Bab 5 Perubahan Aktivitas Enzim Selama Fermentasi Enzim

Bab 5 Perubahan Aktivitas Enzim Selama Fermentasi Enzim

 

Protease, lipase danSuperoxide Dismutase (SOD)adalah enzim fungsional utamaMakanan Kesehatan Enzim Mikroba. Di antara mereka,proteaseberperan dalammempromosikan hidrolisis protein dalam makanandi dalam tubuh manusia. Selain itu, ia juga dapat menguraikan beberapa sel yang sekarat, menghilangkan kotoran pada permukaan kulit dan pori -pori, dan berperan dalam pengelupasan kulit, sehingga banyak digunakan dalam produk mandi. Lipase bekerja pada ikatan ester antara asam lemak dan gliserol, dan substrat hidrolisis umumnya adalah minyak alami. Oleh karena itu, terlihat pada banyak makanan penurunan berat badan dan produk kesehatan. Banyak wanita sangat prihatin dengan topik penurunan berat badan, itulah sebabnya enzim dengan cepat menjadi populer di seluruh dunia.Enzim kaya akan lipase, yang berarti bahwa mereka memiliki nilai penelitian dan prospek aplikasi yang tinggi.MERUMPUTadalah enzim logam khusus yang mengkatalisasi reaksi dismutasiRadikal anion superoksida, dengan demikianMenghapus radikal anion superoksidadi dalam tubuh. Ini adalah penghalang pelindung untuk organisme, sehingga banyak digunakan di bidang medis.
Bab ini mengambil enzim Apple sebagai contoh. Mulai dari tahap awal fermentasi,aktivitas superoksida dismutase, amilase, lipase, protease dan selulase pada kelompok eksperimen dan kelompok kontrol diukur setiap 15 hari untuk secara komprehensif dan sistematis mencerminkan tren aktivitas enzim yang berubah selama seluruh proses fermentasi.

Herbal Baru Cistanche

Klik untuk mendapatkan detail lebih lanjut

 

Layanan Pendukung Wecistanche-The Cistanche Exportir terbesar di Cina:
Email: wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/tel: +86 15292862950

 

 

 

 

 

 

5.1 Bahan dan Metode

5.1.1 Bahan

(1) Bahan Eksperimental

Cuci apel segar dengan air steril dalam kondisi steril, keringkan secara alami di atas meja operasi steril, kupasnya, dan iris untuk digunakan nanti. Tambahkan gula putih dan apel ke dalam toples kaca yang disterilkan dengan rasio massa 1: 1. Aktifkan bakteri yang diperlukan untuk percobaan dan inokulasi ke dalam enzim sesuai dengan skema optimal (langkah operasi ini dihilangkan untuk kelompok kontrol), tutup dan letakkan di tempat yang sejuk dan kering. Setelah 3 bulan fermentasi suhu kamar, ambil sampel untuk mendapatkan seluruh cairan enzim yang mengandung pulpa dan menyaringnya. Ambil supernatan sebagai sampel eksperimental. Setelah sampel disentrifugasi pada 10, 000 rpm selama 15 menit dalam centrifuge berkecepatan tinggi, digunakan untuk mengukur data yang relevan. Perlu dicatat bahwa dalam proses membuat enzim, untuk menghindari kontaminasi yang tidak perlu, semua operasi kami dilakukan dalam kondisi steril.

(2) instrumen utama
Instrumen yang diperlukan untuk percobaan sama dengan 3.1.1 (2).

 

5.1.2 Metode

(1) Penentuan aktivitas superoksida dismutase (SOD) [66]
Larutan pyrogallol sudah dipanaskan sebelumnya dalam pemandian air suhu konstan 25 derajat untuk jangka waktu tertentu. Menurut Tabel 5.1, jumlah buffer yang sesuai, air suling dan volume asam klorida atau larutan pirogallol yang sama ditambahkan ke tabung reaksi. Bawah air suhu konstan diatur ke 25 derajat untuk 2 0 min. Setelah cairan campuran dengan cepat terguncang, segera disuntikkan ke dalam kuvet. Nilai absorbansi A0 dari sampel diukur setiap 30 detik pada panjang gelombang 325nm menggunakan spektrofotometer.

Tab.5.1 Tambahkan jumlah reagen benzena tiga fenol yang berdekatan untuk penentuan laju autoksidasi

 

Metode untuk menentukan aktivitas SOD pada dasarnya sama dengan operasi di atas. Satu -satunya perbedaan adalah bahwa sebelum menambahkan pyrogallol, {{0}}. 5 mL Solusi sampel enzim dari konsentrasi yang berbeda perlu ditambahkan terlebih dahulu. Pada saat yang sama, volume air suling yang sama ditambahkan. Absorbansi yang diukur adalah ASOD. Laju penghambatan dan aktivitas enzim SOD dihitung menurut rumus 5.1 dan rumus 5.2: laju penghambatan (%)=(△ a 0- △ asod)/△ 0 × 100 (5.1) aktivitas enzim (u/mle) {{{{20 {5. (5.2) Di mana: V1 adalah volume total solusi, ML; V2 adalah volume larutan sampel enzim, ML; △ A0 adalah tingkat auto-oksidasi pyrogallol; △ ASOD adalah laju perubahan nilai absorbansi sampel; N adalah penentuan pengenceran beberapa (2) dari aktivitas amilase penelitian ini menggunakan metode kolorimetri iodine-Starch untuk menentukan aktivitas amilase. Langkah -langkah operasi spesifik merujuk pada "Prosedur Operasi Laboratorium Klinis Nasional" [67]. Ini terutama dibagi menjadi dua poin berikut:

 

① Persiapan solusi
Solusi pati buffered ({{0}}. 4g/l): Secara akurat menimbang 9g natrium klorida, 22.6g anhidrat hidrogen fosfat, dan 12.5g petassium {16 {16 {16 {16 {16 {16 {{{15 {{{{{{{{{{{{{{{{16 {{{{{{{{{16 {16 {{{{16 {16 {16 { larutan bisul; Beratnya secara akurat 0,4 g pati terlarut, larut dalam 10ml air suling, aduk rata, dan sesuaikan dengan pasta; Suntikkan larutan pati disesuaikan ke pasta ke dalam larutan mendidih di atas, dan cuci gelas berulang kali sampai pati benar -benar ditransfer ke larutan air mendidih. Setelah diaduk secara merata dengan batang kaca, dinginkan hingga suhu kamar, tambahkan 5ml larutan formaldehida rambut 37%, dan encerkan ke 1L dengan air suling. Nilai pH larutan adalah 7,0 ± 0,1, dan ditempatkan di lemari es untuk digunakan.
Solusi stok yodium (0. 1 mol/l): Berat akurat 1,7835g kalium iodat dan 22,5g kalium iodida dalam 500ml bersih
gelas kimia, perlahan dan merata tambahkan asam hidroklorat 4,5 mL, aduk terus menerus selama proses penambahan, encer ke skala dengan air suling, dan aduk secara merata. Masukkan ke dalam lemari es untuk digunakan dan menyimpannya dalam botol reagen coklat.
Solusi Aplikasi Iodine ({{0}}. 01mol/l): Ambil sejumlah solusi stok yodium (0,1 mol/L), encerkan 10 kali dengan air suling, masukkan ke dalam lemari es untuk digunakan, dan simpan hingga 1 bulan.

② Langkah Operasi Eksperimental
Ambil larutan enzim dan encerkan 10 kali dengan saline fisiologis, dan beroperasi sesuai dengan Tabel 5.2. Campur dengan baik, panjang gelombang spektrofotometer adalah 660nm, dan jalur cahaya cangkir kolorimetri adalah 10mm. Nol dengan air suling dan baca absorbansi setiap tabung. Hitung aktivitas amilase berdasarkan rumus perhitungan dasar 5.3.

 

Tab.5.2 Langkah Operasi Penentuan Amilase

 

(3) Penentuan aktivitas lipase

Metode penentuan dilakukan sesuai dengan qb/t {{0}} [68]. Solusi uji enzim 2% disiapkan dengan 0. 0 25 mol/l buffer fosfat (pH 7,5), fenolftalein digunakan sebagai indikator, dan asam lemak dititrasi dengan solusi natrium hidroksida standar. Aktivitas lipase dihitung berdasarkan volume natrium hidroksida yang dikonsumsi dalam percobaan. Aturannya adalah: pada pH 7,5 dan suhu sekitar 40 derajat, 1 mL larutan enzim cair menghidrolisis lipase selama 1 menit untuk menghasilkan 1 μmol asam lemak, yang merupakan satu unit aktivitas lipase, dinyatakan sebagai U/mL. Kemudian, aktivitas lipase dihitung sesuai dengan rumus 5.4: Aktivitas enzim (U/ml)=(BA) × C/0,05 × 50 × 1/15 × N=200/3 × (BA) × C × N (5.4) Di mana: B adalah volume sodium hyroum (BA) × C × N (5.4) di mana: B adalah volume sodium hyroum, Sodrium Compyide × C × N (5.4) di mana: b adalah volume sodium hyroum di Sodium di Sodium di Sodium Opd; A adalah volume larutan standar natrium hidroksida yang dikonsumsi pada kelompok kontrol kosong, ML; C adalah konsentrasi larutan standar natrium hidroksida, mol/L; 0,05 adalah faktor konversi konsentrasi larutan standar natrium hidroksida; 50 adalah kandungan asam lemak dari larutan natrium hidroksida; 15 menit adalah waktu reaksi; n adalah banyak pengenceran.

(4) Penentuan aktivitas protease

Lihat GB/T 23527-2009 [69] dengan sedikit modifikasi.
① Persiapan kurva standar
Ambil 1ml solusi standar tirosin dengan konsentrasi massa yang berbeda, yaitu 0, 1 0, 20, 30, 40, dan 50mg/L, dan tambahkan 5ml larutan karbonat natrium 0,4mol/L dan 1ml solusi reagen folin ke dalamnya. Bereaksi selama 20 menit pada suhu 40 derajat. Setelah reaksi selesai, lepaskan larutan reaksi dan ukur nilai absorbansi larutan pada panjang gelombang 680nm menggunakan spektrofotometer. Gambar kurva standar tirosin dengan konsentrasi tirosin sebagai sumbu horizontal dan nilai absorbansi sebagai sumbu vertikal.

Cistanche Herbal Baru dengan Kekuatan Antioksidan yang Kuat

② Penentuan aktivitas protease
Kelompok Eksperimen: Ambil 1ml larutan kasein dengan konsentrasi 10 g/L dan aduk rata dengan 1 mL larutan sampel untuk diuji, dan bereaksi selama 10 menit pada suhu sekitar 40 derajat; menyaring dan mendapatkan filtrat setelah berdiri, ambil 1ml filtrat, 5ml larutan natrium karbonat dan 1ml reagen folin, aduk rata, dan bereaksi selama 20 menit pada suhu sekitar 40 derajat; Gunakan spektrofotometer untuk mengukur nilai absorbansi dari larutan pada panjang gelombang 680nm.
Blank Control Group: Ambil 1 mL dari larutan sampel untuk diuji, tambahkan asam trikloroasetat, bereaksi sepenuhnya untuk menonaktifkan protease, dan metode operasi lainnya sama dengan kelompok eksperimen.

Hitung aktivitas protease menurut Formula 5.5:
Aktivitas protease (u/ml)=ak × 4/10 (5.5) di mana: a adalah absorbansi larutan enzim dalam kelompok eksperimen; K adalah jumlah tirosin ketika absorbansi sama dengan 1; 4 adalah volume total solusi reaksi, ML; 10 adalah waktu reaksi, min.

(5) Penentuan aktivitas selulase [70]

Aktivitas selulase dalam enzim umumnya diekspresikan oleh jumlah glukosa yang dilepaskan oleh sejumlah larutan enzim per satuan waktu. Prinsip menggunakan metode kertas filter untuk mengukur aktivitas selulase adalah bahwa selulase dapat menguraikan selulosa dalam kertas filter untuk menghasilkan metabolit sekunder seperti glukosa, dan glukosa dapat bereaksi dengan 3, 5- asam dinitrosisisilat untuk membentuk kompleks kuning. Warna reaksi ini relatif cerah, yang dapat menentukan jumlah glukosa dan gula pereduksi lainnya yang diproduksi.

 

①3, 5- agen kolorimetri asam dinitrosisisilat
Timbang secara akurat 1 0 g dari 3, 5- asam dinitrosisisilat dengan titik leleh 168-169 derajat, melarutkan air suling, tambahkan 20g sodium hydroxide dan 200g kalium natrium tartrat, lanjutkan pemanasan sampai padatan sepenuhnya, kalium sodium tartrat, lanjutkan padam sampai padatan, kuas. 0,5 g natrium sulfit anhidrat, aduk terus menerus selama proses penambahan sampai benar -benar larut, berhenti memanaskan setelah dicampur secara merata, dingin ke suhu kamar, pindahkan semua ke labu volumetrik 1000ml, encerkan ke tanda dengan air suling, letakkan pada suhu kamar selama satu minggu, filter, dapatkan supernan, dan simpan dalam rea brown.②enzymatic Hydrolysis
Pipet {{0}} {{4} 0, {8}}, {8 {8}, 1.0ml, larutan sampel enzim dengan larutan enzim aketis dengan larutan enzim yang bersisi 2ml ke dalam larutan buffer asam asetat-sodium dengan nilai pH 4.5. Setelah 5 menit penangas air suhu konstan pada 40 derajat, tambahkan 6 lembar kertas filter kromatografi dengan luas 1 × 1cm2 masing -masing, dan segera mulai waktu untuk membuat waktu reaksi akurat hingga 60 menit. Segera transfer ke rendaman air mendidih untuk reaksi selama 10 menit, dan selulase kehilangan aktivitasnya.

 

 

③ Reaksi warna
Ambil larutan sampel enzim, tambahkan 3ml dari 3, {5- agen kolorimetri asam dinitrosisilat disiapkan dalam ①, panas dalam rendaman air mendidih selama 15 menit, ambil, dingin ke suhu kamar, tambahkan 10ml air suling, aduk rata, gunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang, dan penyesuaian zero.
④ Gambar kurva standar glukosa
Siapkan solusi standar glukosa dengan konsentrasi 1mg/mL secara akurat, dan gunakan air suling untuk membuat solusi standar glukosa dengan volume 0, {0. 2, {{4}, dan 2, {6 {6}. 3, 5- agen kolorimetri asam dinitrosisisilat disiapkan dalam ① untuk melakukan reaksi pengembangan warna. Plot kurva standar dengan konsentrasi glukosa sebagai sumbu horizontal dan absorbansi sebagai sumbu vertikal.
⑤Salkulasi
Gunakan nilai absorbansi A setelah pengembangan warna dengan larutan enzim, dan kemudian menghitung jumlah pelepasan glukosa m sesuai dengan kurva standar glukosa, dan menghitung sesuai dengan rumus 5.6:
Aktivitas selulase (u/ ml)=m/ (t · m) (5.6) di mana: m adalah jumlah pelepasan glukosa, ug; T adalah waktu hidrolisis enzimatik, min; M adalah kandungan enzim dalam reaksi, UG/mL.