Efek Anti Penuaan Ekstrak Kultur Kalus Leontopodium Alpinum (Edelweiss) Melalui Profil Transkriptom

Silahkan klik{0}}untuk informasi lebih lanjut

Abstrak:Edelweiss (Leontopodium Alpinum) dalam keluarga Asteraceae adalah bunga liar yang tumbuh di tempat batu kapur. Di sini, kami menyelidiki kemanjuran ekstrak kultur kalus edelweis (ekstrak kultur kalus Leontopodium Alpinum; LACCE) menggunakan beberapa pengujian dari in vitro ke in vivo serta profil transkriptom. Beberapa hasil uji in vitro menunjukkan aktivitas antioksidan yang kuat dari LACCE dalam menanggapi pengobatan UVB. Selain itu, LACCE menekan peradangan dan kerutan; namun, aktivitas pelembab ditingkatkan oleh LACCE. Uji klinis in vivo menunjukkan bahwa aplikasi LACCE yang konstan pada wajah dan jaringan kulit meningkatkan kerutan anti-periorbital, elastisitas kulit, kepadatan kulit, dan ketebalan kulit dibandingkan dengan plasebo. Hasil RNA-Sequencing menunjukkan setidaknya 16,56 persen gen manusia diekspresikan dalam sel keratinosit. gen up-regulated LACCE yang mengkode beberapa protein KRT; DDIT4, BNIP3, dan IGFBP3 terlibat dalam regulasi positif dari proses perkembangan, kematian sel terprogram, keratinisasi, dan cornification membentuk penghalang kulit, yang memberikan banyak keuntungan bagi kulit manusia. Sebaliknya, gen yang diatur ke bawah adalah gen yang responsif terhadap stres, termasuk logam, oksidasi, luka, hipoksia, dan infeksi virus, menunjukkan LACCE tidak menyebabkan stres berbahaya pada kulit. Studi komprehensif kami menunjukkan bahwa LACCE adalah agen yang menjanjikan untuk kosmetik anti-penuaan.

Kata kunci:anti penuaan; kalus; edelweis;sel kulit; transkriptom

1. Perkenalan

Edelweiss (Leontopodium mulia sub sp. Alpinum (Cass.) Greuter) dalam keluarga Asteraceae adalah bunga liar yang tumbuh di tempat-tempat batu kapur di dataran tinggi, seperti Pegunungan Alpen Swiss [1,2]. Karena kelangkaan bunga putihnya yang berumur pendek, edelweiss mewakili keindahan dan kemurnian yang terkait dengan Pegunungan Alpen dan Carpathians. Selain itu, banyak negara, termasuk Austria, Bulgaria, Rumania, Slovenia, dan Swiss, menganggap edelweis sebagai simbol nasional.

Silakan klik di sini untuk tahu lebih banyak

Sejak lama, edelweiss telah digunakan sebagai obat tradisional untuk sakit perut, bronkitis, diare, disentri, dan demam [3, A]. Baru-baru ini, beberapa penelitian telah menunjukkan kemanjuran ekstrak edelweiss untuk anti-inflamasi pada tikus dan tikus [3] dan keratinosit manusia dan sel endotel [4]. Selain itu, ekstrak akar edelweiss mengandung konstituen yang meningkatkan neurotransmisi kolinergik, yang menunjukkan potensinya sebagai agen antidemensia [5] dan antioksidan, seperti

leontopodic acid A dan 35-caffeoylquinic acid, yang dapat digunakan sebagai agen anti-penuaan [6]. Selain itu, ekstrak edelweiss menunjukkan aktivitas antibakteri terhadap Enterococcus faecium, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumonia, dan Streptococcus pyogenes, menunjukkan kemungkinan penggunaan etnomedisinal untuk gangguan pernapasan dan perut [7].

Beberapa penelitian sebelumnya telah menganalisis senyawa ekstrak edelweiss. Misalnya, metode kromatografi kapiler mengungkapkan 12 senyawa penting secara farmakologis, termasuk flavonoid, asam caffeic, dan asam leontopodat, dari bagian udara edelweiss [8]. Untuk mengekstrak antioksidan dari tanaman edelweis, metode centrifugal partition chromatography (CPC) dan high performance liquid chromatography (HPLC) telah dikembangkan [6]. Diketahui bahwa senyawa aktif ekstrak edelweis antara bagian atas dan akarnya beragam[3]. Misalnya, akar berbulu edelweiss menghasilkan lignan yang aktif secara farmakologis, seperti login dan 5-metoksi-login, yang dapat dirangsang oleh beberapa komponen lain, seperti perak nitrat, sukrosa, metil jasmonat, dan ekstrak ragi [ 9].manfaat ekstrak cistancheSelanjutnya, pola metabolisme dari 11 spesies Leontopodium yang berbeda telah diungkapkan oleh spektroskopi resonansi magnetik nuklir (1H NMR) dan spektrometri massa kromatografi cair (LC-MS) dalam hubungan taksonomi mereka [10].

Cistanche bisa anti-penuaan

Kalus tanaman dapat didefinisikan sebagai massa sel yang tidak terorganisir atau tidak berdiferensiasi, yang mudah diinduksi dengan melukai untuk menutupi luka tanaman atau secara artifisial melakukan sistem in vitro. Kalus tanaman dibudidayakan secara artifisial dengan menambahkan nutrisi dan zat pengatur tumbuh dalam kondisi pertumbuhan antiseptik. Saat ini, dimungkinkan untuk menghasilkan sejumlah besar sel tanaman tertentu dengan kualitas yang sama dalam bioreaktor. Selain itu, sel tumbuhan memiliki kemampuan yang disebut dengan totipotensi, yaitu potensi genetik sel tumbuhan untuk menghasilkan seluruh tumbuhan dewasa. Dengan demikian, dimungkinkan untuk menghasilkan tanaman dewasa dari kalus tanaman tertentu. Selanjutnya, kalus dapat dimanfaatkan secara luas untuk regenerasi tanaman untuk melestarikan tanaman langka dan hampir punah [12,13].

Seperti sel hewan, sel tumbuhan memiliki kemampuan untuk memfasilitasi stimulasi dan regenerasi tanaman setelah cedera [14]. Meskipun sel punca tanaman dianggap sebagai bahan baru dalam industri kosmetik, bahan yang tersedia terbatas. Penting untuk mengidentifikasi sumber tanaman baru dan mengevaluasi komponen fungsionalnya yang terkait dengan kosmetik.

Ekstrak Edelweiss terkenal karena penggunaannya dalam agen farmasi; Namun, efek ekstrak edelweiss sebagai sumber kosmetik alami jarang dilaporkan. Di sini, kami menyelidiki kemanjuran ekstrak kalus edelweis (ekstrak kultur kalus Leontopodium Alpinum; LACCE) yang berasal dari daun edelweis menggunakan beberapa uji dari in vitro ke in vivo dan mengungkapkan mekanisme molekuler yang disebabkan oleh LACCE menggunakan profil transkriptom.

2. Bahan-bahan dan metode-metode

2.1. Produksi Kalus Edelweis

Benih Edelweiss dibeli secara komersial. Biji edelweis direndam dalam etanol 70 persen selama 30d diikuti dengan pencucian dengan air suling. Sekali lagi, benih dikocok dalam 0.3 persen natrium hipoklorit (Waco, Osaka, Jepang) selama 20 menit dan dicuci dengan air suling. Benih yang disterilkan dikecambahkan pada media dasar Murashige dan Skoog(MS) (Duchefa Biochemie, Haarlem, Belanda). Daun edelweis dalam kondisi aseptik dipotong kecil-kecil (0,5-1 cm). Kami menginduksi tahap awal sel tanaman pada media MS yang mengandung 0.5-3 mg/mL 6-Benzylaminopurine (6-BAP)(Duchefa Biochemie) dan 0.3-1 mg/mL 2,4-Asam diklorofenoksiasetat (2,4-D)(Duchefa Biochemie) dalam kegelapan pada 25± 2 derajat [15]. PH media MS diatur menjadi 5,8 menggunakan NaOH 1N (Duchefa Biochemie). Kalus yang terinduksi diperbanyak dalam cawan petri. Garis kalus yang dipilih dikultur dalam bioreaktor di Institut Penelitian Anti-Aging BIO-FD&C Co., Ltd., Incheon, Korea. Kalus yang dikultur dipanen dan dicuci tiga kali dengan air suling.cistanche genghis khanKalus didehidrasi menggunakan pengering beku (IlShinbioBase, Dongducheonsi, Korea) sesuai dengan instruksi pabrik. Kalus edelweis kering diaduk dalam air suling pada suhu 50 derajat selama 8 jam. Ekstrak kalus diperoleh dengan ekstraksi panas pada suhu 98 derajat selama 10 menit.

2.2. Kultur Sel Kulit Manusia

Efek ekstrak edelweiss yang dievaluasi pada sel kulit manusia, sel keratinosit (HaCaT), dan fibroblas Detroit 551 manusia normal (ATCC, Manassas, VA, USA) dibudidayakan di Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (Welgene, Gyeongsan-si, Korea ) dilengkapi dengan 10 persen fetal bovine serum (FBS) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) dan 1 persen antibiotik-antimikotik (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) pada suhu 37 derajat dengan kondisi CO2 5 persen.

2.3. Penilaian Aktivitas Metabolik Sel dengan MTT Assay

Untuk menilai sitotoksisitas LACCE pada pertumbuhan sel, propagasi, dan kelangsungan hidup sel kulit manusia, suatu MTT({{{0}}(45-dimethylthiazol-2-yl){{3} },5-diphenyltetrazolium bromide) assay dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya [16,17]. Singkatnya, sel HaCaT dan Detroit 551 dengan kepadatan 5×10* sel per sumur, masing-masing, diinkubasi dalam pelat sumur 96-selama 24 jam. Setelah itu, konsentrasi akhir 0,1 persen , 0,5 persen , dan 1 persen LACCE dirawat selama 24 jam. Air suling digunakan sebagai kontrol. Setelah perlakuan LACCE, media dihilangkan diikuti dengan penambahan 4 Lof 5 mg/mL MTT（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA） dan diinkubasi selama 4 jam. Setelah media dihilangkan, 100 L dimetilsulfoksida (DMSO)(Sigma) ditambahkan dan dilarutkan selama 10 menit.perpanjangan hidup cistancheAbsorbansi panjang gelombang diukur pada 570 nm menggunakan Thermo Scientific Multiskan GO Microplate Spectrophotometer (Fisher Scientific Ltd., Vantaa, Finland). Viabilitas sel diperoleh dengan menggunakan rumus berikut. Viabilitas sel ( persen )=(jumlah absorbansi untuk sel yang dirawat/jumlah absorbansi sel kontrol)× 100.

2.4. Penilaian Aktivitas Antioksidan dengan DPPH Assay

Aktivitas antioksidan LACCE diukur dalam uji DPH (2,2-difenil-1-pikril-hidrazin-hidrat) seperti yang dijelaskan sebelumnya [18]. Singkatnya, 0.1 mL konsentrasi akhir 0.1 persen , {{10}}.5 persen , dan 1 persen LACCE diperlakukan dalam 0.1 mL 0.1 mM DPPH (Sigma-Aldrich) dengan adanya 0.4 mL etanol. Kami menggunakan 0,001 persen asam askorbat (vitamin C) (Sigma-Aldrich) sebagai kontrol positif. Sampel dicampur dengan baik selama 10 detik dan diinkubasi pada suhu kamar dalam kondisi gelap selama 30 menit. Absorbansi panjang gelombang diukur pada 517 nm menggunakan Thermo Scientific Multiskan GO Microplate Spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Aktivitas penangkapan radikal dihitung dengan menggunakan rumus berikut. Aktivitas mengais ( persen )=[1-(absorbansi sampel uji/absorbansi kontrol)]×100.

2.5. Penilaian Aktivitas Antioksidan dengan Uji Hidrogen Peroksida(H2O2)

Hidrogen peroksida menghasilkan radikal bebas oksigen dalam sel, yang mengakibatkan kematian sel. Kami menguji tingkat kematian sel yang disebabkan oleh hidrogen peroksida dalam sampel yang diberi perlakuan LACCE. Sel HaCaT dengan kepadatan 5×105 sel per sumur diinkubasi dalam piringan 24-selama 24 jam. Setelah itu, konsentrasi akhir 0.1 persen,0.5 persen, dan 1 persen LACCE diperlakukan dengan adanya 1 mM H, O, selama 8 jam. Sebagai kontrol positif, 0,033 persen NAC(Sigma-Aldrich) digunakan. Uji MTT digunakan untuk mengukur tingkat kelangsungan hidup sel sampel yang diobati dengan LACCE yang disebabkan oleh HO2. Selain itu, kami mengamati morfologi sel dengan pewarnaan biru metilen (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA).

2.6. Transkripsi Terbalik Waktu Nyata (RT)-PCR

Untuk menguji efek LACCE pada anti-kerut, pelembab, dan anti-peradangan, kami melakukan RT-PCR real-time dengan primer yang diketahui memperkuat gen penanda menggunakan QuantiTect Primer Assays (Qiagen, Hilden, Jerman) sesuai dengan instruksi pabrik. Detroit 551 sel dengan kepadatan 5×104 sel per sumur diinkubasi dalam pelat sumur 96-selama 24 jam. Setelah itu, konsentrasi akhir 0.1 persen,0.5 persen, dan 1 persen LACCE diperlakukan selama 24 jam. cDNA disintesis dari masing-masing sel Detroit 551 yang diperlakukan dengan konsentrasi LACCE yang berbeda menggunakan SuperPrep Cell Lysis & RT Kit untuk qPCR (Toyobo, Osaka, Jepang) yang mengandung reagen lisis dan reagen RT sesuai dengan instruksi pabrik. Untuk efek anti-kerut pada perawatan LACCE, ekspresi gen yang mengkode Matrix Metalloproteinase-2(MMP-2) diukur dengan RT-PCR waktu nyata menggunakan Thunderbird SYBR qPCR Mix kit (Toyobo) berdasarkan instruksi pabrik. Untuk evaluasi pelembab melalui pengobatan LACCE, ekspresi gen yang mengkode Aquaporin 3(AOP3) diperiksa dengan RT-PCR waktu nyata. Dalam kasus uji anti-inflamasi, sel HaCaT dengan kepadatan 5x104 sel per sumur diinkubasi dalam piringan 96-selama 24 jam. Setelah media dihilangkan, UVB disinari pada sel HaCaT. Untuk penyinaran UVB, 5 mJ/cm' digunakan oleh kotak UV CL-1000 (Analytic Jena AG, Jena, Germany). Setelah itu, konsentrasi akhir 0,1 persen,0,5 persen, dan 1 persen LACCE diperlakukan selama 4 jam. Kami menggunakan deksametason(Dex)(Sigma-Aldrich) sebagai kontrol positif. Untuk efek anti-inflamasi dari pengobatan LACCE, ekspresi gen yang mengkode COX2 dan iNOS, masing-masing, diukur dengan RT-PCR waktu nyata. Ekspresi gen individu dinormalisasi menjadi ekspresi gen GAPDH. 2.7. Evaluasi Klinis LACCE sebagai Agen Kosmetik di Vioo

Sebuah studi klinis untuk evaluasi kemanjuran LACCE pada pengangkatan wajah dan meningkatkan kerutan periorbital, elastisitas kulit, kepadatan kulit, dan ketebalan kulit dilakukan oleh perusahaan Ellead setelah persetujuan berdasarkan prosedur operasi standar (Ver. 3.{{1} }) (Ellead, Seongnam, Korea) dari Ellead IRB sesuai dengan pedoman Praktik Klinis yang Baik Korea (B1-2015-4-002) yang dijelaskan oleh Kementerian Keamanan Makanan dan Obat (MFDS) dan Prosedur Operasi Standar Ellead (EL-P{ {4}}).

Untuk menguji efek LACCE in vivo, kami melakukan evaluasi klinis LACCE untuk empat faktor berbeda: pengencangan wajah dan peningkatan kerutan periorbital, elastisitas kulit, kepadatan kulit, dan ketebalan kulit. Untuk ini, total 21 relawan wanita dengan rata-rata 48,04 ± 4,28 tahun yang dibagi lagi menjadi 12 relawan berusia 40-an dan sembilan relawan berusia 50-an, berpartisipasi dalam evaluasi klinis selama empat minggu.

Uji klinis dilakukan pada tiga titik waktu yang berbeda, baseline, 2 minggu, dan 4 minggu, untuk semua sukarelawan. Dari seminggu sebelum awal penelitian sampai akhir, semua relawan tidak menjalani perawatan tambahan untuk memperbaiki kulit, kosmetik, dan bantuan sanitasi, yang dapat mempengaruhi hasil. Setelah mencuci wajah para sukarelawan menggunakan busa pembersih, para sukarelawan berdiri setidaknya selama 30 menit di ruangan yang terkendali dengan suhu konstan (20-24 derajat ) dan kelembaban (40 persen -60 persen kelembaban relatif) . Kami melakukan pengukuran secara acak di sisi kiri atau kanan wajah para relawan. Tes kami adalah tes double-blind di mana baik subjek maupun peneliti tidak tahu produk mana yang merupakan sampel uji. Formulasi untuk menghitung penurunan dan kenaikan tarif dijelaskan pada Tabel 1.

2.8. Pengukuran Pengencangan Wajah dan Memperbaiki Keriput Periorbital

Pada awal, kerutan periorbital, elastisitas kulit, kepadatan kulit, ketebalan kulit di pipi, dan pengangkatan wajah di sudut mulut diukur untuk semua sukarelawan. Setelah itu, dua sampel berbeda, LACCE, dan plasebo (kontrol), dioleskan ke area wajah yang ditentukan dua kali sehari (pagi dan malam). Relawan dibagi menjadi dua kelompok yang berbeda, kelompok I (LACCE diterapkan pada area wajah kiri sedangkan plasebo diterapkan pada area wajah kanan) dan kelompok II (plasebo diterapkan pada area wajah kiri sedangkan LACCE diterapkan pada area wajah kiri). daerah wajah kanan). Dua dan empat minggu setelah pengobatan, pengukuran yang sama dilakukan untuk mengevaluasi efek LACCE dibandingkan dengan plasebo.

Kerutan periorbital dianalisis menggunakan sistem pengukuran kulit 3D(dimensi) optik PRIMOS Resolusi Tinggi (Canfield Scientific, Parsippany, NJ, USA), yang ideal untuk penyelidikan struktur mikro kulit dan kerutan. Dua parameter kekasaran yang berbeda, Ra (kekasaran rata-rata), yang merupakan rata-rata nilai absolut dari tinggi profil profil kekasaran, dan Rg (kekasaran kuadrat rata-rata akar), yang merupakan rata-rata kuadrat akar rata-rata dari tinggi profil. profil kekasaran, diukur.

Artikel ini disarikan dari Gens 2020, 11, 230; doi:10.3390/genes11020230 www.mdpi.com/journal/genes