Karakterisasi Proanthocyanidins Alami Dan Alkali-Teroksidasi Dalam Ekstrak Tumbuhan Dengan Ultrahigh-Resolution UHPLC-MS/MS

Untuk informasi lebih lanjut. kontak{0}}

Abstrak: Dalam penelitian ini, kami menganalisis komposisi proanthocyanidin (PA) dari 55 ekstrak tumbuhan sebelum dan sesudah basaoksidasidengan resolusi ultra tinggi UHPLC-MS/MS. Kami mengkarakterisasi struktur PA alami secara rinci dan mempelajari perubahan canggih dalam struktur PA yang dimodifikasi dan pola serta model reaksi yang khas dalam kelas PA yang berbeda karena oksidasi. PA alami adalah PC tipe A dan B, PD, dan campuran PC/PD. Selain itu, kami mendeteksi PA galloylated. PC tipe B dalam ekstrak tumbuhan yang berbeda agak stabil dan tidak menunjukkan atau sedikit modifikasi karenaoksidasi alkali. Untuk beberapa sampel, kami mendeteksi reaksi intramolekul dari PC yang menghasilkan hubungan eter tipe-A. PC tipe-A juga agak stabil tanpa atau sedikit modifikasi, tetapi di beberapa pabrik, pembentukan eter tambahanhubunganterdeteksi. PA yang mengandung unit PD lebih reaktif. Setelah oksidasi basa, PA ini atau produk oksidasinya tidak lagi terdeteksi oleh MS meskipun jenis yang berbeda dan/atau punuk PA yang tertunda masih terdeteksi oleh UV pada 280 nm. PA Galloylated agak stabil di bawah oksidasi basa jika berbasis PC, tetapi kami mendeteksi konversi intramolekul dari tipe B ke tipe A. PD tergaloiilasi lebih reaktif dan bereaksi serupa dengan PD nongalloy.

Kata kunci: spektrometri massa resolusi tinggi; orbitrap; oksidasi; tanin; UHPLC-DAD-MS/MS

Klik di sini untuk mempelajari lebih banyak produk

1. Perkenalan

Proantosianidin(PA, syn. tanin terkondensasi) adalah oligomer dan polimer yang terdiri dari unit monomer flavan-3-ol (Gambar 1). Keragaman struktur PA terutama berasal dari pola hidroksilasinya, urutan unit flavan-3-ol, dan derajat polimerisasi (DP), selain perbedaan stereokimia pada C2 dan C3 dan variasi lokasi. dan stereokimia antarflavanoidobligasi [1]. PA yang paling umum adalah procyanidins (PCs) yang terdiri dari unit (epi)catechin dan prodelphinidins (PDs) yang terdiri dari unit (epi)gallocatechin (Gambar 1). Struktur PA yang disajikan pada gambar memiliki hubungan C4→C8. Namun, PA juga dapat dihubungkan oleh ikatan C4→C6, dan kita tidak dapat memisahkan kedua hubungan ini satu sama lain dengan spektrometri massa.

PAs are the most commonly available subgroup of plant tannins, responsible for nearly 90% of the world's overall market for industrial tannins (>beberapa 100-kilo ton per tahun), dan secara kimia dan ekonomi lebih menarik sebagai bio-polimer [2-5]. Saat ini, hanya sedikit sumber daya, seperti kulit kayu atau kayu pial, mimosa, quebracho, oak, kastanye, bakau, sumach, myrobalans, dan tara, yang digunakan untuk produksinya dan terutama untuk kebutuhan penyamakan kulit, anggur, mineral flotasi, dan industri pengeboran minyak, untuk pembuatan perekat, selain nutrisi hewan [4,6,7]. Namun, bahkan limbah atau produk sampingan dari penanganan dan pemrosesan buah-buahan, sayuran, dan sumber daya hutan dari aplikasi industri yang tercantum di atas dapat menjadi sumber potensial untuk PA alam [8-11]. PA juga dapat dimodifikasi lebih lanjut untuk meningkatkan kegunaan dan bioaktivitasnya [12,13].

Sifat kimia PA dapat dimodifikasi melalui reaksi derivatisasi [12]. Reaksi-reaksi ini meliputi, misalnya, asilasi-O melalui reaksi dengan klorida asam atau anhidrida atau alkilasi dengan alkil halida. Derivatisasi memodifikasi sifat fisikokimia PA untuk aplikasi komersial dan teknologi pemurniannya. Namun, untuk benar-benar memahami reaksi yang sebenarnya terjadi, beberapa parameter, seperti reagen dan pelarut yang digunakan, suhu, pH, dan waktu reaksi perlu diatur [12]. Cara sederhana dan cepat untuk meningkatkan kegunaan PA tanaman adalah dengan mengoksidasinya untuk membuat PA baru dengan struktur molekul yang diubah. Meskipun kondisi reaksi oksidasi sudah diketahui dengan baik dan mekanisme reaksi yang berbeda telah diusulkan, perubahan struktural yang sesuai terutama diketahui untuk PA kecil individu [14-18]. Misalnya, reaksi oksidasi dan penataan ulang dari berbagai monomer dan dimer flavan-3-ol telah dibahas secara elegan 30 tahun yang lalu, menunjukkan bahwa kimia PA ini pada pH basa diatur oleh pembentukan A-dan/atau B-ring quinone-methides sebagai intermediet yang sangat reaktif menyebabkan reaksi penataan ulang dan konversi oksidatif dari PA tipe-B menjadi tipe-A[15]. Sebaliknya, perilaku campuran PA dalam ekstrak tumbuhan tidak diketahui, dan ini kemungkinan besar karena kesulitan dalam menganalisis PA awal yang berbeda secara struktural, yang ditantang lebih jauh setelah oksidasi. Dalam penelitian kami sebelumnya, kami menguji apakah berbagai jenis PA alami dapat dimodifikasi secara kimia untuk menghasilkan jenis PA baru dan mempelajari efek oksidasi basa nonspesifik yang meniru proses ekstraksi alkali yang sering digunakan untuk limbah kulit kayu [19-23]pada 102 ekstrak tumbuhan yang mengandung PA [13]. Hasilnya menunjukkan reaktivitas yang berbeda untuk PC dan PD. Hasilnya menunjukkan bahwa PA tanaman dapat dimodifikasi pada pH tinggi, dan keberadaan gugus PD secara signifikan meningkatkan kemungkinan reaksi modifikasi. Rute reaksi utama disimpulkan menjadi intramolekul, tetapi untuk PA kaya PD dan gallovlated, baik reaksi intra dan antar molekul diindikasikan [13]. Selain itu, penelitian lain menunjukkan bahwa oksidasi PA mencakup reaksi intramolekul dan antarmolekul [14,15,24,25].

Karakterisasi dan pemahaman terperinci tentang PA alami dan teroksidasi merupakan tantangan, tetapi kemajuan terbaru dalam instrumentasi spektrometri massa tandem kromatografi cair kinerja ultra-tinggi (UHPLC-MS/MS) dengan penganalisis massa resolusi tinggi telah memungkinkan karakterisasi banyak PA tanaman yang berbeda. [18,26-28]. Penganalisis massa yang populer untuk karakterisasi PA adalah orbitrap [27,28] dan quadrupole

time-of-flight(OTOF)[29,30] karena sifatnya yang beresolusi tinggi, yang memungkinkan penentuan massa yang tepat dan rumus molekul yang sesuai dari PA yang dipelajari dalam ekstrak tumbuhan. PA yang ditemukan di alam biasanya mengandung campuran struktur oligo dan polimer yang berbeda, yang menghasilkan ion bermuatan ganda dalam ionisasi semprotan listrik, memperluas rentang massa yang digunakan [30-32]. Selain itu, PA memiliki pola fragmentasi karakteristik yang terkenal, yang dapat digunakan untuk identifikasi: ini termasuk pembelahan kuinon-metida (QM), pembelahan cincin heterosiklik (HRF), dan fragmentasi retro-Diels-Alder (RDA). 31-33]. Pola fragmentasi yang sama biasanya ada untuk PA tipe A dan tipe B, dan nilai m/z yang diamati untuk PA tipe A dengan satu hubungan eter berbeda 2 Da dari PA tipe B yang sesuai [26,{{ 19}}].

Dalam penelitian ini, kami menggunakan UHPLC yang dikombinasikan dengan spektrometri massa tandem resolusi ultra tinggi untuk (a) mempelajari struktur PA alami di 55 sampel tanaman kaya PA secara rinci, (b) untuk melihat perubahan canggih dalam struktur PA yang dimodifikasi setelah oksidasi udara dalam kondisi basa dan (c) untuk mengenali pola khas dan model reaksi dalam kelas PA yang berbeda karena oksidasi.

2. Hasil dan Pembahasan

Kami memilih 55 sampel tanaman kaya PA yang mengandung campuran PA alami yang menarik namun kompleks berdasarkan penelitian kami sebelumnya [13]. Sampel tanaman ini juga dioksidasi oleh oksidasi udara di bawah kondisi basa seperti pada [13] dan setelah oksidasi, PA bahkan lebih kompleks. PA alami dan yang dimodifikasi ini dipelajari di sini oleh UHPLC-DAD yang terhubung ke Q-orbitrap MS/MS resolusi ultratinggi untuk mendeteksi perubahan canggih dalam struktur PA. PA diidentifikasi berdasarkan ion bermuatan tunggal dan/atau berlipat ganda dengan massa tepat dan rumus molekul yang sesuai. Analisis dilakukan dengan fase terbalik LC, dan oleh karena itu, PA oligomer dan polimer terutama hadir sebagai punuk yang tidak terselesaikan dalam kromatogram UV pada 280 nm, lihat ekstrak daun Ruprechtia salicifolia pada Gambar 2A sebagai contoh. Dalam kromatogram ion total, ionisasi senyawa fenolik lainnya lebih intensif daripada PA, dan oleh karena itu, punuk PA tidak begitu jelas (Gambar 2B). Namun, akurasi orbitrap membuat interpretasi hasil MS lebih mudah karena pola isotop dari ion bermuatan ganda didefinisikan dengan jelas, dan kemungkinan tumpang tindih puncak dapat dideteksi, sehingga memungkinkan penentuan massa yang tepat dan rumus molekul oligo- yang berbeda. dan PA polimer. Sebagai contoh, galloylated(epi)catechin pada m/z 441, galloylated dimeric PCat m/z729, dan galloylated trimeric PC pada m/z 1017 menunjukkan puncak yang terpisah dengan baik dalam ekstraksi ion chromatograms (EICs) pada Gambar 2C-E, dan mereka dapat dengan mudah dideteksi berdasarkan spektrum UV dan massanya, termasuk massa eksak dan rumus molekul yang sesuai. Hasil yang diperoleh di sini sesuai dengan hasil sebelumnya yang diperoleh MS/MS, menunjukkan bahwa daun Ruprechtia salicifolia mengandung 24 mg/g PA, dimana hanya 3 persen yang merupakan PA yang mengandung PD, beberapa diantaranya tergaloilasi, dan ditemukan mDP menjadi 7 [13].

2.1.B-Tipe PC dalam Ekstrak Tanaman Non-Teroksidasi Awal

PC tipe-B dalam ekstrak tumbuhan dideteksi berdasarkan ion molekul bermuatan tunggal dan ganda di samping pola fragmentasi yang khas. Sebagai contoh, PC di Begonia bower adalah ekstrak "Nigra" yang menunjukkan serangkaian ion [MH] yang berbeda yang dipisahkan oleh 288 Da dari m/z289 hingga m/z 1729 sesuai dengan PC tipe-B dari monomer ke heksamer dan [M{{ 6}}Ion H]' dipisahkan oleh 144 Da dari m/z 1008 hingga m/z 1296 yang sesuai untuk PC tipe-B dari heptamer ke nonamer (Tabel S1). Spektrum massa PC monomer, yaitu, flavan-3-ols catechin dan epicatechin, menunjukkan ion fragmen karakteristik pada m/z 245 seperti yang dilaporkan sebelumnya [3132,36].

Secara umum, MS/MS dimer PC tipe B menunjukkan pola fragmentasi yang khas yang menghasilkan ion pada m/z 287 dan 289 (pembelahan QM), m/z 425, dan 407 (fragmentasi RDA dan eliminasi air berurutan) dan m /z 451(HRF; Gambar 3). Fragmentasi RDA dianggap sebagai pola fragmentasi yang paling penting untuk karakterisasi dimer PC tipe-B dan fragmentasi pada unit ekstensi dianggap lebih menguntungkan secara energetik karena menghasilkan ion fragmen dengan sistem -πhiperkonjugasi yang lebih besar daripada Fragmentasi RDA pada unit terminal [31-33].

2.2.A-Type PC dalam Ekstrak Tumbuhan Non-Teroksidasi Awal

Kehadiran PA tipe-A dalam ekstrak tumbuhan awal dikonfirmasi oleh pola fragmentasi karakteristiknya yang mirip dengan PA tipe-B. Sebagai contoh, karakteristik jalur fragmentasi dan data MS/MS dari dimer dan trimer PC tipe-A yang memiliki satu hubungan tipe-A diperlihatkan dan dibahas secara rinci (Gambar 4 dan 5). Fragmentasi dimer PC tipe-A menghasilkan empat ion fragmen (Gambar 4). Fragmentasi RDA unit terminal menghasilkan ion pada m/z 423, yang menegaskan adanya hubungan tipe-A [26,34,35]. Selain itu, kami menyarankan bahwa fragmentasi RDA dari unit ekstensi dan hilangnya air secara berurutan dapat menghasilkan ion pada m/z 407. Ion pada m/z 449 adalah produksi HRF, yaitu hasil dari hilangnya unit floroglucinol [26]. Ion pada m/z 285 dan 289 berhubungan dengan pembelahan QM. Demikian pula, trimer PC tipe-A menunjukkan ion molekuler pada m/z 863 dan ion fragmen karakteristik dalam MS/MS pada m/z 711.693.573.559.451.411 dan 289 seperti yang dilaporkan sebelumnya oleh Sui et al.(2016) )[26]. Fragmentasi RDA dari trimer PC tipe-A menghasilkan ion pada m/z 711, yang sekali lagi menegaskan adanya hubungan tipe-A menurut penelitian sebelumnya [26] dan mengisyaratkan bahwa hubungan tipe-A bisa berada di antara dua ekstensi. unit. Kami menyarankan bahwa ion pada m/z 693 sesuai dengan hilangnya air secara berurutan dan mendukung posisi hubungan tipe-A, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 5. Selain itu, kami menyarankan bahwa RDA tambahan dari cincin-C heterosiklik dari unit terminal flavan-3-ol menunjukkan ion pada m/z559. Ion ini kecil dalam penelitian kami. Ion pada m/z573 dan 289 berhubungan dengan pembelahan QM dari ikatan antar flavanoid yang lebih rendah [26]. Kami juga mendeteksi ion pada m/z 575 dan 287. Kami mengusulkan bahwa ion pada m/z 451 dan 411 dapat sesuai dengan HRF dari cincin-C heterosiklik dari unit flavan-3-ol tengah yang mendukung lokasi Keterkaitan tipe-A antar unit penyuluhan menurut Gambar 5.

2.3.Modifikasi PC Tipe-B dalam Ekstrak Tumbuhan Karena Oksidasi Alkali

Setelah oksidasi, PC tipe B dalam ekstrak tumbuhan yang berbeda dimodifikasi secara berbeda. Beberapa sampel tidak menunjukkan atau sedikit modifikasi; lihat Gambar 6A, B, misalnya, untuk oligomer PC tipe-B yang lebih pendek dalam ekstrak daun begonia bower adalah "Nigra" sebelum dan sesudah oksidasi. Ketika jenis ekstrak tumbuhan ini dioksidasi, spektrum massa total ekstrak tumbuhan awal dan teroksidasi adalah serupa. Namun, perbedaan kecil terdeteksi dalam data spektrometri massa terperinci. Misalnya, dimer PC pada m/z 577 masing-masing disertai dengan m/z575, dan trimer PC pada m/z865 dengan m/z 863. Ketika jumlah PC rendah sebelum oksidasi, setelah oksidasi sinyal mereka hampir menghilang dari spektrum massa, mengisyaratkan bahwa mereka telah diubah menjadi tidak dapat diidentifikasi atau terdegradasi karena oksidasi. Fenomena ini diamati, misalnya, untuk ekstrak daun Combretum Indicum dan Euphorbia characias yang mengandung sedikit oligomer PC pendek dan didukung oleh data MS/MS sebelumnya yang menunjukkan bahwa kandungan PA menurun dari 4 mg/mL menjadi 1 mg. /mL dan 7 mg/mL menjadi 1 mg/mL, masing-masing, karena oksidasi [13]. Fenomena ini mungkin terkait dengan kondisi eksperimental yang digunakan, artinya lebih parah ketika kandungan PA awal rendah. Dalam beberapa sampel, bagian dari PC tipe-B lebih banyak dimodifikasi, lihat Gambar 6C, D, misalnya, untuk PColigomer tipe-B yang lebih pendek dalam ekstrak daun Cyperus owoaii sebelum dan sesudah oksidasi. Ketika jenis ekstrak tumbuhan ini dioksidasi, perbedaan yang terlihat terdeteksi dalam spektrum massa total yang menunjukkan perbedaan massa 2 Da dibandingkan dengan PC awal (Gambar 6C, D, Tabel S2).

Telah diketahui dengan baik bahwa oksidasi o-dihidroksi polifenol, yaitu cincin katekol B dari PC, biasanya menghasilkan o-kuinon dengan perbedaan massa 2 Da. Faktanya, kita telah memperhatikan bahwa jenis oksidasi ini juga dapat terjadi dalam analisis spektrometri massa. Mungkin ada sinyal kecil dalam spektrum massa yang memiliki nilai m/z 2 Da lebih kecil dari nilai m/z PC yang sesuai dengan kemungkinan oksidasi atau pembentukan bentuk kuinon PC selama ionisasi (data tidak dipublikasikan). Hal ini layak bahwa di sini dalam oksidasi basa, o-dihidroksi polifenol membentuk o-kuinon pertama. Namun, 0-bentuk kuinon yang terbentuk tidak stabil dan kemungkinan besar cepat bereaksi lebih lanjut. Salah satu hasil yang mungkin adalah konversi oksidatif PC tipe-B menjadi PC tipe-A, seperti yang dilaporkan sebelumnya dalam literatur [15]. Transformasi PC tipe-B menjadi PC tipe-A melibatkan penghilangan oksidatif ion hidrida pada C2 cincin-C sebagai langkah awal: kondisi dasar yang berlaku menginduksi oksidasi fungsi o-dihidroksi cincin-B menjadi o-kuinon, yang selanjutnya berfungsi sebagaipengoksidasiuntuk konversi dimer procyanidin tipe-B menjadi tipe-A [15](Gambar 7). Mekanisme kuinon metida ini juga telah dibuktikan dalam suhu, pH, dan kondisi katalitik yang berbeda [37], dengan oksidasi radikal menggunakan 1,1-difenil-2-radikal pikrilhidrazil dalam kondisi netral [38] dan dengan lakase ( EC1.10.3.2) [39].

Ketika kami mempelajari PC yang dimodifikasi dengan perbedaan massa 2 Da dalam ekstrak teroksidasi dan produksinya yang diperoleh dengan MS/MS, mereka disimpulkan mirip dengan PC tipe-A dan ion fragmennya (seperti yang dibahas di atas dalam Bagian 2.2), menunjukkan pola fragmentasi karakteristik yang menghasilkan ion pada m/z 285 dan 289 (pembelahan QM), m/z 423 (fragmentasi RDA) dan m/z449 (HRF). Sebagai contoh, kami menunjukkan konversi dimer PC tipe-B dari ekstrak leaflet Microgramma Mauritania menjadi dimer PC tipe-A pada Gambar 8.tidak teroksidasiekstrak, kami mendeteksi empat dimer PC tipe-B dengan nilai m/z 577 (Gambar 8A) tetapi tidak ada dimer PC tipe-A dengan nilai m/z 575 (Gambar 8B). Puncak kecil di EIC pada m/z575 mungkin berhubungan dengan oksidasi PC tipe-B dalam sumber ion karena waktu retensi persis sama dengan PC tipe-B. Dalam ekstrak teroksidasi, kami hanya mendeteksi jejak PC tipe-B awal pada m/z 577 (Gambar 8C), tetapi sebaliknya, kami mendeteksi puncak intensif pada waktu retensi selanjutnya yang sesuai dengan PC tipe-A pada m/z 575(Gambar 8D). Puncak kecil di EIC pada m/z577 yang memiliki waktu retensi yang sama berhubungan dengan sinyal isotop pada m/z 575. Harus dicatat bahwa penelitian ini bersifat kualitatif, yang berarti bahwa kelimpahan ion tidak dapat diukur. dibandingkan seperti itu. Selain itu, harus dicatat bahwa konversi PC tipe-B ke PC tipe-A tidak selalu selengkap dalam contoh ini dan bahwa semua PC tipe-B tidak dikonversikan ke PC tipe-A; memperkirakan secara kasar kelimpahan ion oligomer PC tipe-A dan tipe-B adalah sama. Di sisi lain, dalam beberapa sampel, kami mendeteksi lebih banyak perbedaan 2 Da; misalnya, heptamer PC pada m/z 2017 dapat disertai dengan ion pada m/z2015 dan 2013, mengisyaratkan pembentukan satu dan dua hubungan tipe-A, masing-masing.

Meskipun konversi PC tipe B ke tipe A tampaknya menjadi mekanisme reaksi utama, kami tidak dapat sepenuhnya mengecualikan reaksi modifikasi lainnya. PA hadir sebagai campuran kompleks dalam ekstrak non-teroksidasi awal, dan campuran ini bahkan lebih kompleks setelah oksidasi basa menghasilkan sejumlah besar data MS. Sebagai contoh, penelitian sebelumnya pada oksidasi katalis basa dan reaksi penataan ulang PA telah menunjukkan bahwa dimer PC dapat berkonversi menjadi produk yang berbeda dari isomerisasi cincin-C, termasuk tetrahidroksipiranokrom, juga dikenal sebagai florotanin [15]. Produk-produk ini akan menunjukkan nilai m/z yang sangat mirip pada 577 tetapi waktu retensi yang berbeda dalam LCdan pola fragmentasi yang berbeda dalam MS. Berdasarkan EIC pada m/z 577, kami tidak mendeteksi penataan ulang semacam ini dalam kondisi reaksi yang digunakan. Penataan ulang dan pembukaan cincin C heterosiklik juga dapat menghasilkan produk lain melalui isomerisasi regio, epimerisasi, atau migrasi 13-aril [15]. Epimerisasi terutama terkait dengan proses manufaktur dan, misalnya, suhu tinggi yang terkait dengan pemanggangan kakao menyebabkan hilangnya flavan{12}}ol, tetapi juga pada epimerisasi monomer flavan-3-ol, dimer , dan trimer [40]. Selain itu, telah dilaporkan bahwa polifenol oksidase pada daging buah pisang menyebabkan epimerisasi (-)-epigallocatechin menjadi (-)-gallocatechin[41]. Kami melihat kemungkinan epimerisasi flavan-3-ol menggunakan EIC pada m/z289, dan secara umum, kami tidak mendeteksi epimerisasi signifikan yang disebabkan oleh oksidasi basa yang digunakan. Namun, kami tidak dapat sepenuhnya mengecualikan epimerisasi karena kami mendeteksi jumlah ( plus ) -catechin yang lebih tinggi dalam kaitannya dengan (-) -epicatechin dalam ekstrak bunga kembang kol Pavonia yang teroksidasi daripada ekstrak non-oksidasi awal (Gambar S1). Juga harus dicatat bahwa ekstrak teroksidasi dinetralkan sebelum UHPLC-MS/MS, yang mungkin menyebabkan reaksi redoks. Dalam bentuk teroksidasi, kuinon adalah elektrofil yang dapat bereaksi dengan air nukleofilik yang ada, dan ini dapat dengan mudah menghasilkan reaksi reduksi yang menghasilkan PC tipe-B, yang juga dapat menjelaskan mengapa beberapa PC tipe-B tampaknya tidak terpengaruh.

2.4.Modifikasi PC Tipe-A dalam Ekstrak Tumbuhan karena Oksidasi Alkali

PC tipe-A dalam ekstrak tumbuhan yang berbeda bereaksi secara berbeda karena oksidasi basa. Beberapa sampel tidak menunjukkan atau sedikit modifikasi. Ketika jenis ekstrak tumbuhan ini mengalami oksidasi basa, tidak ada perbedaan signifikan yang terdeteksi dalam spektrum massa total (misalnya, lihat Tabel S3 untuk ion utama yang diamati dalam ekstrak daun Aglaonema commutatum var. maculatum sebelum dan sesudah oksidasi). Namun, perbedaan kecil dapat dideteksi dalam data spektrometri massa terperinci yang memiliki perbedaan massa 2 Da dan mengisyaratkan bahwa hubungan eter tipe-A tambahan dapat dibentuk. Fenomena ini lebih jelas untuk beberapa sampel dengan PC tipe-A; PC tipe-A ini diketahui membentuk ikatan eter tipe-A tambahan karena oksidasi basa (Gambar 9). Ketika jenis ekstrak tumbuhan ini dioksidasi, perbedaan yang jelas terdeteksi dalam spektrum massa total yang menunjukkan perbedaan massa 2 Da dibandingkan dengan PC tipe-A awal. Ion [MH]-pada m/z 863 berhubungan untuk trimer PC yang memiliki satu ikatan eter tipe-A dan ion pada m/z 861 untuk trimer PC yang memiliki dua ikatan eter (Gambar 9A ). Demikian pula, PC tetramerik yang memiliki hubungan satu, dua, dan tiga eter dideteksi oleh ion [M -H]-pada masing-masing m/z 1151, 1149, dan 1147 (Gambar 9B). Secara proporsional, PC pentamerik dan heksamerik memiliki satu , dua, dan tiga ikatan eter dideteksi oleh ion [M -H]- pada m/z 1439, 1437, dan 1435 dan pada m/z 1727,1725, dan 1723, masing-masing (Gambar 9C, D; namun, [M -2H]2-ion pada m/z 861 heksamer PC secara eksplisit lebih berlimpah daripada ion [MH]-pada m/z 1723 dan oleh karena itu, ditunjukkan pada angka).

Pembentukan hubungan tipe-A tambahan juga mempengaruhi waktu retensi oligomer ini. Jumlah ikatan eter tambahan tampaknya sampai batas tertentu meningkat ketika derajat polimerisasi PC meningkat, yang diharapkan karena ada lebih banyak posisi untuk ikatan tambahan. Namun, juga harus diperhatikan bahwa mungkin ada sinyal kecil dengan perbedaan massa 2 Da yang sesuai dengan kemungkinan oksidasi atau pembentukan bentuk kuinon PC selama ionisasi, seperti yang dibahas di atas. Puncak ini juga terlihat dalam spektrum massa pada Gambar 9 sebelum puncak utama yang sesuai dengan PC tipe-A. Kelimpahan ion, bentuk pola isotop, dan ion fragmen karakteristik yang diperoleh oleh MS/MS mengkonfirmasi pengamatan hubungan eter tipe-A tambahan. Penting juga untuk dicatat bahwa reaksi intramolekul yang diamati ini tampaknya tidak mempengaruhi tingkat rata-rata polimerisasi karena oligomer atau polimer PA yang lebih tinggi tidak terdeteksi dalam ekstrak teroksidasi dibandingkan dengan ekstrak yang tidak teroksidasi. Pengamatan tersebut didukung oleh Mouls dan Fulcrand (2012) [14].

2.5.Ekstrak Tumbuhan dengan PA yang Memiliki Subunit PC dan PD dan Modifikasinya Karena Oksidasi Akaline

Banyak sampel mengandung PA dengan unit (epi)catechin dan (epi)gallocatechin, yaitu, PA adalah campuran PC/PD. Nasib campuran PC/PD ini karena modifikasi melalui oksidasi basa berbeda dibandingkan dengan PC. Campuran PC/PD terdeteksi dengan jelas dalam ekstrak tumbuhan sebelum oksidasi baik oleh UV dan MS; lihat, misalnya, oligomer PA kecil dalam ekstrak daun awal Podocarpus macrophyllus (Gambar 10A dan Tabel S4). Setelah oksidasi, PA yang dimodifikasi masih terdeteksi oleh UV pada 280 nm sebagai tipe yang berbeda dan/atau punuk yang tertunda (Gambar S2), tetapi tidak terdeteksi lagi oleh MS, lihat, misalnya, oligomer PA yang hilang pada daun yang teroksidasi ekstrak Podocarpus microphallus (Gambar 10B dan Tabel S4). Kami tidak mendeteksi sinyal lain yang dapat berhubungan dengan campuran PC/PD yang dimodifikasi maupun kemungkinan produk degradasinya. Misalnya, untuk dimer PC pada m/z 577, kami dapat mendeteksi dimer PC tipe-A yang sesuai pada m/z 575 dalam ekstrak teroksidasi, tetapi pengamatan berbeda yang serupa tidak dapat dilakukan untuk dimer atau trimer PC/PD (Gambar 10B). Alasan hilangnya oligomer PC/PD yang terdeteksi di ESI-MS dapat berupa, misalnya, reaksi antarmolekul antara PA [13-15,24,25]. Reaksi antarmolekul diketahui menghasilkan pembentukan PA termodifikasi dengan menghubungkan dua rantai oligomer yang berbeda, dan biasanya, mereka mengarah pada peningkatan derajat rata-rata polimerisasi [14]. Sebagai contoh, Vernhet et al. (2014) telah memperhatikan oleh percobaan hamburan sinar-X sudut kecil bahwa jika PA dioksidasi dalam larutan pekat, PA yang dimodifikasi adalah polimer tinggi dengan rantai linier atau bercabang yang panjang [25]. Oksidasi lebih lanjut juga dapat menyebabkan siklisasi antara cincin A dan B dari PA yang berbeda [24]. Selain itu, telah dicatat bahwa ikatan dan struktur baru ini tahan terhadap pembelahan yang dikatalisis asam, dan oleh karena itu, peningkatan derajat rata-rata polimerisasi hanya dapat diperkirakan dengan metode non-depolimerisasi [14,24. Namun, hasil kami menunjukkan bahwa PA yang dimodifikasi ini tidak terdeteksi di bawah kondisi ESI-MS standar yang digunakan untuk PA (Gambar 10). Dalam penelitian kami sebelumnya, kami menggunakan metode berdasarkan pemantauan reaksi yang dipilih oleh triple quadrupole untuk mendeteksi PA dalam sampel yang tidak teroksidasi dan teroksidasi dan memperhatikan bahwa komposisi subunit berubah karena oksidasi basa sehingga metode tersebut tidak lagi mampu mendeteksi PA yang dimodifikasi [13]. Hasil MS resolusi tinggi saat ini mendukung pengamatan kami sebelumnya dengan triple quadrupole bahwa PA yang dimodifikasi dalam ekstrak teroksidasi jauh lebih kompleks daripada PA awal dalam ekstrak yang tidak teroksidasi dan bahwa mereka tidak terdeteksi dalam kondisi UPLC-MS/MS yang serupa. [13].

Metode yang digunakan untuk oksidasi PA dalam literatur agak berbeda dari metode kami, dan oleh karena itu, hasilnya mungkin tidak dapat dibandingkan secara langsung [14,24,25]. Dalam penelitian sebelumnya, oksidasi telah dilakukan dalam air yang diasamkan dengan asam trifluoroasetat pada pH 3,5 untuk meniru pH anggur, dan oksidasi sebenarnya telah diperoleh dengan mengaduk sampel dengan adanya udara selama beberapa hari [14,24, 25]. Kami menggunakan oksidasi basa oleh buffer karbonat pada pH 10 hanya selama satu jam.

Sebagian besar ekstrak tumbuhan melibatkan PA dengan subunit PC dan PD, dan hanya dalam dua sampel, PA dapat dianggap hampir murni PD. Kedua sampel tersebut adalah ekstrak Callisia gentlei varelegans dan Pellaea ooata. PD tipe-B dideteksi dalam var lembut Callisia. Ekstrak elegan sebelum oksidasi; lihat, misalnya, oligomer PD kecil pada Tabel S5, tetapi setelah oksidasi, PD ini tidak terdeteksi lagi oleh MS. Kami tidak mendeteksi sinyal lain yang dapat berhubungan dengan PD yang dimodifikasi atau produk degradasi yang mungkin. Namun, beberapa PA yang dimodifikasi masih terdeteksi oleh UV pada 280 nm sebagai punuk yang lebih rendah dan tertunda (Gambar S3). Menariknya, sebelum oksidasi, PD trimerik tipe-A terdeteksi dalam ekstrak data Pellaea, dan setelah oksidasi, sinyal-sinyal ini masih ada, tetapi intensitasnya jauh lebih rendah.

oleh MS dan, sebagai tambahan, nilai m/z yang sesuai dengan pembentukan hubungan tipe-A tambahan pada trimer PD dideteksi mirip dengan PC tipe-A (Tabel S6). Ini mungkin menunjukkan bahwa selain reaksi antarmolekul yang diamati untuk PD homo-dan heterogen tipe-B, PD tipe-A juga dapat memiliki reaksi intramolekul serupa yang terdeteksi untuk PC tipe-A.

2.6. PA Galloulated dalam Ekstrak Tumbuhan dan Modifikasinya Karena Oksidasi Alkali

Beberapa tanaman mengandung PA galloylated. Kehadiran PC, PD, dan PC/PD yang dialokasikan dalam ekstrak tumbuhan dikonfirmasi oleh pola fragmentasi karakteristiknya. Secara umum, fragmentasi PA yang digalovasi dalam analisis MS terjadi serupa melalui mekanisme RDA., HRF, dan QM seperti yang dibahas di atas [31-33]. Sebagai contoh, karakteristik jalur fragmentasi dan data MS/MS dari dimer PC galloylated dalam ekstrak daun Ruprechtia salicifolia ditunjukkan dan dibahas secara rinci (Gambar 11). Posisi gugus galoil hanya indikasi, dan dapat dilampirkan ke gugus hidroksil bebas lainnya di unit terminal. Ion pada m/z603 adalah produksi HRF. Ion pada m/z 287 dan 441 berhubungan dengan pembelahan QM. Selain itu, kami mendeteksi pembelahan gugus galoil yang menghasilkan ion yang sesuai dengan dimer PC pada m/z577 dan fragmentasi RDA berikutnya dengan ion pada m/z425 dan pembelahan lebih lanjut air dengan ion pada m/z 407. HRF m/z 577 menghasilkan ion fragmen pada m/z 451. Selain itu, kami mendeteksi ion fragmen kecil pada m/z 109,123, dan 125, sesuai dengan cincin aromatik. PA yang tergaloiilasi dapat mengandung beberapa gugus galoil dalam strukturnya (Tabel S7).

PA galloylated yang berbeda berperilaku berbeda selama oksidasi udara dalam kondisi basa. PC yang dilapisi agak stabil dan bereaksi serupa dengan PC yang tidak dilapisi. Misalnya, tidak ada perubahan penting yang terdeteksi untuk PC bergaloy yang memiliki satu gugus galoil dalam strukturnya dalam ekstrak daun teroksidasi Nepenthes maxima (Tabel S7). Namun, harus dicatat bahwa intensitas ion untuk PC tergaloiasi yang memiliki dua atau lebih gugus galoil lebih rendah pada ekstrak teroksidasi Nepenthes maxima dan, misalnya, pentamer PC tergaloiasi dengan beberapa gugus galai tidak lagi dapat dideteksi (Tabel S7). Nilai m/z bilangan bulat untuk beberapa PC yang digaloi sama dengan nilai m/z untuk PC/PD dan, oleh karena itu, MS resolusi ultratinggi diperlukan. Sebagai contoh, m/z 881 sesuai dengan trimerik PA yang terdiri dari dua PC dan satu unit PD (C4sH3; O19, mcalculated 882.20074) dan dengan dimer PC galloylated yang memiliki dua gugus galloyl (C44H34O20, mcalculated,882.16435). Dalam beberapa sampel, seperti dalam ekstrak daun teroksidasi Coccoloba uvifera, PC bergaloy diubah menjadi PC tergaloyasi tipe-A karena oksidasi, meskipun PA yang tergaloiilasi dalam ekstrak awal tampaknya serupa dengan yang ada di Nepenthes maxima. Misalnya, dimer PC yang dialokasikan yang memiliki satu gugus galoil dan menunjukkan ion m/z 729 (Tabel S7) stabil selama oksidasi basa dalam ekstrak daun Nepenthes maxima tetapi sebagian termodifikasi dalam ekstrak daun Coccoloba ugifera yang menunjukkan ion baik pada m /z 727 dan 729. Ion sebelumnya berhubungan dengan PCdimer tipe-A galloylated (m/z727.13148, C37H2O16) dan menunjukkan karakteristik fragmen MS/MS yang mendukung hubungan tipe-A:m/z601(produk HRF dari m/z 727),575(A-type PCdimer), 557 (pembelahan air dari m/z575),449 (HRF m/z575, lihat Gambar 4),423(RDA m/z 575, lihat Gambar 4),285 (QM dari m/z575, lihat Gambar 4), 169 (asam galat),125 (lihat Gambar 11) dan 109 (lihat Gambar 11). Salah satu alasan untuk perbedaan PA serupa antara ekstrak tumbuhan bisa jadi adalah senyawa lain yang ada dalam ekstrak dan mempengaruhi reaksi PA.

Campuran PC/PD dan PD yang digaloi adalah reaktif dan dimodifikasi mirip dengan campuran dan PD PC/PD yang tidak digaloi. Setelah oksidasi, PA ini tidak terdeteksi oleh MS meskipun masih terlihat pada UV pada 280 nm. Kami tidak mendeteksi sinyal lain yang dapat sesuai dengan PA yang dimodifikasi ini maupun dengan kemungkinan produk degradasinya. Dalam satu sampel, yaitu pada daun Acacia karroo, PD tergaloilasi dan nongalloy termodifikasi juga tidak terdeteksi oleh UV pada 280 nm.

Dalam penelitian kami sebelumnya [13], di mana PA dalam ekstrak tidak teroksidasi dan teroksidasi dianalisis dengan metode pemantauan reaksi yang dipilih, kami melihat bahwa punuk galoil yang jelas terdeteksi dengan metode MS/MS khusus galoil dalam sampel teroksidasi, tetapi bentuknya punuk telah berubah dan bergeser sesuai dengan punuk yang diamati dalam kromatogram UV. PA galovasi asli telah dimodifikasi sedemikian rupa sehingga gugus galoil masih dapat dideteksi dengan metode pemantauan reaksi yang dipilih [13]. Studi sebelumnya pada (-)-epigallocatechin gallate dan (-)-epigallocatechin telah menunjukkan bahwa trihydroxyphenyl B-ring adalah situs utama aksi untuk oksidasi dan bahwa tidak ada produk yang dapat dideteksi yang dihasilkan dari oksidasi bagian galloyl [42]. Namun, kondisi reaksi yang digunakan dan produk oksidasi yang diperoleh cukup berbeda dibandingkan dengan penelitian kami karena oksidasi dilakukan dengan radikal peroksil yang dihasilkan oleh termolisis inisiator azo 2,2'-azobis(2,4-dimetilvaleronitril) [42].

Selain PA galloyated, dua sampel, yaitu Cephalotaxus harringtomia subsp. selebaran drupaceous dan daun Laurus nobilis tampaknya mengandung PC terglikosilasi yang memiliki satu unit gula yang melekat pada satu struktur PC. Beberapa PC tipe B terglikosilasi ini diketahui berubah menjadi PC tipe A terglikosilasi selama oksidasi basa tanpa pembelahan unit gula. Selain itu, pembentukan tautan eter tambahan ke PC tipe-A terdeteksi.

3. Bahan dan Metode

Pengumpulan bahan tanaman, pengolahannya, dan ekstraksi, selain itu, untuk oksidasi pada pH 1{{10}}, dilakukan seperti yang dilaporkan sebelumnya [13]. Studi awal berisi 102 sampel, di mana kami menganalisis lebih lanjut 55 sampel (Tabel S8). Untuk oksidasi udara, 20μLo dari setiap ekstrak dioksidasi dengan 18{{40}}uL pH 1{{60}}buffer selama 1 jam pada suhu kamar. Oksidasi dihentikan dengan menambahkan 100 uL 0,6 persen HCOOH berair. Selain itu, 280 Lof air ditambahkan ke 20 L awal yang tidak teroksidasi sebelum analisis untuk mendapatkan volume akhir 300 uL untuk sampel yang tidak teroksidasi dan teroksidasi. Analisis spektrometri massa resolusi ultratinggi dilakukan oleh UPLC-DAD-ESI-QOrbitrap-MS/MS. Instrumen terdiri dari sistem UPLC Acquity (Waters Corp., Milford, MA, USA) yang digabungkan dengan spektrometer massa quadrupole-Orbitrap (QExactiveTM, Thermo Fisher Scientific GmbH, Bremen, Jerman). Kolom yang digunakan adalah kolom Acquity UPLC BEH Phenyl (2,1 × 100 mm,1,7 um, Waters Corp., Wexford, Irlandia). Eluennya adalah A= asetonitril dan B=0.1 persen HCOOH. Laju alir 0,5 mLmin-1 digunakan, dan profil elusinya adalah sebagai berikut:0-0. 5 menit,0,1 persen A dalam B(isokrat);0.5-5 min,0.1-30 persen A dalam B(gradien linier);5-6min,30 persen {{44} } persen A dalam B(gradien linier);6-6.1 menit, 35-90 persen A dalam B(gradien linier); 6.1-9.5 menit, kolom wash dan re-equilibration. Volume injeksi adalah 5μL. Data UV =190-500nm） dan MS dicatat selama analisis. Ionisasi negatif digunakan dalam sumber ESI yang dipanaskan dengan tegangan semprot -3.0 kV, laju alir gas selubung (N2) 60, laju alir gas bantu (N2) 20, laju alir gas sapuan 0, suhu kapiler plus 380 derajat dan disosiasi akibat tumbukan (CID) di sumber sebesar 30 eV. Untuk pemindaian penuh MS, rentang massa orbitrap adalah m/z150-2250, resolusi 35,000, dan kontrol penguatan otomatis3×10*. Untuk analisis MS/MS yaitu dd-MS2(TopN), parameternya adalah sebagai berikut: TopN 3; energi tumbukan yang dinormalisasi bertahap 20, 50, dan 80 eV, resolusi 17.500, dan kontrol penguatan otomatis 1×105. Kalibrasi dilakukan oleh Pierce ESI Negative Ion Calibration Solution (Thermo Fisher Scentific Inc., Waltham, MA, USA). Data diolah dengan software Thermo Xcalibur Oral Browser (Version3.0.63, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA). Sebagai sampel teroksidasi diperoleh dengan menggunakan buffer natrium karbonat (pH 10), natrium membentuk ion cluster dengan asam format selama analisis UHPLC-MS/MS. Oleh karena itu, pada awal setiap kromatogram ion total sampel teroksidasi, puncak kuat gugus natrium format terdeteksi (Tabel S9). Polanya mudah dideteksi dan tidak mempengaruhi analisis PA. Ion fragmen MS/MS dari oligomer PA kecil disajikan pada Tabel S10.

4. Kesimpulan

Dalam penelitian ini, kami menganalisis komposisi PA dari 55 ekstrak tumbuhan sebelum dan sesudah oksidasi basa dengan resolusi ultratinggi UHPLC-MS/MS (Tabel S8). Struktur PA alami berisi PC tipe A dan B, PD, dan campuran PC/PD selain yang dialokasikan. Komposisi PA kompleks, dan MS resolusi ultra tinggi diperlukan untuk mengukur massa yang tepat dan rumus molekul yang sesuai dari beragam PA. PC tipe B dalam ekstrak tumbuhan yang berbeda agak stabil dan tidak menunjukkan atau sedikit modifikasi karena oksidasi basa. Untuk beberapa sampel, kami mendeteksi reaksi intramolekul dari PC yang menghasilkan hubungan eter tipe-A. PC tipe-A juga agak stabil tanpa atau sedikit modifikasi, tetapi, di beberapa pabrik, pembentukan ikatan eter tambahan terdeteksi. Ekstrak tumbuhan yang mengandung unit PD dalam PA (baik PD murni atau campuran PC/PD) lebih reaktif. Setelah oksidasi basa, PA ini atau produk oksidasinya tidak lagi terdeteksi oleh MS meskipun jenis yang berbeda dan/atau punuk PA yang tertunda masih terdeteksi oleh UV pada 280nm. Reaksi antarmolekul antara PA mungkin memodifikasi PA ini sehingga tidak terdeteksi di bawah kondisi ESI-MS standar. Studi sebelumnya telah menunjukkan bahwa PA yang dimodifikasi ini tidak dapat dipelajari dengan metode degradasi. Oleh karena itu, diperlukan metode analisis baru untuk identifikasi dan karakterisasinya. PA yang digaloyasi relatif stabil di bawah oksidasi basa jika berbasis PC, tetapi ikatan eter tambahan dibentuk untuk mendukung konversi PA tipe B yang digaloiilasi menjadi PA tipe A yang digaloiilasi. PA yang mengandung dua atau lebih gugus galoil lebih reaktif daripada yang hanya mengandung satu gugus. Campuran PC/PD yang digalovasi dan PD lebih reaktif dan bereaksi serupa dengan yang tidak tergaloiilasi. Namun, harus dicatat bahwa reaksi intra dan antar molekul tidak eksklusif, dan reaksi ini dapat terjadi secara bersamaan. Selain itu, matriks tanaman dan senyawa lain yang ada mempengaruhi interaksi ini.