Bagian satu Acteoside Repressed Microglia M1 Polarization Melalui Jalur Pensinyalan NF-κB yang Dihambat Dan Pemulihan Fungsi Mitokondria yang Dimediasi AMPK
Mar 03, 2022
untuk informasi lebih lanjut:ali.ma@wecistanche.com
BAGIAN 1 Bagaimana Cistanche Acteosides meningkatkan vitalitas sel otak dan meringankan penyakit Alzheimer?
Universitas Farmasi Cina Ying-Qi Li
Universitas Farmasi Tiongkok Yi Chen
Universitas Farmasi Cina Si-Qi Jiang
Universitas Farmasi China Yuan-Yuan Shi
Universitas Farmasi Tiongkok Xiao-Li Jiang
Universitas Farmasi Tiongkok Shan-Shan Wu
Universitas Farmasi Ping Zhou China
Universitas Farmasi China Hui-Ying Wang
Universitas Farmasi Ping Li China
Kata Kunci Penelitian: akteosida, sel BV-2, metabolisme, RNA-seq, mitokondria, peradangan saraf
Abstrak
Latar Belakang: Penyakit Alzheimer (AD) merupakan jenis demensia yang paling sering terjadi. Ketikaakteosida(ACT), senyawaterpencildariCistanche tubulosa, memilikisifat neuroprotektif. Namun, mekanisme yang mendasari dalam mengatur polarisasi mikroglia masih belum jelas. Metode: Di sini, model AD yang diinduksi AlCl3-pada larva ikan zebra diterapkan untuk mengungkap kemanjuran terapeutik ACT. Sel BV-2 digunakan untuk menunjukkan peran ACT pada polarisasi mikroglia. RNA- Sequence, HPLC-Q-TOF-MS, western blot, dan molecular docking digabungkan untuk mengkonfirmasi mekanismenya.
Hasil: ACT secara signifikan memperbaiki diskinesia eksperimental dan gangguan sistem saraf pada ikan zebra. Selanjutnya, ia menekan polarisasi M1 dan mempromosikan fenotipe M2 dalam sel BV-2 yang diinduksi LPS. Kami pertama kali menunjukkan bahwa ACT memberikan dampak transkriptomik yang mendalam, yang melibatkan regulasi jalur pensinyalan utama dalam peradangan, biosintesis arginin, serta biosintesis pantotenat dan CoA, yang berkorelasi dengan fungsi mitokondria. Pengobatan ACT mengurangi polarisasi mikroglia M1 dengan menghambat jalur pensinyalan NF-κB. Dan jalur metabolisme selanjutnya dikonfirmasi oleh HPLC-Q-TOF-MS. Selain itu, ACT memperbaiki ROS yang berlebihan untuk memulihkan fungsi mitokondria melalui peningkatan regulasi PGC-1 dan UCP-2 yang dimediasi AMPK, konsisten dengan perubahan metabolisme. Menariknya, ACT dapat secara langsung mengikat NF-κB dan AMPK , sebagaimana dibuktikan dengan docking molekuler. Kesimpulan: Penelitian ini memberikan mekanisme infus ACT dan menggambarkan perspektif baru berdasarkan disfungsi mitokondria untuk mengungkapkan hubungan antara metabolisme dan polarisasi mikroglia.
Latar belakang
Penyakit Alzheimer (AD) adalah penyakit neurodegeneratif yang umum disertai dengan gangguan kognitif dan diskinesia[1]. Ini ditandai dengan hilangnya saraf yang parah, plak pikun, dan kusut neuro-brillary [2]. Patogenesis DA bersifat multidimensi dan terkait dengan peradangan saraf. Neuroinflammation didorong oleh aktivasi sel glial, terkait erat dengan perkembangan AD [3, 4]. Selama perkembangan dan eksaserbasi peradangan saraf, mikroglia dianggap sebagai faktor kunci. Mikroglia adalah sel kekebalan utama dalam sistem saraf pusat. Ini terkait erat dengan rangkaian proses, yang mengandung perkembangan otak, mempertahankan lingkungan yang netral, serta merespons cedera dan perbaikan[1]. Selain itu, mikroglia dapat dirangsang ke fenotipe M1 dan ekspresi sitokin pro-inflamasi meningkat ketika penyakit yang berhubungan dengan peradangan saraf seperti AD terjadi [5]. Studi juga menunjukkan bahwa polarisasi ke fenotipe M1 sering disertai dengan gangguan metabolisme[6], menyebabkan ketidakseimbangan metabolisme energi dan disfungsi mitokondria[7]. Perubahan merugikan ini berasal dari neurodegenerasi, bahkan AD.
Akteosida(ACT), suatu glikosida fenilethanoid, terutama berasal dariBentengtubulosa. Semakin banyak bukti telah menyarankan bahwaBERTINDAKmemiliki banyak farmakologisaktivitas, termasuk efek neuroprotektif[8], anti-inflamasi[9], dan antioksidan[10]. Khususnya, ACT telah dilaporkan meningkatkan pembelajaran dan gangguan memori serta meningkatkan metabolisme energi pada tikus yang diinduksi streptozotocin [11]. Ini juga telah disarankan untuk menghambat kematian sel apoptosis neuron dan kerusakan mitokondria pada tikus percobaan ensefalomielitis autoimun [12]. Namun, lebih sedikit penelitian yang difokuskan pada efek ACT pada polarisasi mikroglia M1/M2. Terutama berbagai mekanisme, seperti perbaikan fungsi mitokondria dan pengaturan metabolisme sel, belum dilakukan. Selain itu, mekanismeBERTINDAKberkontribusi pada polarisasi mikroglia M1 / M2 tetap belum dijelajahi. Laporan ini bertujuan untuk menyelidiki kemanjuran terapeutik ACT serta mekanisme molekuler yang mendasarinyaBERTINDAKdiIKLAN. Disini,BERTINDAKmenunjukkan efek perlindungan saraf yang signifikan pada larva ikan zebra AD yang diinduksi oleh AlCl3-. Selain itu, ACT secara efektif menghambat polarisasi M1 dan mempromosikan fenotipe M2 dalam sel BV yang diinduksi LPS-2. RNA-Sequencing (RNA-Seq) terintegrasi dengan metode metabolomik untuk lebih memahami mekanisme yang mendasari ACT dalam mengatur polarisasi mikroglia. Crosstalk antara metabolisme dan polarisasi mikroglia dalam hal fungsi mitokondria diselidiki. Studi ini akan memberikan penghormatan baru untuk penyelidikan lebih lanjut dari ACT sebagai agen terapi potensial untuk mengobati AD.
Metode
Pengelompokan hewan dan model
Zebra¦sh tipe liar (strain AB, umur 4 bulan) dipilih dalam penelitian ini (Nanjing Qi Wu Biotechnology Co., Ltd.). Mereka dipertahankan di bawah siklus terang/gelap 14/10 jam pada 28 derajat , mengikuti metode sebelumnya[13]. Pupuk alami dan embrio yang berkembang normal dihasilkan dan dibiakkan hingga 3 hari setelah pembuahan (pdf) dalam inkubator iluminasi. Semua eksperimen ikan zebra dilakukan di bawah pengawasan Komite Etika Hewan Universitas Farmasi China. Larva ikan zebra dibagi menjadi enam kelompok dan diberi perlakuan dari 3 pdf hingga 7 pdf: kelompok kontrol, kelompok model, kelompok model plus donepezil hidroklorida (DPZ), model plus kelompok ACT. Kelompok kontrol dipertahankan dalam medium dengan 0,2 persen DMSO dan kelompok model diperlakukan dengan 150 M AlCl3 (pH 5,8). Model ditambah kelompok DPZ diberi perlakuan bersama dengan AlCl3 dan 8 M DPZ. Model ditambah kelompok ACT diberi perlakuan bersama dengan AlCl3 dan konsentrasi ACT yang berbeda (200, 100, 50 M). ACT (Kemurnian HPLC Lebih besar atau sama dengan 98 persen ) diperoleh dari Baoji Herbest Bio-Tech Co., Ltd. (Baoji, China). AlCl3·6H2O dan DPZ dibeli dari Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., LTD. (Shanghai, Tiongkok).
Analisis perilaku Halaman 3/34Pergerakan larva ikan zebra direkam dengan penganalisis perilaku ViewPoint (Zebralab 2018, ViewPoint Life Sciences Co., Ltd.) pada 28 derajat . Secara singkat, parameter perilaku, dan pemrosesan hasil konsisten dengan metode yang kami buat sebelumnya [13]. Di sini, kecepatan rata-rata (AS), perubahan kecepatan (ΔS), tingkat pemulihan diskinesia (DRR), dan efisiensi respons (RE, persen) dipilih untuk mengevaluasi pemulihan diskinesia pada ikan zebra.
Penentuan aktivitas asetilkolinesterase (AChE) dan kolin asetiltransferase (ChAT)
Setelah perlakuan dari 3 pdf ke 7 pdf, larva ikan zebra dikumpulkan untuk mengukur aktivitas AChE dan ChAT.
Berdasarkan protokol pabrikan, aktivitas tersebut dideteksi oleh kit enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) (MLBIO biotechnology Co. Ltd., Shanghai, China). Dan konsentrasi protein dari sampel yang berbeda ditentukan dengan metode BCA
Kultur dan perawatan sel
Garis sel BV-2 (garis sel mikroglial murine abadi) dibeli dari Koleksi Budaya Tipe Amerika (ATCC, Manassas, VA, USA). Mereka dibudidayakan di DMEM (KeyGen Biotech Co., Ltd, Nanjing, Cina). Media dilengkapi dengan 10 persen FBS (Gibco, Grand Island, NY, USA), 100 U/mL penisilin, serta 100 mg/mL streptomisin, dengan 95 persen udara/5 persen CO2 pada 37 derajat. Sel BV-2 diinkubasi dengan ACT (50, 25, 12,5 M) atau distimulasi dengan Lipopolisakarida (LPS, 1 ug/mL; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) selama 24 jam. Akhirnya, semua sel atau supernatan dikumpulkan untuk berbagai analisis.
Uji viabilitas sel
Alat Penghitung Sel-8 (CCK-8) (JianCheng Bioengineering Institute, Nanjing, China) digunakan untuk mengevaluasi viabilitas sel BV-2. Sel-sel diunggulkan dalam piringan 96-sumur (1×104 sel/sumur, Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd.). Secara singkat, media dihilangkan pada akhir perawatan, dan 100 L media bebas serum yang mengandung larutan CCK-8 ditambahkan ke masing-masing sumur selama 2 jam pada suhu 37 derajat . Absorbansi diukur pada 450 nm dengan pembaca lempeng mikro (Bio-Tek Instrument, Winooski, VT, USA). Viabilitas sel dinyatakan sebagai persentase dari kelompok kontrol. Percobaan diulang tiga kali.
Uji produksi oksida nitrat (NO)
NO ditentukan dengan mengukur kadar nitrit dalam supernatan kultur BV-2 menggunakan reagen Griess. Singkat cerita, pada akhir perawatan, media (100 L) dipindahkan ke 96-well plate baru. Volume reagen Griess yang sama ditambahkan ke setiap sumur dan direaksikan selama 15 menit dalam gelap. Penyerapan pada 540 nm ditentukan oleh Microplate Reader.
Tingkat sitokin inflamasi dalam supernatan
Konsentrasi TNF-, IL-1, dan IL-10 dalam supernatan sel BV-2 ditentukan dengan kit ELISA sesuai dengan instruksi pabrik (MLBIO biotechnology Co. Ltd., Shanghai, China ).
Pengamatan morfologi seluler
Untuk menentukan efek ACT pada polarisasi M1/M2 sel BV-2, sel-sel disepuh dalam cawan sumur 6-dan diamati di bawah mikroskop terbalik (Nikon ECLIPSE Ti2, Jepang).
Penentuan metabolisme seluler dengan analisis HPLC-Q-TOF-MS
Sel BV{{0}} diunggulkan dalam cawan sumur 6-secara terpisah (n=6/grup). Setelah perawatan, media dihilangkan, dan sel dicuci tiga kali dengan PBS dingin. Kemudian segera terpapar nitrogen cair untuk menekan metabolisme sel. Sel dipanen dengan metanol dingin 80 persen (1 mL/sumur) dan suspensi dipindahkan ke tabung Eppendorf 2 mL. Untuk memfasilitasi pengendapan protein, divorteks dengan kuat selama 1 menit dan disentrifugasi pada 13,000 rpm selama 15 menit pada 4 derajat . Suspensi sel dipindahkan ke tabung Eppendorf 2 mL baru dan dikeringkan di bawah aliran nitrogen dan disimpan pada -80 derajat sampai analisis. Residu kering dilarutkan dalam 15{{40}} L 25 persen asetonitril yang telah didinginkan sebelumnya. Untuk memastikan stabilitas dan akurasi analisis urutan, volume yang sama (10 L) dari setiap sampel sel digabungkan sebagai sampel kontrol kualitas (QC). Selama deteksi metabolit, sampel ini disuntikkan setelah setiap enam sampel sel untuk memastikan stabilitasnya. Alikuot 1 L disuntikkan untuk HPLC-Q-TOF-MS. Analisis HPLC-Q-TOF-MS dilakukan pada sistem HPLC Agilent 1290 yang terhubung dengan spektrometer massa Agilent 6530 Quadrupole Time-of-Flight (Q-TOF) (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Pemisahan dilakukan pada kolom ACQUITY UPLC BEH C18 (2,1×100 mm, 1,7 m). Fase gerak terdiri dari 0,1 persen asam format-air (v/v; A) dan asetonitril (B). Laju aliran ditetapkan pada 0,4 mL/menit dengan kondisi elusi gradien optimal berikut: 0 hingga 2 menit, 5 persen B; 2 hingga 20 menit, 5 persen hingga 95 persen B (mode ion positif); 0 sampai 2 menit, 5 persen B; 2 hingga 20 menit, 5 persen hingga 95 persen B (mode ion negatif). Parameter operasi spektrometer massa ditetapkan sebagai berikut: suhu gas, 320 derajat; gas pengering, 10 L/menit; nebulizer, 35 psi; VCap, 4000 V; fragmen, 120 V. Data mentah dioperasikan di bawah MassHunter Workstation Software versi B.07.00 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Data mentah telah diproses sebelumnya oleh platform XCMS. Analisis komponen utama (PCA) dan analisis diskriminan kuadrat terkecil (PLS-DA) dari data yang dinormalisasi dilakukan dengan MetaboAnalyst (https://www.metaboanalyst.ca). Dikombinasikan dengan literatur, metabolit diferensial (VIP> 1, T-test P <0,05) diidentifikasi="" pada="" hmdb="" (https://hmdb.ca).="" akhirnya,="" analisis="" jalur="" dilakukan="" dengan="">
Pengukuran potensial membran mitokondria (MMP)
MMP dideteksi menggunakan probe fluorescent JC-1 (Beyotime, China) sesuai dengan instruksi pabriknya. Secara singkat, sel-sel dari kelompok yang berbeda dibilas dengan PBS dan diinkubasi dengan larutan pewarnaan JC-1 selama 20 menit pada suhu 37 derajat. Setelah pewarnaan, sel dicuci dua kali menggunakan buffer pewarnaan. Kemudian, sinyal fluoresen dideteksi dengan flow cytometry (BD Accuri C6).
Pengukuran mitokondria adenosin 5'-trifosfat (ATP)
Konsentrasi ATP dalam mitokondria dideteksi oleh ATP Assay Kit (Beyotime, China) sesuai dengan instruksi pabrik. Secara singkat, media kultur sel BV-2 dari kelompok yang berbeda dibuang, dan sel dihomogenisasi dengan buffer lisis di atas es. Supernatan yang diperoleh setelah sentrifugasi (12,000 g, 5 menit) digunakan untuk menentukan konsentrasi ATP. Pendaran (reaksi fluorescein yang dikatalisis luciferase) dideteksi oleh EnVision Multimode Microplate Reader (PerkinElmer).
Pengukuran tingkat spesies oksigen reaktif (ROS) intraseluler
ROS Assay Kit (Beyotime, China) digunakan untuk mengukur tingkat ROS. Sel-sel dari kelompok yang berbeda diinkubasi dengan DCFH-DA (10 M) selama 20 menit pada 37 derajat. Setelah pemuatan probe, sel dicuci tiga kali dengan DMEM. Kemudian, sinyal fluoresen dideteksi dengan flow cytometry (BD Accuri C6)
Mikroskop elektron transmisi (TEM)
Sel BV-2 diunggulkan dalam cawan sumur 6-. Media telah dihapus dan 1 mL glutaraldehid 2,5 persen dengan cepat ditambahkan ke masing-masing sumur. Kemudian sel-sel dipindahkan ke tabung Eppendorf 1,5 ml dan disentrifugasi pada 1000 rpm selama 3 menit. Sel-sel difiksasi semalaman dengan glutaraldehid baru 2,5 persen pada 4 derajat. Setelah fiksasi, dehidrasi, dan penyisipan, sel-sel diamati dengan mikroskop elektron transmisi HT7800 (Hitachi, Tokyo, Jepang).
RNA-seq dan analisis data bioinformatika
Total RNA dari sel BV-2 (n=3/group) diekstraksi menggunakan reagen Trizol (Vazyme Biotech, China) sesuai dengan instruksi pabrik pembuat reagen. Semua sampel analitik dikirim ke Majorbio (Shanghai Majorbio Bio-pharm Technology Co., Ltd.) untuk melakukan uji urutan RNA. Data dianalisis pada platform online gratis Majorbio Cloud Platform. Parameter untuk analisis ekspresi diferensial adalahP-sesuaikan < 0.05 dan |log2FC|Lebih dari atau sama dengan1. Data urutan asli telah diserahkan ke database NCBI Sequence Read Archive (SRA).
Reaksi berantai polimerase real-time kuantitatif (qRT-PCR)
Total RNA sel BV-2 di setiap kelompok dipanen menggunakan 500 L RNA-easyTM Isolation Reagent (Vazyme Biotech, China), dan reaksi transkripsi terbalik dilakukan dengan FastKing-RT SuperMix (TIANGEN Biotech, China) . Reaksi dilakukan sesuai dengan protokol pabrikan. cDNA menjadi sasaran uji qRT-PCR dengan primer spesifik dan TransStart TOP Green qPCR SuperMix (TransGen Biotech, China). Primer tercantum dalam Tabel S1 (lihat File Tambahan 1) dan -actin digunakan sebagai kontrol internal. Metode 2-ΔΔCT digunakan untuk analisis kuantitatif.
Analisis Western blot
Sel BV-2 dilisiskan oleh buffer lisis RIPA (KeyGen Biotech Co., Ltd, Nanjing, China) yang mengandung 1 persen Protease Inhibitor Cocktail (Thermo Fisher) untuk mendapatkan protein total. SDS-PAGE 10 persen dilakukan untuk memisahkan protein, yang ditransfer ke membran NC. Setelah diblok dengan 5 persen susu skim/BSA selama 2 jam, membran diinkubasi dengan AMPK (Proteintech), p-AMPK (A¨nity Biosciences), PGC-1 (Proteintech), NF-κB (Proteintech), p-NF-κB (ABclonal), atau antibodi GAPDH (ABclonal) dalam 5 persen TBST pada 4 derajat semalam. Membran diinkubasi dengan antibodi terkonjugasi peroksidase lobak sekunder (ABclonal) selama 1 jam pada suhu kamar. Substrat western blotting ECL high-sig (Tanon, Cina), sistem pencitraan Gel (Tanon, Cina), dan perangkat lunak ImageJ digunakan untuk visualisasi dan kuantisasi.
Docking molekuler
Analisis docking molekuler dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak Autodock (Versi 4.2). Afinitas antara ACT dan protein diamati oleh perangkat lunak AutodockTools. Struktur protein tiga dimensi (3D) AMPK (PDB ID: 5g5j), dan NF-κB (PDB ID: 4q3j) diambil dari Protein Data Bank
Analisis statistik
Semua data dinyatakan sebagai mean ± standar deviasi (SD). Perbedaan antara kelompok yang berbeda dianalisis dengan analisis varians satu arah (ANOVA), diikuti dengan kelipatan Tukey.
Hasil
ACT mengurangi diskinesia dan meningkatkan fungsi sistem kolinergik pada larva ikan zebra
Model AD yang diinduksi AlCl3-dalam larva ikan zebra digunakan untuk menunjukkan efek ACT pada AD. Pertama, pergerakan larva ikan zebra dalam siklus terang/gelap diamati dan jejak renang mereka dicatat (Gbr. 1a, 1b). AS dan S gerakan ikan zebra yang diinduksi oleh AlCl3 dalam waktu yang sesuai setelah pemberian dihitung. Hasil penelitian menunjukkan bahwa dosis ACT yang berbeda secara efektif meningkatkan AS dan S ikan zebra (Gbr. 1c). DRR dan RE menemukan perbandingan ACT dan DPZ yang lebih intuitif (Gbr. 1d). Dengan demikian, ACT mengurangi diskinesia, menunjukkan efek yang sama seperti DPZ. Secara umum disepakati bahwa sistem kolinergik memainkan peran penting dalam proses pembelajaran dan memori. Dengan demikian, aktivitas AChE dan ChAT digunakan untuk mengungkapkan efek ACT. Paparan AlCl3 pada ikan zebra dengan perubahan kolinergik otak (Gbr. 1e). Sangat luar biasa bahwa pengobatan ACT menekan aktivitas AChE. Selain itu, aktivitas ChAT menunjukkan penurunan setelah pengobatan ACT. Singkatnya, ACT menunjukkan dampak besar pada fungsi sistem kolinergik pada larva ikan zebra AD yang diinduksi AlCl3-.
ACT menekan polarisasi M1 dan mempromosikan polarisasi M2 dalam sel BV yang diinduksi LPS-2
Efek ACT pada polarisasi mikroglia dipelajariin vitromenggunakan sel mikroglial BV-2. LPS secara signifikan menurunkan viabilitas sel BV-2 setelah dirawat 24 jam. Untungnya, ACT meningkatkan viabilitas sel dari sel BV yang diinduksi LPS-2 (Gbr. 2a). Selain itu, morfologi sel BV-2 diamati. Setelah 24 jam stimulasi LPS, menunjukkan bahwa sel BV-2 mengalami keadaan polarisasi M1. Dan perubahan morfologi dicegah dengan pengobatan bersama ACT (Gbr. 2b). Selain itu, hasil menunjukkan bahwa tidak seperti sel BV-2 yang distimulasi oleh LPS, sel BV-2 yang diobati bersama dengan ACT menunjukkan penekanan signifikan TNF- (Gbr. 2c), IL-1 ( Gbr. 2d), dan ekspresi NO (Gbr. 2f) dalam supernatan sel. Ini adalah sitokin pro-inflamasi klasik sebagai indikator polarisasi mikroglia M1. Serupa dengan hasil ELISA, hasil qPCR menemukan bahwa ekspresi mRNA TNF- , nitric oxide synthase (iNOS), IL-1 , dan CD86 signifikan.dihambat dengan pengobatan ACT dibandingkan dengan kelompok LPS (Gbr. 3a). Selanjutnya, kami mengukur tingkat polarisasi mikroglia M2 dengan ELISA (Gbr. 2e) dan qPCR (Gbr. 3b), yang hasilnya menunjukkan bahwa ACT secara signifikan meningkatkan level ekspresi penanda terkait mikroglia M2 (IL-10, CD206 , TGF- , dan Arg-1). Secara keseluruhan, hasil ini menunjukkan bahwa ACT menekan polarisasi mikroglia M1 dan mempromosikan fenotipe M2.
Polarisasi M1/M2 yang diatur ACT melalui penghambatan jalur pensinyalan NF-κB dalam sel BV yang diinduksi LPS-2
Analisis transkriptomik dilakukan oleh RNA-seq untuk memahami mekanisme ACT dalam sel BV-2 dari tingkat keseluruhan. PCA menggambarkan bahwa kelompok kontrol, LPS, dan ACT dapat dibedakan dengan baik (Gbr. 4a). Ini mengungkapkan 899 gen yang diekspresikan secara berbeda (DEG) antara kelompok kontrol dan kelompok LPS, sedangkan 49 DEG berada di antara kelompok LPS dan kelompok ACT (Gbr. 4b). Secara konsisten, analisis pengayaan Gene Ontology (GO) (Gbr. 4c) dan analisis pengayaan Kyoto Encyclopedia of Gens and Genomes (KEGG) (Gbr. 4d) menemukan bahwa efek ACT terlibat dalam jalur pensinyalan NF-κB. Kumpulan gen yang terkait dengan jalur pensinyalan NF-κB dikonfirmasi lebih lanjut dan homeostasis mereka tentu saja dipengaruhi oleh LPS. Seperti yang diharapkan, ACT secara signifikan mempengaruhi ekspresi mereka (Gbr. 4e). Jalur pensinyalan NF-kB adalah jalur klasik untuk mengatur perkembangan peradangan, yang pada akhirnya menghasilkan pelepasan faktor pro-inflamasi. Untuk mendapatkan dukungan mekanistik, protein kunci dari jalur pensinyalan NF-kB dievaluasi dengan analisis western blot. Stimulasi LPS menyebabkan aktivasi NF-κB, terkait dengan mempromosikan polarisasi M1. Konsisten dengan analisis RNA-seq, ACT menghambat fosforilasi NF-kB yang dirangsang LPS (Gbr. 4f). Oleh karena itu, ACT membebaskan polarisasi M1 yang diinduksi LPS melalui jalur pensinyalan NF-κB dalam sel BV-2.
ACT mengganggu biosintesis arginin serta biosintesis pantotenat dan CoA dalam sel BV yang diinduksi LPS-2
RNA-seq menunjukkan bahwa jalur yang dipengaruhi oleh ACT juga termasuk biosintesis arginin (Arg) serta biosintesis pantotenat dan CoA (Gbr. 4d). Dan telah disarankan bahwa stimulasi LPS menyebabkan gangguan metabolisme sel BV-2 yang terkait dengan polarisasi M1[14]. Dengan demikian, metabolisme sel yang tidak ditargetkan oleh HPLC-Q-TOF-MS digunakan untuk mengidentifikasi efek ACT pada metabolisme sel. PCA (Gbr. 5a) dan PLS-DA (Gbr. 5b) menggambarkan bahwa kelompok kontrol, LPS, dan ACT dapat dibedakan dengan baik berdasarkan metabolit intraseluler. Tingkat berbagai metabolit dalam sel BV yang diinduksi LPS -2 diubah setelah pengobatan ACT (Gbr. 5c). Dibandingkan dengan kelompok kontrol, terdapat 11 metabolit yang berubah secara signifikan pada kelompok LPS (Tabel S2, lihat File Tambahan 2). Sedangkan 14 metabolit jelas berubah setelah pengobatan ACT (Tabel S3, lihat Tambahan le 3), yang melibatkan 11 jalur metabolisme (Gbr. 5d). Efek ACT terutama terdiri dari pengaturan metabolisme asam amino (biosintesis fenilalanin, tirosin, dan triptofan, metabolisme D-Glutamine dan D-glutamat, biosintesis Arg, metabolisme fenilalanin), metabolisme nukleotida (metabolisme purin, metabolisme pirimidin), metabolisme energi (nitrogen metabolisme), serta metabolisme kofaktor dan vitamin (biosintesis pantotenat dan CoA). Menariknya, jalur metabolisme yang diperoleh oleh metabolome konsisten dengan RNA-seq, termasuk biosintesis Arg serta biosintesis pantotenat dan CoA. Hal di atas menunjukkan bahwa ACT dapat mengatur biosintesis Arg serta biosintesis pantotenat dan CoA dalam sel BV yang distimulasi LPS-2.
Act Mitigated Lps-induced Bv-2 Disfungsi Mitokondria
Mitokondria adalah inti dari jalur metabolisme. Bukti berkembang bahwa mitokondria adalah pemain kunci dalam polarisasi mikroglial M1/M2. Penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa LPS dapat menyebabkan disfungsi mitokondria. Gambaran status mitokondria dalam morfologi dan distribusi sel dinilai oleh TEM. Setelah stimulasi LPS, sel BV-2 menunjukkan kondensasi kromatin nukleus, penurunan sitoplasma, serta mitokondria yang lebih sedikit (Gbr. 6a). Selain itu, krista mitokondria kelompok LPS tidak teratur atau bahkan menghilang, menunjukkan kristolisis parsial, ukuran berkurang, dan morfologi berbentuk bulat. Menariknya, pengobatan ACT dapat meringankan perubahan morfologi yang diinduksi LPS di mitokondria. Secara bergantian, kami memeriksa fungsi mitokondria sel BV-2 yang diobati dengan LPS, termasuk MMP, dan produksi ATP mitokondria. MMP (Gbr. 6b, 6c) dan produksi ATP di mitokondria (Gbr. 6d) meningkat secara signifikan pada sel yang diobati dengan ACT dibandingkan dengan kelompok LPS. Disfungsi mitokondria mungkin terkait dengan peningkatan kadar ROS dalam sel. Analisis flow cytometry mengungkapkan bahwa isi ROS kelebihan beban pada kelompok LPS (Gbr. 6e, 6f). Untungnya, ACT menghilangkan ROS yang berlebihan. Ini menunjukkan bahwa ACT dapat mengembalikan fungsi mitokondria dengan membersihkan ROS.
ACT memulihkan fungsi mitokondria melalui peningkatan regulasi PGC-1 dan UCP-2
Peroksisom proliferatif diaktifkan reseptor-co-aktivator-1 (PGC-1) memainkan peran penting dalam biogenesis mitokondria[15]. Stimulasi LPS menurunkan ekspresi PGC-1 , menunjukkan disfungsi mitokondria. Hebatnya, mRNA gen PGC-1 dan ekspresi protein secara signifikan dibalikkan oleh pengobatan ACT dalam sel BV-2 yang diobati dengan LPS (Gbr. 7a). Protein uncoupling mitokondria-2 (UCP-2) juga diketahui mengatur fungsi mitokondria. Sebagai protein hilir PGC-1 , ia dapat mengontrol depolarisasi MMP yang diinduksi LPS dan produksi ROS. Laporan terbaru menunjukkan bahwa itu adalah pusat dari proses aktivasi mikroglial, dengan regulasi berlawanan dari polarisasi M1 dan M2.[16]. Hasil western blot menunjukkan bahwa kadar protein UCP-2 menurun setelah stimulasi LPS. Pengobatan bersama LPS dan ACT dapat meningkatkan regulasi ekspresi UCP-2 dibandingkan dengan pengobatan LPS. Tingkat ekspresi mRNA dari UCP-2 juga menunjukkan perubahan yang serupa (Gbr. 7b). Secara bersama-sama, ACT memulihkan fungsi mitokondria melalui peningkatan regulasi PGC-1 dan UCP-2.
ACT menekan polarisasi mikroglia M1 melalui pemulihan fungsi mitokondria melalui aktivasi AMPK
AMP-activated protein kinase (AMPK), sebagai kunci sensor energi seluler, memainkan peran penting dalam menjaga keseimbangan metabolisme sel. Pada saat yang sama, PGC-1 adalah protein hilir AMPK. Hasil menemukan bahwa LPS menghambat aktivasi AMPK, yang mengakibatkan gangguan metabolisme sel dan disfungsi mitokondria. Patut dicatat bahwa ACT dapat bergantung pada dosis meningkatkan ekspresi protein p-AMPK (Gbr. 8a). Disarankan bahwa ACT dapat meningkatkan ekspresi PGC-1 dan mengembalikan fungsi mitokondria dengan mengaktifkan jalur pensinyalan AMPK. Dalam penelitian ini, untuk menyelidiki apakah aktivasi AMPK berkontribusi pada efek regulasi ACT pada polarisasi M1/M2, senyawa C (CC) digunakan untuk menghambat efek AMPK. Berbeda dengan level NO yang diturunkan regulasinya pada kelompok perlakuan ACT, CC memblokir sebagian efek ACT pada level NO (Gbr. 8d). Berdasarkan hasil tersebut, ACT dapat mengatur polarisasi M1/M2 sel BV-2 melalui aktivasi AMPK.
ACT mengikat dan menghambat NF-κB serta mengaktifkan AMPK
Docking molekuler diterapkan untuk mengkonfirmasi apakah ACT mengikat protein NF-κB dan AMPK. Temuan menunjukkan bahwa energi ikat ACT dan NF-κB adalah 8,4 kkal/mol, sedangkan ACT dan AMPK adalah 10,8 kkal/mol. Afinitas yang signifikan memverifikasi bahwa ACT terikat langsung dengan NF-kB dan AMPK (Gbr. 9). Selanjutnya, kemungkinan mode pengikatan dan interaksi dalam kantong asam amino dieksplorasi lebih lanjut, termasuk Phe A146, Pro A147, Asn A240, Leu A236, Arg A232, His A183, Arg A239, Glu A179, Cys A149, dan Tyr A227 dari NF -κB (Gbr. 9c) serta Phe A213, Gly A481, Ala A370, Leu A482, Arg A212, Ile A369, Arg A106, Phe A215, Phe A108, Thr A309, Ser A119, dan Thr A224 dari AMPK (Gbr. .9f). Hasil ini menunjukkan bahwa ACT mungkin secara langsung mempengaruhi NF-κB dan AMPK untuk melemahkan polarisasi BV-2 mikroglia M1 dan mempromosikan fenotipe M2.
