Polisakarida Cistanche Meningkatkan Penyerapan Echincoside di Vivo Dan Mempengaruhi Mikrobiota Usus

Kontak: emily.li@wecistanche.com

Zhifei Fu, dkk

Abstrak

Polisakarida danglikosida feniletanoiddariCistanche deserticolatelah terbukti memiliki berbagai manfaat kesehatan, namun efek interaktif antara kedua jenis senyawa ini secara in vivo belum diketahui secara rinci. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menyelidiki aksi sinergis polisakarida cistanche dengan glikosida fenilethanoid dan efek polisakarida pada mikrobiota usus. Tikus Sprague-Dawley diberi makan berbagai jenis polisakarida cistanche selama 20 hari, pada hari terakhir semua tikus diberiechinacosidapada 100mg/kg. Hasilnya dibandingkan terutama pada perbedaan parameter farmakokinetik, komposisi mikrobiota usus, dan kandungan asam lemak rantai pendek. Hasil menunjukkan bahwa semua polisakarida cistanche, termasuk polisakarida kasar, molekul tinggipolisakarida berat, dan polisakarida dengan berat molekul rendah, dapat mengatur keragaman mikrobiota usus, meningkatkan bakteri menguntungkan dan khususnya meningkatkan pertumbuhan Prevotella spp. serta meningkatkan produksi asam lemak rantai pendek dan penyerapan echinacosida. Dengan mengeksplorasi aksi sinergis polisakarida dengan molekul kecil, temuan ini menunjukkan bahwa polisakarida cistanche, terutama polisakarida dengan berat molekul rendah, dapat digunakan sebagai manipulator mikrobiota usus untuk promosi kesehatan.

Kata kunci:Bentenggurun pasirpolisakaridaechinacosidaMikrobiota usus

Klik di sini untuk mendapatkan informasi lebih lanjut tentang produk cistanche

1. Perkenalan

Dalam beberapa tahun terakhir, telah menjadi jelas bahwa polisakarida memodulasi komposisi mikrobiota usus dan bahwa perubahan dapat memediasi beberapa penyerapan nutrisi [1], menghasilkan fungsi fisiologis [2,3]. Polisakarida dari pengobatan tradisional Cina (TCM) telah terbukti menjadi kandidat ideal untuk regulasi mikrobiota usus dan menunjukkan efek prebiotik. Dalam pencernaan, polisakarida dan beberapa senyawa molekul kecil yang kontak pasti, menunjukkan beberapa efek pada aktivitas biologis [4]. Sebagai salah satu bahan aktif utama dalam Panax ginseng, yang telah digunakan secara luas selama ribuan tahun, polisakarida menunjukkan hasil yang baik.peningkatandalamususmetabolismedanpenyerapandariginsenosidessecara langsung [5]. Polisakarida Codonopsis pilosula menunjukkan efek promosi penyerapan saponin pada tikus kolitis yang diinduksi natrium dekstran sulfat [6]. Polisakarida Ganoderma lucidum, terutama fraksi berat molekul tinggi, terungkap memilikiprebiotikfungsipada model tikus dysbiosis usus yang diinduksi diet tinggi lemak [7]. Polisakarida lengkeng mengatur mikrobiota usus dan metabolit usus (meningkatkan kandungan piruvat dan butanoat) untuk menghasilkan aktivitas imunomodulator [8].

Cistanche deserticola, sebagai Pengobatan Tradisional Cina, telah banyak digunakan sebagai suplemen makanan di Cina. Studi farmakologis menunjukkan bahwa itu menunjukkanpelindung saraf, imunomodulator, hormonalkeseimbangan, anti-kelelahan, anti-inflamasi, hepatoprotektor,anti-oksidatif, anti-bakteri, anti-virus, dananti-tumorefek [9]. Analisis kimia menunjukkan bahwa glikosida fenilethanoid dan polisakarida adalah konstituen aktif utama. Echincoside, glikosida fenilethanoid utama dalam C. deserticola, telah menunjukkan tindakan farmakologis yang luas, namun, kemampuan obatnya terbatas karena bioavailabilitas yang buruk, metabolisme yang cepat dan ekstensif secara in vivo. Studi telah memverifikasi echinacosida dapat dimetabolisme oleh mikrobiota usus in vitro [10,11]. Namun, bukti in vivo belum diselidiki. Seperti yang kita ketahui, mikrobiota usus berperan penting dalam memediasi bioaktivitas metabolisme obat herbal. Oleh karena itu, tujuan utama dari pekerjaan ini adalah untuk menyelidiki pengaruhpolisakarida cistanchepada mikrobiota usus dan efek pada metabolisme echinacosida.

2. Bahan-bahan dan metode-metode

2.1. Bahan dan bahan kimia

Cistanche deserticola YC Ma diperoleh dari Alashan, Mongolia Dalam, pengembangan industri pasir Mandela Co., LTD, Cina. Mereka disahkan oleh profesor Lijuan Zhang (Universitas Pengobatan Tradisional Tiongkok Tianjin). Spesimen voucher disimpan di laboratorium kami. Zat standar seperti echinacoside, acteoside, dan chlorogenic acid diperoleh dari National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products (Beijing, China). Kemurnian masing-masing standar lebih besar atau sama dengan 98 persen. Asetonitril dan metanol kelas kromatografi dibeli dari Fisher Scientific (Pitts burgh, PA). Asam format dibeli dari Anaqua Chemical Supply Inc. (Wilmington, USA). Reagen kimia lainnya adalah kelas analitis dan dibeli dari Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. (Shanghai, China).

Tikus jantan Sprague-Dawley (200–220 g) dipasok oleh Beijing HFK Bioscience CO., LTD (Beijing, China, No. lisensi SCXK (Jing) 2014- 0004). Semua hewan dibiakkan dan ditempatkan di bawah kondisi SPF di fasilitas hewan. Eksperimen dilakukan sesuai dengan pedoman yang ditetapkan oleh perawatan hewan dan menggunakan komite TJUTCM dan sesuai dengan panduan untuk perawatan dan penggunaan hewan laboratorium yang diterbitkan oleh Institut Kesehatan Nasional AS (Nomor Publikasi NIH 85-23, direvisi 1996 ). Setelah 1 minggu masa aklimatisasi, tikus secara acak dibagi menjadi empat kelompok: kelompok kontrol, kelompok polisakarida total, kelompok polisakarida molekul tinggi, dan kelompok polisakarida molekul rendah. Setiap kelompok terdiri dari 6 ekor tikus yang dikembangbiakkan dalam kandang yang sama.

2.2. Persiapan polisakarida cistanche

3.0 kg Cistanche deserticola YC Ma dibersihkan dan dikeringkan pada suhu 40 derajat dalam oven pengering udara, kemudian dihancurkan menjadi bubuk kasar. Bubuk kasar kering diekstraksi dengan 85 persen etanol berair (v/v) pada 60 derajat dua kali, dan 2 jam untuk setiap waktu. Rasio padat-cair adalah 1:12 dan 1:10, masing-masing. Residu herbal diekstraksi dengan air pada 100 derajat lagi dua kali, waktu ekstrak dan rasio padat-cair adalah sama dengan 85 persen etanol. Larutan air digabungkan dan dipekatkan di bawah tekanan yang dikurangi dan kemudian diendapkan dalam etanol 80 persen, berdiri di bawah 4 derajat selama 24 jam. Endapan diisolasi melalui sentrifugasi pada 8000 rpm selama 10 menit pada 4 derajat dan kemudian diliofilisasi untuk mendapatkan polisakarida total (ZT). ZT kemudian dilarutkan dalam air deionisasi dan disaring pada membran ultrafiltrasi serat berongga 100 kDa, polisakarida molekul tinggi (HM) infiltrat retentif dikumpulkan. Filtrat yang meresap disaring dengan membran ultrafiltrasi 6 kDa. Filtrat retentif polisakarida molekul tengah (MM) dan polisakarida molekul rendah (LM) filtrat meresap diperoleh.

2.3. Karakterisasi utama polisakarida cistanche

Kandungan polisakarida ditentukan dengan metode asam sulfat fenol menggunakan glukosa sebagai standar [12]. Kandungan protein total ditentukan dengan metode BCA [13]. Analisis komposisi monosakarida dilakukan dengan HPLC (sistem UltiMate 3000) yang dilengkapi dengan kolom SinoPak C18 (5 m, 150 mm × 4,6 mm) dan detektor susunan dioda (VWD-3000). Pemisahan secara kromatografi turunan pra-kolom PMP (1-fenil-3- metil-5-pirazolon) dilakukan dengan menggunakan 100 mM dapar fosfat dan asetonitril dengan perbandingan 82:18 (v/v , persen ) sebagai fase gerak pada laju alir 1,0 mL/menit. 10 L masing-masing sampel disuntikkan dan waktu analisis 30 menit dengan deteksi pada 245 nm digunakan. Akuisisi dan pemrosesan data dilakukan menggunakan Perangkat Lunak Chromeleon 7.1 (Dionex, Sunnyvale, CA, USA).

Berat molekul (Mw) ditentukan dengan kromatografi eksklusi ukuran kinerja tinggi (HPSEC, UltiMate 30{{10}}0 sistem), dilengkapi dengan gel TSK G3000 PWXL (7,8 × 300,0 mm, Tosoh, Jepang) dan kolom gel TSK GMPWXL (7,8 × 300,0 mm, Tosoh, Jepang) dan detektor indeks bias (RID) RefractoMax521. Sampel dielusi dengan 0,1 mol/L Na2SO4 pada laju alir 0,5 mL/menit. Suhu kolom dipertahankan pada 35 derajat. Dekstran sebagai standar dan kurva standar diplot sesuai dengan waktu elusi yang diplot terhadap logaritma berat molekul.

2.4. Studi farmakokinetik

Sampel darah dikumpulkan dari kantus bagian dalam pada {{0}} jam, 0.083 jam, 0.167 jam, 0.25 j, 0.5 j, 0.75 j, 1.0 j, 2.0 j, 3.{{20}} h, 4.0 h, 6.0 h, 8.0 h, 10 h, 12 h dan 24 h setelah pemberian echinacoside (100 mg/kg). Sampel plasma diperoleh dengan sentrifugasi selama 10 menit pada 7.500 malam. Untuk 100 L sampel plasma, 10 L larutan IS (asam klorogenat), dan 500 L metanol ditambahkan. Campuran kemudian divortex selama 3 menit dan disentrifugasi pada 14,000 rpm selama 10 menit. Supernatan dikumpulkan dan dikeringkan dalam nitrogen pada suhu kamar. Selanjutnya, residu dilarutkan dalam 100 L 50 persen metanol berair, sentrifugasi pada 14,000 rpm selama 10 menit lagi. Akhirnya, 3 L supernatan disuntikkan ke dalam sistem LC-MS/MS untuk dianalisis. Sampel dianalisis menggunakan metode sesuai dengan yang dilaporkan sebelumnya. Fase gerak terdiri dari CH3CN (pelarut A) dan H2O (mengandung 0,1 persen HCOOH; pelarut B) menggunakan gradien berikut: 0-1 menit, 10 persen A; 1–8 menit, 10–90 persen A; 8–9 menit, 90–10 persen A; 9-11 menit: 10 persen A. Sampel dipisahkan pada kolom ACQUITY HSS T3 (1,8 m, 100 mm × 2,1 mm id). Laju aliran adalah 0,3 mL/menit dan suhu kolom diatur pada 35 derajat. Dalam analisis MS, mode ionisasi negatif digunakan, dengan parameter yang dioptimalkan sebagai berikut: tegangan kapiler, 2,5 kV; suhu desolvasi, 450 derajat. Nitrogen digunakan sebagai desolvasi dan gas kerucut, masing-masing pada laju aliran 900 L/jam dan 150 L/jam. Kuantifikasi dengan demikian dilakukan dengan menggunakan MRM dari transisi m/z 785,29 → 623,26 untuk echinacosida, m/z 353,06 → 191,07 untuk asam klorogenat (IS), m/z 623,24 → 161,09 untuk acteoside. Tegangan kerucut untuk echinacoside, IS dan acteoside adalah 100 V, 32 V, dan 74 V; energi tumbukan, 32 V, 14 V, dan 30 V.

2.5. Studi asam lemak rantai pendek (SCFAs)

Tikus jantan Sprague-Dawley diberikan ZT, HM, dan LM secara oral selama 3 minggu. Penentuan SCFA (asam asetat, asam propionat, asam isobutirat, asam butirat, asam isovalerat, asam valerat, dan asam heksanoat) dengan kromatografi gas (GC) dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya dengan beberapa modifikasi [14]. Secara singkat, 0.5 g sampel tinja didispersikan dalam 2,5 mL air Milli-Q, divorteks selama 10 menit, dan 7,5 mL larutan HCl/etanol 1 persen yang mengandung standar internal (asam butirat 24,0 ug /mL dan 2- asam etil heksanoat 1,32 ug/mL sebagai standar internal) ditambahkan. Campuran dihomogenkan selama 5 menit dan disentrifugasi pada 14,000 rpm selama 10 menit pada 4 derajat . Lima mikroliter supernatan disuntikkan dalam mode split dengan perbandingan 30:1. Gas pembawa adalah N2 (99,999 persen) pada 1 mL/menit. Gas make-up (N2) adalah pada 25 mL / menit. Laju aliran H2 dan udara masing-masing adalah 30 mL/menit dan 300 mL/menit. Sampel feses dikumpulkan pada hari ke 20 penelitian ini dan segera disimpan pada suhu 80 derajat .

2.6. Pengumpulan tinja, ekstraksi DNA, dan pengurutan gen 16S rRNA

Sekitar 200 mg sampel tinja segar dikumpulkan dalam tabung Eppendorf 1,5 mL steril dari per tikus dan disimpan pada suhu -80 derajat untuk persiapan DNA selanjutnya. DNA diekstraksi dari tinja menggunakan QIAamp DNA Stool Mini Kit (QIAGEN). Jumlah DNA ditentukan menggunakan spektrofotometer NanoDrop (Thermo Electron Corporation); integritas dan ukuran diperiksa dengan elektroforesis gel agarosa 1,0 persen. Berdasarkan konsentrasinya, DNA diencerkan menjadi 1 ng/μL menggunakan air steril.

16S rRNA diamplifikasi menggunakan primer spesifik (V4: 515F-806R) dengan kode batang. Semua reaksi PCR dilakukan dengan Phusion® High Fidelity PCR Master Mix (New England Biolabs). Campur volume yang sama dari buffer pemuatan 1x (mengandung SYB green) dengan produk PCR dan operasikan elektroforesis pada gel agarosa 2 persen untuk deteksi. Strip utama yang cerah antara 400 dan 450 bp dipilih untuk percobaan lebih lanjut. Produk PCR dicampur dalam rasio kepadatan UE. Kemudian, campuran produk PCR dimurnikan dengan Kit Ekstraksi Gel Qiagen (Qiagen, Jerman).

Pustaka pengurutan dibuat menggunakan TruSeq® DNA PCR Free Sample Preparation Kit (Illumina, USA) mengikuti rekomendasi pabrikan dan kode indeks ditambahkan. Kualitas perpustakaan dinilai pada sistem Qubit® 2.0 Fluorometer (Thermo Scientific) dan Agilent Bioanalyzer 2100. Pustaka diurutkan pada platform Illumina HiSeq 2500 dan pembacaan akhir berpasangan 250 bp dihasilkan.

2.7. Analisis bioinformatika

Pemotong kode batang dan urutan primer, perakitan urutan, dan penyaringan data menurut QIIME (V 1.7.0). Urutan dengan kesamaan Lebih dari atau sama dengan 97 persen ditugaskan ke OTU yang sama. OTU dianotasi sebagai label SILVA. Indeks keragaman alfa yang mengevaluasi kekayaan komunitas mikroba usus (metrik ACE dan Chao1) dan keragaman komunitas (metrik Shannon dan Simpson) dihitung menggunakan Qiime (Versi 1.9.1). Analisis keragaman beta digunakan untuk menyelidiki variasi struktural komunitas mikroba menggunakan jarak UniFrac. Perbedaan antara semua kelompok diuji dengan uji Tukey dan uji Wilcox. Analisis koordinat utama (PCoA) diterapkan untuk menjelaskan perbedaan komposisi antara empat kelompok menggunakan paket R. Metode ukuran efek analisis diskriminan linier (LEfSe) dirancang khusus untuk penemuan biomarker dan data sekuensing penjelasan. Dan analisis diskriminan linier (LDA) digunakan untuk menghitung ukuran efek dari setiap mikroba usus yang berbeda dan karakteristik yang terkait dengan setiap kelompok tikus. Analisis korelasi dilakukan dengan menggunakan paket R gcorrplot (Versi 1.1.463).

Data SCFA dianalisis menggunakan ANOVA SPSS 22.0.

3. Hasil dan Pembahasan

3.1. Persiapan dan analisis kimia polisakarida cistanche

Cistanches Herba digunakan sebagai makanan dan obat-obatan di Cina. Polisakarida yang diisolasi darinya telah menarik perhatian besar karena aktivitasnya yang signifikan. Pada penelitian ini diperoleh empat bagian polisakarida cistanche (ZT, HM, MM, dan LM) dengan metode ekstraksi air, pengendapan alkohol, dan ultrafiltrasi. Komposisi kimia dari empat bagian polisakarida ditunjukkan pada Tabel 1.

Kadar gula total sampel dengan menggunakan kurva standar glukosa. Hasil penelitian menunjukkan bahwa rendemen HM dan LM lebih tinggi dari MM. Polisakarida menunjukkan sifat farmakologis yang beragam, terutama aktivitas imun. Studi telah menunjukkan bahwa kandungan dan jenis monosakarida, berat molekul, jenis kelompok substituen memainkan peran penting dalam aktivitas polisakarida [15]. Bagian yang berbeda dari komposisi monosakarida polisakarida cistanche serupa, dan manosa (Man), asam galakturonat (GalUA), glukosa (Glc), galaktosa (Gal), dan arabinosa (Ara) adalah monosakarida utama.

Namun, isinya berbeda di antara keempat bagian itu. Glukosa dan arabinosa merupakan komponen utama ZT dan HM, sedangkan glukosa adalah unit gula utama LM, selain itu, sedikit rhamnosa dan asam glukuronat (GlcUA) juga terdeteksi dalam fraksi ini.

Berat molekul relatif sampel diselidiki dengan kromatografi eksklusi ukuran kinerja tinggi (HPSEC). Menurut kurva standar dekstrans dan waktu retensi dalam kolom, berat molekul puncak utama di ZT diamati pada 1,68 × 106 Da dan 1,70 × 104 Da, dalam HM ditentukan menjadi 1,54 × 106, 2,06 × 105, dan 4,81 × 104, dalam MM dan LM ditentukan masing-masing menjadi 1,09 × 104 dan 2,05 × 104. Hasil dari mereka tercantum dalam Tabel 1 dan hasil MM rendah dan tidak cukup untuk hewan percobaan. Studi sebelumnya telah menunjukkan efek struktur-tergantung polisakarida cistanche pada bioaktivitas beragam [16]. Eksperimen lebih lanjut masih diperlukan, terutama pemurnian, analisis struktural yang baik harus diterapkan untuk studi struktur-aktivitas

3.2. Studi Farmakokinetik

Farmakokinetik echinacosida diselidiki dengan kromatografi cair kinerja tinggi spektrometri massa rangkap tiga (UPLC dan Xevo TQ-S) setelah pemberian echinacosida secara oral. Profil waktu konsentrasi plasma rata-rata echinacosida ditunjukkan pada Gambar. 1. Menurut perangkat lunak obat dan statistik (DAS, versi 2.0), farmakokinetik echinacosida sesuai dengan model satu kompartemen, dan yang lainnya parameter dalam kelompok ZT, HM, dan LM dirangkum dalam Tabel 2, termasuk waktu untuk mencapai konsentrasi maksimum (Tmax), konsentrasi maksimum (Cmax), area di bawah kurva konsentrasi-waktu (AUC), dan waktu tinggal rata-rata (MTR ). Sebuah studi farmakokinetik menunjukkan bahwa rata-rata Cmax echinacoside pada kelompok ZT, HM, dan LM ditemukan 646,4 ng/mL, 732.0 ng/ml, dan 898,4 ng/mL yaitu 1,6, 1,8 dan 2,2 kali dibandingkan dengan kelompok kontrol (406,8 ng/ml), masing-masing. Dengan perlakuan awal polisakarida, AUC(0-24 h) echinacoside masing-masing meningkat sebesar 6,6 persen , 36,7 persen , dan 63,6 persen pada kelompok ZT, HM, dan LM, dibandingkan dengan kelompok kontrol, yang membuktikan bahwa polisakarida menunjukkan aktivitas mempromosikan penyerapan molekul kecil. Hasil ini sangat mirip dengan bahwa chitooligosaccharides meningkatkan bioavailabilitas glikosida fenilethanoid dalam ekstrak Fructus Forsythia [17] dan polisakarida dari Polygonum multiflorum meningkatkan sifat biofarmasi dari 2, 3, 5, 4′-tetrahidroksi-stilbene- 2- O- -D-glukosida pada tikus Sprague-Dawley normal [18]. Mikrobiota usus mengandung berbagai enzim terkait metabolisme obat dan mekanisme mikrobioma membentuk farmakokinetik dan farmakodinamik obat masih belum diketahui [19]. Polisakarida dapat menyehatkan mikrobiota usus dengan meningkatkan sistem kekebalan tubuh, menyerap nutrisi, dan mengurangi pertumbuhan patogen [20,21]. Meskipun literatur melaporkan bahwa polisakarida cistanche dapat meningkatkan metabolit echinacoside (seperti acteoside) in vitro, kami tidak menemukan polisakarida yang hidup berdampingan telah diuntungkan untuk echinacoside diubah menjadi acteoside in vivo [10,11].

3.3. Kandungan SCFA dalam kotoran tikus

Mikrobiota usus memfermentasi polisakarida, menghasilkan berbagai polimer bioaktif dan metabolit, seperti SCFA [3]. Sebagai metabolit utama polisakarida, SCFA dianalisis dalam tinja. SCFA, termasuk asam asetat, asam propionat, dan butirat telah dilaporkan memiliki efek menguntungkan pada metabolisme glukosa, kolesterol, dan lipid. Asetat adalah SCFA utama di usus besar dan merupakan substrat penting untuk sintesis kolesterol, propionat adalah substrat untuk glukoneogenesis di hati dan butirat adalah substrat energi yang disukai kolonosit dan memiliki antiinflamasi di usus [22,23].

Hasil kami menunjukkan bahwa asetat adalah SCFA utama yang terbentuk dalam tinja untuk semua kelompok, diikuti oleh butirat dan propionat, sedangkan konsentrasi SCFA valerat dan bercabang (asam isobutirat dan asam isovalerat) lebih rendah. Asetat telah terbukti meningkatkan aktivitas enzim di jaringan hati, menghasilkan kontrol gula darah yang lebih baik [24]. Pada hari ke-20 (Gbr. 2), kelompok LM memiliki kadar asetat yang jauh lebih tinggi (pb 0,05), proporsi propionat cenderung menurun, dan proporsi butirat cenderung meningkat meskipun perubahan itu tidak signifikan dalam tinja dibandingkan dengan kelompok kontrol.

Namun, kelompok HM memiliki proporsi butirat yang jauh lebih rendah daripada kelompok kontrol (pb 0.05). Kandungan SCFA total antara LM dan HM memiliki kecenderungan yang berlawanan dibandingkan dengan kelompok kontrol dan hanya kelompok LM yang memiliki perbedaan yang signifikan.

Banyak faktor yang mempengaruhi kadar SCFA dalam feses, antara lain komposisi dan jumlah mikrobiota usus, sumber makanan, dan waktu yang dibutuhkan makanan untuk melewati saluran pencernaan. Akumulasi studi menunjukkan bahwa struktur polisakarida, termasuk komposisi residu monosakarida, derajat polimerisasi, keduanya dapat mempengaruhi sifat fermentasi dan produksi SCFA [25]. Dari hasil kami, kami dapat menyimpulkan bahwa polisakarida cistanche memodulasi produksi SCFA dan polisakarida struktur yang berbeda memiliki efek yang berbeda.

3.4. Polisakarida Cistanche menginduksi perubahan inti dalam komposisi dan keragaman mikrobiota usus

Komposisi bakteri dari sampel tinja (n=4) diperiksa menggunakan teknik pengurutan throughput tinggi Illumina. Pustaka diurutkan pada platform Illumina HiSeq2500 dan pembacaan akhir berpasangan 250 bp diproduksi. Mereka diproses untuk identifikasi taksonomi dan analisis keragaman. Kurva rarefaction (Gbr. 3a) menunjukkan bahwa, untuk setiap sampel, kekayaan spesies bakteri menurun seiring dengan meningkatnya kedalaman pengambilan sampel, yang menunjukkan bahwa upaya pengurutan sudah cukup dan bahwa keragaman total dalam sampel dapat ditangkap. Kurva Shannon (Gbr. 3b) menunjukkan bahwa jumlah spesies bakteri unik meningkat seiring dengan meningkatnya jumlah sekuens yang teridentifikasi. Saturasi kurva Shannon berarti data sekuensing cukup untuk mencakup semua spesies bakteri.

Analisis keragaman alfa digunakan untuk mengukur keragaman dalam suatu sampel. Indeks keragaman Chao1, ACE, Shannon, dan Simpson dihitung dengan uji Tukey untuk menggambarkan keragaman alfa. Analisis keragaman berdasarkan indeks ACE dan Chao 1 mengungkapkan kekayaan komunitas mikrobiota usus di tingkat OTU. Indeks ACE dan Chao 1 secara signifikan lebih rendah pada sampel tinja kelompok LM dibandingkan dengan kelompok kontrol (pb 0.05) (Gbr. 4a, b), menyiratkan bahwa kekayaan spesies mikrobiota usus menurun dengan pemberian LM. Analisis keragaman berdasarkan indeks Shannon dan Simpson mengungkapkan keragaman komunitas mikrobiota usus. Tidak ada perubahan yang jelas dalam indeks keragaman Shannon dan Simpson ketika diobati dengan polisakarida cistanche dibandingkan dengan kelompok kontrol.

Polisakarida Cistanche menginduksi perubahan besar dalam taksa. Selain itu, dalam empat kelompok N98 persen dari OTU terkait dengan filum Bacteroidetes, Firmicutes, dan Proteobacteria. Filum yang paling dominan adalah Bacteroidetes yang menyumbang 55,09 persen , 57,89 persen , 52,72 persen , dan 69,{{20}}4 persen mikrobiota tinja kontrol, ZT, HM, dan Kelompok LM masing-masing, diikuti oleh Firmicutes, masing-masing menyumbang 41,39 persen , 38,03 persen , 42,15 persen , dan 28,15 persen (Gbr. 5a, b). Dibandingkan dengan kelompok kontrol, kelompok ZT terbukti menghasilkan efek yang lemah pada kelimpahan relatif dari filum utama, kecuali kelimpahan rendah Actinobacteria meningkat secara signifikan (MetaStat, pb 0,05). Pada kelompok HM, Proteobacteria meningkat secara signifikan (pb 0,01). Hal ini menunjukkan bahwa polisakarida HM Cistanche dapat mempromosikan pengayaan Proteobacteria untuk mempengaruhi metabolisme zat pada tikus. Pada kelompok LM, kelimpahan Bacteroidetes, yang penyumbang utamanya adalah Prevotellaceae dan Prevotellaceae_UCG-001 meningkat secara signifikan (pb 0,05) dan kelimpahan Firmicutes, termasuk Peptococcaceae, menurun secara signifikan (pb 0,01) . Anggota Prevotella dan Bacteroides sebelumnya digambarkan sebagai pengurai serat makanan [26], menghasilkan produk akhir metabolik seperti suksinat dan asetat [27]. Temuan tersebut mengkonfirmasi penelitian sebelumnya yang menunjukkan bahwa beberapa Prevotella spp. dapat mendegradasi polisakarida tanaman yang kompleks. Sebuah laporan sebelumnya juga menunjukkan bahwa dua divisi bakteri yang dominan, peningkatan rasio filum Firmicutes/Bacteroidetes dikaitkan dengan obesitas [28]. Kelimpahan yang lebih rendah dari yang pertama dan kelimpahan yang lebih tinggi dari yang terakhir dalam kelompok LM menunjukkan bahwa LM dapat membantu menurunkan berat badan.

Dari 72 famili yang terdeteksi, taksa top10 diisolasi dan dianalisis (Gbr. 5c, d). Lachnospiraceae dan Ruminococcaceae adalah dua famili yang paling banyak ditemukan di lingkungan usus mamalia dan telah dikaitkan dengan pemeliharaan kesehatan usus [29]. Dalam penelitian ini, famili Bacteroidales_S24-7_kelompok (39,11 ± 6,04 persen , 36,88 ± 4,44 persen , 28,37 ± 4,01 persen , 35,81 ± 7,91 persen ), Prevotellaceae (10,66 ± 3,84 persen , 15,14 ± 5,50 persen , 19,65 ± 8,97 persen , 21,05 ± 8,39 persen ), Lachnospiraceae (18,21 ± 5,20 persen , 15,09 ± 3,29 persen , 12,13 ± 7,14 persen , 13,12 ± 6,82 persen ), dan Ruminococcaceae (9,64 ± 0,88 persen , 10,44 , 27 ± 2,45 persen ), ± 4,70 persen , 8,19 ± 1,72 persen ) mendominasi pada masing-masing kelompok. Famili S24-7 telah dilaporkan mengandung banyak enzim pendegradasi karbohidrat [30]. Prevotellaceae menunjukkan peningkatan dan Lachnospiraceae menunjukkan kecenderungan menurun pada kelompok polisakarida dibandingkan dengan kelompok kontrol [31]. Diasumsikan bahwa tidak ada enzim aktif polisakarida cistanche yang sesuai pada kelompok Bacteroidales_S{24-7_dan Lachnospiraceae atau modul pengikat karbohidrat bakteri pada polisakarida. Genera Prevotella telah dilaporkan berhubungan dengan lokus pemanfaatan polisakarida dan enzim aktif karbohidrat [32]. Untuk mengetahui hubungan antara bakteri dan SCFA, digunakan analisis korelasi Spearman. Beberapa genera seperti Bacteroides, Prevotella, dan Lactobacillus dalam mikrobiota usus memainkan peran penting dalam hidrolisis polisakarida menjadi SCFA [33]. Hasil kami juga menunjukkan bahwa Bacteroidaceae berkorelasi positif dan mikrobiota yang mendominasi menghasilkan lebih banyak butirat [34], sedangkan Prevotellaceae berkorelasi positif dan mikrobiota yang mendominasi menghasilkan lebih banyak asetat. Mikrobiota yang didominasi Lactobacillaceae dan Ruminococcaceae menghasilkan lebih banyak propionat (Gbr. 6).

Analisis keragaman beta digunakan untuk menyelidiki variasi struktural mikrobiota usus di seluruh sampel menggunakan metrik jarak UniFrac. Perbedaan jarak Unifrac dianalisis dengan uji Tukey dan Wilcox (Gbr. 7). Menggunakan analisis unweighted uniFrac, kami menemukan bahwa LM memberi makan tikus mengelompok jauh dari kelompok lain. Pola pengelompokan yang jelas diidentifikasi untuk kelompok kontrol, ZT, HM, dan LM.

Kelimpahan mikroba ini dimodulasi secara berbeda dengan perawatan polisakarida. Untuk mengidentifikasi taksa bakteri spesifik pada masing-masing kelompok, komposisi mikrobiota dari kelompok kontrol, ZT, HM, dan LM dibandingkan dengan metode linear discriminant analysis effect size (LEfSe). Linear Discriminant Analysis (LDA) digunakan untuk menghitung ukuran efek dari setiap fitur yang berlimpah secara diferensial. Ambang batas skor LDA lebih tinggi dari 4 daftar, menunjukkan kelimpahan komunitas relatif lebih tinggi dalam kelompok yang sesuai daripada di kelompok lain. Dengan menggunakan metode ini, kami menemukan bahwa 19 OTU berbeda secara signifikan di semua kelompok, yaitu, 6 OTU pada kelompok kontrol lebih tinggi, hanya 1 OTU pada kelompok ZT yang lebih tinggi, 10 OTU pada kelompok HM lebih tinggi dan 2 OTUS pada kelompok LM lebih tinggi dari kelompok lain (Gbr. 8). Kelimpahan g_Prevotellaceae_ UCG_001 di LM meningkat secara signifikan (8,47 ± 1,9 persen di LM, 0.40 ± {{21 }}.09 persen pada kelompok Kontrol, pb 0,01). Hasilnya konsisten dengan laporan bahwa polisakarida Porphyra haitanensis dan Ulva prolifera jelas dapat mendorong proliferasi Prevotellaceae UGC-001 (pb 0,05) dan Rikenellaceae RC9 (pb 0,01) [35].

4. Kesimpulan

Jelas bahwa ada hubungan antara konstituen kimia TCM, mikrobiota usus, dan metabolit tertentu yang dihasilkan dari mikroba usus. Temuan kami saat ini menyediakan metode untuk mempelajari sinergi metabolisme echinacosida dengan berbagai jenis polisakarida berdasarkan mikrobiota usus. Mikrobiota usus dapat memetabolisme TCM dan TCM dapat mempengaruhi pertumbuhan mikrobiota usus. Di satu sisi, setelah pemberian oral polisakarida ke dalam usus, berbagai mikrobiota usus mengkode enzim metabolisme, memainkan peran penting dalam dekomposisi polisakarida, dan untuk menghasilkan metabolit bioaktif. Di sisi lain, kontribusi polisakarida memiliki beberapa dampak pada keseimbangan lingkungan mikro usus dalam prosesnya. Melalui perbandingan dengan atau tanpa polisakarida, kami menemukan bahwa polisakarida meskipun dicerna oleh inang secara langsung, berpotensi bertindak sebagai prebiotik, yang mengarah pada perubahan yang menguntungkan dalam mikrobiota usus dengan mendorong pertumbuhan probiotik. Polisakarida Cistanche mengatur keragaman mikrobiota usus, meningkatkan bakteri menguntungkan dan terutama polisakarida bermolekul rendah meningkatkan pertumbuhan Prevotella spp. Selanjutnya, mikrobiota usus yang ditingkatkan kemudian meningkatkan penyerapan echinacosida di Cistanche deserticola. Tapi alasannya tidak sepenuhnya jelas, mungkin akibat dari cacat gabungan mikrobiota usus, SCFA, dan kekebalan, dan penelitian lebih lanjut diperlukan untuk model penyakit. Sulit untuk membuktikan efek prebiotik pada model hewan sehat yang komunitas mikrobiota stabil dan tangguh. Polisakarida Cistanche deserticola dapat dikembangkan sebagai produk probiotik untuk mengatur mikrobiota usus dan dapat diterapkan pada metabolisme sinergis molekul kecil di masa depan. Data ini akan membantu kami merancang intervensi untuk mencegah kelompok masyarakat rentan untuk meningkatkan kesehatan mereka.

Deklarasi kepentingan bersaing

Para penulis menyatakan bahwa tidak ada konflik kepentingan mengenai publikasi makalah ini.

Ucapan Terima Kasih

Penulis mengucapkan terima kasih kepada National Natural Science Foundation of China (Hibah No. 81830112 dan 81904058)

Referensi
[1] I. Khangwal, P. Shukla, Prebiotik potensial dan mekanisme penularannya: pendekatan terbaru, J. Food Drug Anal. 27 (3) (2019) 649–656.
[2] XF Xu, PP Xu, CW Ma, J. Tang, XW Zhang, Mikrobiota usus, kesehatan inang, dan polisakarida, Biotechnol. Adv. 31 (2) (2013) 318–337.
[3] NT Porter, EC Martens, Peran penting polisakarida dalam ekologi dan fisiologi mikroba usus, Annu. Pdt. Mikrobiol. 71 (2017) 349–369.
[4] QW Guo, QQ Ma, ZH Xue, XD Gao, HX Chen, Studi tentang karakteristik pengikatan tiga polisakarida dengan berat molekul berbeda dan flavonoid dari sutra jagung (stigma Maydis), Carbohyd. Polim. 198 (2018) 581–588.
[5] SS Zhou, J. Xu, H. Zhu, J. Wu, JD Xu, R. Yan, XY Li, HH Liu, SM Duan, Z. Wang, HB Chen, H. Shen, SL Li, Mikrobiota usus -mekanisme yang terlibat dalam meningkatkan paparan sistemik ginsenosides oleh polisakarida hidup berdampingan dalam rebusan ginseng, Sci. Rep. 6 (2016), 22474.
[6] YP Jing, AP Li, ZR Liu, PR Yang, JS Wei, XJ Chen, T. Zhao, YR Bai, LJ Zha, CJ Zhang, Penyerapan saponin Codonopsis pilosula oleh polisakarida yang hidup berdampingan meredakan disbiosis mikroba usus dengan natrium dekstran sulfat -diinduksi kolitis pada tikus model, Biomed. Res. Int. 2018 (2018), 1781036 (18 halaman).
[7] CJ Chang, CS Lin, CC Lu, J. Martel, YF Ko, DM Ojcius, SF Tseng, TR Wu, YYM
Chen, JD Young, HC Lai, Ganoderma Lucidum mengurangi obesitas pada tikus dengan memodulasi komposisi mikrobiota usus, Nat. Kom. 6 (2015) 7489.
[8] JC Zhang, GM Yang, YZ Wen, SX Liu, CF Li, RL Yang, W. Li, Mikrobiota usus terlibat dalam aktivitas imunomodulator polisakarida lengkeng, Mol. nutrisi Makanan Res. 61 (11) (2017), 170466.
[9] T. Wang, XY Zhang, WY Xie, Cistanche deserticola YC Ma, "Ginseng Gurun": ulasan, Am. J.Cin. Med. 40 (6) (2012) 1123-1141.
[10] Y. Li, GS Zhou, SH Xing, PF Tu, XB Li, Identifikasi metabolit echinacosida yang diproduksi oleh bakteri usus manusia menggunakan cairan ultraperforma
kromatografi–spektrometri massa waktu terbang quadrupole, J. Agr. Kimia Makanan. 63 (30) (2015) 6764–6771.
[11] Y. Li, Y. Peng, MY Wang, PF Tu, XB Li, Metabolisme gastrointestinal manusia dari ekstrak air Cistanches Herba in vitro: penjelasan profil metabolisme berdasarkan identifikasi metabolit komprehensif dalam jus lambung, jus usus, usus manusia bakteri, dan mikrosom usus, J. Agric. Kimia Makanan. 65 (34)
(2017) 7447–7456.
[12] M. Dubois, K. Gilles, JK Hamilton, PA Rebers, F. Smith, metode kolorimetri untuk penentuan gula dan zat terkait, Anal. Kimia 168 (4265) (1956) 167.
[13] NH Cho, SY Seong, KH Chun, YH Kim, IC Kwon, BY Ahn, SY Jeong, Imunisasi mukosa baru dengan konjugat protein polisakarida yang terperangkap dalam mikrosfer alginat, J. Control. Rilis 53 (1–3) (1998) 215–224.
[14] XY Zhao, ZZ Jiang, F. Yang, Y. Wang, XM Gao, YF Wang, X. Chai, GX Pan, Y. Zhu, Deteksi sensitif dan sederhana dari pengaruh antibiotik pada perubahan dinamis dan serbaguna dari tinja pendek -asam lemak rantai, PLoS One 11 (12) (2016), e167032.
[15] SJ Li, QP Xiong, XP Lai, X. Li, MJ Wan, JN Zhang, YJ Yan, M. Cao, L. Lu, JM Guan, DY Zhang, Y. Lin, Modifikasi molekul polisakarida dan bioaktivitas yang dihasilkan , Komp. Pdt. Makanan. Sci. F. 15 (2) (2016) 237–250.
[16] ZF Fu, X. Fan, XY Wang, XM Gao, Cistanches Herba: ikhtisar sifat kimia, farmakologi, dan farmakokinetiknya, J. Ethnopharmacol. 219 (2018) 233–247.
[17] W. Zhou, XB Tan, JJ Shan, T. Liu, BC Cai, LQ Di, Pengaruh chitooligosaccharides pada
penyerapan usus glikosida fenilethanoid dalam ekstrak Fructus Forsythia, Phytomedicine 21 (12) (2014) 1549–1558.
[18] LL Sun, M. Wang, HJ Zhang, GJ You, YN Liu, XL Ren, YR Deng, Pengaruh polisakarida dari Ophiopogon japonicus pada 2,3,5,4′-tetrahydroxy -stilbene-2- Z. Fu dkk. / Jurnal Internasional Makromolekul Biologi 149 (2020) 732–740 739 O- -d-glukosida tentang sifat biofarmasi in vitro dan farmakokinetik in vivo, Int. J.Biol. Makromol. 119 (2018) 677–682.
[19] KN Lam, M. Alexander, PJ Turnbaugh, Pengobatan presisi menjadi mikroskopis: merekayasa mikrobioma untuk meningkatkan hasil obat, Mikroba Host Sel 26 (1) (2019) 22–34.
[20] I. Khangwal, P. Shukla, Prospek prebiotik, metode evaluasi inovatif, dan aplikasi kesehatannya: ulasan, 3 Biotech. 9 (5) (2019) 187.
[21] GR Gibson, R. Hutkins, ME Sanders, SL Prescott, RA Reimer, SJ Salminen, K. Scott, C. Stanton, KS Swanson, PD Cani, K. Verbeke, G. Reid, Asosiasi ilmiah internasional untuk probiotik dan pernyataan konsensus prebiotik (ISAPP) tentang definisi dan ruang lingkup prebiotik, Nat. Pdt. Gastro. hati. 14 (8) (2017) 491–502.
[22] JMW Wong, R. de Souza, CWC Kendall, A. Emam, DJA Jenkins, Kesehatan kolon: fermentasi dan asam lemak rantai pendek, J. Clin. Gastroenterol. 40 (3) (2006) 235–243.
[23] SI Cook, JH Sellin, Artikel ulasan: asam lemak rantai pendek dalam kesehatan dan penyakit, Aliment. Farmasi. Ada. 12 (6) (1998) 499–507.
[24] H. Yamashita, K. Fujisawa, E. Ito, S. Idei, N. Kawaguchi, M. Kimoto, M. Hinamori, H. Tsuji, Peningkatan obesitas dan toleransi glukosa oleh asetat pada diabetes tipe 2 Otsuka Long- Evans Tokushima Fatty (OLETF) tikus, Biosci. Bioteknologi. Biokimia. 71 (5) (2007) 1236–1243.
[25] AL Ho, O. Kosik, A. Lovegrove, D. Charalampopoulos, RA Rastall, In vitro fermentabilitas xylooligosaccharides dan fraksi Xylo-polisakarida dengan berat molekul berbeda oleh bakteri tinja manusia, Carbohyd. Polim. 179 (2018) 50–58.
[26] TT Chen, WM Long, CH Zhang, S. Liu, LP Zhao, BR Hamaker, Kapasitas pemanfaatan serat bervariasi dalam mikrobiota usus yang didominasi Prevotella versus Bacteroides, Sci. Rep.7 (1) (2017) 2594.
[27] M. Sakamoto, M. Ohkuma, Bacteroides sartorii adalah sinonim heterotipik sebelumnya dari Bacteroides chinchilla dan memiliki prioritas, Int. J. Sistem. Evolusi mikro 62 (6) (2012) 1241–1244.
[28] PJ Turnbaugh, RE Ley, MA Mahowald, V. Magrini, ER Mardis, JI Gordon, Mikrobioma usus terkait obesitas dengan peningkatan kapasitas untuk panen energi, Nature 444 (7122) (2006) 1027-1131.
[29] LF Gomez-Arango, HL Barrett, HD McIntyre, LK Callaway, M. Morrison, NM Dekker, Hubungan antara mikrobioma usus dan hormon metabolisme pada awal kehamilan pada wanita yang kelebihan berat badan dan obesitas, Diabetes 65 (8) (2016) 2214 –2223.
[30] KL Ormerod, DL Wood, N. Lachner, SL Gellatly, JN Daly, JD Parsons, CG Dal Molin, RW Palfreyman, LK Nielsen, MA Cooper, M. Morrison, PM Hansbro, P. Hugenholtz, Karakterisasi genomik dari famili Bacteroidales yang tidak berbudaya S24-7 yang menghuni usus hewan homeotermik, Microbiome. 4 (1) (2016) 36.
[31] JD Zhang, LJ Lagu, YJ Wang, C. Liu, L. Zhang, SW Zhu, SJ Liu, LP Duan, Efek menguntungkan dari Lachnospiraceae yang memproduksi butirat pada hipersensitivitas viseral yang diinduksi stres pada tikus, J. Gastro. Hepatol. 34 (8) (2019) 1368–1376.
[32] T. Accetto, G. Avguštin, Peralatan degradatif polisakarida tanaman yang beragam dan luas dari rumen dan hindgut Spesies Prevotella: faktor di mana-mana? Sistem aplikasi Mikrobiol. 42 (2) (2019) 107–116.
[33] KE Bach Knudsen, MS Hedemann, HN Lærke, Peran karbohidrat dalam kesehatan usus babi, Anim. Memberi makan. Sci. Teknologi. 173 (1–2) (2012) 41–53.
[34] SA Parker, A . Geirnaert, L. Berchtold, A. Greppi, L. Krych, RE Steinert, T. de Wouters, C. Lacroix, Memahami potensi prebiotik serat makanan yang berbeda menggunakan model fermentasi dewasa berkelanjutan in vitro (PolyFermS), Sci. Rep.8 (1) (2018) 4318.
[35] ZS Zhang, XM Wang, SW Han, CD Liu, F. Liu, Pengaruh dua polisakarida rumput laut pada mikrobiota usus pada tikus dievaluasi oleh Illumina PE250 sequencing, Int. J.Biol. Makromol. 112 (2018) 796–802.