Cistanche Deserticola Polysaccharide Melemahkan Osteoklastogenesis Dan Resorpsi Tulang Melalui Penghambatan Pensinyalan RANKL Dan Produksi Spesies Oksigen Reaktif

Kontak:{0}}/ WhatsApp: 008618081934791

Dezhi Song dkk

Osteoporosis adalah penyakit metabolik yang ditandai dengan osteopenia dan kerusakan mikrostruktur tulang. Osteoklas adalah sel efektor utama yang mendegradasi matriks tulang dan fungsi abnormalnya mengarah pada perkembangan osteoporosis. Akumulasi spesies oksigen reaktif (ROS) selama metabolisme sel mendorong proliferasi dan diferensiasi osteoklas, oleh karena itu, memainkan peran penting dalam osteoporosis.Bentengdeserticolapolisakarida(CDP) memiliki aktivitas antitumor, antiinflamasi, dan antioksidan. Namun, dampak CDP pada osteoklas tidak jelas. Dalam penelitian ini, pewarnaan asam fosfatase tahan tartrat, imunofluoresensi, reaksi rantai transkripsi-polimerase terbalik, dan analisis western blot digunakan untuk menunjukkan bahwa CDP(Bentengdeserticolapolisakarida)menghambat osteoklastogenesis dan resorpsi hidroksiapatit. Selain itu, CDP(Bentengdeserticolapolisakarida)juga menghambat ekspresi gen penanda osteoklas termasuk Ctsk, Mmp9, dan Acp5, dan tidak berpengaruh pada aktivator reseptor ekspresi faktor nuklir B (RANK). Analisis mekanistik mengungkapkan bahwa CDP(Bentengdeserticolapolisakarida)meningkatkan ekspresi enzim antioksidan untuk melemahkan produksi ROS yang dimediasi RANKL dalam osteoklas dan menghambat faktor nuklir sel T teraktivasi dan aktivasi protein kinase teraktivasi mitogen. Hasil ini menunjukkan bahwa CDP dapat mewakili obat kandidat untuk pengobatan osteoporosis yang disebabkan oleh aktivitas osteoklas yang berlebihan.

KATA KUNCIresorpsi tulang,Bentengdeserticolapolisakarida, MAPK, osteoklas, spesies oksigen reaktif

binaraga cistanche

1|PENGANTAR

Keseimbangan antara pembentukan tulang, yang dimediasi oleh osteoblas, dan resorpsi tulang, yang dimediasi oleh osteoklas, memainkan peran penting dalam mempertahankan homeostasis metabolik tulang (Manolagas, 2000; Zhu et al., 2018). Ketika resorpsi tulang melebihi pembentukan tulang, terjadi osteoporosis, yang ditandai dengan berkurangnya massa tulang dan kerusakan mikrostruktur tulang (Ikeda, 2008). Osteoporosis adalah penyakit umum pada individu lanjut usia dan wanita pascamenopause dan patogenesisnya belum sepenuhnya dijelaskan (Cooper & Melton, 1992). Defisiensi estrogen merupakan penyebab utama osteoporosis (Manolagas, O'Brien, & Almeida, 2013). Selain itu, spesies oksigen reaktif (ROS) dapat diinduksi oleh aktivator reseptor ligan faktor nuklir B (RANKL) dan dikaitkan dengan pembentukan osteoklas (Yip et al., 2005), dan dengan demikian dapat berkontribusi pada perkembangan osteoporosis (Manolagas, 2005). 2010). Beberapa penelitian telah menemukan bahwa defisiensi Nrf2-antioksidan meningkatkan kadar ROS dan mendorong diferensiasi osteoklas yang diinduksi RANKL (Hyeon, Lee, Yang, & Jeong, 2013). Oleh karena itu, pengurangan produksi ROS selama diferensiasi osteoklas harus dievaluasi sebagai strategi terapeutik untuk pengobatan osteoporosis.

Osteoklas berasal dari monosit atau garis keturunan hematopoietik makrofag dan merupakan satu-satunya sel berinti banyak yang melakukan resorpsi tulang (Teitelbaum, 2000). Oleh karena itu, penelitian yang melibatkan pembentukan osteoklas sangat penting dalam mengembangkan pengobatan yang efektif untuk penyakit metabolisme tulang (Lorenzo, 2017). Faktor perangsang koloni makrofag (M-CSF) dan RANKL, diproduksi oleh osteoblas dan sel T teraktivasi, adalah sitokin penting yang mengatur osteoklastogenesis (Kim & Kim, 2016; Teitelbaum & Ross, 2003). RANKL menginduksi ekspresi faktor inti sel T teraktivasi (NFATc1), yang merupakan faktor transkripsi kritis yang aktif selama pembentukan osteoklas (Ishida et al., 2002). NFATc1 teraktivasi mempromosikan ekspresi gen penanda osteoklas seperti asam fosfatase tahan tartrat (TRAcP) dan cathepsin K (CTSK) yang mengatur osteoklastogenesis dan fungsi osteoklas (Balkan et al., 2009; Crotti et al., 2008).

Bentengdeserticolapolisakarida(CDP) diisolasi dari batang berdaging dariBentengdan memiliki regulasi kekebalan, antitumor, antipenuaan, dan efek farmakologis lainnya (Guo et al., 2016; Jia, Guan, Guo, & Du, 2012). CDP(Bentengdeserticolapolisakarida)memiliki efek penghambatan pada produksi oksida nitrat (NO) yang diinduksi lipopolisakarida dalam sel mikroglial tikus (sel BV-2; Nan et al., 2013). Selain itu, ekstrak kaya fenilethanoid (ECD) dariBentengmeningkatkan kapasitas renang tikus dengan mengurangi kerusakan otot, menunda akumulasi asam laktat, dan meningkatkan penyimpanan energi (Cai et al., 2010). Namun, efek CDP pada fungsi dan aktivitas osteoklas masih belum diketahui.

Dalam penelitian ini, kami menunjukkan bahwa CDP(Bentengdeserticolapolisakarida)menghambat diferensiasi osteoklas yang diinduksi RANKL dan resorpsi tulang. Mekanisme yang mendasarinya adalah bahwa CDP(Bentengdeserticolapolisakarida)meningkatkan ekspresi enzim antioksidan untuk melemahkan produksi ROS, dan kemudian menekan kaskade pensinyalan protein kinase (MAPK) yang diaktifkan RANKL dan NFAT yang diaktifkan oleh RANKL. Hasil ini menunjukkan bahwa CDP(Bentengdeserticolapolisakarida)dapat digunakan untuk mengobati osteoporosis yang disebabkan oleh resorpsi tulang osteoklastik yang berlebihan.

cistanche maca ginseng

2|BAHAN DAN METODE

2.1|Bahan:

CDP(Bentengdeserticolapolisakarida)(kemurnian > 98 persen ) dibeli dari Solarbio (Beijing, Cina) dan disiapkan pada konsentrasi stok 1 mM dalam phosphate-buffered saline (PBS). Antibodi spesifik untuk c-Fos, CTSK, GSR, TRX1, NOS2, TRAF6, RANK, NFATc1, ERK, JNK, p38, terfosforilasi (p)-ERK, p-p38, p-JNK, dan -aktin diperoleh dari Santa Bioteknologi Cruz (San Jose, CA). Antibodi terhadap V-ATPase d2 diproduksi seperti yang dijelaskan sebelumnya (H. Feng et al., 2009). Sistem assay 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5- (3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS) dan luciferase diperoleh dari Promega (Sydney, Australia) . M-CSF rekombinan dibeli dari R&D Systems (Minneapolis, MN). Protein GST-rRANKL rekombinan diekspresikan dan dimurnikan seperti yang dijelaskan sebelumnya (Xu et al., 2000).

2.2|Budaya sel

Sel RAW264.7 (sel makrofag tikus) diperoleh dari Koleksi Kultur Tipe Amerika (ATCC, Manassas, VA) dan dikultur dalam media esensial minimal yang dimodifikasi (Thermo Fisher Scientific, Scoresby, Australia) yang dilengkapi dengan 10 persen serum janin sapi, 2 mM L-glutamin, 100 U/ml penisilin, dan 100 ug/ml streptomisin (media lengkap). Monosit yang diturunkan dari sumsum tulang (BMM) diisolasi dari tikus C57BL/6J berusia 6 minggu, yang di-eutanasia menurut prosedur yang disetujui oleh Komite Etika Hewan dari University of Western Australia (RA/3/100/1244). Tulang panjang dibedah bebas dari jaringan lunak dan sumsum tulang dikeluarkan dari femur dan tibia, yang kemudian dikultur dalam media lengkap dengan adanya M-CSF (50 ng/ml).

2.3|Uji osteoklastogenesis

BMM dilapisi ke dalam pelat kultur 96-sumur dengan kepadatan 6 × 103 sel per sumur dan diperlakukan dengan media lengkap yang mengandung M-CSF (50 ng/ml) dan GST-rRANKL (100 ng/ml), dengan adanya atau tidak adanya variasi konsentrasi CDP(Bentengdeserticolapolisakarida). The cell culture medium was changed every 2 days. After 5 days, cells were fixed with 4% paraformaldehyde for 10 min, washed three times with PBS, and then stained for TRAcP‐enzymatic activity using the leukocyte acid phosphatase staining kit (Sigma‐Aldrich, Sydney, Australia), following the manufacturer's procedures. TRAcP‐positive multinucleated cells (>tiga inti) diidentifikasi sebagai osteoklas.

2.4|Tes sitotoksisitas

BMM diunggulkan ke dalam pelat 96-sumur pada 6 × 103 sel per sumur dan dibiarkan semalaman untuk melekat. Hari berikutnya, sel-sel diinkubasi dengan berbagai konsentrasi CDP(Bentengdeserticolapolisakarida). Setelah 48 jam lebih lanjut, larutan MTS (20 l/sumur) ditambahkan dan diinkubasi dengan sel selama 2 jam. Absorbansi pada 490 nm ditentukan dengan pembaca lempeng mikro (Multiscan Spectrum; Thermo Labsystems, Chantilly, VA.

2.5|Pewarnaan imunofluoresen

BMM diunggulkan dengan kepadatan 6 × 103 sel per sumur dengan adanya M-CSF (50 ng / ml) semalaman. Sel kemudian distimulasi dengan M-CSF dan GST-rRANKL (100 ng/ml) sampai osteoklas matang terbentuk. Osteoklas kemudian diobati dengan berbagai konsentrasi CDP(Bentengdeserticolapolisakarida)selama 48 jam sebelum difiksasi dengan 4 persen paraformaldehyde, permeabilisasi dengan 0.1 persen Triton X-100-PBS, dan memblokir dengan 3 persen albumin serum sapi di PBS. Sel-sel yang telah disiapkan diinkubasi dengan phalloidin terkonjugasi rhodamin selama 45 menit dalam gelap untuk menodai F-aktin. Sel kemudian dicuci dengan PBS, inti counterstained dengan 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), dan dipasang dengan penutup untuk mikroskop confocal.

pengalaman cistanche

2.6|Uji resorpsi hidroksiapatit

Untuk mengukur aktivitas osteoklas, BMM (1 × 105 sel per sumur) yang dikultur pada pelat berlapis kolagen enam lubang (BD Biocoat; Thermo Fisher Scientific) dirangsang dengan GST-rRANKL (100 ng/ml) dan M-CSF (50 ng/ml) ml) sampai osteoklas matang dihasilkan (Zhou et al., 2016). Sel-sel kemudian dengan hati-hati dilepaskan dari pelat menggunakan larutan disosiasi sel (Sigma-Aldrich) dan jumlah osteoklas dewasa yang sama diunggulkan ke dalam lubang individu dalam pelat 96-sumur berlapis hidroksiapatit (Corning Osteoassay, Corning, NY). Osteoklas dewasa diinkubasi dalam media yang mengandung GST-rRANKL dan M-CSF dengan atau tanpa CDP(Bentengdeserticolapolisakarida)pada konsentrasi yang ditunjukkan. Setelah 48 jam, setengah dari sumur diwarnai secara imunohistokimia untuk aktivitas TRAcP, seperti dijelaskan di atas, untuk menilai jumlah sel berinti banyak per sumur. Sumur yang tersisa diputihkan selama 10 menit untuk menghilangkan sel dan memungkinkan pengukuran area yang diserap. Area resorbed difoto di bawah mikroskop cahaya standar dan perangkat lunak Image J (National Institutes of Health, Bethesda, MD) digunakan untuk mengukur persentase area permukaan hidroksiapatit yang diserap oleh osteoklas.

2.7|Tes reporter Luciferase

Untuk menyelidiki aktivasi transkripsi NFATc1, sel RAW264.7 secara stabil ditransfeksi dengan konstruk reporter luciferase yang responsif NFATc1 (Cheng et al., 2018; van der Kraan et al., 2013). Sel-sel yang ditransfusikan dikultur dalam pelat 48-sumur dengan kepadatan 1,5 × 105 sel per sumur dan diolah sebelumnya dengan berbagai konsentrasi CDP(Bentengdeserticolapolisakarida)selama 1 jam. Setelah perlakuan awal, sel distimulasi dengan GST-rRANKL (100 ng/ml) selama 24 jam, dan aktivitas luciferase diukur menggunakan sistem uji reporter luciferase sesuai dengan protokol pabrikan (Promega).

2.8|Analisis kuantitatif reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)

Total RNA diisolasi dari sel menggunakan reagen Trizol sesuai dengan protokol pabrikan (Thermo Fisher Scientific). DNA komplementer disintesis menggunakan Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase dengan 1 ug template RNA dan primer oligo-dT. Amplifikasi reaksi berantai polimerase dari sekuens spesifik dilakukan dengan menggunakan program berikut: 94 derajat selama 5 menit, diikuti oleh 30 siklus 94 derajat selama 40 detik, 60 derajat selama 40 detik, dan 72 derajat selama 40 detik, dan langkah ekstensi terakhir dari 5 menit pada 72 derajat. Informasi rinci primer spesifik ditunjukkan pada Tabel 1. Tingkat RNA utusan relatif dihitung dengan normalisasi ekspresi gen rumah tangga Hmbs.

2.9|Analisis Western blot

BMM dikultur dalam media lengkap dengan M-CSF dalam pelat enam sumur dan distimulasi dengan GST-rRANKL (100 ng/ml) untuk waktu yang ditentukan. Sel dilisiskan dalam buffer lisis radioimunopresipitasi dan protein diselesaikan dengan elektroforesis gel natrium dodesil sulfat-poliakrilamida dan dipindahkan ke membran poli (vinilidena fluorida) (GE Healthcare, Silverwater, Australia). Membran diblokir dalam 5 persen susu skim selama 1 jam dan kemudian diperiksa dengan berbagai antibodi primer spesifik dengan pengocokan lembut semalaman pada suhu 4 derajat . Membran dicuci dan kemudian diinkubasi dengan antibodi sekunder terkonjugasi peroksidase lobak. Reaktivitas antibodi kemudian dideteksi dengan reagen chemiluminescence yang ditingkatkan (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) dan divisualisasikan dengan Image-quant LAS 4000 (GE Healthcare).

2.10|Deteksi ROS intraseluler

Tingkat ROS intraseluler dideteksi menggunakan kit uji deteksi ROS seluler 2′,7′-dichlorofluorescein diacetate (Abcam, Melbourne, Australia). BMM (5 × 103 sel per sumur) dikultur dalam pelat 96 sumur dan diobati dengan RANKL (100 ng/ml), M-CSF (50 ng/ml), dan CDP selama 72 jam. Tingkat ROS intraseluler diukur menggunakan 2′,7′-dichlorofluorescein diacetate, yang teroksidasi menjadi DCF fluoresen dengan adanya ROS. Sel dicuci dalam buffer Hank dan diinkubasi dalam gelap selama 30 menit dengan 10 M DCFH-DA. Gambar diperoleh dengan menggunakan mikroskop confocal.

2.11|Analisis statistik

Semua data mewakili setidaknya tiga percobaan yang dilakukan dalam rangkap tiga kecuali dinyatakan lain. Data dinyatakan sebagai mean ± SD. Analisis varians satu arah yang diikuti oleh uji post hoc Student-Newman-Keuls digunakan untuk menentukan signifikansi perbedaan antara hasil, dengan p < 0.05="" dianggap="">

3|HASIL

3.1|CDP menghambat osteoklastogenesis dan fusi osteoklas yang diinduksi RANKL

Untuk menentukan apakah CDP(Bentengdeserticolapolisakarida)dapat menekan pembentukan osteoklas yang diinduksi RANKL, pertama-tama kami melakukan uji osteoklastogenesis menggunakan BMM tikus (Liu et al., 2013; Song et al., 2016). BMM diobati dengan RANKL dan M-CSF selama 5 hari dengan peningkatan konsentrasi CDP. CDP mengurangi jumlah sel berinti banyak TRAcP- positif ketika konsentrasi CDP(Bentengdeserticolapolisakarida)mencapai 5 M atau lebih tinggi (Gambar 1a,b). Untuk mengevaluasi CDP(Bentengdeserticolapolisakarida)toksisitas dan mengkonfirmasi bahwa hasil ini bukan cerminan kematian atau jumlah sel, kami melakukan uji MTS. BMM diobati dengan RANKL dan M-CSF selama 48 jam dengan berbagai dosis CDP(Bentengdeserticolapolisakarida). CDP tidak berpengaruh pada proliferasi BMM pada konsentrasi 15 M atau kurang (Gambar 1c).

Untuk menguji efek CDP(Bentengdeserticolapolisakarida)pada fusi osteoklas, osteoklas diinduksi dengan pengobatan RANKL dan M-CSF, dengan atau tanpa dosis CDP yang bervariasi(Bentengdeserticolapolisakarida). Osteoklas diwarnai dengan rhodamin-phalloidin dan DAPI untuk menilai jumlah inti per osteoklas (Gambar 2a). Baik jumlah osteoklas maupun jumlah rata-rata inti per osteoklas menurun setelah CDP(Bentengdeserticolapolisakarida)pengobatan (5-10 M; Gambar 2b,c). Oleh karena itu, CDP(Bentengdeserticolapolisakarida)memiliki efek penghambatan pada osteoklastogenesis dan fusi osteoklas yang diinduksi RANKL dengan cara yang bergantung pada dosis.

3.2|CDP(Bentengdeserticolapolisakarida)melemahkan aktivitas resorpsi hidroksiapatit osteoklastik yang diinduksi oleh RANKL

Uji resorpsi hidroksiapatit dilakukan untuk mendeteksi efek CDP(Bentengdeserticolapolisakarida)pada fungsi osteoklas (Gambar 3a). Setelah inkubasi 24 jam, jumlah osteoklas per sumur tidak berubah sementara area resorpsi hidroksiapatit secara signifikan menurun dengan pengobatan dengan 5 dan 10 M CDP bila dibandingkan dengan kelompok kontrol (Gambar 3b,c). Hasil ini menunjukkan bahwa CDP(Bentengdeserticolapolisakarida)memiliki efek penghambatan yang kuat pada pembentukan osteoklas dan aktivitas resorpsi osteoklas tanpa efek sitotoksik.

3.3|CDP(Bentengdeserticolapolisakarida)menghambat ekspresi gen penanda osteoklas

Untuk menyelidiki lebih lanjut efek penghambatan CDP(Bentengdeserticolapolisakarida)pada osteoklastogenesis dan resorpsi tulang osteoklastik, BMM diobati dengan RANKL dan M-CSF selama 5 hari dengan berbagai konsentrasi CDP(Bentengdeserticolapolisakarida). RT-PCR kemudian dilakukan untuk mendeteksi ekspresi gen penanda osteoklas. Ekspresi Nfatc1, faktor transkripsi penting selama osteoklastogenesis, dihambat oleh CDP(Bentengdeserticolapolisakarida)dengan cara yang bergantung pada dosis (Gambar 4a). Selain itu, CDP(Bentengdeserticolapolisakarida)(5 dan 10 M) menurunkan regulasi ekspresi gen terkait resorpsi tulang, termasuk Mmp9, Ctsk, dan Acp5 (Gambar 4b–d).

3.4|CDP menekan aktivitas NFATc1 dan ekspresi protein hilir

Untuk menguji pengaruh CDP(Bentengdeserticolapolisakarida)pada aktivitas NFATc1 yang diinduksi RANKL, dilakukan uji reporter luciferase. Pengobatan dengan CDP(Bentengdeserticolapolisakarida), pada konsentrasi 5 M dan lebih tinggi, secara signifikan menghambat aktivitas NFATc1 yang diinduksi RANKL (Gambar 5a). Selain itu, analisis western blot menunjukkan bahwa CDP(Bentengdeserticolapolisakarida)secara signifikan menekan ekspresi protein NFATc1 dan c-Fos dalam BMM yang diobati dengan RANKL dan M-CSF selama 3 dan 5 hari (Gambar 5b). Selain itu, ekspresi protein terkait fungsi osteoklas, seperti V-ATPase-d2 dan CTSK, diturunkan regulasinya dengan adanya CDP(Bentengdeserticolapolisakarida)dibandingkan dengan kelompok kontrol. Namun, CDP tidak berpengaruh pada ekspresi RANK (Gambar 5b).

3.5|CDP mempromosikan ekspresi enzim antioksidan untuk mengais produksi ROS selama osteoklastogenesis yang diinduksi RANKL

Untuk mengeksplorasi mekanisme yang mendasari penghambatan osteoklastogenesis bergantung-CDP, BMM diobati dengan RANKL (100 ng/ml) dan M-CSF (50 ng/ml) bersama-sama dengan PBS atau CDP(Bentengdeserticolapolisakarida)selama 72 jam. Kami memeriksa efek CDP pada produksi ROS intraseluler yang dirangsang oleh RANKL. Tingkat ROS intraseluler ditingkatkan dengan pengobatan RANKL, yang dilemahkan oleh CDP (5 dan 10 M; Gambar 6a). Baik jumlah sel ROS-positif dan intensitas pewarnaan ROS diturunkan dengan pengobatan CDP dengan cara yang bergantung pada dosis (Gambar 6b, c). Analisis Western blot menunjukkan bahwa CDP(Bentengdeserticolapolisakarida)mempromosikan ekspresi thioredoxin (TRX1) dan glutathione reductase (GSR) sambil menekan ekspresi inducible nitric oxide synthase (NOS2) dalam BMM yang diobati dengan RANKL dan M-CSF selama 3 hari (Gambar 6d).

Untuk mengeksplorasi lebih lanjut apakah CDP(Bentengdeserticolapolisakarida)menekan diferensiasi osteoklas dengan mengurangi produksi ROS, kami kemudian merawat BMM dengan peroksida (10 M) untuk meniru status ROS yang tinggi dalam sel. BMM diinduksi oleh RANKL dan M-CSF selama 3 hari dan hasil analisis western blot dan RT-PCR menunjukkan bahwa peroksida mempromosikan ekspresi NFATc1 dan c-Fos dibandingkan dengan kelompok kontrol. Konsisten dengan hasil pada Gambar 5, ekspresi NFATc1 dan c-Fos ditekan oleh CDP(Bentengdeserticolapolisakarida)sementara peroksida menyelamatkan efek penghambatan CDP (Gambar 6e, f). Data ini menunjukkan bahwa CDP menekan ekspresi NFATc1 dan c-Fos dengan mengais produksi ROS.

3.6|CDP(Bentengdeserticolapolisakarida)menekan jalur MAPK selama osteoklastogenesis yang diinduksi RANKL

Selanjutnya, kami menyelidiki efek CDP(Bentengdeserticolapolisakarida)pengobatan pada ekspresi TRAF6 yang dimediasi RANKL dan aktivasi jalur MAPK. Setelah inkubasi dalam medium bebas serum selama 2 jam, BMM dirangsang dengan RANKL, dengan atau tanpa CDP, selama 60 menit. Stimulasi dengan CDP (10 M) tidak berpengaruh pada ekspresi TRAF6 dan fosforilasi JNK2 dan ERK1/2 yang dilemahkan pada 10 dan 20 menit (Gambar 7). Selain itu, fosforilasi p38 secara signifikan dihambat oleh CDP(Bentengdeserticolapolisakarida)pengobatan 60 menit dibandingkan dengan kelompok kontrol (Gambar 7). Data ini mengungkapkan bahwa CDP(Bentengdeserticolapolisakarida)menekan jalur pensinyalan MAPK yang diinduksi RANKL, konsisten dengan efek penghambatannya pada pembentukan dan aktivitas osteoklas.

4|DISKUSI

Cistanche, yang dikenal sebagai "ginseng gurun," telah menarik banyak perhatian baru-baru ini karena kemampuannya untuk memodulasi kekebalan dan bertindak protektif selama penuaan dan stres oksidatif (Jia et al., 2012; Snytnikova et al., 2012). Glikosida tersubstitusi fenilpropanoid, komponen aktif utama Cistanche, telah terbukti menghambat aktivitas NO dalam makrofag (Ahn, Chae, Chin, & Kim, 2017). Sebagai tambahanBentengekstrak mengurangi stres oksidatif pada miokardium reperfusi berikut iskemia dan memainkan peran penting dalam penghambatan jalur apoptosis yang mengarah ke cardioprotection (Yu, Li, & Cao, 2016). Sebagai komponen penting dari Cistanche, CDP(Bentengdeserticolapolisakarida)memiliki berbagai fungsi farmakologis. Studi kami saat ini menemukan bahwa CDP menekan diferensiasi dan aktivasi osteoklas teraktivasi-RANKL dengan melemahkan produksi ROS serta aktivasi NFAT dan MAPK.

Sebagai fosfatase asam, TRAcP ada dalam berbagai sel dan berlimpah dalam osteoklas dan makrofag alveolar (Snipes, Lam, Dodd, Gray, & Cohen, 1986). TRAcP adalah enzim karakteristik osteoklas dan ekspresinya terkait erat dengan fungsi osteoklas, dianggap sebagai indikator aktivitas osteoklas dan resorpsi tulang (Minkin, 1982). Dalam penelitian kami, CDP(Bentengdeserticolapolisakarida)menghambat jumlah sel TRAcP-positif, menunjukkan bahwa osteoklastogenesis yang diinduksi RANKL diblokir oleh CDP(Bentengdeserticolapolisakarida). Degradasi matriks tulang oleh osteoklas bergantung pada cathepsin K (CTSK) dan MMPs (Gruber, 2015). Di sini, CDP secara signifikan menurunkan regulasi ekspresi gen fungsional osteoklas seperti Mmp9, Ctsk, dan Acp5.

Diferensiasi dan fungsi osteoklas diatur oleh beberapa jalur pensinyalan (Boyle, Simonet, & Lacey, 2003). Setelah mengikat RANK, RANKL merekrut protein adaptor TRAF6 untuk mengaktifkan ekspresi NFATc1, yang merupakan faktor transkripsi penting untuk pembentukan osteoklas, mempengaruhi ekspresi gen spesifik-osteoklas, termasuk TRAcP dan CTSK (X. Feng, 2005; Takayanagi et al., 2002). Dalam penelitian ini, kami menemukan bahwa CDP(Bentengdeserticolapolisakarida)tidak memiliki efek pada ekspresi RANK dan TRAF6 dalam osteoklas. Namun, CDP(Bentengdeserticolapolisakarida)menghambat aktivasi NFATc1 yang diinduksi RANKL selama osteoklastogenesis BMM. Selain itu, ditunjukkan bahwa ROS, yang diproduksi oleh mitokondria dalam proses pengiriman elektron, mendorong proliferasi dan diferensiasi osteoklas dan mengatur degradasi matriks tulang (Ha et al., 2004). Sebuah studi baru-baru ini menemukan bahwa RANKL menginduksi impor nuklir Bach1 dan melemahkan produksi enzim antioksidan yang dimediasi Nrf2, sehingga menambah ekspresi ROS intraseluler dan osteoklastogenesis pada tikus (Kanzaki et al., 2017). Selain itu, peningkatan pembentukan ROS intraseluler oleh homosistein meningkatkan pembentukan dan aktivitas osteoklas (Koh et al., 2006). Studi kami menemukan bahwa CDP mengurangi akumulasi ROS dalam osteoklas dengan menghambat ekspresi NOS2 dan mempromosikan ekspresi enzim antioksidan, seperti TRX1 dan glutathione reduktase. Ketika kami memperlakukan BMM dengan peroksida untuk meningkatkan akumulasi ROS intraseluler, hasil bahwa peningkatan ROS dapat meningkatkan ekspresi NFATc1 mengungkapkan bahwa ROS adalah hulu NFATc1. Kami juga menemukan bahwa peroksida menyelamatkan efek penghambatan CDP pada ekspresi NFATc1. Jadi, data kami menyarankan bahwa CDP menekan akumulasi ROS untuk menghambat ekspresi NFATc1, kemudian menekan pembentukan dan fungsi osteoklas.

ERK, JNK, dan p38 milik keluarga MAPK, yang juga terlibat dalam regulasi diferensiasi osteoklas (Seger & Krebs, 1995). RANKL mengaktifkan jalur MAPK dengan meningkatkan fosforilasi ERK, JNK, dan p38 (Mizukami et al., 2002). Kami menunjukkan bahwa CDP(Bentengdeserticolapolisakarida)menekan fosforilasi yang dimediasi oleh RANKL dari protein kunci dalam jalur MAPK, dengan demikian berkontribusi pada efek penghambatan CDP pada ekspresi gen penanda osteoklas. Sepengetahuan kami, ini adalah studi pertama yang menunjukkan efek penghambatan CDP(Bentengdeserticolapolisakarida)pada produksi ROS, NFAT, dan aktivasi MAPK, mewakili mekanisme baru aksi CDP in vitro.

Singkatnya, kami menunjukkan bahwa CDP(Bentengdeserticolapolisakarida)melemahkan osteoklastogenesis dan resorpsi hidroksiapatit, dan ekspresi gen penanda osteoklas termasuk Ctsk, Mmp9, dan Acp5. CDP(Bentengdeserticolapolisakarida)mampu menekan produksi ROS yang dimediasi RANKL, serta aktivasi NFAT dan MAPK (Gambar 8). Secara kolektif, hasil kami menunjukkan bahwa CDP(Bentengdeserticolapolisakarida)dapat mewakili obat kandidat untuk pengobatan kondisi terkait osteoklas disertai dengan produksi berlebih ROS.

GAMBAR 8 Diagram skema CDP(Bentengdeserticolapolisakarida)berfungsi dalam diferensiasi osteoklas. CDP(Bentengdeserticolapolisakarida)menekan produksi ROS yang diinduksi RANKL, serta aktivasi NFATc1 dan MAPK, karenanya menghambat osteoklastogenesis. CDP,Bentengdeserticolapolisakarida; MAPK, protein kinase yang diaktifkan mitogen; NFATc1, faktor inti sel T teraktivasi; RANKL, aktivator reseptor ligan faktor nuklir B; ROS, spesies oksigen reaktif [Gambar warna dapat dilihat di wileyonlinelibrary.com]

UCAPAN TERIMA KASIH

Studi ini didukung oleh Nature Science Foundation of China (81572164), National Key Technology Research and Development Program of China (2017YFC1103300), Natural Science Foundation of Guangxi Province (2016GXNSFAA380295), dan University Science and Technology Research Project Guangxi Provinsi (KY2015YB054). Hal ini juga didukung sebagian oleh Proyek Rencana Pengembangan Penelitian dan Teknologi Ilmiah Guangxi (GKG13349003, 1598013-15), Dana Infrastruktur Penelitian Medis & Kesehatan Australia Barat, Arthritis Australia Foundation, Penghargaan Kolaborasi Penelitian Universitas Western Australia (UWA), dan Dewan Penelitian Kesehatan dan Medis Australia (NHMRC, No. 1107828 dan 1027932).

KONFLIK KEPENTINGAN

Para penulis menyatakan bahwa tidak ada konflik kepentingan

Dari: 'Bentengdeserticolapolisakaridamelemahkan osteoklastogenesis dan resorpsi tulang melalui penghambatan pensinyalan RANKL dan produksi spesies oksigen reaktif oleh Dezhi Song et al

---©2018 Wiley Periodicals, Inc. wileyonlinelibrary.com/journal/jcp J Cell Physiol. 2018;233:9674–9684