Bab2: Faktor Seperti Krϋppel 15 Menekan Proliferasi Sel Mesangial Glomerulus Ginjal Melalui Peningkatan Konjugasi P53 SUMO1

Untuk informasi lebih lanjut. kontak{0}}

3. HASIL

3.1|Pemutaran gen pengikat KLF15-melalui ChIP-Seq di MC glomerulus ginjal primer

Untuk mengidentifikasi gen mitra pengikat langsung KLF15, kami melakukan analisis ChlP-Seq dan akhirnya menyaring 2478 gen. Analisis GO dari gen-gen ini melalui alat di situs web www.uniprot.org (Gambar 1A, B) mengungkapkan istilah fungsi molekuler yang terkait dengan 1941 gen, istilah komponen seluler yang terkait dengan 1662 gen, dan istilah proses biologis yang terkait dengan 1766 gen. Karena tujuan kami adalah untuk mengetahui bagaimana KLF15 memengaruhi MC, kami fokus pada gen terkait proses sel. Di antara 1315 gen terkait proses sel, 74 gen ditemukan berpartisipasi dalam proses siklus sel; secara khusus, gen-gen ini berpartisipasi dalam siklus sel mitosis, transisi fase siklus sel dan proses lainnya (Gambar 1C, D). Selanjutnya, kami menganalisis gen yang terlibat dalam pertumbuhan dan menemukan bahwa mereka terkait dengan pertumbuhan perkembangan, pertumbuhan sel dan jenis pertumbuhan lainnya (Gambar 1E).

3.2|Penyaringan gen yang diatur secara berbeda dalam KLF15-MC glomerulus ginjal yang diekspresikan secara berlebihan menggunakan SILAC dan LC/MS

Analisis SILAC dan LC/MS dari HRMC yang mengekspresikan KLF15 secara berlebihan dibandingkan dengan sel induk mengarah pada identifikasi 1357 protein. Kami menggunakan DAVID dan IPA untuk memperoleh domain GO dan jalur yang diperkaya dari protein terukur yang diidentifikasi oleh SILAC. Menariknya, banyak istilah terkait fungsi biologis protein termasuk di antara 30 istilah GO yang diperkaya secara signifikan, termasuk regulasi proses metabolisme asam amino seluler, kompleks proteasome, pengikatan protein, dan istilah transkripsi dan translasi, yang semuanya terkait erat dengan di mana-mana (Gambar 2A). Gambar 2B menunjukkan 30 istilah jalur yang diperkaya secara signifikan. Beberapa istilah proses biologis, termasuk istilah penyakit proteasome dan neurodegeneratif, juga terkait dengan ubiquitination.

Klik untuk mengetahui tentangcistanchedijual dengan rincian

3.3|Analisis bioinformatika gen pengikat KLF15-yang berpotensi terkait dengan proliferasi MC glomerulus ginjal

Untuk menjelajahi gen pengikat15-KLF yang berpotensi terkait denganglomerulus ginjalProliferasi MC, kami melakukan analisis bioinformatika dari data ChIP-Seq dan data SILAC-LC/MS. Lima puluh dua gen disaring (Tabel 2 dan Gambar 2C), dan lima dari gen ini, termasuk SUMO1, faktor penghambat migrasi makrofag (MIF), faktor inisiasi eukariotik (EIF), faktor pertumbuhan seperti insulin (IGF) dan retikulokalbin (RCN). ), berhubungan erat denganproliferasi sel. Karena GO dan analisis jalur dari protein yang diekspresikan secara berbeda menunjukkan bahwa gen yang disaring terkait terutama dengan proses ubiquitinasi, kami menyimpulkan bahwa SUMO1, anggota keluarga protein ubiquitin-like (UBL), berpartisipasi dalam modifikasi pasca-translasi mirip dengan ubiquitination sebagai gen target KLF15.

Semakin banyak bukti telah menunjukkan bahwa HG adalah salah satu faktor utama yang mendorong perkembangan nefropati diabetik, dan ini mendorong proliferasi MC dan peningkatan sintesis matriks in vitro.25 Sebuah penelitian sebelumnya telah menunjukkan bahwa PDGF-BB sangat penting untuk proliferasi MC sebelum perkembangannya. glomerulosklerosis pada glomerulonefritis eksperimental.26 Setelah memastikan bahwa MC dirangsang oleh HG atau PDGF-BB in vitro, kami mendeteksi perubahan ekspresi KLF15 dan SUMO1 pada RNA dan protein

tingkat dan menemukan bahwa molekul-molekul ini memiliki tren yang sama (Gambar 2D-l). Akhirnya, kami menentukan SUMO1 menjadi gen target KLF15.

3.4|KLF15 mengatur ekspresi gen SUMO-1 dengan mengikat ke wilayah promotor CACCCA-SUMO-1 16 bp dan motif kaya C plus A

Kami menggunakan suite MEME(http://meme-suite.org/tools/meme) untuk mengkarakterisasi motif pengikatan KLF15-dari 52 gen yang disaring dari data KLF15 ChlP-Seq dan mengidentifikasi motif pengikatan KLF (Gambar 3A). Selain itu, kami menganalisis lebih lanjut lebih dari seribu basa di hulu promotor SUMO1 dan menemukan bahwa KLF15 dapat mengenali dan mengikat ke urutan 16 bp (nukleotida -205~-199)termasuk - CACCCA-(Gambar 3B).ChIP-PCR mengkonfirmasi bahwa KLF15 terikat pada promotor SUMO1, dan hasilnya menunjukkan ekspresi SUMO1 yang secara signifikan lebih tinggi pada kelompok antibodi anti-KLF15 dibandingkan dengan kelompok kontrol latar belakang (Gambar 3C).

Selanjutnya, kami melakukan uji reporter luciferase ganda untuk mengonfirmasi hubungan penargetan antara SUMO1 dan KLF15. Kelompok promotor SUMO1 tipe liar menunjukkan aktivitas luciferase yang lebih tinggi daripada vektor pGL3 dan kelompok mutan di HRMC, dan aktivitasnya meningkat secara signifikan dengan ekspresi berlebih KLF15. Peningkatan aktivitas luciferase dibalikkan dengan transfeksi dengan plasmid yang mengekspresikan daerah promotor mutan (Gambar 3D). Secara keseluruhan, data ini menunjukkan bahwa SUMO1 adalah target transkripsi langsung KLF15.

3.5 |Penyaringan P53 sebagai substrat SUMOylation SUMO1

Modifikasi SUMO secara luas diekspresikan sebagai modifikasi pasca-translasi pada eukariota. Konjugasi reversibel dari modifikasi ini ke protein substrat juga dikenal sebagai SUMOylation, yang memainkan peran penting dalam mengatur fungsi protein target dan selanjutnya berpartisipasi dalam berbagai proses biologis, seperti transportasi nukleositoplasma, regulasi transkripsi, apoptosis, stabilisasi protein, respons stres dan progresi siklus sel.27 Untuk mengeksplorasi molekul pensinyalan hilir yang terkonjugasi secara langsung oleh SUMO1, kami melakukan analisis jaringan SUMO1 menggunakan database IPA, dan data menunjukkan bahwa SUMO1 dapat langsung terkonjugasi ke P53, APP, JUN dan AKT, antara lain protein (Gambar 4A-C). Kami awalnya memilih P53 sebagai molekul hilir SUMO1 karena merupakan protein terkenal yang terkait erat dengan proliferasi sel.28.29 Selanjutnya, kami menggunakan perangkat lunak SUMOsp untuk memprediksi kemungkinan urutan SUMOylation dari P53 dalam berbagai spesies dan menemukan bahwa P53 memiliki urutan SUMOylation（ Gambar 4D）. Untuk menentukan apakah P53 memang dimodifikasi oleh SUMOylation, kami secara transien mentransfeksi HRMC dengan plasmid ekspresi berlebih SUMO1 atau SUMO1 siRNA. Baik hasil IP dan Western blot mengungkapkan tren perubahan ekspresi SUMO1-P53dan P53 yang konsisten dengan perubahan di SUMO1 (Gambar 4E-J). Data ini menunjukkan bahwa P53 adalah substrat SUMOylation dari SUMO1.

3.6 |KLF15 menghambat proliferasi MC dengan mempromosikan ekspresi SUMO1 dan SUMOylation P53

Untuk menetapkan regulasi P53 SUMOylation dan proliferasi MC oleh KLF15 dan SUMO1, kami melakukan intervensi dengan ekspresi KLF15 atau SUMO1 di HRMC dan memperlakukan HRMC dengan PDGF-BB. Di antara HRMC yang diobati dengan PDGF-BB, sel yang ditransfeksi dengan plasmid overekspresi KLF15 menunjukkan ekspresi SUMO1-P53, P53, KLF15 dan SUMO1 yang lebih tinggi daripada sel yang ditransfeksi dengan plasmid kontrol KLF15. Perubahan yang sama pada SUMO1-P53, P53 dan SUMO1 ditemukan pada sel yang ditransfeksi plasmid ekspresi berlebih SUMO1, sedangkan ekspresi KLF15 tidak berubah dalam sel ini (Gambar 5A-F). PDGF-BB adalah salah satu faktor pertumbuhan paling efektif dari MC yang dijelaskan sejauh ini, dan respons proliferasi HRMC terhadap PDGF-BB diamati. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 5G, H, persentase sel positif EdU meningkat secara signifikan dengan pemberian PDGF-BB rekombinan. Hasil pewarnaan EdU menunjukkan bahwa ekspresi berlebih KLF15 dan SUMO1 menghambat proliferasi sel yang diinduksi PDGF-BB (Gambar 5G, H).

Untuk mendapatkan wawasan lebih lanjut tentang peran KLF15 dan SUMO1 dalam proliferasi HRMC, kami mentransfeksi sel hanya dengan SUMO1 siRNA atau mentransfeksinya dengan SUMO1 siRNA dan plasmid ekspresi berlebih KLF15. Regulasi turun SUMO1 tidak mempengaruhi ekspresi KLF15, tetapi level ekspresi SUMO1-P53 dan P53 jelas menurun setelah transfeksi siRNA SUMO1 (Gambar6A-C). Selain itu, ketika ekspresi SUMO1 dihambat, level ekspresi SUMO1-P53 dan P53 juga ditekan bahkan dalam sel yang mengekspresikan KLF15 secara berlebihan (Gambar 6D-F). Kemudian, proliferasi MC dievaluasi menggunakan uji pewarnaan EdU. SUMO1 RNAi meningkatkan efek proliferasi PDGF-BBon HRMCs, dan kelompok yang dikotransfeksi dengan plasmid overekspresi KLF15 dan SUMO1 siRNA memiliki lebih banyak sel EdU-positif daripada kelompok yang dikotransfeksi dengan plasmid ekspresi berlebih dan siRNA kontrol urutan hibrid (Gambar 6G, H) . Oleh karena itu, kami menyimpulkan bahwa KLF15 menekan proliferasi MC dengan meningkatkan SUMOylation P53.

3.7|Ekspresi SUMO1 dan P53 global pada MC glomerulus berkorelasi negatif dengan proliferasi MC pada nefritis -1 tikus

Nefritis anti-Thy1 adalah model klasik glomerulonefritis proliferatif mesangial self-limited dengan fase proliferasi dan fase pemulihan. Kami menyuntikkan antibodi Thy1 ke tikus Wistar untuk membuat model ini. Baik serum urea nitrogen dan kreatinin tidak memiliki perubahan yang signifikan antara tikus kontrol dan tikus model (Gambar S1). Proliferasi mesangial yang ditandai dan akumulasi ECM diamati selama fase proliferasi (hari ke 5 dan 7) pada tikus model, dan jumlah MC menurun selama fase pemulihan pada hari ke 10 (Gambar 7A). Kami juga mendeteksi perubahan ekspresi penanda proliferasi sel PCNA oleh IHC (Gambar 7A, B). Level PCNA meningkat pada hari ke-5, memuncak pada hari ke-7 dan menurun pada hari ke-10 (Gambar 7F). Analisis Western blot menunjukkan bahwa ekspresi protein P53, SUMO1 dan KLF15 pada glomeruli terisolasi lebih rendah pada kelompok model dibandingkan pada kelompok kontrol (Gambar 7C, D), konsisten dengan hasil imunohistokimia (Gambar 7E, F). Hasil ini menunjukkan bahwa proliferasi abnormal MC pada tikus model anti-Thy1 terkait dengan ekspresi KLF15 dan SUMO1 tingkat rendah. Mengganggu ekspresi molekul-molekul ini diharapkan dapat meringankan fenotipe patologis pada tikus.

4. DISKUSI

Ituglomerulusadalah unit filtrasi dariginjal. Gangguan fungsi glomerulus dapat disebabkan oleh patologi primer glomerulus atau dapat juga sekunder akibat penyakit sistemik. Perubahan mesangial terlihat setelah cedera glomerulus termasuk hiperproliferasi MC diikuti oleh produksi berlebihan ECM (ekspansi mesangial) dan produksi chemoattractant untuk sel inflamasi. Oleh karena itu, modulasi respon MC, terutama proliferasi abnormal, adalah pendekatan terapi baru. KLF15 adalah protein yang berperan sebagai regulator sebagai faktor transkripsi dengan mengikat sekuens DNA spesifik. Banyak penelitian telah melaporkan bahwa KLF15 terlibat dalam regulasi proliferasi sel. Misalnya, telah ditemukan bahwa KLF15 berpartisipasi dalam penghambatan jalur pensinyalan terkait proliferasi MC,15,30 tetapi gen target langsungnya belum dilaporkan dalam literatur. Oleh karena itu, penelitian ini terutama melibatkan penyaringan bersama tingkat transkripsi dan translasi untuk mengidentifikasi gen target langsung KLF15.

KLF15 mengatur gen yang berbeda pada spesies yang berbeda dan pada jaringan dan organ yang berbeda. Dalam proses mengatur proliferasi MC, KLF15 mempengaruhi ekspresi beberapa gen dan berpartisipasi dalam beberapa jalur.131,32 Untuk mengeksplorasi gen target langsung KLF15, kami menggunakan ChIP-Seg.Klein RH dan rekan-rekannya menggunakan ChlP-seq teknologi untuk mempelajari regulasi KLF7 pada diferensiasi sel epitel kornea.33 Ying M et al menggunakan teknik ini untuk mempelajari efek penghambatan KLF9pada pluripotensi glioblastoma.34Dibandingkan dengan chip ChlP, ChIP-Seq memungkinkan analisis seluruh genom yang sebenarnya dengan resolusi yang lebih tinggi, sensitivitas deteksi yang lebih tinggi, dan permintaan ukuran sampel yang lebih rendah.35 Kami menggunakan ChP untuk mendapatkan fragmen DNA yang terikat langsung oleh KLF15, dan setelah perbandingan dan analisis dengan GenBank, kami menyaring 2478 kemungkinan gen target. Melalui analisis GO dan jalur, kami mengidentifikasi banyak gen target yang terlibat dalam siklus sel dan proses proliferasi.

Eksperimen ChlP-Seq memerlukan PCR untuk amplifikasi sinyal deteksi, dan beberapa derajat bias selama proses amplifikasi tidak dapat dihindari. Selain itu, ChIP-Seq hanya memperoleh gen yang dapat diikat oleh KLF15 dan tidak menunjukkan perubahan yang terjadi pada ekspresi gen tersebut ketika ekspresi KLF15 berubah. Kami menggunakan analisis proteomik SILAC-LC/MS untuk mengkompensasi kekurangan ini. Teknik ini memberikan informasi tentang semua protein yang ekspresinya berubah setelah diatur oleh KLF15, termasuk protein yang diatur secara langsung oleh KLF15 dan protein yang diatur secara tidak langsung atau dimodifikasi pasca-translasi. HRMC dikultur menggunakan SILAC, dan KLF15 diekspresikan secara berlebihan dalam sel melalui transfeksi plasmid. Protein dikumpulkan untuk deteksi LC/MS, dan diperoleh 1357 protein yang diekspresikan secara berbeda. Analisis GO dan jalur mengungkapkan bahwa beberapa protein yang diekspresikan secara berbeda terlibat dalam ubiquitinasi. Data gen dan protein berpotongan. Gen yang tidak terkait dengan tujuan penelitian dan gen yang tidak diatur secara langsung oleh KLF15 dihilangkan; akhirnya, 52 gen disaring. Di antaranya, lima gen dengan perbedaan ekspresi paling jelas yang paling dekat hubungannya dengan proliferasi dipilih. Mengingat hasil gabungan dari analisis jalur, analisis ekspresi SUMO1 dan KLF15 dalam proliferasi HRMC, ChlP-PCR dan uji reporter dual-luciferase, protein SUMO1 dipilih sebagai gen target KLF15.

Selain ubiquitin, peningkatan jumlah protein UBL,3637 termasuk SUMO,38 yang diekspresikan sel prekursor saraf, 8(NEDD8)3940 dan gen terstimulasi interferon 15(ISG15),41 yang diregulasi perkembangannya sedang diidentifikasi. Protein pengubah ini dengan kuat mengatur berbagai proses biologis. Penambahan kovalen SUMO ke substrat, disebut SUMOylation, adalah modifikasi pasca-translasi yang terlibat dalam serangkaian proses seluler, termasuk transportasi nuklir-sitosol, regulasi transkripsi, apoptosis, kontrol stabilitas protein, respons stres, dan perkembangan siklus sel.27SUMO biasanya melekat pada residu lisin akseptor dari substrat protein yang menyimpan urutan konsensus dan berkontribusi pada regulasi interaksi protein-protein serta kompartementalisasi subseluler dan stabilitas protein.2 sUMO1, sebagai anggota keluarga SUMOS, dapat memengaruhi proliferasi sel dengan memodifikasi substrat dan menstabilkan protein pengatur siklus sel.43 Oleh karena itu, dikombinasikan dengan laporan literatur dan hasil skrining dan analisis yang komprehensif, kami berfokus pada bagaimana KLF15 mengatur efek SUMO1 pada proliferasi sel mesangial.

Untuk mengidentifikasi substrat SUMO1, kami melakukan analisis jaringan SUMO1 menggunakan database IPA dan perangkat lunak SUMOsp. Dikombinasikan dengan penelitian yang dipublikasikan pada P53, data penyaringan awal kami menyarankan P53 sebagai molekul hilir SUMO1 dengan urutan SUMOylation YKxD/E. Studi sebelumnya telah menunjukkan bahwa P53 adalah substrat SUMOylation,45 dan peningkatan konjugasi P53 SUMO1 mempromosikan stabilitas dan aktivitas P53 dan menginduksi penuaan.46 Dalam penelitian kami, gangguan dengan ekspresi SUMO1 di HRMC menghasilkan tren perubahan yang sama dalam SUMO1-P53 dan P53, menunjukkan bahwa P53 merupakan substrat SUMOylasi SUMO1.

Bukti yang muncul menunjukkan bahwa SUMOylation dan de-SUMOylation berperan dalam berbagai penyakit nefropati, seperti disgenesis ginjal, karsinoma ginjal, penyakit glomerulus, apoptosis podosit, dan hipertonisitas medula ginjal, cedera ginjal akut, dan nefrolitiasis.7-51 Untuk memperjelas hubungan antara KLF15, SUMO1, P53 SUMOylation dan proliferasi MC, kami melakukan serangkaian perawatan transfeksi pada sel yang telah mengalami proliferasi yang diinduksi PDGF-BB. Ekspresi berlebih KLF15 mengatur ekspresi SUMO1, sedangkan ekspresi berlebih SUMO1 tidak memengaruhi ekspresi KLF15. Ekspresi berlebih KLF15 atau SUMO1 meningkatkan SUMOilasi P53 dan memusuhi proliferasi sel yang diinduksi oleh PDGF-BB. Ketika ekspresi SUMO1 dihambat, SUMOylation dari P53 juga dihambat, dan KLF15 kehilangan efek antagonisnya pada proliferasi sel. Dalam hidup. proliferasi MC secara bertahap meningkat dengan bertambahnya nefritis proliferatif mesangial, sedangkan ekspresi KLF15, SUMO1 dan P53 menurun secara signifikan. Mempertimbangkan pengamatan terintegrasi dalam sel dan jaringan, kami sebelumnya menyimpulkan bahwa KLF15 mengatur SUMOylation P53 melalui SUMO1, sehingga menghambat proliferasi MC.

5. KESIMPULAN

Beberapa penelitian telah menunjukkan bahwa KLF15 memainkan peran penting dalam mengatur proliferasi MC. Dalam karya ini, kami mengeksplorasi mekanisme penekanan proliferasi MC yang dimediasi oleh faktor transkripsi ini. Kami mengidentifikasi SUMO1 sebagai target utama KLF15 di MC melalui analisis bioinformatika yang melibatkan ChIP-Seq dan SILAC-LC/MS. Selanjutnya, dengan bantuan database IPA dan perangkat lunak SUMOsp, kami menentukan bahwa P53 adalah substrat langsung SUMO1. Eksperimen in vitro dan in vivo mengkonfirmasi bahwa KLF15 dapat mempromosikan ekspresi SUMO1 dan SUMOylation P53 kemudian menghambat proliferasi MC (Gambar S2). Hasil ini berkontribusi pada pemahaman tentang peran regulasi KLF15 dalam proliferasi MC dan memberikan dasar teoretis untuk menemukan pengobatan baru untuk penyakit ginjal terkait proliferasi MC.