Cistanche Species Mitogenomes Menyarankan Keanekaragaman Dan Kompleksitas dalam Lamiales-Order Mitogenomes

2.4. Pengulangan dan Analisis Duplikasi Segmen

Jenis dan jumlah pengulangan bervariasi di antara ketiga mitogenom. SSR adalah urutan yang terdiri dari pengulangan dengan panjang motif 1 hingga 6 bp. Di antara mitogenom Cistanche, jumlah SSR berkisar antara 37–133 dengan urutan sebagai berikut:C. tubulosa (133),C.deserticola(44) danC.salsa(37). Jenis pengulangan poliadenin atau politimin adalah SSR mononukleotida yang paling umum (Gambar 2A dan Tabel S10). Hasil ini sesuai dengan fakta bahwa kandungan AT (55,41–55,43 persen ) lebih tinggi daripada kandungan GC (44,57–44,59 persen ) dalam mitogenom Cistanche (Tabel 1).

Gambar 2. Pengulangan urutan sederhana (SSR), pengulangan diselingi dan pengulangan tandem pada 3 mitogenom spesies Cistanche. ( A ) Perbandingan SSR di antara ketiga mitogenom. Setiap kolom warna mewakili jenis pengulangan SSR yang berbeda. ( B ) Perbandingan pengulangan tandem di antara ketiga mitogenom. ( C ) Perbandingan pengulangan diselingi dalam tiga mitogenom. Setiap kolom warna mewakili jenis pengulangan-selingan yang berbeda. Jumlah pengulangan di setiap kategori ditampilkan di bagian atas kolom yang sesuai.

Klik Di Sini Untuk Mendapatkan Info Lebih Lanjut tentang Bagaimana Cistanche meningkatkan Kesehatan

Selanjutnya, kami mendeteksi pengulangan yang diselingi oleh REPuter. Pengulangan diselingi dibagi menjadi empat jenis: pengulangan maju, palindrom, mundur, dan komplemen. DalamMitogenom Cistanche, pengulangan maju dan palindromik adalah jenis utama dari pengulangan diselingi (Gambar 2B dan Tabel S11-S13). Hanya 353 pengulangan diselingi yang terdeteksi pada mitogenom C. salsa (Tabel S12), dan lebih dari 1300 pada C. tubulosa (Tabel S13).

In addition to the SSRs and interspersed repeats, we also detected tandem repeats >30 bp in length and similarities of >90 persen . Jumlah pengulangan yang diselingi berkisar antara 4 hingga 26 dalam mitogenom Cistanche (Gambar 2C). Jumlah unit pengulangan berkisar antara 1,8 hingga 2,5 salinan per pengulangan tandem, dan ukuran pengulangan berkisar antara 21 hingga 127 bp (Tabel S14–S16).

Hasil identifikasi duplikasi segmen menunjukkan bahwa sekuens segmen berkisar antara 199.584 bp hingga 2.142.551 bp panjangnya (Tabel 1), terhitung 24,9 persen , 11,7 persen dan 53,9 persen dari panjang C. deserticola, C. salsa dan C. mitogenom tubulosa, masing-masing (Gambar 3). Dalam mitogenom C. deserticola, 39 keberpihakan diidentifikasi. Panjang penyelarasan berkisar dari 5078 bp hingga 38.025 bp (Tabel S17). Sebaliknya, hanya 14 keberpihakan yang diidentifikasi dalam mitogenom C. salsa. Panjang keselarasan berkisar antara 5385 bp hingga 23.085 bp (Tabel S18). Perlu dicatat bahwa 168 penjajaran ditemukan pada mitogenom C. tubulosa. Panjang penyelarasan berkisar antara 5169 bp hingga 64.106 bp (Tabel S19). Duplikasi segmen pasir berulang ini mungkin telah mempromosikan penataan ulang genom dan berkontribusi pada variasi ukuran genom.

Gambar 3. Distribusi duplikasi segmen mitogenomik dari3 spesies Cistanche. (A) Cistanche tubulosa. (B) Cistanche deserticola. (C) Salsa cistanche. Lingkaran terluar menandai posisi mitogenom. Busur kuning cerah menunjukkan duplikasi segmen.

2.5. Analisis Filogenetik dengan Urutan Mitogenom

Filogeni direkonstruksi menggunakan PCG mitokondria bersama dari 11 mitogenom Lamiales menggunakan metode kemungkinan maksimum (ML). Genus saudara dariCistancheadalah Castilleja, dengan skor bootstrap (BS) 100 (Gambar 4). Kedua genera ini termasuk dalamkeluarga Orobanchaceae. Spesies Cistanche didistribusikan dalam dua clade utama. Clade pertama (BS: 100) dibentuk olehC.deserticoladanC.salsa, dengan ukuran mitogenom yang sama. Clade kedua berisi C. tubulosa dengan BS 100. Kedua clade ini kemudian dikelompokkan bersama (BS: 100) (Gambar 4). Skor bootstrap tinggi untuk semua cabang, menunjukkan tingkat keandalan pohon filogenetik yang tinggi. Selain itu, hubungan filogenetik darispesies Cistanchedibangun menggunakan mitogenom adalah kongruen dengan yang menggunakan genom plastid, seperti yang ditunjukkan dalam penelitian kami sebelumnya.

Gambar 4. Hubungan filogenetik spesies Cistanche dengan 8 spesies Lamiales lainnya. Pohon itu dibangun berdasarkan urutan asam amino dari 49 gen penyandi protein mitokondria, termasuk atp1, atp4, atp6, atp8, atp9, atpB, atpE, ccmB, ccmC, ccmFc, ccmFn, tongkol, cox1, cox2, cox3, cytB, ItrA, matR, mttB, nad1, nad2, nad3, nad4, nad4L, nad5, nad6, nad7, nad9, petG, petL, rbcL, rpl2, rpl5, rpl10, rpl16, rpl23, rpl36, rps1, rps3, rps4, rps7, rps10, rps11, rps12, rps13, rps14, rps19, sdh3 dan sdh4. Spesies dalam kotak merah ada tigaspesies Cistanche.

2.6. Tingkat Pergantian PCG Mitokondria

PCG mitokondria bersama digunakan untuk memperkirakan tingkat substitusi nukleotida dari PCG mitokondria di Lamiales. Untuk masing-masing dari 28 PCG, rasio Ka/Ks berpasangan dihitung. Kami menemukan bahwa ransum Ka/Ks dari empat PCG lebih dari 1.0 di sebagian besar spesies (Gambar 5 dan Tabel S20). Keempat PCG ini adalah atp4, ccmB, ccmFc dan matR, yang menunjukkan potensi seleksi positif. Namun, sebagian besar PCG mitokondria menunjukkan rasio Ka/Ks yang rendah, menunjukkan kemungkinan seleksi pemurnian. Secara khusus, rasio Ka/Ks dari atp9, cox1, cox3 dan nad4L menunjukkan nilai yang relatif rendah (Gambar S8–S31).

Gambar 5. Boxplot nilai Ka/Ks berpasangan di antara masing-masing gen penyandi protein mitokondria yang dipertahankan dalam 11 spesies Lamiales.

3. Diskusi

3.1. Ekspansi Genom pada C. tubulosa

Sebagian besar mitogenom tanaman dapat terdiri dari urutan berulang kecil [26]. Sebagai contoh, DNA berulang dengan kompleksitas rendah membentuk 5-10 persen dari sekuens dalam mitogenom Citrullus dan Cucurbita [27]. Selain itu, rasio serupa dari sekuens DNA berulang dengan kompleksitas rendah diamati pada tanaman lain [9,28]. Dalam penelitian kami, C. tubulosa, C. salsa, dan C. deserticola memiliki urutan berulang dengan panjang 174.618 bp, 32.375 bp, dan 149.945 bp, terhitung masing-masing 4,4 persen , 1,89 persen, dan 8,06 persen dari ukuran mitogenom. Hasil ini sejalan dengan hasil penelitian sebelumnya yang menunjukkan bahwa sekuen yang berulang dapat menyebabkan perubahan ukuran mitogenom [9,26,27,28].

C.deserticolamemiliki proporsi urutan pengulangan terbesar di antara tiga mitogenom Cistanche dalam penelitian kami. Namun,ukuran mitogenom C. derserticola mendekati C. salsa, yang berarti bahwa faktor lain juga dapat memainkan peran penting dalam ukuran mitogenom selain urutan pengulangan yang kecil. Duplikasi segmen dan gen penyandi protein multi-salinan adalah dua faktor lain yang menyebabkan ekspansi mitogenom.

Dalam mitogenom C. tubulosa, urutan segmen yang digandakan panjangnya 2.142.511 bp, terhitung 53,9 persen dari keseluruhan ukuran mitogenom. Demikian pula, Sloan melaporkan bahwa 4.6-pengulangan megabyte diidentifikasi dalam mitogenom dari Silene conica, terhitung 40,8 persen dari keseluruhan mitogenom [13]. Selain itu, gen penyandi protein multi-salinan dapat menghasilkan ekspansi mitogenom. Dalam mitogenom C. tubulosa, proporsi gen inti duplikat dan gen variabel masing-masing adalah 58 persen dan 35 persen . Untuk mitogenom besar yang khas (spesies Cucumis), beberapa gen penyandi protein (rps19) juga disajikan dua kali di Citrullus dan Cucurbita [14]. Dalam C. tubulosa, kompleks Ⅰ (nad4, nad4L, nad6 dan nad7), kompleks Ⅳ (cox1 dan cox2), kompleks Ⅴ (atp4, atp8 dan atp9), biogenesis sitokrom (ccmFc dan ccmFn), subunit kecil protein ribosomal (rps3, rps4 dan rps14), gen penyandi protein Intron maturase (matR) dan transportasi independen SecY (mttB) semuanya memiliki banyak salinan. Kami berspekulasi bahwa ini terkait dengan fakta bahwa tumbuhan holoparasit tidak melakukan fotosintesis. Selain itu, tekanan lingkungan mungkin meningkatkan ekspresi beberapa gen terkait. Studi sebelumnya menunjukkan bahwa rantai transpor elektron mitokondria tanaman dapat meningkatkan kinerja tanaman dalam kondisi lingkungan yang penuh tekanan [29].Tidak seperti C. deserticola dan C. salsa, C. tubulosa mengalami cekaman garam dan cekaman dingin daripada cekaman kekeringan.[30,31,32]. Ini mungkin menyebabkan duplikasi gen di C. tubulosa. Singkatnya, pengulangan kecil, duplikasi segmen, dan gen multi-salinan adalah penyebab utama ekspansi mitogenom.

3.2. Kehadiran MTPT

Pada tumbuhan angiosperma, MTPT hampir selalu ada [33]. Dalam penelitian kami, kami menemukan urutan 158 C. deserticola, 128 C. salsa dan 139 C. tubulosa MTPT. Panjangnya 35.165 bp, 28.963 bp dan 26.911 bp, terhitung 1,89 persen , 1,64 persen dan 0.68 persen dariC.deserticola, C.salsadanC. tubulosamitogenom, masing-masing. Cheng dkk. menyarankan bahwa 26.87-kilobyte MTPT fragmen ditemukan di Suaeda glauca, terhitung 5,18 persen dari mitogenom [34]. Selain itu, MTPT yang ditemukan di Salix suchowensis menyumbang 11,3 persen (17,5 kb) dari plastome dan 2,8 persen (18,1 kb) dari mitogenom [35]. Menariknya, proporsi MTPT dalam mitogenom Cistanche relatif rendah. Selain itu, hasil kami menunjukkan bahwa, dalam urutan MTPT, PCG plastid dan RNA ribosom adalah urutan parsial. Sebaliknya, gen tRNA plastid memiliki urutan lengkap dalam fragmen MTPT. Hilangnya sebagian PCG plastid dan RNA ribosom menunjukkan bahwa mereka mungkin tidak lagi berfungsi dalam urutan MTPT. Hal ini mendukung teori bahwa fragmen DNA dari plastom biasanya menjadi pseudogen nonfungsional, sedangkan beberapa gen tRNA masih melakukan fungsi normal [36].

4. Bahan dan Metode

4.1. Pengambilan Sampel, Ekstraksi DNA, dan Pengurutan Genom

Sampel segar C. deserticola, C. salsa dan C. tubulosa dikumpulkan dari Liga Alxa (Daerah Otonomi Mongolia Dalam), Kota Tacheng (Daerah Otonomi Uighur Xinjiang), Prefektur Hotan (Wilayah Otonom Uighur Xinjiang), Tiongkok (Tabel S1) . Sampel diidentifikasi oleh Profesor Yulin Lin dan disimpan di Herbarium Akademi Ilmu Kedokteran China dan Perguruan Tinggi Kedokteran Peking Union (di bawah nomor registrasi spesimen CMPB13484, CMPB13485 dan CMPB13487). Ekstraksi DNA total dilakukan dengan menggunakan kit ekstraksi DNA genom tanaman (Tiangen Biotech, Beijing, Cina). Memanfaatkan NEBNext® library building kit [37], perpustakaan DNA dengan ukuran sisipan 400 bp dibangun. Selanjutnya, platform pengurutan Illumina HiSeq4000 digunakan untuk pengurutan. Pengurutan menghasilkan masing-masing 5,44, 5,16 dan 4,34 G data mentah (Tabel S1). Trimmomatic digunakan untuk menyaring data mentah untuk mendapatkan data bersih [38]. Secara total, masing-masing diperoleh data bersih 4,88 G, 4,62 G, dan 3,92 G. Sampel tanaman juga digunakan untuk pengurutan Oxford Nanopore. Konstruksi perpustakaan, deteksi kualitas, dan pengurutan dilakukan mengikuti protokol standar pabrikan. Akibatnya, 78,96 G, 39,19 G dan 59,52 G data mentah diperoleh, dan 48 G, 31,96 G dan 54,56 G tersisa setelah penyaringan dan kualifikasi (Tabel S1).

4.2. Majelis Mitogenom dan Anotasi

Delapan mitogenom Lamiales diunduh sebagai referensi dari NCBI (Tabel S2). Kami awalnya memperkaya pembacaan bersih terkait mitogenom dari data Oxford Nanopore menggunakan USEARCH [39]. Bacaan Nanopore yang difilter dirangkai menjadi contigs menggunakan Nextdenovo v2.4.0 (tersedia online: https://github.com/Nextomics/NextDenovo (20 Desember 2020)) dengan parameter default. Contigs yang diperoleh kemudian dijadikan referensi yang diberi nama Cistanche Structure Contigs. Bacaan berpasangan Illumina dipetakan kembali ke Cistanche Structure Contigs menggunakan Minimap2 [40] dan SAMtools [41]. Kami mengekstrak bacaan akhir berpasangan Illumina yang difilter dan menyusunnya menjadi contigs menggunakan SPAdes v. 3.10.1 [42]. Dengan membandingkan kumpulan short-reads dan long-reads menggunakan Minimap2 [40], kami sebelumnya menentukan contig mana yang merupakan molekul mitokondria diduga. Contigs perakitan yang diperoleh di atas dikoreksi dengan Illumina pair-end reads menggunakan NextPolish1.3.1 [43]. Draf contig mitokondria diproses lebih lanjut mengikuti langkah-langkah di bawah ini. Pertama, kami membandingkan urutan dengan yang ada di GenBank menggunakan program BLASTn untuk menentukan apakah itu bacaan mitokondria [44]. Kedua, kami menganotasi mitogenom menggunakan MITOFY untuk menentukan apakah sekuens tersebut mengandung gen mitokondria [14].

4.3. Identifikasi DNA Plastid Mitokondria (MTPTs)

Mitogenom Cistanche dibandingkan dengan plastom C. deserticola (MN614127), C. slsa (MN614128) dan C. tubulosa (MN614129) untuk mengidentifikasi MTPT menggunakan BLASTn [44]. Parameter BLASTn dipilih berdasarkan yang dilaporkan sebelumnya [45]. Selanjutnya, TBtools digunakan untuk memvisualisasikan hasil BLASTn [46]. Dengan bantuan plastom Cistanche sebagai referensi, segmen DNA yang ditransfer diidentifikasi dianotasi menggunakan BLASTn [44].

4.4. Analisis Pengulangan Urutan Sederhana (SSR), Pengulangan Tandem, Pengulangan Diselingi, dan Duplikasi Segmen

Situs web online MISA (Tersedia online: http://webblast.ipk-gatersleben.de/misa/ (15 Januari 2021)) digunakan untuk mengidentifikasi SSR dalam genom mitokondria. SSR ini termasuk mono-, di-, tri-, tetra-, penta-, dan hexanucleotides dengan jumlah minimum masing-masing 10, 6, 5, 5, 5 dan 5. Dengan parameter default, Tandem Repeat Finder [47] digunakan untuk mengidentifikasi pengulangan tandem. Selain itu, REPuter digunakan untuk mengidentifikasi urutan pengulangan maju, mundur, palindromik, dan komplementer [48]. Ukuran pengulangan minimum ditetapkan menjadi 30 bp dan identitas unit pengulangan lebih besar dari atau sama dengan 90 persen . Duplikasi segmen diidentifikasi dengan membandingkan genom mitokondria dengan dirinya sendiri menggunakan BLASTN dengan pengaturan parameter e-value=1 × 10−5. Semua penjajaran dengan panjang > 5000 bp dan skor > 90 persen dianggap sebagai duplikasi segmen untuk perhitungan nomor duplikasi segmen. TBtools digunakan untuk memvisualisasikan hasil BLASTn [46].

4.5. Analisis Filogenetik dan Estimasi Laju Substitusi Nukleotida

Untuk analisis filogenetik, sekuens DNA PCG genom mitokondria bersama dari 11 spesies Lamiales, termasuk spesies Cistanche dalam karya ini (Tabel S2), digunakan dalam konstruksi. Mitogenom dari 8 spesies Lamiales lainnya diunduh dari basis data GenBank Organelle Genome Resource. PhyloSuite (v1.2.1) digunakan untuk mengekstrak PCG mitokondria bersama dari spesies Lamiales [49]. MAFFT (v7.450) digunakan untuk menyelaraskan urutan asam amino yang sesuai [50]. Urutan asam amino yang selaras digabungkan dan digunakan untuk membangun pohon filogenetik melalui metode kemungkinan maksimum (ML), menggunakan Solanum lycopersicum (MF03

5. Kesimpulan

Sebagai kesimpulan, penelitian ini memberikan wawasan pertama tentang keragaman dan kompleksitas strukturalMitogenom Cistanche. Hasil kami menjawab tiga pertanyaan ilmiah yang diajukan dalam pendahuluan. Pertama, mitogenom lengkap dariC.deserticola, C.salsadanC. tubulosaberhasil dirakit, yang merupakan pencapaian signifikan dalam studi mitogenom Cistanche. Kedua,C. tubulosaukurannya mendekati 4 Mb, menunjukkan ekspansi yang signifikan. Selanjutnya,C. tubulosamitogenom berbeda secara signifikan dari mitogenomC.deserticoladan C. salsa dalam hal jumlah duplikat PCG dan duplikasi segmen. Tiga spesies Cistanche dibentuk menjadi satu clade, mirip dengan spesies Orobanchaceae. Selain itu, topologi Lamiales dalam penelitian ini sangat mirip dengan sistem APG IV. Ketiga, urutan MTPT diidentifikasi dalam tiga mitogenom spesies Cistanche, dengan PCG parsial dan fragmen RNA ribosom, dan tRNA lengkap dari plastom. Oleh karena itu, hasil penelitian ini mengungkapkan banyak aspek menarik dari keragaman dan kompleksitas mitogenom.