Cistanche Tubulosa Phenylethanoid Glycosides Menginduksi Apoptosis di Sel Eca‑109 Melalui Jalur yang Bergantung pada Mitokondria
Mar 06, 2022
Kontak: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:{0}}
CHANGSHUANG FU , JINYU LI , ADILA AIPIRE , LIJIE XIA , YI YANG , QIUYAN CHEN , JIE LV , XINHUI WANG and JINYAO LI
Abstrak
Cistanche tubulosamemiliki berbagai fungsi biologis. Dalam penelitian ini, efek antitumor dari glikosida fenilethanoid yang larut dalam air dari C. tubulosa (CTPG-W) pada kanker esofagus diselidiki. Sel Eca-109 diobati dengan CTPG-W dan viabilitas sel diukur dengan uji MTT. Apoptosis, siklus sel, potensial membran mitokondria (Δψm), dan spesies oksigen reaktif dianalisis dengan flow cytometry. Tingkat protein dalam jalur apoptosis dideteksi dengan analisis western blot. Ditentukan bahwa CTPG‑W secara signifikan mengurangi kelangsungan hidup sel Eca-109 melalui induksi apoptosis dan penghentian siklus sel. Setelah pengobatan CTPG-W, m Eca-109 terutama menurun, yang terkait dengan tingkat peningkatan regulasi limfoma sel B-2 (Bcl-2) terkait X dan tingkat penurunan regulasi dari Bcl-2. Akibatnya, kadar sitokrom c dan c-Jun NH2-terminal kinase meningkat, yang meningkatkan kadar cleaved-poly (ADP-ribose) polymerase dan cleaved-caspase-3, {{18} } dan -9, tetapi bukan huruf besar-8. Sejalan dengan itu, tingkat spesies oksigen reaktif dalam sel Eca-109 menunjukkan perubahan penting. Hasil ini menunjukkan bahwa CTPG-W menginduksi apoptosis sel Eca-109 melalui jalur yang bergantung pada mitokondria.
pengantar
Kanker kerongkongan adalah salah satu jenis kanker yang paling umum dengan tingkat morbiditas tertinggi ke-11 dan tingkat kematian tertinggi ke-6 secara global dan menyebabkan ~439,000 kematian pada tahun 2015 (1). Insiden kanker kerongkongan sangat bervariasi di antara wilayah yang berbeda, dengan Asia timur dan Afrika timur dan selatan menunjukkan tingkat kejadian tertinggi dan Afrika barat menunjukkan tingkat terendah pada tahun 2012 (1,2). Di Cina, perkiraan kasus dan kematian akibat kanker kerongkongan masing-masing adalah 477,000 dan 375,000, pada tahun 2015 (3). Meskipun angka morbiditas kanker esofagus telah menurun di negara-negara indeks sosiodemografi menengah dan tinggi antara tahun 2005 dan 2015, angka kematian tetap tinggi karena prognosis yang buruk (1,4). Kombinasi reseksi bedah dengan kemoterapi atau radioterapi telah digunakan untuk mengobati kanker esofagus, namun telah dilaporkan bahwa antara tahun 2003 dan 2014 tingkat kelangsungan hidup 5-tahun tetap<20% in="" china,="" the="" usa,="" and="" europe="" (4,5).="" for="" these="" reasons,="" it="" is="" urgent="" to="" develop="" novel="" therapeutic="" agents="" to="" treat="" esophageal="">
Obat herbal tradisional Cina (CHM) telah digunakan untuk mengobati berbagai jenis kanker, termasuk kanker paru-paru non-sel kecil (6), kanker kolorektal (7), karsinoma hepatoseluler (8). Baru-baru ini, uji klinis melaporkan bahwa kombinasi CHM dengan kemoterapi atau radioterapi tidak hanya menunjukkan sejumlah manfaat pada kualitas hidup dan mengurangi efek samping yang disebabkan oleh kemoterapi atau radioterapi (9,10), tetapi juga meningkatkan tingkat kelangsungan hidup pasien. dengan kanker paru non-sel kecil, hati, lambung, kolorektal, nasofaring atau serviks (9). Namun, ada bukti yang bertentangan mengenai kemanjuran pengobatan CHM pada kanker kerongkongan (10,11). Sejumlah penelitian menetapkan bahwa sejumlah obat atau komponen herbal dapat menghambat pertumbuhan sel kanker esofagus secara in vitro dan in vivo, antara lain Andrographis paniculata (12,13), Daikenchuto (14), icariin (15), Rosa Roxburghii Tratt, dan Fagopyrum. Cymosum (16), Jaridonin (17), Marsdenia tenacissima (18), OP16 (sebuah novel ent-kaurene diterpenoid) (19), Qigesan (20) dan rebusan Tonglian (21). Cistanche adalah jenis CHM dan memberikan berbagai fungsi biologis, termasuk anti-oksidasi, anti-inflamasi, dan pelindung saraf (22,23). Penelitian kami sebelumnya menunjukkan bahwaGlikosida fenilethanoid Cistanche tubulosa(CTPG) dapat menekan pertumbuhan sel melanoma B16-F10 in vitro dan in vivo (24). Namun, kelarutan air yang buruk dari CTPG yang sebelumnya digunakan membatasi pengembangan obat (24). Oleh karena itu, CTPG yang larut dalam air (CTPG-W) digunakan dan efek antitumor pada sel kanker esofagus (Eca-109) diselidiki. Ditentukan bahwa CTPG-W dapat secara mandiri menghambat kelangsungan hidup sel Eca-109 melalui induksi apoptosis melalui jalur yang bergantung pada mitokondria.
Bahan dan metode Hewan.
Tikus betina C57BL/6 (6-8 minggu, ~25 g) dibeli dari Pusat Penelitian Hewan Laboratorium Beijing (Beijing, Cina) dan ditempatkan di suhu terkontrol (25˚C), bersepeda ringan (12/ 12) Fasilitas Hewan Universitas Xinjiang (Urumqi, Cina). Semua hewan menerima air dan makanan bebas patogen.
Garis sel dan kultur. Garis sel karsinoma esofagus manusia (Eca-109) diawetkan oleh Laboratorium Kunci Xinjiang untuk Sumber Daya Biologis dan Rekayasa Genetika (Sekolah Tinggi Ilmu Pengetahuan dan Teknologi Hayati, Universitas Xinjiang, Urumqi, Cina) dan dibiakkan di RPMI{{1} } medium (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA) dilengkapi dengan 10 persen serum janin sapi yang tidak diaktifkan panas (FBS; MRC, EN MOASAI Biological Technology Co., Ltd, Jiangsu, China), 1 persen L -glutamin (100 mM), 100 U/ml penisilin dan 100 g/ml streptomisin pada 37˚C dalam suasana lembab yang mengandung 5 persen CO2.
Kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC). CTPG-W (cat. no. SGJG20170410) dibeli dari Shanghai Upbio Tech Co., Ltd. (Shanghai, China). Senyawa utama CTPG memenuhi syarat dan diukur dengan HPLC menurut penelitian kami sebelumnya (24). Secara singkat, HPLC dilakukan pada Kolom ZORBAX SB‑C18 (250x4.6 mm; 5 m) pada 30˚C dan dielusi dengan larutan asam format 0,2 persen dan gradien metanol mulai dari 23 persen, karena 1 ml ditambahkan setiap menit. selama 45 menit hingga mencapai 31 persen. Sebanyak 10 l sampel disuntikkan dan dideteksi pada 330 nm. Standar echinacoside dibeli dari Shanghai Baoban Biotech Co., Ltd. (Shanghai, Cina), dan standar acteoside dibeli dari Sigma-Aldrich (Merck KGaA, Darmstadt, Jerman). Standar tersebut digunakan untuk menganalisis komponen CTPG-W.
uji MTT. Proliferasi sel diukur dengan uji MTT. Eca{{0}} sel diinokulasi ke dalam 96-well plate dengan kepadatan 5x103 sel dalam 100 l RPMI{{5 }} medium/sumur dan dikultur pada 37˚C selama 24 jam, kemudian diperlakukan dengan konsentrasi yang berbeda (0, 200, 400, 600, dan 800 g/ml) CTPG-W atau 0,4 persen dimetil sulfoksida (DMSO) selama 24, 48 dan 72 jam. DMSO digunakan sebagai kontrol pelarut (800 g/ml CTPG-W mengandung 0,4 persen DMSO). Cisplatin (20 g/ml) digunakan sebagai kontrol positif. Selanjutnya, supernatan dibuang setelah disentrifugasi pada 225 xg selama 5 menit pada suhu kamar, dan 100 l larutan MTT (0,5 mg/ml dalam media RPMI-1640 tanpa FBS) ditambahkan ke setiap sumur dan diinkubasi pada suhu 37˚C. selama 3 jam. Kristal formazan yang terbentuk dilarutkan dalam 200 l DMSO. Nilai densitas optik (OD) diukur pada panjang gelombang 490 nm dengan 96-pembaca lempeng mikro (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). Viabilitas sel relatif dihitung menurut rumus: Viabilitas sel ( persen )=(ODtreated/ODuntreated)x100 persen . Morfologi sel Eca‑109 diamati dengan mikroskop fluoresensi terbalik (pembesaran, x200) (Nikon Eclipse Ti‑E; Nikon Corporation, Tokyo, Jepang).
Untuk proliferasi splenosit, tikus C57BL/6 di-eutanasia dengan dislokasi serviks, dan limpa diisolasi. Suspensi sel tunggal dibuat dan splenosit diunggulkan ke dalam 96-piring sumur dengan kepadatan 1x105 sel/sumur dalam media 100 l RPMI{-1640, dan kemudian diperlakukan dengan konsentrasi yang berbeda (0, 200, 400, 600, dan 800 g/ml) CTPG-W selama 24, 48 dan 72 jam pada 37˚C dengan 5 persen CO2. Proliferasi splenosit diukur dengan uji MTT, sesuai dengan protokol yang disebutkan di atas. Indeks stimulator=ODtreated/ODuntreated.
Pengukuran apoptosis dan siklus sel. Sel Eca{{0}} dikultur dalam cawan 60 mm dengan kepadatan 2,5x105 sel/piring selama 24 jam dan diperlakukan dengan konsentrasi yang berbeda ({{31} }, 200, 400, 600, dan 800 g/ml) CTPG-W atau 0,4 persen DMSO selama 24 jam pada 37˚C dengan 5 persen CO2. Sel dikumpulkan dan diwarnai dengan kit Deteksi Apoptosis Annexin V‑fluorescein isothiocyanate (FITC)/Propidium iodide (PI) (Shanghai Shengsheng Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China), sesuai dengan protokol pabrikan. Sampel dikumpulkan dengan flow cytometry (BD FACSCalibur; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) dan dianalisis dengan FlowJo 7.6 (Tree Star, Inc., Ashland, OR, USA). Untuk menganalisis efek CTPG-W pada siklus sel, sel 2.5x105 Eca-109 diunggulkan dalam cawan kultur 60 mm dan diperlakukan dengan CTPG-W (0, 100, 200, dan 400 g/ml) atau 0,4 persen DMSO selama 24 jam pada 37˚C dengan 5 persen CO2. Semua sel dipanen dan dicuci dua kali dengan PBS dingin (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.), kemudian difiksasi dalam 70 persen etanol dingin pada suhu 4˚C selama 30 menit. Setelah dicuci dua kali dengan PBS sedingin es, sel disuspensikan kembali dalam 300 l buffer pewarnaan PI / RNase (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) selama 10 menit pada suhu kamar. Distribusi siklus sel dianalisis dengan perangkat lunak ModFit LT 3.0 dengan flow cytometry (BD FACSCalibur).
Analisis potensi membran mitokondria (Δψm) dan spesies oksigen reaktif (ROS). Untuk menganalisis m, sel Eca{{0}} diperlakukan dengan CTPG-W (0, 400, 600 dan 800 g/ml) atau 0,4 persen DMSO selama 24 jam pada 37˚C dengan 5 persen CO2, dan diwarnai dengan kit uji potensi membran mitokondria dengan JC-1 (Beyotime Institute of Biotechnology, Shanghai, China), menurut protokol pabrikan, selama 20 menit pada 37˚C . Setelah dicuci dua kali dengan buffer pencuci JC-1 (Beyotime Institute of Biotechnology), sampel disuspensikan kembali dengan 300 l buffer pencuci JC‑1 dan dianalisis dengan flow cytometry (BD FACSCalibur). Fluoresensi pewarna JC‑1 dalam sel Eca‑109 juga diamati dengan mikroskop fluoresensi terbalik (pembesaran, x200; Nikon Eclipse Ti‑E). Untuk analisis ROS, sel Eca-109 diperlakukan dengan CTPG-W (0, 400, 600, dan 800 g/ml) selama 2, 4, 6, 12, dan 24 jam, dan diwarnai dengan Reactive Oxygen Species Kit Assay (Beyotime Institute of Biotechnology), menurut protokol pabrikan, selama 20 menit pada 37˚C. Setelah dicuci tiga kali dengan PBS dingin, sampel dikumpulkan dengan flow cytometry (BD FACSCalibur) dan dianalisis dengan perangkat lunak FlowJo 7.6.
2,2‑difenil‑1‑pikrilhidrazil (DPPH) aktivitas pemulungan radikal. Aktivitas penangkapan radikal bebas CTPG-W ditentukan dengan uji radikal bebas DPPH sesuai dengan protokol yang diterbitkan dengan sedikit modifikasi, karena metanol diganti dengan etanol untuk melarutkan DPPH (25,26). Untuk pengukuran kondisi tunak, 150 l DPPH (100 mmol/l) dalam etanol dicampur dengan konsentrasi CTPG-W yang berbeda (25, 50, 75, 100, 250, 300, 400, 500, dan 600 g/ml) dalam 50 l PBS, dan diinkubasi di tempat gelap selama 30 menit pada suhu kamar. Absorbansi pada 517 nm terdeteksi dengan ada dan tidak adanya CTPG-W. Sebanyak 50 l Vitamin C digunakan sebagai kontrol positif. Aktivitas scavenging radikal DPPH dihitung dengan menggunakan rumus: Scavenging ( persen )=[1-(A sample-Ablank)/A0] x100, di mana Ablank adalah absorbansi kontrol (tanpa DPPH), Sampel adalah absorbansi sampel dan A0 adalah absorbansi PBS dengan DPPH.
analisis noda barat. Sel Eca{{0}} diperlakukan dengan CTPG-W (0, 200, 600 g/ml) atau 0,4 persen DMSO selama 24 jam pada 37˚C dengan 5 persen CO2. Pencucian berikutnya dua kali dengan PBS, sel-sel dilisiskan dalam buffer Radioimmunoprecipitation Assay Lysis (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd., Beijing, China) selama 20 menit di atas es. Setelah sentrifugasi pada 10,000 xg selama 10 menit pada suhu 4˚C, supernatan dikumpulkan, dan konsentrasi protein dideteksi dengan kit asam bicinchoninic (Thermo Fisher Scientific, Inc.) sesuai dengan protokol pabrikan. Analisis Western blot dilakukan sesuai dengan deskripsi kami sebelumnya (24). Antibodi terhadap caspase-7 (cat. no. D120077), caspase-8 (cat. no. D155240), caspase-9 (cat. no. D220078), limfoma sel B{ {24}} (Bcl-2)-terkait X (Bax) (cat. no. D220073) dan Bcl-2 (cat. no. D260117), dan anti-tikus IgG-horseradish peroxidase (HRP ) (cat. no. D111050) dan anti-kelinci IgG-HRP (cat. no. D110058) dibeli dari BBI Life Sciences (Shanghai, China). Antibodi terhadap caspase-3 (cat. no. E-AB-10050) dan caspase aktif-3 (cat. no. E-AB-22115) dibeli dari Elabscience ( Wuhan, Cina). Antibodi lain terhadap caspase-7 (cat. no. 9492), poli (ADP-ribose) polymerase (PARP) (cat. no. 9542), cytochrome c (cat. no. AC909), c-Jun NH{ {48}}terminal kinase (JNK) (cat. no. 9252S), dan -actin (cat. no. 58169) diperoleh dari Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA). Semua antibodi primer dan sekunder diencerkan pada 1:1,000. Antibodi primer diinkubasi pada suhu 4˚C semalaman dan antibodi sekunder diinkubasi pada suhu 37˚C selama 1 jam.
Protein target dideteksi menggunakan kit uji chemiluminescence yang disempurnakan (Beyotime Institute of Biotechnology), menurut protokol pabrikan.
Analisis statistik. Signifikansi statistik dihitung dengan analisis varians satu arah dengan uji post hoc Tukey dan hasilnya dianalisis menggunakan perangkat lunak GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA) di antara kelompok perlakuan dan kontrol. Semua data disajikan sebagai mean ± standar deviasi. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Glikosida fenilethanoid Cistanche tubulosa(CTPG)
Hasil
CTPG‑W menekan pertumbuhan sel Eca‑109. Komponen CTPG-W dikualifikasi dan diukur dengan HPLC (Gbr. 1), yang dibandingkan dengan standar echinacosida dan akteosida. Menurut waktu retensi puncak dan area puncak, CTPG-W mengandung 39,16 persen echincoside dan 2,44 persen acteoside. Pertama, efek CTPG-W pada kelangsungan hidup sel Eca-109 ditentukan dengan uji MTT. CTPG-W dilarutkan dalam DMSO pada 200 mg/ml dan diencerkan dengan media RPMI-1640 yang mengandung 10 persen FBS yang tidak diaktifkan panas hingga konsentrasi yang ditunjukkan. Sel Eca-109 diperlakukan dengan CTPG-W dan viabilitas sel dianalisis dengan uji MTT pada titik waktu yang ditunjukkan. Perawatan CTPG‑W secara signifikan mengurangi kelangsungan hidup sel Eca-109 dengan cara yang bergantung pada dosis dan waktu (P<0.001; fig.="" 2a).="" the="" morphology="" of="" eca-109="" cells="" was="" observed="" with="" an="" inverted="" fluorescence="" microscope="" (magnification,="" x200)="" following="" ctpg‑w="" treatment="" for="" 24="" h,="" which="" changed="" notably="" in="" a="" dose-dependent="" manner,="" with="" the="" cells="" shrinking="" and="" becoming="" round="" following="" ctpg-w="" treatment="" (fig.="" 2b).="" these="" results="" indicate="" that="" ctpg-w="" suppresses="" the="" growth="" of="" eca-109="" cells.="" the="" effect="" of="" ctpg-w="" on="" the="" proliferation="" of="" splenocytes="" was="" also="" detected="" with="" an="" mtt="" assay.="" ctpg-w="" significantly="" promoted="" the="" proliferation="" of="" splenocytes="" in="" a="" dose-dependent="" manner="" (fig.="" 2c),="" indicating="" that="" it="" has="" no="" cytotoxic="" effect="" on="">
CTPG‑W menginduksi apoptosis pada sel Eca‑109. Untuk menyelidiki apakah CTPG-W menekan pertumbuhan sel Eca-109 melalui induksi apoptosis atau nekrosis, sel diperlakukan dengan konsentrasi CTPG-W yang berbeda. Setelah 24 jam, apoptosis dan nekrosis sel Eca-109 terdeteksi dengan pewarnaan Annexin V/PI. Seperti digambarkan pada Gambar. 3A, sel Annexin V-/PI plus digerbang sebagai sel nekrotik, dan Annexin V plus /PI plus dan Annexin V plus /PI- sel digerbang sebagai sel apoptosis. CTPG-W terutama menginduksi apoptosis sel Eca-109 dengan cara yang bergantung pada dosis, meskipun sel Eca-109 yang nekrotik juga meningkat secara signifikan di bawah pengobatan 600 dan 800 g/ml CTPG-W (P<0.001 at="" 600="" µg/ml="" and=""><0.05 at="" 800="" µg/ml).="" consistently,="" the="" levels="" of="" pro-apoptotic="" bax="" and="" anti-apoptotic="" bcl-2="" in="" eca-109="" cells="" were="" upregulated="" and="" downregulated,="" respectively,="" upon="" ctpg-w="" treatment="" (fig.="" 3b).="" the="" results="" indicated="" that="" ctpg-w="" primarily="" inhibited="" the="" growth="" of="" eca-109="" cells="" through="" the="" induction="" of="">
CTPG‑W menginduksi penghentian siklus sel pada fase S dalam sel Eca‑109. Gangguan siklus sel kanker akan menekan pertumbuhan sel dan mendorong apoptosis (27). Distribusi siklus sel dalam sel Eca-109 terdeteksi dengan pewarnaan PI setelah pengobatan CTPG-W selama 24 jam. Diamati bahwa sel-sel dalam fase S meningkat dan sel-sel dalam fase G0/G1 menunjukkan penurunan yang signifikan secara keseluruhan pada pengobatan CTPG‑W (P<0.05; fig.="" 4),="" indicating="" that="" ctpg-w="" arrests="" the="" eca-109="" cell="" cycle="" at="" the="" s="">
CTPG‑W menurunkan m dan menginduksi pelepasan sitokrom c. Apoptosis dapat diinduksi oleh jalur yang bergantung pada mitokondria (28,29). Anggota pro-dan anti-apoptosis dari keluarga protein BCL-2 berperan penting dalam regulasi integritas membran mitokondria (30,31). Setelah pengobatan CTPG-W selama 24 jam, m dinilai menggunakan pewarnaan JC‑1. Agregat JC‑1 (fluoresensi merah terdeteksi di FL‑2) akan hancur menjadi monomer (fluoresensi hijau terdeteksi di FL-1) ketika m berkurang (32). Seperti digambarkan pada Gambar. 5A, frekuensi sel FL-1 plus FL-2-/plus meningkat secara signifikan dengan cara yang bergantung pada dosis, menunjukkan bahwa m sel Eca‑109 menurun. Perubahan fluoresensi dalam sel Eca‑109 juga diamati dengan mikroskop fluoresensi terbalik (Gbr. 5B). Dengan meningkatnya konsentrasi CTPG‑W, fluoresensi merah menurun dan fluoresensi hijau meningkat, yang konsisten dengan data dari flow cytometry. Juga diamati bahwa tingkat sitokrom c dalam sitosol meningkat secara signifikan (Gbr. 5C), yang merupakan hasil dari pengurangan m. Ini memperkuat kesimpulan yang diambil dari peningkatan jumlah FL-1 plus FL-2-/plus sel yang m menurun sebagai akibat dari pengobatan CTPG-W. Telah dilaporkan bahwa JNK dapat mengatur aktivasi keluarga protein BCL-2 yang menyebabkan pelepasan sitokrom c (33-35). Juga ditentukan bahwa tingkat JNK terutama diregulasi setelah pengobatan CTPG-W (Gbr. 5C). Hasilnya menunjukkan bahwa CTPG-W dapat menginduksi apoptosis sel Eca-109 melalui jalur yang bergantung pada mitokondria.
Efek CTPG‑W pada generasi ROS intraseluler. ROS dapat mengurangi m untuk menginduksi apoptosis (36). Untuk menyelidiki apakah CTPG-W dapat meningkatkan produksi ROS, sel Eca-109 diperlakukan dengan konsentrasi CTPG-W yang berbeda. Sel dikumpulkan pada titik waktu yang ditunjukkan dan diwarnai dengan DCFH-DA. Produksi ROS intraseluler dalam sel Eca-109 ditentukan oleh flow cytometry. Seperti digambarkan pada Gambar. 6A, 800 g/ml CTPG-W secara signifikan meningkatkan produksi ROS dari 2-6jam dan menurun dari 12-24 jam. Selain itu, 400 g/ml CTPG‑W secara signifikan meningkatkan produksi ROS dari 12-24 jam. Lebih lanjut, 200 g/ml CTPG-W tidak secara signifikan mengubah produksi ROS. Perubahan dinamis produksi ROS mungkin terkait dengan apoptosis sel Eca-109. Juga ditentukan bahwa CTPG-W memiliki aktivitas pembersihan radikal bebas (Gbr. 6B), yang mungkin terkait dengan penurunan produksi ROS dalam sel Eca-109 yang diobati dengan 800 g/ml CTPG-W setelah 12 jam.
CTPG‑W meningkatkan aktivitas caspase‑3, caspase‑7, caspase‑9 dan PARP. Pelepasan sitokrom c akibat reduksi m dapat mengaktifkan protease caspase untuk menginduksi apoptosis (29,30,37). Setelah pengobatan CTPG-W selama 24 jam, aktivasi caspase-3, 7, 8, 9, dan PARP dideteksi dengan analisis western blot. Dibandingkan dengan kontrol, tingkat cleaved-caspase-9, cleaved-caspase-7, cleaved-caspase-3, dan cleaved-PARP, tetapi tidak tingkat cleaved-caspase{{ 20}}, diregulasi oleh pengobatan CTPG dengan cara yang bergantung pada dosis (Gbr. 7). Hasil ini menunjukkan bahwa CTPG-W mengurangi m dan mendorong pelepasan sitokrom c untuk mengaktifkan caspases yang menginduksi apoptosis sel Eca-109.
Ekstrak Cistanche tubulosa
Diskusi
CHM tradisional dapat menginduksi apoptosis sel kanker esofagus melalui jalur yang berbeda, termasuk reseptor kematian ekstrinsik, jalur stres retikulum mitokondria dan endoplasma intrinsik (29). Penelitian kami sebelumnya menunjukkan bahwa CTPG, sebagai komponen utama C. tubulosa, menghambat pertumbuhan sel melanoma B16-F10 melalui induksi apoptosis melalui jalur yang bergantung pada mitokondria (24). Dalam penelitian ini, efek antitumor CTPG-W pada sel Eca-109 diselidiki dan ditentukan bahwa CTPG-W menekan pertumbuhan sel Eca-109, menginduksi apoptosis, dan penghentian siklus sel, mengurangi m, meningkatkan pelepasan sitokrom c dan mengaktifkan caspases. CTPG dan CTPG-W dapat menginduksi apoptosis dan penghentian siklus sel pada sel kanker. Namun, mekanisme yang akurat berbeda karena komponen CTPG yang berbeda (26,64 persen echinacoside, 10,19 persen acteoside, dan 1,71 persen isoacteoside) dan CTPG-W (39,16 persen echinacoside dan 2,44 persen acteoside). CTPG menangkap sel B16-F10 pada fase G0/G1, tetapi CTPG-W menahan sel Eca-109 pada fase S (24). Produksi ROS meningkat tergantung dosis oleh CTPG, tetapi ini menunjukkan perubahan tergantung waktu dengan CTPG‑W dosis tinggi, yang meningkat secara signifikan pada awal pengobatan CTPG-W (2-6 jam) dan menurun secara signifikan setelah 12 jam, dibandingkan dengan kontrol. Alasan yang mungkin adalah bahwa komponen utama CTPG-W adalah echinacosida. Sejumlah penelitian melaporkan bahwa echinacosida dapat menghambat produksi ROS dan apoptosis yang diinduksi ROS untuk memberikan efek neuroprotektif dan anti-penuaan (38-40). Demikian pula, aktivitas pemulungan radikal bebas diamati dalam penelitian ini. Oleh karena itu, diduga bahwa beberapa komponen, termasuk verbascoside, iso-verbascoside, dan salidroside dalam dosis tinggi CTPG-W dapat segera menginduksi pembentukan ROS untuk menyebabkan apoptosis sel Eca-109 (41,42), dan kemudian ROS diambil oleh echinacosida. Alasan lain yang mungkin untuk perbedaan dalam produksi ROS oleh CTPG dan CTPG-W adalah bahwa garis sel yang berbeda digunakan dalam penelitian ini dan penelitian sebelumnya (24). Dong et al (43) melaporkan bahwa echinacosida dapat menginduksi apoptosis sel kanker kolorektal SW480 manusia melalui generasi kerusakan DNA oksidatif tanpa peningkatan kadar ROS.
Pengobatan CTPG-W mengurangi m dan menyebabkan pelepasan sitokrom c, yang mendorong pembelahan caspase-9 (28). Secara konsisten, tingkat cleaved-caspase-9 diregulasi oleh pengobatan CTPG-W. Selanjutnya, caspase aktif-9 dapat mengaktifkan caspase-3 untuk menginduksi apoptosis (44). Tingkat cleaved-caspase-3 juga diregulasi oleh pengobatan CTPG-W. Namun, caspase-8 tidak diaktifkan oleh CTPG-W, menunjukkan bahwa jalur reseptor kematian ekstrinsik tidak terlibat dalam apoptosis yang diinduksi oleh CTPG-W. Pengamatan ini menunjukkan bahwa CTPG-W menginduksi apoptosis sel Eca-109 melalui aktivasi jalur yang bergantung pada mitokondria.
PARP berperan penting dalam stabilitas genom dan dapat dibelah oleh kaspase aktif, khususnya kaspase-3 dan -7 (45). Ditentukan bahwa pengobatan CTPG-W mengaktifkan caspase-3 dan -7, yang dapat membelah PARP untuk menghambat perbaikan DNA dan menyebabkan apoptosis.
CTPG-W juga bergantung pada dosis dan waktu menekan pertumbuhan sel karsinoma hepatoseluler manusia BEL-7404 (data tidak dipublikasikan). Meskipun CTPG-W menghambat pertumbuhan sel Eca-109 dan BEL-7404, ia mendorong proliferasi splenosit, yang mungkin disebabkan oleh kandungan polisakarida (~50 persen ) di CTPG-W (46 ). Demikian pula, sejumlah penelitian telah melaporkan bahwa polisakarida dapat meningkatkan proliferasi splenosit (46-49). Pada model tikus, ditentukan bahwa CTPG‑W secara signifikan meningkatkan indeks limpa, dibandingkan dengan kelompok kontrol, tetapi tidak mempengaruhi berat badan dan indeks organ lainnya termasuk jantung, hati, ginjal, dan paru-paru (data tidak dipublikasikan), menunjukkan bahwa CTPG-W tidak memiliki efek sitotoksik pada sel normal.
Secara kolektif, data menunjukkan bahwa CTPG-W menghambat pertumbuhan sel Eca-109 dengan menginduksi apoptosis melalui jalur yang bergantung pada mitokondria.
manfaat cistanche: anti-apoptosis
Ucapan Terima Kasih
Penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada Dr. Jianhua Yang (Baylor College of Medicine) yang telah memoles naskah ini.
Pendanaan
Studi ini didukung oleh Proyek Pelelangan Biologi Disiplin Utama Rencana Lima Tahun ke-13 (hibah no. 17SDKD0202), Universitas Normal Xinjiang dan Laboratorium Utama Aplikasi dan Regulasi Keanekaragaman Hayati Lingkungan Khusus di Xinjiang (hibah no. XJTSWZ-2017-04) kepada JL dan Hibah Yayasan Ilmu Pengetahuan Alam Nasional China (hibah no. 31760260) kepada XW.
Ketersediaan data dan bahan
Data dan bahan yang digunakan dan dianalisis selama penelitian ini tersedia dari penulis terkait atas permintaan yang wajar.
Kontribusi penulis
CF, AA, YY, dan QC melakukan percobaan. LX, JLv, dan XW menganalisis data dan angka yang disiapkan. JinyuL dan JinyaoL merancang proyek dan menulis naskahnya.
Persetujuan etika dan persetujuan untuk berpartisipasi
Semua eksperimen hewan telah disetujui oleh Komite Etika Eksperimen Hewan dari Laboratorium Utama Sumber Daya Biologi dan Rekayasa Genetika Xinjiang (persetujuan, no. BRGE-AE001; Universitas Xinjiang).
Persetujuan pasien untuk publikasi
Tak dapat diterapkan.
Kepentingan bersaing
Para penulis menyatakan bahwa mereka tidak memiliki kepentingan yang bersaing.
Referensi
Wu CR, Lin HC, dan Su MH: Pembalikan oleh airekstrak Cistanche tubulosadari defisit perilaku pada model tikus seperti penyakit Alzheimer: Relevansi untuk deposisi amiloid dan fungsi neurotransmitter pusat. BMC Complement Altern Med 14:202, 2014.
Li J, Aspire A, Gao L, Huo S, Luo J dan Zhang F:Glikosida fenilethanoid dari Cistanche tubulosamenghambat pertumbuhan sel B16-F10 baik in vitro maupun in vivo dengan induksi apoptosis melalui Jalur yang bergantung pada mitokondria. J Kanker 7: 1877-1887, 2016.
Brand-Williams W, Culver ME, dan Berset C: Penggunaan metode radikal bebas untuk mengevaluasi aktivitas antioksidan. LWT-Food Sci Technol 28: 25-30, 1995.
