Karakterisasi Asam Caffeoylquinic Dari Lepisorus Thunbergianus Dan Aktivitas Penghambatan Melanogenesisnya

Kontak: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:{0}}

Hak Hyun Kim, Jae Kwon Kim, Jaehyun Kim, Se-Hui Jung,* and Kooyeon Lee*

ABSTRAK:Hiperpigmentasi akibat overaktivasi tirosinase menyebabkan bintik-bintik gelap atau bercak pada kulit manusia. Meskipun fenomena ini tidak berbahaya, masih ada permintaan yang besar untuk inhibitor melanogenesis untuk mencegah hiperpigmentasi dengan menghambat tirosinase, enzim yang membatasi laju dalam melanogenesis. Meskipun Lepisorus thunbergianus telah digunakan dalam pengobatan tradisional sebagai agen diuretik dan hemostatik, efeknya pada melanogenesis belum dilaporkan. Dalam penelitian ini, kami menyiapkan ekstrak L.thunbergianus dan fraksi pelarutnya dan mengevaluasi aktivitas biologisnya terhadap radikal bebas dan sintesis melanin. Ekstrak L. thunbergianus menghambat aktivitas tirosinase jamur lebih efisien daripada, dan dengan aktivitas antioksidan serupa dengan, arbutin in vitro. Evaluasi komparatif aktivitas anti-melanogenesis dan anti-tirosinase fraksi pelarut L. thunbergianus menunjukkan bahwa, dengan menghambat aktivitas tirosinase, fraksi butanol memiliki potensi tertinggi untuk penghambatan melanogenesis pada sel melanoma. Kami menemukan dengan analisis struktural menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) dan spektroskopi NMR bahwa senyawa utama dalam fraksi butanol adalah tiga turunan asam caffeoylquinic. Ketiga turunan tersebut memiliki aktivitas penangkal radikal dan anti-tirosinase yang serupa secara in vitro, sementara hanya asam 5-caffeoylquinic yang memiliki efek penghambatan pada melanogenesis yang diinduksi -MSH. Efek penghambatan 5-asam caffeoylquinic diverifikasi dengan penentuan kandungan melanin dan aktivitas tirosinase dalam melanoma setelah merawat sel dengan senyawa komersial. Lebih lanjut, kami mengungkapkan bahwa 5-asam caffeoylquinic menghambat melanogenesis dengan mengkhelat kation tembaga dari kompleks tembaga-tirosinase. Dengan demikian, 5-asam caffeoylquinic atau fraksi butanol yang diisolasi dari L. thunbergianus mungkin berguna dalam kosmetik sebagai bahan pemutih kulit.

Cistanche tubulosa: agen pemutih kulit.

PENGANTAR

Melanin, sekelompok pigmen alami yang ditemukan di sebagian besar organisme, memainkan peran penting dalam pencoklatan buah-buahan, jamur, dan sayuran dan pigmentasi pada kulit manusia.1 Melanini dihasilkan dari asam amino tirosin melalui proses multilangkah yang mencakup oksidasi enzimatik dan polimerisasi. 2 Pada manusia, pigmen melanin disintesis oleh melanosit sel dendritik khusus yang terletak di persimpangan antara epidermis dan dermis di mana sintesis dimulai dengan paparan sinar ultraviolet (UV).3 Pigmen melanin diangkut ke keratinosit untuk melindungi kulit terhadap sinar UV dan radikal bebas; dengan demikian, warna kulit ditentukan oleh pola distribusi pigmen melanin.2 Disregulasi sintesis melanin menyebabkan berbagai bentuk hiperpigmentasi, seperti melasma, bintik-bintik, bintik-bintik penuaan, solar lentigo, hiperpigmentasi pascainflamasi, dan sindrom hiperpigmentasi lainnya.4 Lebih dari satu Seratus protein terkait dengan sintesis melanin, dan di antaranya, tirosinase adalah enzim pembatas laju yang diakui sebagai sintesis formelanin yang bertanggung jawab.5 Dengan demikian, sebagian besar penelitian untuk mencegah hiperpigmentasi difokuskan pada identifikasi, isolasi, sintesis, dan karakterisasi senyawa potensial baru. inhibitor tirosinase untuk pencegahan melanogenesis.1,6 Sejumlah inhibitor tirosinase, seperti asam kojic, arbutin, hidrokuinon, asam azelaic, asam ellagic, dan asam traneksamat, telah populer digunakan dalam industri kosmetik sebagai agen anti-melanogenesis; namun, karena keterbatasan obat kimia, yang meliputi sitotoksisitas dan efek samping, masih ada permintaan bahan baru dengan keamanan, stabilitas, dan kemanjuran yang lebih baik.7

Produk alami, termasuk tanaman, bakteri, dan jamur, telah menjadi sumber alternatif untuk penemuan bahan pemutih kulit yang efisien karena toksisitasnya yang lebih rendah dan biokompatibilitas dan bioavailabilitas yang lebih baik.1,8 Lepisorus thunbergianus adalah pakis yang termasuk dalam Polypodiaceae, yang tumbuh menempel pada batuan tua atau kulit pohon dan tersebar di daerah beriklim sedang di Asia Timur, seperti Korea, Jepang, Cina, Filipina, dan Indocina. L. thunbergianus telah digunakan sebagai diuretik, agen hemostatik dan antitusif dalam pengobatan rakyat Korea. Studi sebelumnya melaporkan bahwa ekstrak L. thunbergianus memiliki aktivitas peroksidasi anti-lipid topikal dalam aktivitas lokal dan antioksidan.9 Selanjutnya, ekstrak L. thunbergianus menunjukkan penghambatan pertumbuhan tergantung konsentrasi yang signifikan pada kanker mulut dan sel kanker usus besar.10 Ekstrak L. thunbergianus mungkin memiliki aplikasi potensial dalam industri kosmetik karena tanaman ini mengandung berbagai senyawa flavonoid dan berbagai molekul bioaktif, yang meliputi quercetin 3-metil eter-glukosida, vitexin, oriental, periodik-glukosida, isovitexin, orientin, Corentin, dan caffeoylquinicacid.9a Namun, efek dari L. thunbergianus ekstrak sintesis onmelanin dalam melanosit belum dapat dijelaskan.

Gambar 1. Analisis ekstrak L. thunbergianus untuk (A) ABTS radikal scavenging, (B) anti-tirosinase, dan (C) intraseluler ROS scavengingactivities

Dalam penelitian ini, kami menyiapkan ekstrak L. thunbergianus dan fraksi pelarutnya melalui fraksinasi serial dan menyelidiki efek penghambatan fraksi pelarut pada biosintesis melanin dalam sel melanoma B16F10. Kami mengidentifikasi fraksi butanol (n-BuOH) sebagai bagian utama yang mengandung inhibitor alami dan selanjutnya mengkarakterisasi efek turunan asam caffeoylquinic yang diisolasi dari ekstrak L. thunbergianus pada penghambatan biosintesis melanin.

ulasan cistanche: anti-oksidasi

HASIL DAN DISKUSI

Ekstrak Etanol L. thunbergianus Mengais Radikal 2,2′-Azinobis(3-etil-benzotiazolin-6-asam sulfonat (ABTS) dan Menghambat Aktivitas Tirosinase.

Ekstraksi L. thunbergianus dengan etanol 70 persen (EtOH) dilakukan untuk menilai potensi aktivitas penghambatan senyawa alam di dalam tanaman. Aktivitas pemulungan radikal ekstrak L.thunbergianus ditentukan dalam rentang konsentrasi 2-200 ug/mL. Ekstrak etanol menunjukkan aktivitas penangkapan radikal yang bergantung pada konsentrasi dengan efek maksimal pada 50 ug/mL dimana hasilnya konsisten dengan arbutin yang digunakan sebagai kontrol positif (Gambar 1A).

Kami juga mengevaluasi efek penghambatan ekstrak pada aktivitas tirosinase jamur dengan mengukur laju sintesis dopakrom yang dikatalisis oleh tirosinase. Ekstrak etanol menghambat 87 persen aktivitas tirosinase pada 500 ug/mL, sedangkan arbutin hanya menghambat 38 persen aktivitas tirosinase pada konsentrasi yang sama (Gambar 1B). Kemudian, kami mengevaluasi aktivitas pemulungan ekstrak pada ROS intraseluler yang meningkat sebesar 100 M hidrogen peroksida. Pengobatan dengan hidrogen peroksida yang diinduksi sekitar 2,1-kali lipat peningkatan tingkat ROS intraseluler sel B16F10 (Gambar 1C). Kami menemukan bahwa peningkatan ROS intraseluler yang dimediasi oleh hidrogen peroksida diambil oleh ekstrak dengan cara yang bergantung pada dosis: aktivitas pembersihan maksimal pada 100 ug/mL adalah 78 persen (Gambar 1C). Hasil ini menunjukkan bahwa ekstrak etanol L. thunbergianus mengandung bahan bioaktif yang menghambat aktivitas tirosinase serta mengais radikal ABTS dan ROS intraseluler.

ekstrak cistanche deserticola: menghambat aktivitas tirosinase.

Potensi Inhibisi Fraksi L. thunbergianus Terhadap Melanogenesis.

A crude EtOH extract was fractionated with various solvents including hexane (Hex), methylene chloride (CH2Cl2), ethyl acetate (EtOAc), and butanol to identify and characterize ingredients inhibiting melanogenesis. To identify which solvent fractions have the potential against melanin synthesis, we performed a comparative analysis of four different L. thunbergianus solvent fractions for the radical scavenging and anti-tyrosinase activities. First, to evaluate the antioxidant activity of the four solvent fractions of the L. thunbergianus extract, we determined the ABTS radical scavenging activities in the concentration range of 2−200 μg/ mL. All fractions showed a concentration-dependent increase in ABTS radical scavenging activity (Figure 2A). In particular, EtOAc and n-BuOH fractions completely scavenged the ABTS radical at a 50 μg/mL concentration. The ABTS radical scavenging activity was in the order of n-BuOH > EtOAc >CH2Cl2 > Hex, yang konsisten dengan laporan sebelumnya.10bSelanjutnya, efek penghambatan aktivitas ontirosinase fraksi pelarut yang berbeda meningkat dengan cara yang bergantung pada konsentrasi: aktivitas penghambatan maksimal fraksi n-Hex dan CH2Cl2 berada di bawah 65 persen , tetapi aktivitas EtOAc dan Fraksi n-BuOH berada di atas 70 persen (Gambar 2B). Aktivitas penghambatan berada pada urutan n-BuOH > EtOAc > CH2Cl2 > n-Hex. Hasil ini menunjukkan bahwa lebih banyak fraksi hidrofilik, termasuk fraksi n-BuOH dan EtOAc, menunjukkan aktivitas penangkapan radikal yang lebih tinggi dan aktivitas penghambatan yang lebih baik daripada fraksi n-Hex dan CH2Cl2 yang lipofilik. .

Selanjutnya, efek dari fraksi pelarut L. thunbergianus pada proliferasi sel melanoma diselidiki dengan memperlakukan sel B16F10 dengan 200 ug/mL masing-masing fraksi yang berbeda atau 2mg/mL arbutin di adanya hormon -melanocyte-stimulating (-MSH), yang dikenal untuk mempromosikan melanogenesis melalui induksi microphthalmia-associated transcription factor (MITF).11 Hasil menunjukkan bahwa tidak ada fraksi yang memiliki efek signifikan pada proliferasi sel melanoma (Gambar 2C). Kami kemudian menyelidiki efek penghambatan fraksi pelarut pada melanogenesis yang distimulasi oleh -MSH dalam sel melanoma. Pengobatan dengan -MSH menginduksi peningkatan sekitar 2.0-kali lipat kandungan melanin intraseluler sel B16F10 (Gambar 2D). Kami menemukan bahwa melanogenesis yang dimediasi -MSH sepenuhnya dihambat oleh fraksi n-BuOH (p <0,01) dan="" sebagian="" dihambat="" oleh="" etoacfraction="" (40="" persen,="" p=""><0,01), sedangkan="" melanogenesis="" yang="" dimediasi="" -msh="" tidak="" diubah="" secara="" signifikan="" oleh="" n-hex="" dan="" fraksi="" ch2cl2="" (gambar="" 2d).="" selanjutnya,="" efek="" penghambatan="" fraksi="" pelarut="" pada="" aktivasi="" tirosinase="" yang="" dimediasi="" oleh="" -msh="" ditentukan="" karena="" tirosinase="" memainkan="" peran="" kunci="" dalam="" melanogenesis.="" n-buoh="" (95="" persen,="" p=""><0,001) dan="" etoac="" (66="" persen,="" p=""><0,001) fraksi="" membalikkan="" aktivasi="" tirosinase="" yang="" dimediasi="" oleh="" -msh,="" sedangkan="" fraksi="" n-hex="" dan="" ch2cl2="" tidak,="" seperti="" yang="" ditunjukkan="" pada="" gambar="" 2e.="" selain="" itu,="" efek="" pembilasan="" dari="" fraksi="" pelarut="" yang="" berbeda="" pada="" peningkatan="" ros="" intraseluler="" dirangsang="" oleh="" hidrogen="" peroksida.="" semua="" fraksi="" pelarut="" membalikkan="" peningkatan="" ros="" intraseluler="" yang="" dimediasi="" oleh="" hidrogen="" peroksida,="" seperti="" yang="" ditunjukkan="" pada="" gambar="" 2f.="" hasil="" ini="" menunjukkan="" bahwa="" fraksi="" buoh="" dari="" l.="" thunbergianus="" menghambat="" sintesis="" melanin="" yang="" diinduksi="" -msh="" dengan="" menghambat="" aktivitas="" tirosinase="" intraseluler="" dalam="" sel="" b16f10.="" selanjutnya,="" hasil="" ini="" menunjukkan="" bahwa="" bahan="" bioaktif="" yang="" menghambat="" sintesis="" melanin="" bersifat="" hidrofilik="" dan="" terutama="" ditemukan="" pada="" fraksi="">

Gambar 2. Pengaruh fraksi pelarut pada aktivitas scavenging radikal ABTS, anti-tirosinase, dan anti-melanogenesis.

Identifikasi dan Karakterisasi Senyawa Bioaktif Ekstrak L. thunbergianus.

Untuk mengidentifikasi dan mengkarakterisasi bahan yang menghambat melanogenesis, dilakukan analisis kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) untuk semua fraksi pelarut. Analisis HPLC dari fraksi pelarut mengungkapkan bahwa semua fraksi mengandung tiga senyawa utama pada waktu retensi masing-masing 21, 28, dan 29 menit untuk senyawa 1, 2, dan 3 (Gambar 3A−D). Ketiga senyawa utama ini selanjutnya diisolasi dengan pemurnian HPLC preparatif. Jumlah tiga senyawa utama dalam fraksi n-BuOH ditentukan menggunakan turunan asam caffeoylquinic komersial sebagai molekul standar internal, menurut laporan sebelumnya.12

Senyawa yang diisolasi kemudian diidentifikasi dengan membandingkan data 1H dan 13C NMR dengan literatur dan ditemukan sesuai dengan struktur yang diusulkan (Gambar 4).13 Gambar 3E menunjukkan struktur molekul dari tiga senyawa. Senyawa 1 (hasil, 3,2 ± 0.1 mg/100 mg n fraksi BuOH) diperoleh sebagai bubuk kuning pucat. 1HNMR (400 MHz, DMSO-d6) 9,66 (1H, brs), 9,20 (1H, brs),7,49 (1H, d, J=15,9 Hz), 7,04 (1H, s), 6,99 ( 1H, d, J=8.2Hz), 6.78 (1H, d, J=8.1 Hz), 6.23 (1H, d, J=15.9 Hz), 5.20( 1H, m), 5,08 (1H, brs), 4,89 (1H, brs) 4,13 (1H, m), 3,84(1H, m), 3,56 (1H, s), 3,35 (1H, s), 1,99 (1H, m), 1,92 (1H,m), 1,89 (1H, m), 1,79 (1H, m). 13C{1H} NMR (100 MHz,DMSO-d6) (176.42, 168.10, 148.14, 145.53, 144.75, 125.65.121.07, 115.75, 114.71, 114.22, 72.88, 71.01, 70.85, 69.49,35.22, 33.75). Senyawa 1 diidentifikasi sebagai 3-caffeoylquinicacid dengan analisis NMR dan dibandingkan dengan literatur sebelumnya.13b

Senyawa 2 (hasil, 14,1 ± 0,1 mg/100 mg n-BuOHfraksi) diperoleh sebagai bubuk kuning pucat. 1H NMR (400MHz, DMSO-d6) 9,64 (1H, brs), 9,20 (1H, brs), 7,52 (1H,d, J=15.9 Hz), 7,06 (1H, s), 7,02 ( 1H, d, J=8.1 Hz) 6.79(1H, d, J=7.9 Hz), 6.30 (1H, d, J=15.9 Hz), 4.85 ( 1H, brs),4,70 (1H, d, J=4.9 Hz), 4,12 (1H, brs), 3,95 (1H, m), 1,97(2H, m), 1,88 (1H, m), 1,83 (1H, m). 13C{1H} NMR (100MHz, DMSO-d6) (176.02, 166.27, 148.28, 145.55, 144.77.125.54, 121.19, 115.76, 114.68, 114.57, 76.66, 73.92, 66.05.64.31, 48.57, 38.20). Senyawa 2 diidentifikasi sebagai {}asam caffeoylquinic dengan analisis NMR dan dibandingkan dengan literatur sebelumnya.13c

Senyawa 3 (hasil, 3,9 ± 0.2 mg/100 mg n-BuOHfraksi) diperoleh sebagai bubuk kuning pucat. 1H NMR (400MHz, DMSO-d6) 9,64 (1H, brs), 9,20 (1H, brs), 7,52 (1H,d, J=15.9 Hz), 7,06 (1H, s), 7,02 ( 1H, d, J=8.1 Hz) 6.79(1H, d, J=7.9 Hz), 6.30 (1H, d, J=15.9 Hz), 4.85 ( 1H, brs),4,70 (1H, d, J=4.9 Hz), 4,12 (1H, brs), 3,95 (1H, m), 1,97(2H, m), 1,88 (1H, m), 1,83 (1H, m). 13C{1H} NMR (100MHz, DMSO-d6) (176.02, 166.27, 148.28, 145.55, 144.77.125.54, 121.19, 115.76, 114.68, 114.57, 76.66, 73.92, 66.05.64.31, 48.57, 38.20). Senyawa 3 diidentifikasi sebagai {}asam caffeoylquinic dengan analisis NMR dan dibandingkan dengan literatur sebelumnya.13a

Gambar 3. Kromatogram HPLC dari (A) n-Hex, (B) CH2Cl2, (C) EtOAc, dan (D) n-BuOH fraksi L. thunbergianus dan (E) struktur tiga senyawa utama.

Potensi Penghambatan Turunan Asam Caffeoylquinic yang Diisolasi dari L. thunbergianus terhadap Melanogenesis.

Selanjutnya, untuk mengidentifikasi bahan aktif biologis yang mendasari anti-melanogenesis yang kuat, kami menentukan aktivitas penghambatan dari tiga turunan asam caffeoylquinic yang diisolasi dari L. thunbergianus terhadap sintesis melanin dalam sel-sel melanoma. Pertama, efek dari tiga turunan pada pemulungan radikal ABTS diselidiki. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ketiga turunannya memiliki aktivitas penangkal radikal ABTS yang sama (Gambar 5A). Kami kemudian menyelidiki efek penghambatan dari tiga turunan yang diisolasi dari aktivitas ontyrosinase L. thunbergianus. Tiga turunan menunjukkan penghambatan aktivitas tirosinase yang bergantung pada konsentrasi, dengan penghambatan maksimal pada konsentrasi 200 M (Gambar 5B). Selanjutnya, kami menyelidiki efek penghambatan dari ketiga turunan tersebut pada sintesis melanin yang diinduksi -MSH dalam sel B16F10. Pengobatan dengan -MSH menginduksi kira-kira 2.0-peningkatan kandungan melanin intraseluler sel B16F10 (Gambar 5C). Menariknya, senyawa 1 (3-caffeoylquinicacid) dan 3 (4-caffeoylquinic acid) secara signifikan meningkatkan sintesis melanin masing-masing sebesar 25 dan 23 persen (Gambar 5C, p< 0.001),="" while="" compound="" 2="" (5-caffeoylquinic="" acid)="" completely="" reversed="" α-msh-induced="" melanogenesis="" (p="" <="" 0.001).="" these="" results="" suggest="" that="" the="" three="" caffeoylquinic="" acid="" derivatives="" with="" similar="" structures="" but="" different="" substitution="" sites="" have="" different="" biological="" activities="" on="" melanogenesis.="" furthermore,="" 5-caffeoylquinic="" acid="" has="" potent="" inhibitory="" activity="" against="">

Gambar 4. Spektrum 1H NMR dari (A) 3-asam caffeoylquinic, (B) 4-asam caffeoylquinic, dan (C) 5-asam caffeoylquinic dan spektrum 13C NMR dari (D) {{ 6}}asam caffeoylquinic, (E) 4-asam caffeoylquinic, dan (F) 5-asam caffeoylquinic

Verifikasi Khasiat Anti-Melanogenesis dari 5-Caffeoylquinic Acid.

Untuk memverifikasi efek penghambatan {{0}}asam caffeoylquinic terhadap melanogenesis, kami menentukan efek penghambatan sintesis 5-caffeoylquinic acid onmelanin komersial yang dimediasi oleh -MSH. Pengobatan dengan konsentrasi yang lebih rendah dari 0.1 dan 0.2 mM 5-caffeoylquinicacid sedikit meningkatkan sintesis melanin dan aktivitas tirosinase intraseluler, sementara konsentrasi yang lebih tinggi dari 0,5 dan 1 mm senyawa membalikkan melanogenesis yang dimediasi MSH dan aktivitas tirosinase intraseluler (Gambar 6A, B) yang hasilnya konsisten dengan laporan sebelumnya.14

Asam caffeoylquinic adalah senyawa fenolik yang dibentuk oleh ikatan ester antara asam caffeic dan asam L-quinic. Turunan asam caffeoylquinic telah diketahui memiliki aktivitas anti-melanogenesis dan anti-tirosinase serta aktivitas ROS scavenging. Tirosinase adalah metalloenzim yang mengandung tembaga multifungsi dengan kation tembaga divalen.1 Turunan asam caffeoylquinic dapat menghambat aktivitas tirosinase dengan mengkhelat kation tembaga yang bertanggung jawab untuk mempertahankan keadaan aktif tirosinase. Untuk memprediksi interaksi antara 5-asam caffeoylquinic dan tirosinase, studi komputasi docking molekul dilakukan dengan menggunakan program Maestro. Pose terbaik untuk senyawa tersebut, totyrosinase yang ditambatkan, digambarkan pada Gambar 6C, D. Studi penambatan molekuler mengungkapkan bahwa 5-asam caffeoylquinic berinteraksi dengan tembaga pada jarak 2,43 dan membentuk serangkaian susun dengan His 259, Asn 260, His 85, dan His 263 residu dan ikatan H dengan Arg 268. Selanjutnya, energi ikat antara tirosinase dan 5-asam caffeoylquinic adalah −4,425 kJ/mol. Hasil ini menunjukkan bahwa asam 5-caffeoylquinic dapat menghambat aktivitas tirosinase dengan khelasi tembaga. Untuk memverifikasi mekanisme penghambatan melanogenesis oleh 5-caffeoylquinicacid, kami menentukan kemampuan chelating tembaga dari 5-caffeoylquinic acid. Kemampuan mengkelat tembaga dari 5-asam caffeoylquinic meningkat dengan cara yang bergantung pada konsentrasi (Gambar 6E). Hasil ini menunjukkan bahwa 5-caffeoylquinicacid menghambat sintesis melanin melalui pengkelat kation tembaga yang berinteraksi dengan tirosinase.

Gambar 5. Efek dari tiga turunan asam caffeoylquinic pada radikal scavenging, in vitro anti-tirosinase, dan aktivitas anti-melanogenesis di sel B16F10.

BAHAN DAN METODE

Bahan:

L. thunbergianus dibeli dari pasar online www.jirisangol.com (Korea) dan dikeringkan di bawah kondisi sekitar sebelum digunakan dalam penelitian ini. Reagen, seperti 2,2′- zinc bis(3-etil-benzotiazolin-6-asam sulfonat (ABTS) dan 3-(4,5-dimetiltiazol-2- yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT), suatu -melanocyte-stimulating hormone ( -MSH), dan enzim, seperti tirosinase jamur, diperoleh dari Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).Potassiumpersulfate (K2S2O8), pyrocatechol violet, dan 3,4-dihydroxy-L phenylalanine (L-DOPA) dibeli dari Alfa Aesar (Haverhill, MA, USA).

Ekstraksi dan Fraksinasi L. thunbergianus.

L. thunbergianus kering (80 g) dihaluskan menggunakan penghancur (HBL-3500S, Samyang Electronics, Korea) dan diekstraksi dengan 70 persen EtOH tiga kali (800 mL, setiap kali ) pada 70 derajat selama 3 hari. Ekstrak yang dihasilkan disaring secara vakum menggunakan kertas Advantecfilter no. 1 dan 2 (Toyo Roshi Kaisha, Ltd., Tokyo, Jepang) dan dipekatkan menggunakan rotaryevaporator Hei-Vap Advantage (Heidolph, Jerman) untuk mendapatkan 17,2 g ekstrak EtOHcrude. Ekstrak kasar ini disuspensikan dalam dH2O (180mL) dan berturut-turut difraksinasi dengan Hex, CH2Cl2, EtOAc, dan n-BuOH untuk menghasilkan Hex (1,51 g, 8,8 persen ), CH2Cl2 (0,88 g, 5,1 persen ), EtOAc (3,95 g, 23,0 persen), dan n-BuOH (3,02 g, 17,6 persen), seperti yang dijelaskan sebelumnya.15 Ekstrak dan fraksi yang dihasilkan dikeringkan-beku dan disimpan pada suhu -80 derajat sebelum digunakan.

Penentuan Aktivitas Pemulungan Radikal Bebas ABTS.

Untuk mengevaluasi aktivitas antioksidan ekstrak L.thunbergianus dan fraksi pelarutnya, aktivitas pemulungan radikal ABTS ditentukan, seperti yang dijelaskan sebelumnya.16 Untuk menghasilkan radikal ABTS, 10 mL 7 mMABTS dicampur dengan 176 L 140 mM potassiumperoxy disulfate dalam dH2O dan diinkubasi dalam gelap pada suhu kamar (RT) selama 16 jam sebelum digunakan. Larutan radikal ABTS diencerkan dengan metanol absolut untuk mendapatkan anabsorbansi mendekati 0,7 pada 734 nm. Aliquot 100 L dari setiap ekstrak atau fraksi dalam kisaran konsentrasi yang ditunjukkan 2−200 ug/mL ditambahkan ke 100 L larutan radikal ABTS yang diencerkan dan diinkubasi selama 10 menit dalam gelap di RT. Absorbansi kemudian diukur pada 732 nm menggunakan pembaca microplate multimode SpectraMaxM5 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). Aktivitas pemulungan radikal ABTS dihitung sebagai berikut:

Aktivitas penangkal radikal ABTS ( persen ) =1−(Sampel/Akontrol)×100 (1)

Penghambatan Tirosinase In Vitro.

Efek penghambatan ekstrak L.thunbergianus dan fraksi pelarutnya pada aktivitas tirosinase dinilai dengan jumlah dopakrom yang disintesis dari reaksi katalitik tirosinase.2a,17 Secara singkat, 50 L setiap ekstrak atau fraksi dalam kisaran konsentrasi yang ditunjukkan dicampur dengan 50 L 50 U/mL tirosinase jamur dalam 50 mM phosphate-buffered saline(PBS; 8.1 mM Na2HPO4, 1.2 mM KH2PO4, pH 6.8, 2.7 mMKCl, dan 138 mM NaCl) dalam 96-well plate dan diinkubasi selama 30 menit di RT. Kemudian, 100 L 1 mM L-DOPA ditambahkan ke setiap sumur diikuti dengan inkubasi selama 10 menit pada suhu 37 derajat. Absorbansi larutan yang dihasilkan diukur pada 475 nm menggunakan microplatereader multimode SpectraMax M5.

Budaya sel.

Sel melanoma murine B16F10 dikultur dalam medium Eagle yang dimodifikasi Dulbecco (DMEM) (Gibco, Gaithersburg, USA) yang dilengkapi dengan 10 persen serum sapi janin yang tidak diaktifkan panas (Gibco), 100 unit/mL penisilin, dan 100ug/mL streptomisin (Gibco) pada suhu 37 derajat di bawah 5 persen CO2 yang dilembabkan.

Viabilitas Sel.

Kelangsungan hidup sel B16F10 ditentukan dengan menggunakan uji MTT, seperti yang dijelaskan sebelumnya.18 Secara singkat, sel B16F10 diunggulkan di 24-pelat sumur dengan kepadatan 1 × 104 sel per sumur. Setelah 24 jam, sel diperlakukan dengan konsentrasi ekstrak atau fraksi L. thunbergianus yang ditunjukkan selama 48 jam. Sel-sel tersebut kemudian diinkubasi dengan larutan MTT selama 4 jam, dan kristal formazan tereduksi dilarutkan dalam DMSO. Solusi yang dihasilkan dipindahkan ke pelat sumur 96-, dan absorbansi diukur pada 540 nm menggunakan pembaca mikroplate multimode SpectraMax M5.

Penentuan Spesies Oksigen Reaktif Intraseluler (ROS).

Tingkat ROS intraseluler diukur menggunakan kit uji ROS seluler DCF/H2DCFDA (ab113851,Abcam), sesuai dengan instruksi pabrik. Secara singkat, sel B16F10 diunggulkan di 48-pelat sumur dengan kepadatan 2 × 104 sel per sumur. Setelah kultur 24 jam, sel-sel diperlakukan selama 1 jam dengan konsentrasi yang ditunjukkan ekstrak L. thunbergianus atau fraksi pelarut dalam 0,1 persen bovine serum albumin (BSA) yang mengandung media kultur tanpa fenol merah. Sel-sel kemudian diinkubasi dengan 100 M hidrogen peroksida selama 30 menit. Setelah dicuci dengan PBS, sel-sel diperlakukan dengan 25 MH2DCFDA dalam PBS selama 45 menit. Tingkat ROS dianalisis oleh pembaca lempeng mikro (Synergy H1, Biotek, Vermont, USA) yang dilengkapi dengan filter fluoresensi pada 485/545 nm (panjang gelombang eksitasi/emisi). Intensitas fluoresensi relatif rata-rata dari kontrol disamakan dengan 100 persen, dengan kondisi perlakuan dihitung secara proporsional.

Penentuan Kandungan Melanin.

Kandungan melanin ditentukan, seperti yang dijelaskan sebelumnya, dengan beberapa modifikasi.19 Sel-sel melanoma dikultur dalam piringan enam sumur selama 24 jam. Mereka diperlakukan dengan konsentrasi yang ditunjukkan dari ekstrak L. thunbergianus atau fraksi pelarutnya selama 48 jam lebih lanjut dengan adanya 100 nM -MSH. Setelah dicuci dua kali dengan saline buffer fosfat Dulbecco yang didinginkan ditambah dengan kalsium klorida dan magnesium klorida (D-PBS, Gibco), sel-sel yang dihasilkan dipisahkan dengan inkubasi dengan larutan tripsin−EDTA. Setelah disentrifugasi pada 1000 rpm selama 3 menit, pelet sel dilarutkan dalam 150 L NaOH 1 M yang mengandung 10 persen DMSO selama 1 jam pada 60 derajat selama 1 jam. Kandungan melanin ditentukan dengan absorbansi pada 405 nm menggunakan pembaca lempeng mikro.

Ekstrak Cistanche menghambat melanin.

Penentuan Aktivitas Tirosinase Seluler pada Sel Melanoma.

Aktivitas tirosinase dalam sel B16F10 diperiksa berdasarkan jumlah dopakrom yang dihasilkan dari reaksi katalitik tirosinase intraseluler.20 Secara singkat, sel melanoma dikultur dalam pelat enam sumur selama 24 jam diikuti dengan perlakuan dengan konsentrasi ekstrak L.thunbergianus yang berbeda atau pelarutnya fraksi selama 48 jam lebih lanjut dengan adanya 100 nM -MSH. Setelah dicuci dua kali dengan D-PBS dingin, sel-sel dilisiskan dalam 200 L buffer radioimmunoprecipitation assay (RIPA) (Sigma-Aldrich) yang mengandung protease dan inhibitor fosfatase. Setelah sentrifugasi lisat sel yang dikumpulkan dari masing-masing sumur pada 15,000g selama 15 menit, 100 L supernatan dicampur dengan 100 L 1 mM L-DOPA dalam PBS (pH 6,8) diikuti dengan inkubasi selama 30 menit pada suhu 37 derajat . Absorbansi dopakrom diukur pada 475 nm menggunakan microplatereader. Data dinormalisasi dengan konsentrasi protein yang ditentukan dengan uji asam bicinchoninic.

Isolasi dan Karakterisasi Senyawa Bioaktif Menggunakan HPLC.

HPLC dilakukan pada YL{{0}}(Young Lin Instrument, Korea), dilengkapi dengan kolom TC-C18 (4,6 mm, 250 mm, dan 5 m, Agilent, USA), inkonjungsi dengan sistem gradien yang terdiri dari pelarut A(0,2 persen asam format) dan pelarut B (MeOH). Rasio pelarut kemiringan diatur ke 0−5 menit, 15 persen B; 5−10 menit, 15−20 persen B; 10−15 menit, 20−30 persen B; 15−30 menit, 30−40 persen B; 30−37 menit, 40−60 persen B; 37−40 menit, 60−100 persen B; 40−45 menit, 100 persen B; 45−50 menit, 100−15 persen B; dan 50−55 menit, 15 persen B. Untuk mengidentifikasi bahan dalam fraksi pelarut, fase gerak dikirim pada laju alir 1 mL/menit, dan deteksi eluting dilakukan pada 330 nm. Untuk mengumpulkan fraksi pelarut bahan bioaktif, fase gerak disampaikan pada laju alir 15,0 mL/menit, dan deteksi eluting dilakukan pada 330 nm menggunakan prep-HPLC (YL-9100 s, Young Lin Instrument, Korea ), dilengkapi dengan kolom persiapan-C18 (4,6 mm, 212 mm,10 m, Agilent, USA), bersama dengan sistem gradien yang terdiri dari pelarut A (0,2 persen asam format) dan pelarut B(MeOH). Rasio kemiringan pelarut diatur ke 0−10 menit, 10 persen B;10−20 menit, 10-15 persen B; 20−40 menit, 15 persen B; 40−60 menit, 15−20 persen B; dan 60−70 menit, 30 persen B.

Pemodelan Molekul.

Struktur kristal jamur tirosinase untuk pemodelan molekul adalah Agaricustyrosinase (PDB tidak: 2Y9X) yang diperoleh dari Protein DataBank (PDB). Enzim disiapkan dengan menggunakan alur kerja persiapan proteinwizard yang tertanam dalam program Maestro (Maestro, versi 11.9.011, Schrödinger, LLC, NewYork, NY, USA, 2019). Air dan semua molekul lain yang ada dalam file PDB telah dihapus. Docking molekuler dilakukan menggunakan protokol induced fit docking (IFD) (protokol Schrödinger Suite 2019 Induced Fit Docking), seperti yang dilaporkan sebelumnya.21

Kemampuan Mengkelat Tembaga.

Kemampuan mengkelat tembaga dari senyawa yang diisolasi dari L. thunbergianus ditentukan menurut laporan sebelumnya.22 Setiap turunan asam caffeoylquinic (10 L) dalam konsentrasi yang ditunjukkan dicampur dengan 280 L 50 mM buffer natrium asetat (pH 6,0), 6 L larutan pyrocatechol violet 4 mM disiapkan dalam buffer yang sama, dan 10 L 1 ug/μL CuSO4·5H2O. Hilangnya warna biru diamati dengan mengukur absorbansi pada 632nm menggunakan pembaca microplate multimode SpectraMax M5. Air digunakan sebagai kontrol sebagai pengganti sampel. Persen aktivitas pengkelat tembaga dihitung dari absorbansi pada 632 nm, yaitu sebagai berikut:

kemampuan mengkelat tembaga ( persen )=1− (Sampel/Sebuah kontrol)×100 (2)

Analisis statistik.

Semua data dalam penelitian ini dinyatakan sebagai mean ± standar deviasi (SD) dari tiga percobaan independen. Analisis statistik dilakukan dengan menggunakan GraphPad Prism 8.0 (GraphPad Software Inc., La Jolla,CA, USA). Perbedaan antara nilai rata-rata kelompok kontrol dan kelompok terpapar dianalisis menggunakan analisis varians satu arah (ANOVA) diikuti dengan post hoctest Dunnett. Ambang batas signifikansi statistik untuk semua analisis adalah p < 0.05="" (dua="">

KESIMPULAN

Dalam penelitian ini, kami menunjukkan bahwa ekstrak L. thunbergianus menangkap radikal ABTS dan menunjukkan efek penghambatan yang kuat pada biosintesis melanin tanpa sitotoksisitas yang signifikan. Bahan abioaktif yang ada di L. thunbergianus dan penghambat melanogenesis diisolasi dalam fraksi n-BuOH. Selanjutnya, kami menemukan bahwa ketiga turunan asam caffeoylquinic adalah senyawa utama yang ada di fraksi n-BuOH dan bahwa 5-asam caffeoylquinic merupakan bahan penting untuk menekan melanogenesis dalam sel melanoma dengan menghambat aktivitas tirosinase seluler. Di sini, kami mengisolasi senyawa inhibitor alami 5-caffeoylquinic acid dari ekstrak L.thunbergianus untuk mencegah hiperpigmentasi dan mengungkapkan mekanisme penghambatannya yang mendasari melanogenesis. Dengan demikian, temuan kami menunjukkan bahwa 5-asam caffeoylquinic dan fraksi n-BuOH yang diisolasi dari L. thunbergianus mungkin berguna dalam kosmetik sebagai agen pemutih kulit.

irisan cistanche