Efek Neuroprotektif Poli(pro-17 estradiol) Tergantung Dosis Akut pada Model Tikus yang Cedera Memar Tulang Belakang

Abstrak

17 -Estradiol (E2) memberikan perlindungan saraf pada model praklinis cedera sumsum tulang belakang bila diberikan secara sistemik. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menerapkan E2 secara lokal pada sumsum tulang belakang yang cedera untuk jangka waktu yang lama menggunakan biomaterial film poli(pro-E2).

Ketika orang-orang belajar lebih banyak tentang cedera tulang belakang, kami mulai menyadari dampaknya terhadap kesehatan fisik dan mental. Meskipun cedera tulang belakang dapat menyebabkan banyak dampak buruk, untungnya dampaknya terhadap memori dapat dikendalikan.

Pertama, kita perlu memperjelas apa itu cedera tulang belakang. Sumsum tulang belakang merupakan saraf yang dilindungi di tulang belakang yang bertugas mentransmisikan instruksi dari otak ke berbagai bagian tubuh. Jika sumsum tulang belakang terluka, beberapa bagian tubuh akan kehilangan koneksi baik dengan otak, sehingga berdampak pada pergerakan anggota tubuh, sensasi, dan kontrol otonom.

Cedera sumsum tulang belakang mungkin mempunyai dampak tertentu pada ingatan seseorang, terutama pada tahap awal rehabilitasi pasien cedera tulang belakang. Cedera sumsum tulang belakang dapat menyebabkan penurunan perhatian, memori kerja, dan kemampuan pemrosesan emosi seseorang, sehingga akan mempengaruhi kemampuan memori seseorang.

Namun dampak negatif tersebut lambat laun akan berkurang seiring pasien menjalani perawatan rehabilitasi. Pasien dapat meningkatkan daya ingatnya dengan berpartisipasi dalam permainan memori dan pelatihan kognitif lainnya. Pada saat yang sama, rehabilitasi fisik juga bermanfaat untuk memulihkan fungsi motorik dan sensorik tubuh, sehingga meningkatkan fungsi emosional dan kognitif.

Kita harus mendorong pasien dengan cedera tulang belakang untuk berpartisipasi aktif dalam perawatan rehabilitasi dan terus mengikuti pelatihan rehabilitasi untuk meningkatkan kesehatan fisik dan mental. Harap percaya bahwa dengan bantuan kognisi yang benar dan perawatan pasca operasi, pasien dapat mengatasi dampak cedera tulang belakang pada memori dan terus menjalani kehidupan yang aktif. Terlihat bahwa kita perlu meningkatkan daya ingat, dan Cistanche dapat meningkatkan daya ingat secara signifikan karena Cistanche juga dapat mengatur keseimbangan neurotransmiter, seperti meningkatkan kadar asetilkolin dan faktor pertumbuhan, yang sangat penting untuk daya ingat dan pembelajaran. Selain itu, Cistanche juga dapat meningkatkan aliran darah dan meningkatkan pengiriman oksigen, yang dapat memastikan otak memperoleh nutrisi dan energi yang cukup, sehingga meningkatkan vitalitas dan daya tahan otak.

Klik suplemen tahu untuk meningkatkan daya ingat

Setelah cedera kontusif sumsum tulang belakang pada tikus jantan dewasa, film poli(pro-E2) ditanamkan secara subdural, dan perlindungan saraf dinilai menggunakan imunohistokimia 7 hari setelah cedera dan implantasi. Dalam penelitian ini, film poli(pro-E2) sedikit meningkatkan perlindungan saraf tanpa mempengaruhi respon inflamasi. jika dibandingkan dengan kontrol yang cedera.

Untuk meningkatkan dosis E2 yang dilepaskan, film poli(pro-E2) yang melepaskan bolus dibuat dengan memasukkan E2 yang tidak terikat ke dalam film poli(proE2).

Namun, dibandingkan dengan kontrol yang terluka, film poli(pro-E2) yang melepaskan bolus tidak secara signifikan meningkatkan perlindungan saraf atau membatasi peradangan pada 7 atau 21 hari pasca cedera. Penelitian di masa depan akan fokus pada pengembangan biomaterial poli(pro-E2) yang mampu lebih tepatnya melepaskan dosis terapeutik E2.

PERKENALAN

Cedera sumsum tulang belakang traumatis (SCI) adalah kondisi yang melemahkan yang mempengaruhi lebih dari 18,000 orang setiap tahun di Amerika Serikat,1 sedangkan prevalensi global SCI diperkirakan antara 236 dan 1009 per juta.2

Pasien yang terkena SCI mengalami defisit neurologis yang parah termasuk hilangnya sensasi, gangguan fungsi usus/kandung kemih, dan kelumpuhan.3,4 Dampak utama pada sumsum tulang belakang menyebabkan kematian neuron di lokasi cedera yang selanjutnya diperburuk oleh beberapa rangkaian cedera sekunder yang melibatkan astrosit dan makrofag. .

Seiring waktu, astrosit ini membentuk bekas luka glial yang mencegah perluasan akson melampaui tepi lesi.5 Hingga saat ini, belum ada obat neuroprotektif yang disetujui FDA untuk mengobati SCI.

Penelitian selama beberapa dekade telah berfokus pada pemberian biomolekul secara sistemik untuk mencegah hilangnya neuron akibat cedera sekunder dan/atau mendorong regenerasi aksonal, yang pada akhirnya mengarah pada pemulihan fungsi yang hilang.6 Salah satu biomolekul yang menunjukkan harapan signifikan dalam model praklinis SCI adalah perempuan. hormon seks, 17 -estradiol(E2).

Pemberian E2 secara luas bermanfaat bagi sistem saraf pusat dengan mengurangi peradangan,7–9 mengurangi reaktivitas sel glial,10 membatasi stres oksidatif,11–14 dan mengurangi kematian neuron eksitotoksik yang disebabkan oleh glutamat.15 E2 meningkatkan pemulihan fungsional dalam berbagai model hewan pengerat SCI.10, 16,17 Menariknya, pemberian E2 sistemik dosis ganda menginduksi pemulihan fungsional lebih cepat18,19 dibandingkan dengan hewan yang hanya menerima satu dosis.17

Karena E2 mendorong pemulihan fungsional secara lebih efektif melalui rejimen dosis ganda, tujuan kami adalah melepaskan E2 secara lokal secara stabil di lokasi cedera (untuk mencegah efek di luar target) untuk menghindari masalah yang timbul dari dosis ganda/suntikan sistemik E2.

Untuk itu, kami menggunakan strategi biomaterial poli(prodrug) di mana obat asli (E2) pertama kali difungsikan dengan gugus alil reaktif dan kemudian dipolimerisasi melalui penambahan radikal tiol-ena yang diinisiasi dengan ditiol oligo-(etilen glikol) fleksibel, seperti yang dijelaskan sebelumnya. .20 Kami memperoleh rantai polimer dengan berat molekul tinggi, yang terdiri dari obat E2 sebagai unit berulang di dalam polimer.

Setelah degradasi hidrolitik, polimer secara bertahap melepaskan E2 ke media sekitarnya. Satu-satunya produk sampingan lain dari pelepasan ini adalah karbon dioksida dan oligo(etilen glikol) (oEG) (Gambar 1). Rantai poli(pro-E2) yang dibuat menjadi film atau serat mikro dapat melepaskan E2 pada konsentrasi nanomolar secara in vitro dalam skala waktu berbulan-bulan hingga bertahun-tahun. .20

E2 yang dilepaskan dari perancah poli(pro-E2) ini bersifat bioaktif, dan perancah ini meningkatkan neurotropisme dan perlindungan saraf secara in vitro dengan melindungi neuron dari tekanan oksidatif yang diinduksi oleh hidrogen peroksida. Di sini, kami menerapkan film poli (pro-E2) dalam model SCI memar murine, segera setelah cedera, dan menilai kemampuan neuroprotektifnya secara in vivo.

Desain film poli(pro-E2) awal kami meningkatkan perlindungan saraf secara akut (7 hari pasca cedera) di lokasi cedera tanpa memengaruhi respons inflamasi. Karena film poli(pro-E2) melepaskan nanogram E2 per hari, kami mengembangkan strategi pelepasan lain di mana E2 yang tidak terikat dimasukkan ke dalam matriks poli(pro-E2). Kami berhipotesis bahwa pelepasan E2 yang tidak terikat secara bolus dapat memberikan manfaat neuroprotektif tambahan.

Film poli(pro-E2) melepaskan E2 secara meledak diikuti dengan pelepasan E2 secara berkelanjutan dari polimer pada konsentrasi yang lebih rendah. Pewarnaan imunohistologis menilai neuron, astrosit, dan makrofag/mikroglia yang terdapat di lokasi cedera secara akut (7 hari pasca cedera) dan secara kronis (21 hari pasca cedera) setelah SCI dengan adanya film poli (pro-E2) yang melepaskan bolus ini.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Film poli(pro-E2) melepaskan E2 pada konsentrasi nanomolar, meningkatkan pertumbuhan neuron dari ganglion akar dorsal, dan melindungi neuron dari stres oksidatif yang diinduksi hidrogen peroksida secara in vitro.20 Penelitian yang disajikan di sini bertujuan untuk menentukan kemampuan poli(pro-E2) film untuk memberikan perlindungan saraf in vivo menggunakan model kontusio SCI murine.

SCI memar sedang diinduksi pada tikus jantan dewasa, dan segera setelah cedera, film poli (pro-E2) ditempatkan tepat di atas cedera (Gambar 2A). Untuk memastikan film poli(pro-E2) tetap di tempatnya setelah implantasi, film poli(pro-E2) yang mengandung rhodamin B ditanamkan ke dalam sumsum tulang belakang hewan yang terluka. Tujuh hari pasca implantasi, sumsum tulang belakang dikumpulkan dan dicitrakan menggunakan mikroskop cahaya (Gambar 2B). Pada semua hewan, film poli(pro-E2) yang mengandung rhodamin B yang ditanamkan tetap berada di tempatnya untuk memvalidasi protokol implantasi.

Untuk menguji kemampuan film poli(pro-E2) dalam memberikan perlindungan saraf dan mengurangi peradangan, film poli(pro-E2) (tanpa rhodamin B) ditanamkan setelah cedera memar tulang belakang, dan sumsum tulang belakang dikumpulkan 7 hari setelah cedera dan implantasi. Bagian memanjang (tebal 10 μm) dipotong, dipusatkan di sekitar episentrum cedera, dan diberi label imunolabel untuk memvisualisasikan neuron dan makrofag di sumsum tulang belakang (Gambar 3).

Bagian diberi label NeuN untuk menilai keberadaan neuron, dan analisis kuantitatif pewarnaan mengungkapkan bahwa film poli (pro-E2) secara signifikan meningkatkan area positif NeuN di sekitar pusat cedera dibandingkan dengan kontrol yang terluka yang tidak menerima implan film (Gambar 3A; p=0.0002). Pewarnaan tambahan untuk akson menggunakan NFH (rantai berat neurofilamen) juga mengungkapkan efek neuroprotektif akut dari film poli(pro-E2) yang ditanamkan (Gambar 3B; p=0.0017).

Kami mengamati bahwa perubahan perlindungan saraf ini bukan disebabkan oleh perubahan apoptosis (caspase 3) pada lokasi cedera (Gambar S1; p=0.9966). Pewarnaan untuk makrofag teraktivasi (CD68) juga tidak menunjukkan adanya perbedaan yang signifikan antara hewan yang diberi perlakuan film poli(pro-E2) dan hewan yang tidak diberi perlakuan (Gambar 3C; p= 0.7207).

Secara keseluruhan, film poli(pro-E2) sedikit meningkatkan perlindungan saraf secara akut tanpa mengubah respons inflamasi. Film poli(pro-E2) meningkatkan kepadatan saraf secara akut hampir 20%, namun film tersebut tidak memiliki efek antiinflamasi yang nyata (berdasarkan kuantifikasi area yang ditempati oleh makrofag yang diaktifkan) (Gambar 3).

Kurangnya pengurangan peradangan mungkin menunjukkan bahwa dosis anti-inflamasi dan neuroprotektif E2 berbeda dan keduanya tidak tercapai dengan formulasi film saat ini.20 Kami berhipotesis bahwa peningkatan pelepasan E2 dari film poli(pro-E2) secara akut dapat mengurangi peradangan. dan memungkinkan respons neuroprotektif yang lebih kuat.

Untuk meningkatkan dosis pelepasan E2 secara akut, film poli(pro-E2) dimodifikasi sehingga pelepasan bolus E2 akan terjadi segera setelah implantasi. Setelah pelepasan E2 secara bolus, degradasi polimer akan terjadi dan melepaskan E2 pada konsentrasi yang sama seperti sebelumnya. Percobaan yang dijelaskan di atas diulangi dengan menggunakan film poli (pro-E2) yang melepaskan bolus, dan perlindungan saraf serta peradangan dinilai pada 7 hari pasca cedera (dpi).

Namun, alih-alih memberikan manfaat tambahan, film poli(pro-E2) yang melepaskan bolus tidak secara signifikan meningkatkan area positif NeuN dibandingkan dengan kontrol yang terluka dan tidak diobati (Gambar 4A; p=0.6770). Film poli(proE2) yang melepaskan bolus meningkatkan ekspresi CD68, namun peningkatan tersebut tidak berbeda secara statistik (p= 0.1780).

Tren peningkatan reaktivitas glial dan peradangan mikroglial juga diamati dengan adanya film poli (pro-E2) yang melepaskan bolus karena peningkatan ekspresi GFAP (astrosit) dan Iba1 (mikroglia); namun, peningkatan ini secara statistik tidak lebih besar dari apa yang diamati pada kelompok kontrol yang cedera dan tidak diobati (masing-masing p=0.3233 dan p=0.3053). Secara keseluruhan, film poli(pro-E2) yang melepaskan bolus tidak meningkatkan perlindungan saraf, dan reaktivitas astrosit serta keberadaan makrofag/mikroglia tidak berkurang seperti yang dihipotesiskan pada awalnya.

Karena perbedaan antara hewan yang terluka, yang tidak diobati dan hewan yang terluka, hewan yang diberi film poli(proE2) yang melepaskan bolus tidak teramati pada titik waktu akut, 7 dpi, titik waktu kronis dipilih untuk penyelidikan lebih lanjut sejak film poli(pro-E2) dapat melepaskan E2 dalam jangka panjang.20 Percobaan yang dijelaskan di atas diulangi dengan film poli(pro-E2) pelepas bolus, namun hewan dinilai secara kronis pada 21 dpi (Gambar 5).

Sumsum tulang belakang diberi label untuk jenis sel yang sama seperti yang disebutkan sebelumnya. Setelah analisis, terdapat kecenderungan peningkatan fraksi luas NeuN pada hewan yang diberi implan film poli(pro-E2) yang melepaskan bolus dibandingkan dengan hewan yang terluka dan tidak diobati (Gambar 5A; p=0.0897) .Selain itu, tren yang diamati adalah film poli(pro-E2) yang melepaskan bolus menurunkan fraksi area ekspresi CD68 dan GFAP dibandingkan dengan data dari hewan kontrol yang tidak diobati dan terluka (Gambar 5B, C; p=0.0859 dan p=0.2780).

Namun, tidak ada tren yang berbeda secara statistik. Di sisi lain, bagian jaringan berlabel Iba1 dari hewan yang diberi perlakuan poli(pro-E2) yang melepaskan bolus menunjukkan peningkatan ekspresi dibandingkan dengan data dari kontrol yang tidak diobati dan terluka (p <0.0001). Penelitian kami sebelumnya menunjukkan bahwa poli(pro -E2) film yang dicetak pada kaca penutup 15 mm × 15 mm melepaskan sekitar 266 ng E2 per hari,20 yang berarti sekitar 2 ng E2 per hari dari film (1 mm × 1,8 mm) yang digunakan di sini. Film poli(pro-E2) yang melepaskan bolus melepaskan tambahan 40 ug E2 tak terikat secara akut setelah implantasi.

Penelitian yang berfokus pada penggunaan E2 pada model SCI hewan pengerat menunjukkan bahwa estrogen dosis rendah (10 ug/kg) yang diberikan secara intravena melemahkan gliosis reaktif dan memberikan perlindungan saraf sekaligus melemahkan kejadian inflamasi, menghambat apoptosis, dan meningkatkan angiogenesis.21 Sebaliknya, estrogen dosis tinggi dan sistemik mempunyai efek yang merugikan. efek samping yang mencakup peningkatan angka trombosis vena dalam dan kanker22,23 serta berkembangnya sifat fisik feminin pada pria. Hal ini penting karena sebagian besar penelitian E2 berfokus pada pemberian E2 secara sistemik baik secara intravena atau intraperitoneal.

Mengingat masalah keamanan penggunaan E2 dosis tinggi secara sistemik, penting untuk mengoptimalkan konsentrasi E2 untuk pengiriman lokal ke sumsum tulang belakang yang cedera untuk mencegah efek samping. Sampai saat ini, hanya satu penelitian yang telah menghasilkan E2 dari biomaterial dengan menggunakan nanopartikel untuk menghasilkan E2 secara fokus (2,5 ug atau 25 ug). Pelepasan nanopartikel dengan cepat menurunkan peradangan secara akut pada model tikus yang mengalami memar SCI.9 Kurangnya respons yang signifikan secara statistik dalam data kami (Gambar 4 dan 5) mungkin disebabkan oleh ketidakseimbangan dalam jumlah E2 yang kami kirimkan secara lokal ke sumsum tulang belakang dengan terlalu banyak E2 (40 ug) yang dilepaskan secara akut sementara sangat sedikit (2 ng) yang dilepaskan secara kronis.

Meskipun apa yang kami amati dari data ini adalah tren yang sederhana, penelitian ini menyoroti pentingnya pemberian dosis E2 untuk meningkatkan perlindungan saraf in vivo. Mengurangi dosis awal E2 dan menyesuaikan kinetika degradasi biomaterial poli(pro-E2) dapat membantu meringankan masalah ini dan berpotensi memberikan hasil neuroprotektif yang lebih baik.

Meskipun penelitian ini dilakukan hanya pada laki-laki, penting untuk menilai efek film poli (pro-E2) pada kedua jenis kelamin untuk menetapkan potensi translasi yang valid untuk biomaterial ini. Penelitian telah menunjukkan bahwa setelah SCI, peningkatan kadar estrogen pada wanita mungkin ikut bertanggung jawab atas peningkatan hasil fungsional mereka dibandingkan dengan laki-laki.24 Karena terdapat peningkatan kadar estrogen pada wanita, strategi biomaterial apa pun yang menggunakan estrogen harus mempertimbangkan peningkatan kadar ini dan memodifikasi bahannya. kinetika pelepasan yang sesuai untuk memastikan bahwa dosis yang diberikan tetap sama untuk pria dan wanita.

METODE

Fabrikasi Film Poli(pro-E2).

Polimer (pro-E2) polimer P1 disintesis dan dikarakterisasi seperti dijelaskan secara rinci sebelumnya.20 Polimer tersebut memiliki berat molekul rata-rata MW ~ 80 kDa dan dispersi Đ ~ 3, menurut kromatografi permeasi gel (GPC). Film poli (pro-E2) dibuat dengan melarutkan polimer dalam kloroform (5% berat / berat; polimer / kloroform), menuangkan larutan ke dalam kaca penutup kaca berukuran 15 mm × 15 mm (100 μL larutan per kaca penutup), dan membiarkannya. untuk mengeringkan semalaman di bawah vakum (<100 mTorr) at room temperature (RT). In a subset of experiments, the polymer solution was supplemented with rhodamine B (0.005 wt %/wt; rhodamine B/chloroform) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) to verify the presence of the poly(pro-E2) films in animals post-implantation.
Untuk membuat film poli(pro-E2) dengan E2 tak terikat, film dibuat dengan menambahkan E2 tak terikat(Abcam, Cambridge, MA) ke dalam larutan polimer (0.0625 wt %/wt; E2/chloroform) sebelum pengecoran tetes larutan ke dalam kaca penutup. Sebelum implantasi, kaca penutup dengan film disterilkan menggunakan radiasi ultraviolet (UV) selama 30 menit dan film dikupas dari kaca penutup dalam lemari keamanan hayati yang steril. Film poli(pro-E2) kemudian dipotong menjadi potongan berukuran 1 mm× 1,8 mm, cocok untuk implantasi pada tikus dewasa seperti dijelaskan di bawah.

Cedera Tulang Belakang Memar dan Implantasi Film Poli(pro-E2).

Semua prosedur perawatan bedah dan pasca operasi telah disetujui oleh Rensselaer PolytechnicInstitute dan Komite Perawatan dan Penggunaan Hewan Institusional Universitas Negeri Ohio (IACUC). Untuk menginduksi SCI memar, tikus C57BL/6 jantan dewasa (berusia 10- hingga 12-minggu), dibeli dari Laboratorium Jackson (stok no. 000664; Bar Harbor, ME), dibius dengan injeksi intraperitoneal ketamin (80 mg/kg) dan xylazine (10 mg/kg). Bagian belakang hewan dicukur dan disiapkan secara aseptik menggunakan etanol 70% dan betadine.

Setelah hewan ditempatkan pada bantalan pemanas dengan suhu 37 derajat, lapisan kulit dan otot dibuka untuk mengekspos tulang belakang, dan laminektomi dorsal dilakukan pada tulang belakang toraks kesembilan (T9) untuk mengekspos sumsum tulang belakang. SCI memar sedang (75 kdyn) diinduksi pada tingkat ini menggunakan penabrak Infinite Horizons (Precision Systems and Instrumentation, Lexington, KY).

Setelah hemostasis tercapai, dura dibuka (Gambar 2) dan film poli(pro-E2) atau film poli(pro-E2) yang melepaskan bolus (1 mm × 1,8 mm) ditempatkan di bawah dura dan di atas sumsum tulang belakang, menutupi lokasi cedera. Pada hewan kontrol, dura dibuka tetapi film poli(pro-E2) tidak ditanamkan. Lapisan otot kemudian ditutup menggunakan jahitan steril, dan kulit ditutup menggunakan klip luka logam steril.

Tikus menerima 2 mL larutan garam steril yang disuntikkan secara subkutan dan dikembalikan ke kandangnya dan ditempatkan pada slide penghangat yang diatur pada suhu 37 derajat semalaman. Untuk memastikan hidrasi yang tepat dan mencegah infeksi, tikus disuntik secara subkutan dengan 1-2 mL larutan garam steril dan Gentocin (1 mg/kg) setiap hari selama 5 hari pertama pasca cedera (dpi). Kandung kemih diekspresikan secara manual dua kali sehari selama percobaan. Semua hewan ditempatkan dalam kondisi konvensional dalam siklus terang-gelap 12-jam dengan akses ad libitum terhadap makanan dan air.

Pengambilan Jaringan.

Pada titik waktu terminal yang ditentukan yaitu 7 atau 21 dpi, tikus disuntik dengan ketamin/xylazine dosis mematikan (1,5× dosis bedah) dan diperfusi secara transkardial dengan 0.1 Mphosphate-buffered saline (PBS; pH 7,4) diikuti dengan paraformaldehyde 4% (PFA; pH 7.4). Sumsum tulang belakang dikeluarkan, difiksasi selama 2 jam dalam PFA 4%, dan kemudian dipindahkan ke buffer fosfat 0.2M (PB; pH 7.4) semalaman.

Sumsum tulang belakang dilindungi krioproteksi dalam sukrosa 30% selama 48 jam pada suhu 4 derajat dan kemudian diblokir menjadi segmen 10 mm yang berpusat di sekitar lokasi cedera dengan kolom punggung menghadap ke atas. Bagian-bagian ini tertanam dalam media suhu pemotongan optimal Tissue-Tek (VWR International, Radnor, PA) dan dibekukan dengan cepat di atas es kering. Semua sumsum tulang belakang dipotong pada 10 μm pada cryostat Microm HM505E, ditempatkan pada slide ColorFrost Plus (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA), dan kemudian disimpan pada suhu −20 derajat sampai digunakan untuk immunostaining.

Imunohistokimia dan Kuantifikasi.

Slide dicairkan pada penghangat slide selama 1 jam dan kemudian dibilas 3 kali dalam 0.1 MPBS. Aktivitas peroksidase endogen dimatikan dengan menginkubasi slide dalam H2O2 6% yang diencerkan dalam metanol selama 15 menit di RT. Setelah dicuci 3 kali dalam 0.1 M PBS, bagian tersebut diinkubasi dengan 4% BSA dan 0.1% Triton X-100 dalam 0.1 M PBS selama 1 jam diikuti dengan inkubasi antibodi primer semalaman pada suhu 4 derajat atau RT (Tabel 1).

Slide diinkubasi dengan antibodi sekunder terbiotinilasi yang sesuai (1:1000; Laboratorium Vektor, Burlingame, CA) di RT selama 1 jam. Untuk memvisualisasikan antibodi yang terikat, slide diinkubasi dengan Vectastain Elite-ABC (Vector Laboratories) selama 1 jam dan dikembangkan dengan ImmPACT3,3′-diaminobenzidine (DAB) atau substrat Vector SG (Vector Laboratories) selama 10 menit.

Bagian-bagian ini didehidrasi melalui inkubasi berurutan selama 2x2 menit dalam etanol 70% dan 90%, 2x3 menit dalam etanol 100%, diikuti oleh 3x3 menit dalam Histoclear, dan akhirnya ditutup dengan Permount (ThermoFisher Scientific). Enam bagian per hewan, dengan jarak 100 μm pada sumsum tulang belakang yang terluka, digunakan untuk analisis kuantifikasi.

Bagian yang diberi imunolabel dicitrakan menggunakan mikroskop pencitraan Axioplan 2 yang dilengkapi dengan kamera digital AxioCam dan perangkat lunak AxioVision versi 4.8.2 (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Jerman) dan objektif 5x.

Jumlah piksel positif di setiap bagian dihitung menggunakan perangkat lunak analisis gambar MIPAR (MIPAR, Worthington, OH) untuk menghitung persentase fraksi area positif per bagian. Rata-rata persen area positif dari enam bagian per hewan dihitung untuk masing-masing noda dan dilaporkan.

Analisis Statistik.

Semua data dilaporkan sebagai mean ± standar deviasi. Analisis statistik dilakukan dengan menggunakan Perangkat Lunak Statistik GraphPad Prism 9 (Perangkat Lunak GraphPad, San Diego, CA). Dalam semua percobaan, 5-6 hewan digunakan per kelompok, yang berasal dari setidaknya dua kelompok hewan berbeda. Untuk menguji perbedaan antara kelompok film kontrol dan poli(pro-E2), digunakan uji-t Student (Gambar 3, 4, dan 5). Signifikansi ditetapkan pada p Kurang dari atau sama dengan 0,05.

Materi Tambahan

Lihat versi Web di PubMed Central untuk materi tambahan.

UCAPAN TERIMA KASIH

Penulis berterima kasih kepada Wenmin Lai atas bantuannya dalam operasi tikus.

Pendanaan

Pekerjaan ini mendapat dukungan dari Craig H. Neilsen Foundation Fellowship (Grant 468116) dan Paralyzed Veteransof America Research Foundation Fellowship (Grant 3171) kepada MKG dan dari NIH R01 (Grant NS092754) dan New York State Spinal Cord Injury Review Board Hibah Dukungan Institusional C32245GG kepada RJG Semua pekerjaan hewan dilakukan dengan bantuan dari Inti Bedah Departemen Ilmu Saraf Universitas Negeri Ohio didukung oleh NINDS Grant P30NS104177.

REFERENSI

(1). Pusat Statistik Cedera Tulang Belakang Nasional. (2020) Sekilas Fakta dan Angka Cedera Tulang Belakang, Universitas Alabama di Birmingham, Birmingham, AL.

(2). Cripps RA, Lee BB, Wing P, Weerts E, MacKay J, dan Brown D (2011) Peta Global untuk Epidemiologi Cedera Tulang Belakang Traumatis: Menuju Tempat Penyimpanan Data Hidup untuk Pencegahan Cedera. Sumsum tulang belakang. 49, 493–501. [PubMed: 21102572]

(3). Donovan WH (2007) Cedera Tulang Belakang - Dulu, Sekarang, dan Masa Depan. Jurnal Kedokteran Tulang Belakang 30, 85–100.

(4). Pickelsimer E, Shiroma EJ, dan Wilson DA (2010) Investigasi di Seluruh Negara Bagian terhadap Kondisi Kesehatan Merugikan Orang dengan Cedera Tulang Belakang yang Ditangani Secara Medis. J. Med. Tulang Belakang. 33 (3),221–231. [PubMed: 20737795]

(5). Silver J, dan Miller JH (2004) Regenerasi melampaui Glial Scar. Nat. Pendeta Neurosci. 5 (2),146–156. [PubMed: 14735117]

(6). Varma AK, Das A, Wallace G, Barry J, Vertegel AA, Ray SK, dan Banik NL (2013) Cedera Tulang Belakang: Tinjauan Terapi Saat Ini, Perawatan Masa Depan, dan Batasan Sains Dasar.Neurochem. Res. 38, 895–905. [PubMed: 23462880]

(7). Zendedel A, Mönnink F, Hassanzadeh G, Zaminy A, Ansar MM, Habib P, Slowik A, Kipp M, andBeyer C (2018) Estrogen Melemahkan Ekspresi dan Aktivasi Peradangan Lokal setelah Cedera Tulang Belakang. mol. Neurobiol. 55 (2), 1364–1375. [PubMed: 28127698]

(8). Lee JY, Choi HY, Ju BG, dan Yune TY (2018) Estrogen Mengurangi Nyeri Neuropatik yang Dipicu setelah Cedera Tulang Belakang dengan Menghambat Aktivasi Mikroglia dan Astrosit. Biokimia. Biofisika. Akta, Mol. Dasar Dis. 1864 (7), 2472–2480. [PubMed: 29653184]

(9). Cox A, Varma A, Barry J, Vertegel A, dan Banik N (2015) Nanopartikel Estrogen pada Cedera Tulang Belakang Tikus Menimbulkan Efek Anti-Peradangan yang Cepat pada Plasma, Cairan Serebrospinal, dan Jaringan.J. Neurotrauma 32 (18), 1413–1421. [PubMed: 25845398]

(10). Sribnick EA, Samantaray S, Das A, Smith J, Matzelle DD, Ray SK, dan Banik NL (2010) Perawatan Estrogen Pasca Cedera pada Cedera Tulang Belakang Kronis Meningkatkan Fungsi Lokomotor pada Tikus. J. Ilmu Saraf. Res. 88 (8), 1738–1750. [PubMed: 20091771]

(11). Honda K, Shimohama S, Sawada H, Kihara T, Nakamizo T, Shibasaki H, dan Akaike A (2001) Transduksi Sinyal Antiapoptosis Nongenomik oleh Estrogen pada Neuron Kortikal yang Dikultur. J.Neurosci. Res. 64 (5), 466–475. [PubMed: 11391701]

(12). Sribnick EA, Wingrave JM, Matzelle DD, Ray SK, dan Banik NL (2003) Estrogen sebagai Agen Neuroprotektif dalam Pengobatan Cedera Tulang Belakang. Ann. NY Akademik. Sains. 993.125–133. [PubMed: 12853305]

For more information:1950477648nn@gmail.com