/fcimb.2014.00028.
Han, YM, Zhang, MH, Li, N., Chen, TY, Zhang, Y., Wan, T., dan Cao, XT (2004). KLRL1, reseptor mirip lektin sel pembunuh baru, menghambat sitotoksisitas sel pembunuh alami. Darah 104, 2858-2866. DOI 10.1182/darah-2004-03-0878.
Iliev, ID, Funari, VA, Taylor, KD, Nguyen, Q., Reyes, CN, Strom, SP, Brown, J., Becker, CA, Fleshner, PR, Dubinsky, M., dkk. (2012). Interaksi antara jamur komensal dan reseptor lektin tipe C Dectin-1 mempengaruhi kolitis. Sains 336, 1314-1317. 10.1126/sains.1221789.
Jason L. Kubinak, WZS, Ray Soto, Charisse Petersen, Tyson Chiaro, Lasha Gogokhia, Rickesha Bel1, Nadim J. Ajami, Joseph F. Petrosino, Linda Morrison4, Wayne K. Potts, Peter E. Jensen, Ryan M.O' Putaran Connell & June L. (2015). Variasi MHC membentuk komunitas mikroba individual yang mengontrol kerentanan terhadap infeksi enterik. Komunikasi Alam. 0,1038/ncomms9642.
Kono, H., Chen, CJ, Ontiveros, F., dan Rock, KL (2010). Asam urat meningkatkan respons inflamasi akut terhadap kematian sel steril pada tikus. J.Klin. Menginvestasikan. 120, 1939-1949. 10.1172/Jci40124.
Kozich, JJ, Westcott, SL, Baxter, NT, Highlander, SK, dan Schloss, PD (2013). Pengembangan Strategi Pengurutan Indeks Ganda dan Saluran Kurasi untuk Menganalisis Data Urutan Amplikon pada Platform Pengurutan MiSeq Illumina. Mikrobiologi Terapan dan Lingkungan 79, 5112-5120. 10.1128/Aem.01043-13.
Kubinak, JL, Petersen, C., Stephens, WZ, Soto, R., Bake, E., O'Connell, RM, dan Round, JL (2015). Pensinyalan MyD88 dalam sel T mengarahkan kontrol mikrobiota yang dimediasi IgA untuk meningkatkan kesehatan. Mikroba Inang Sel 17, 153-163. 10.1016/j.chom.2014.12.009.
Li, K., Neumann, K., Duhan, V., Namineni, S., Hansen, AL, Wartewig, T., Kurgyis, Z., Holm, CK, Heikenwalder, M., Lang, KS, dan Ruland, J.(2019). Reseptor kristal asam urat Clec12A mempotensiasi respons interferon tipe I. Proc Natl Acad Sci AS 116, 18544-18549. 10.1073/pnas.1821351116.
Liu, JZ, van Sommeren, S., Huang, H., Ng, SC, Alberts, R., Takahashi, A., Ripke, S., Lee, JC, Jostins, L., Shah, T., dkk . (2015). Analisis asosiasi mengidentifikasi 38 lokus kerentanan terhadap penyakit radang usus dan menyoroti risiko genetik bersama di seluruh populasi. Nat. Genet. 47, 979-986. 10.1038/ng.3359.
Cinta, MI, Huber, W., dan Anders, S. (2014). Estimasi perubahan lipatan dan dispersi yang dimoderasi untuk data RNA-seq dengan DESeq2. Biol Genom. 15. ARTN 550 10.1186/dtk13059-014-0550-8.
Love, MI, Soneson, C., Cupang, PF, Johnson, LK, Pierce, NT, Shepherd, L., Morgan, M., dan Patro, R. (2020). Tximeta: Checksum urutan referensi untuk identifikasi asal di RNA-seq. Biologi Komputasi Plos 16. ARTN e1007664 10.1371/journal.pcbi.1007664.
Luo, Y., Tucker, SC, dan Casadevall, A. (2005). Aktivasi reseptor Fc dan komplemen merangsang perkembangan siklus sel makrofag dari G1 menjadi SJ Immunol. 174, 7226- 7233. 10.4049/jimmunol.174.11.7226.
Macpherson, AJ, Gatto, D., Sainsbury, E., Harriman, GR, Hengartner, H., dan Zinkernagel, RM (2000). Mekanisme primitif yang tidak bergantung pada sel T dari respons IgA mukosa usus terhadap bakteri komensal. Sains 288, 2222-+. DOI 10.1126/sains.288.5474.2222.
Maglinao, M., Eriksson, M., Schlegel, MK, Zimmermann, S., Johannssen, T., Gotze, S., Seeberger, PH, dan Lepenies, B. (2014). Sebuah platform untuk menyaring karbohidrat pengikat reseptor lektin tipe C dan potensinya untuk penargetan spesifik sel dan modulasi kekebalan. Jurnal Rilis Terkendali 175, 36-42. 10.1016/j.jconrel.2013.12.011.
Marshall, ASJ, Willment, JA, Lin, HH, Williams, DL, Gordon, S., dan Brown, GD (2004). Identifikasi dan karakterisasi reseptor mirip lektin tipe-c (MICL) penghambat Myeloid manusia baru yang sebagian besar diekspresikan pada granulosit dan monosit. J.Biol. kimia. 279, 14792-14802. 10.1074/jbc.M313127200.
Martin, M. (2011). Cutadapt Menghapus Urutan Adaptor dari Pembacaan Urutan Throughput Tinggi. EMBNet.journal 17. Martinez-Lopez, M., Iborra, S., Conde-Garrosa, R., Mastrangelo, A., Danne, C., Mann, ER, Reid, DM, Gaboriau-Routhiau, V., Chaparro , M., Lorenzo, MP, dkk. (2019). Penginderaan Mikrobiota oleh Mincle-Syk Axis dalam Sel Dendritik Mengatur Produksi Interleukin-17 dan -22 serta Meningkatkan Integritas Penghalang Usus. Imunitas 50, 446-461 e449. 10.1016/j.imun.2018.12.020.
Martinon, F., Petrilli, V., Walikota, A., Tardivel, A., dan Tschopp, J. (2006). Kristal asam urat terkait asam urat mengaktifkan inflamasi NALP3. Alam 440, 237-241. 10.1038/alam04516.
Nakajima, A., Vogelzang, A., Maruya, M., Miyajima, M., Murata, M., Son, A., Kuwahara, T., Tsuruyama, T., Yamada, S., Matsuura, M., dkk. (2018). IgA mengatur komposisi dan fungsi metabolisme mikrobiota usus dengan mendorong simbiosis antar bakteri. J.Eks. medis. 215, 2019-2034. 10.1084/jem.20180427.
Neumann, K., Castineiras-Vilarino, M., Hockendorf, U., Hannesschlager, N., Lemeer, S., Kupka, D., Meyermann, S., Lech, M., Anders, HJ, Kuster, B. , dkk. (2014). Clec12a adalah reseptor penghambat kristal asam urat yang mengatur peradangan sebagai respons terhadap kematian sel. Imunitas 40, 389-399. 10.1016/j.imun.2013.12.015.
Okai, S., Usui, F., Yokota, S., Hori, IY, Hasegawa, M., Nakamura, T., Kurosawa, M., Okada, S., Yamamoto, K., Nishiyama, E., dkk Al. (2016). IgA monoklonal afinitas tinggi mengatur mikrobiota usus dan mencegah kolitis pada tikus. Nat Mikrobiol 1, 16103. 10.1038/nmicrobiol.2016.103.
Pabst, O., dan Slack, E. (2020). IgA dan mikrobiota usus: pentingnya menjadi spesifik. Imunol Mukosa. 13, 12-21. 10,1038/dtk41385-019-0227-4.
Taman, DH, Chuvochina, M., Waite, DW, Rinke, C., Skarshewski, A., Chaumeil, PA, dan Hugenholtz, P. (2018). Taksonomi bakteri standar berdasarkan filogeni genom secara substansial merevisi pohon kehidupan. Nat. Bioteknologi. 36, 996-+. 10.1038/nbt.4229.
Patro, R., Duggal, G., Love, MI, Irizarry, RA, dan Kingsford, C. (2017). Salmon memberikan kuantifikasi ekspresi transkrip yang cepat dan sadar bias. Nat. Metode 14, 417-+. 10.1038/nmeth.4197.
Pedregosa, F., Varoquaux, G., Gramfort, A., Michel, V., Thirion, B., Grisel, O., Blondel, M., Prettenhofer, P., Weiss, R., Dubourg, V., dkk. (2011). Scikit-learn: Pembelajaran Mesin dengan Python. J Mach Pelajari Res 12, 2825-2830.
Pyz, E., Huysamen, C., Marshall, AS, Gordon, S., Taylor, PR, dan Brown, GD (2008). Karakterisasi murine MICL (CLEC12A) dan bukti ligan endogen. euro. J. Imunol. 38, 1157-1163. 10.1002/eji.200738057.
Raulf, MK, Johannssen, T., Matthiesen, S., Neumann, K., Hachenberg, S., Mayer-Lambertz, S., Steinbeis, F., Hegermann, J., Seeberger, PH, Baumgartner, W., dkk. (2019). Reseptor lektin tipe C CLEC12A mengenali hemozoin plasmodial dan berkontribusi terhadap perkembangan malaria serebral. Perwakilan Sel 28, 30-38 e35. 10.1016/j.celrep.2019.06.015.
Ray, A., dan Dittel, BN (2015). Keterkaitan antara disbiosis pada mikrobiota usus akibat defisiensi imun dan penetrasi penyakit kolitis. Imunologi 146, 359-368. 10.1111/imm.12511.
Redelinghuys, P., Whitehead, L., Augello, A., Drummond, RA, Levesque, JM, Vautier, S., Reid, DM, Kerscher, B., Taylor, JA, Nigrovic, PA, dkk. (2016). MICL mengontrol peradangan pada rheumatoid arthritis. Ann. Selesma. Dis. 75, 1386-1391. 10.1136/anrheumdis-2014-206644.
