Ekstrak Daun Abrus Precatorius Membalikkan Diabetes Mellitus yang Diinduksi Alloxan/Nicotinamide pada Tikus Melalui Modulasi Hormonal (Insulin, GLP-1, Dan Glukagon) Dan Enzimatik ( -Amylase/ - Glucosidase) Bagian 1

Mohon hubungi{0}}untuk informasi lebih lanjut

Latar belakang

Abrus precatorius digunakan dalam pengobatan tradisional di seluruh wilayah Afro-Asia di dunia. Sebelumnya, efek penurun glukosa dan perlindungan pankreas dari ekstrak daun Abrus precatorius (APLE) dikonfirmasi secara eksperimental pada tikus diabetes yang diinduksi STZ/nicotinamide; namun, mekanisme yang mendasari efek antidiabetes dan perlindungan pankreas tetap tidak diketahui. Objektif. Penelitian ini menjelaskan mekanisme antidiabetes dan efek perlindungan pankreas dari APLE pada tikus diabetes. Bahan dan metode. APLE dibuat dengan metode ekstraksi etanol/Soxhlet. Total fenol dan flavonoid dikuantifikasi secara kalorimetri setelah penyaringan fitokimia awal. Diabetes mellitus (DM) ditemukan pada tikus dewasa Sprague-Dawley (dengan berat 120-180 g) dari kedua jenis kelamin dengan injeksi nikotinamida berurutan setiap hari (48 mg/kg; ip) danaloksan(120mg/kg; ip) selama 7 hari. Kecuali tikus kontrol yang memiliki kadar glukosa darah puasa (FBG) 4,60 mmol/L, tikus yang memiliki FBG stabil (16-21 mmol/L) 7 haripasca nikotinamida/aloksaninjeksi dianggap diabetes dan secara acak dipindahkan ke salah satu kelompok berikut (model, APLE (100, 200, dan 400 mg/kg, masing-masing; PO) dan metformin (300 mg/kg; PO)) dan diobati setiap hari selama 18 hari . Berat badan dan FBG diukur setiap 72 jam selama 18 hari. Pada hari ke 18, tikus telah dikorbankan di bawah lautanestesi; organ (ginjal, hati, pankreas, dan limpa) diisolasi dan ditimbang. Darah dikumpulkan untuk estimasi insulin serum, glukagon, dan (LP-1 menggunakan kit ELSA spesifik tikus,' Pankreas diproses, dipotong, dan diwarnai H&E untuk pemeriksaan histologis. Pengaruh APLE padaenzimatikaktivitas alpha (a)-amilase dan -glukosidase dinilai. Sifat antioksidan dan penangkal radikal bebas dari APLE dinilai menggunakan metode standar. Hasil. Dosis ketergantungan APLE menurunkan FBG awal sebesar 68,67 persen, 31,07 persen, dan 4,39 persen dibandingkan dengan model (4,34 persen) dan metformin (43,63 persen). Perawatan APLE (100 mg/kg) mengembalikan penurunan berat badan relatif terhadap model. APLE meningkatkan insulin serum dan GLP-1 tetapi menurunkan serum glukagon relatif terhadap model. APLE meningkatkan jumlah dan median luas penampang (×10 derajat um') pulau pankreas dibandingkan dengan model. APLE menghasilkan penghambatan tergantung konsentrasi -amilase dan -glukosidase relatif terhadap acarbose. Konsentrasi APLE yang bergantung pada DPPH dan radikal oksida nitrat (NO) dan menunjukkan peningkatan kapasitas antioksidan pereduksi besi (FRAC) relatif terhadap standar. Kesimpulan. Efek antidiabetes dari APLE dimediasi melalui modulasi insulin dan GLP-1 berbanding terbalik dengan glukagon, penghambatan nonkompetitif c-amilase dan -glukosidase, pembersihan radikal bebas, dan pemulihan sel pankreas yang rusak/nekro-apoptosis.

Silakan klik di sini untuk tahu lebih banyak

1. Perkenalan

Diabetes melitus (DM) merupakan salah satu sindrom metabolik yang ditandai dengan hiperglikemia kronis yang berpuncak pada disregulasi metabolisme glukosa sekunder akibat defek pada fungsi sel pankreas [1]. Secara patologis, DM merupakan produk dari kesalahan metabolisme glukosa akibat defek fungsi sel pankreas yang menyebabkan insufisiensi insulin (DM tipe 1) atau resistensi insulin (DM tipe 2). Gejala umum DM meliputi polifagia, polidipsia, penglihatan kabur, penurunan berat badan kronis, gastroparesis, dan poliuria [2]. Seiring waktu, hiperglikemia yang tidak terselesaikan meningkatkan risiko komplikasi mikrovaskular DM seperti nefropati diabetik, retinopati diabetik, dan neuropati diabetik [2]. Komplikasi ini terjadi karena stres oksidatif yang luas dan lipidperoksidasiyang merupakan produk sampingan dari reaksi antara glukosa dan molekul biologis [3]. Glikosilasi ekstensif molekul biologis seperti DNA, protein, dan lipid mengarah pada pembentukan zat antara biokimia yang tidak stabil yang berfungsi sebagai sumber spesies oksigen reaktif (ROS) dan spesies nitrogen (RNS). ROS dan RNS adalah pendorong utama reaksi oksidan dan peroksidatif di berbagai sel dan jaringan [3].

Secara epidemiologi, dilaporkan bahwa DM mempengaruhi lebih dari 387 juta orang di seluruh dunia [4]. Perkiraan sementara ini diproyeksikan meningkat menjadi 592 juta pada tahun 2035 [5]. Awalnya, DM dianggap onset dewasa, tetapi sekarang, DM terbukti tidak bergantung pada usia, yang dengan jelas menunjukkan besarnya ancaman yang ditimbulkan. oleh DM untuk kesehatan global.

Cistanche dapat meningkatkan kekebalan

Secara konvensional, pengobatan DM (tipe 1 dan 2) melibatkan penggunaan agen antidiabetik, yang dikelompokkan sebagai noninsulin (termasuk biguanida (misalnya, metformin), sulfonilurea (misalnya, glyburide), inhibitor SGLT-2 (misalnya, dapagliflozin), sekuestran asam empedu (misalnya, colesevelam), amylin mimetic (misalnya, pramlintide), agonis dopamin-2 (misalnya, bromokriptin), penghambat DPP-4 (misalnya, sitagliptin), GLP{{5 }}RAs (misalnya, exenatide), thiazolidinedione (misalnya, rosiglitazone), dan -glucosidase inhibitor (misalnya, Acarbose dan voglibose)) dan terapi insulin (misalnya, insulin manusia dan analog) [6]. Terapi antidiabetes konvensional telah terbukti efektif meskipun fakta bahwa penggunaan beberapa dari mereka mahal dan mungkin berhubungan dengan efek samping yang serius[7]. Biaya, efek samping, dan kepercayaan umum bahwa obat konvensional adalah sintetis dan dalam hal ini tidak aman dibandingkan dengan obat-obatan herbal, yang dianggap "alami" dan relatif aman telah berkontribusi pada minat baru dalam penggunaan herbal dan turunannya. produk untuk pengobatan dan pengelolaan penyakit manusia termasuk DM[8,9]. Paradigma ini cukup umum di negara-negara tropis yang lebih miskin di dunia, di mana kebanyakan orang mengandalkan obat herbal untuk memenuhi kebutuhan perawatan kesehatan primer mereka [8]. Juga, ini mungkin menegaskan pernyataan biasa bahwa penggunaan herbal mendahului pengobatan modern dan bahwa produk alami terus berfungsi sebagai template untuk sintesis farmasi obat baru [10] termasuk agen antidiabetes. Yang penting, herbal dan terapi turunan herbal ini digunakan sebagai terapi tambahan dengan cara yang mencerminkan sistem kepercayaan dan warisan etnobotani sebagian besar komunitas lokal di seluruh wilayah Afro-Asia di dunia. Sebagai contoh, banyak tanaman obat dengan klaim etnobotani untuk pengobatan diabetes mellitus seperti Chrysobalanus orbicularis[11], Spondias mombin dan Mangifera indica[12], Sesamum indicum [13], dan Bryophyllum pinnatum [14] semuanya telah menunjukkan -amilase dan -efek penghambatan glukosidase yang dianggap penting untuk kontrol glikemik. Menanggapi minat baru dalam penggunaan herbal dan produk turunan herbal sebagai terapi tambahan atau alternatif, Organisasi Kesehatan Dunia (WHO) bersama dengan kelompok kepentingan lainnya telah merekomendasikan penggabungan sistem penyembuhan asli, khususnya obat herbal ke dalam sistem kesehatan negara-negara miskin [15]. Rekomendasi ini mengharuskan perlunya verifikasi klaim kesehatan pada tanaman obat yang biasa digunakan oleh masyarakat setempat untuk mengobati penyakit manusia[16,17]. Menariknya, Abrus pre-catorius yang biasa disebut "kacang jequirity" adalah ramuan obat yang banyak digunakan dalam pengobatan tradisional di banyak budaya di seluruh wilayah Afro-Asia di dunia untuk pengobatan penyakit manusia[18-20]. Beberapa laporan telah menyoroti penggunaan tradisional daun Abrus precatorius dalam pengobatan dan pengelolaan diabetes mellitus [21-23]. Sebagai catatan, ekstrak dari daun Abrus precatorius telah menunjukkan kemanjuran terhadap diabetes mellitus [1] dan kanker payudara [24], dua penyakit manusia yang telah memberikan kontribusi signifikan terhadap beban penyakit global [25]. Banyak penelitian telah membenarkan penggunaan etnofarmakologi dan klaim obat lainnya dari Abrus precatorius dengan menunjukkan secara eksperimental sifat biologisnya termasuk pemulungan radikal bebas [26], reno-protection [27], neuro-protection [28], imunomodulator [19], anti-inflamasi [29], anti-lipotoksisitas [30], dan agregasi antiplatelet [31] hanya untuk menyebutkan tetapi sampel.

Sebelumnya, efek penurun glukosa dan perlindungan pankreas dari APLE ditunjukkan secara eksperimental pada tikus diabetes yang diinduksi STZ/nicotinamide untuk mengkonfirmasi penggunaannya sebagai obat tradisional antidiabetes oleh masyarakat lokal di wilayah barat Ghana [1]. Namun, mekanisme yang mendasari efek penurun glukosa dan perlindungan pankreas dari APLE masih kurang dijelaskan. Saat ini, mekanisme yang mendasari efek penurun glukosa dan perlindungan pankreas dari APLE seperti modulasi insulin, glukagon, dan GLP-1, penghambatan aktivitas enzimatik -amilase, dan -glukosidase, pembersihan radikal bebas, dan pemulihan kerusakan sel pankreas dan nekro-apoptosis ditunjukkan secara in vivo dan in vitro.

2. Bahan-bahan dan metode-metode

2.1. Obat-obatan dan Bahan Kimia. Alloxan monohydrate(Sigma-Aldrich Co., St.Louis, MO, USA), nicotinamide(Sigma-Aldrich Co., St.Louis, MO, USA), acarbose (LGM Pharma, USA), metformin (Bristol Laboratory Ltd.) , asam galat (Merck KGaA, USA), rutin(Acros organics, USA), asam askorbat (Carl Roth, Jerman), quercetin(Alfa Aesar, UK), p-nitrophenyl glucopyranoside (pNPG)(BBI Biotech, China), Tikus Kit ELISA insulin, kit Glukagon-ELISA Tikus, dan kit ELSA GLP-1 Tikus (Wuxi Donglin Sci & Tech Development Co.Ltd, Cina) digunakan dalam penelitian ini. Semua pelarut dan bahan kimia lain yang digunakan dalam penelitian ini adalah kelas analitis.

2.2. Koleksi, Identifikasi, dan Otentikasi Daun Abrus precatorius. Daun segar A. precatorius dikumpulkan dari lahan pertanian yang tidak diolah di Sefwi Asawinso'A' (Distrik Bibiani-Ahwiaso-Bekwai, Wilayah Barat, Ghana). Daun diidentifikasi dan disahkan oleh ahli botani yang memenuhi syarat di unit herbarium, School of Biological Sciences, University of Cape Coast, di mana spesimen voucher (CC3366) disimpan seperti yang dilaporkan sebelumnya [1].

2.3.Persiapan Ekstrak Daun Abrus precatorius (APLE). APLE disiapkan menurut metode sebelumnya [1]. Secara singkat, daun kering naungan A. precatorius digiling secara mekanis menjadi bubuk halus. Daun bubuk disimpan dalam wadah plastik kedap udara sebelum digunakan. Serbuk daun sebanyak 120 gram direndam dalam 700 mL etanol selama 48 jam dan ditutup dengan kain tipis. Campuran diaduk minimal 3 kali sehari. Pada hari kedua, campuran disaring melalui kertas saring yang dipasang pada corong Buchner. Filtrat dipisahkan dengan menggunakan rotary evaporator yang dipasang pada penangas air. Setelah mengambil etanol menggunakan rotavapor, cairan sirup hijau tua yang dihasilkan dikeringkan dalam desikator selama beberapa minggu meninggalkan ekstrak padat hijau tua. Ekstrak diberi label dan disimpan dalam desikator sebelum digunakan. APLE terus disiapkan untuk mendapatkan jumlah yang cukup untuk semua percobaan.

2.4.FitokimiaPenyaringan APLE.APLE disaring untuk keberadaan senyawa fitokimia seperti yang dilaporkan sebelumnya [1]. 2.5.Penentuan Total Phenolic Content (TPC) dalam APLE. Kandungan total fenolik dalam APLE ditentukan dengan menggunakan metode reagen Folin Ciocalteu seperti yang dijelaskan sebelumnya [32] dengan sedikit modifikasi. Konsentrasi encer APLE 250μL 1mg/mL）dicampur dengan 750μL reagen Folin Ciocalteu（1 dalam 10 pengenceran dengan air） dan 750μL 7 persen Na, CO. Campuran kemudian dicukupkan hingga 5mL dengan air suling dan diinkubasi pada suhu kamar selama 2 jam untuk perkembangan warna. Absorbansi kemudian diukur pada 765 nm dengan menggunakan spektrofotometer (UV-vis, T70 PG Instruments). Setelah pembuatan kurva standar asam galat (0-300ug/mL), TPC dalam APLE diekstrapolasi dari kurva kalibrasi asam galat dan dinyatakan dalam setara asam galat (GAE). Semua percobaan dilakukan dalam rangkap tiga.

2.6.Penentuan Kandungan Flavonoid Total (TFC) dalam APLE. Kandungan flavonoid total dalam APLE diukur per metode yang dijelaskan sebelumnya [33] dengan beberapa modifikasi. Secara singkat, 500μL ekstrak tumbuhan Abrus precatorius 1 mg/mL）dibuat dalam 50 persen etanol dicampur dengan 500 L 10 persen aluminium klorida（AlCl,.6H,O） dan 1500μL 10 persen natrium asetat(NAC,H,O ,.3H,O). Campuran reaksi diinkubasi pada suhu kamar selama 40 menit, dan absorbansi diukur pada 415 nm menggunakan spektrofotometer (UV-vis, T70 PG Instruments). Setelah persiapan kurva kalibrasi rutin standar (0-250ug/mL), TFC dalam APLE diekstrapolasi dari kurva kalibrasi rutin dan dinyatakan dalam ekuivalen rutin (RE). Semua percobaan dilakukan dalam rangkap tiga.

2.7. Persetujuan Etis. Semua protokol yang melibatkan hewan pada awalnya ditinjau dan disetujui oleh Dewan Peninjau Institusional Universitas Sains dan Teknologi Kwame Nkrumah (KNUST) tentang Eksperimen Hewan (FPPS/PCOL/006/2019). Selain itu, eksperimen yang melibatkan tikus dilakukan sesuai dengan Arahan Uni Eropa (2010/63/EU) tentang penggunaan dan perawatan hewan dalam eksperimen ilmiah. Penderitaan hewan dan jumlah hewan dikurangi sebanyak mungkin untuk memenuhi persyaratan dalam rekomendasi 3R (Refinement, Replacement, and Reduction) [34].

2.8. Akuisisi dan Perawatan Hewan Percobaan. Tikus Sprague-Dawley dewasa berumur 7-8-minggu yang sehat dari kedua jenis kelamin (beratnya antara 120 dan 180g) dibeli dari Institut Penelitian Medis Noguchi (NMRI), Universitas Ghana. Tikus kemudian diangkut ke Rumah Hewan Departemen Ilmu Biomedis, Universitas Cape Coast, Cape Coast, Ghana. Tikus ditempatkan di kandang stainless (34cm × 47cm × 18cm) dengan serutan kayu kering sebagai alas tidur, diberi makan dengan chow hewan pengerat normal (GAFCO, TEMA), dan memiliki akses tidak terbatas ke air. Tikus dipelihara dalam kondisi suhu, kelembaban, dan siklus gelap/terang normal. Namun, kondisi ini bervariasi sesuai dengan persyaratan khusus dari beberapa percobaan. Tikus diizinkan untuk membiasakan diri di bawah kondisi lingkungan dan laboratorium ini selama lebih dari dua minggu sebelum digunakan dalam percobaan.

2.9.Pembentukan Diabetes Mellitus yang Diinduksi Aloksan/Nicotinamide pada Tikus. Diabetes mellitus eksperimental didirikan pada tikus Sprague-Dawley dewasa normoglikemik yang dipuasakan semalaman menurut metode yang dijelaskan sebelumnya [1, 35] dengan beberapa modifikasi. Secara singkat, tikus secara berurutan disuntik dengan nikotinamida (48 mg/kg; IP) yang dilarutkan dalam larutan garam normal dan dipelihara di atas es; kemudian, 15 menit kemudian, aloksan (120mg/kg; ip) dilarutkan dalam 100 mM larutan buffer sitrat (pH4.5) diberikan kepada tikus setiap hari selama 7 hari. Selanjutnya, tikus diberi larutan glukosa 5 persen (5 mL/kg; PO) setiap hari selama 7 hari. Untuk memastikan terjadinya hiperglikemia pada tikus, darah diambil dari tikus yang dipuasakan semalaman 3-7 hari pasca-Alloxan/nicotinamide dan 5 persen perawatan glukosa menggunakan metode amputasi ujung ekor. Ekor tikus dibersihkan terlebih dahulu dengan kapas steril yang dicelupkan ke dalam etanol 10 persen. Glukosa darah puasa (FBG) diukur dengan menggunakan glukometer URIT G26 (URIT Medical Electronic Co., Ltd.).

2.10.Experimental Design. A curative rather than prophylactic treatment approach was adopted in this study, where after the establishment of experimental diabetes mellitus in rats, diabetic rats were subjected to various treatments. Figure 1 shows an outline of experiments carried out in this study. Rats having consistent FBG(11.1 mmol/L or >250mg/dL) pada beberapa pengukuran dianggap menderita diabetes mellitus (hiperglikemia) [1,35]. Tikus diabetes yang dikonfirmasi secara acak dibagi menjadi lima kelompok. Tikus kontrol tidak terpajan aloksan; sebagai gantinya, mereka diberi garam normal. Semua kelompok diperlakukan untuk jangka waktu 18 hari seperti yang ditunjukkan di bawah ini:

Kontrol: salin normal (5 mL/tikus/hari; po) ditambah makanan hewan pengerat ditambah air

Model: nicotinamide (48mg/kg ip) plus Alloxan(120mg/kg;ip) plus chow hewan pengerat plus air

Metformin: nicotinamide (48mg/kg; ip) ditambah Alloxan (120 mg/kg; ip) ditambah metformin (300mg/kg; po) ditambah chow hewan pengerat ditambah air

APLE(100 mg/kg): nicotinamide(48 mg/kg; ip) ditambah Alloxan (120mg/kg; ip) ditambah APLE(100mg/kg; po) ditambah makanan hewan pengerat ditambah air

APLE (200 mg/kg): nicotinamide (48 mg/kg; ip) ditambah Alloxan (120mg/kg; ip) ditambah APLE (200mg/kg; po) ditambah makanan hewan pengerat ditambah air

APLE(400 mg/kg):nicotinamide(48 mg/kg; ip) ditambah Aloxan (120mg/kg; ip) ditambah APLE(400mg/kg po) ditambah makanan hewan pengerat ditambah air

2.11. Pengukuran Berat Badan.Berat badan tikus diukur sebelum dimulainya semua percobaan hewan. Selanjutnya, bobot badan tikus pada semua kelompok diukur setiap 3 hari selama 18 hari. Dosis disesuaikan untuk mencerminkan perubahan berat badan setiap 3 hari. Akhirnya, berat badan tikus di semua kelompok diukur sebelum pengorbanan mereka.

2.12. Pengambilan Darah, Pembuatan Sera, dan Isolasi Organ.Setelah menimbang tikus pada hari ke 18, tikus dikorbankan dengan anestesi kloroform dalam. Sampel darah dikumpulkan melalui tusukan jantung dan kemudian dibagikan ke dalam tabung vacutainer kosong berlabel. Sampel darah yang representatif untuk setiap kelompok disentrifugasi pada 3000rpm (Eppendorf centrifuge 5702,4 derajat) selama 5 menit. Untuk mendapatkan serum, supernatan dikumpulkan ke masing-masing tabung sampel berlabel. Hati, limpa ginjal, dan pankreas dipanen, baru ditimbang, dan difiksasi dalam formalin 10 persen.

2.13.Pengukuran Serum Insulin, Glukagon, dan GLP-1.Kadar insulin serum, glukagon, dan GLP-1, masing-masing, diukur dengan menggunakan ELISA insulin tikus (Wuxi Donglin Sci & Tech Development Co. Ltd, Cina), ELISA glukagon tikus (Wuxi Donglin Sci & Tech Development Co.Ltd. , China), dan rat GLP-1 ELISA(Wuxi Donglin Sci & Tech Development Co.Ltd., China) secara ketat sesuai dengan instruksi pabrik.

2.14.Penentuan Luas Median Pulau Langerhans Pankreas.Setelah pemrosesan histologis dari pankreas yang representatif, fotomikrograf yang dihasilkan untuk masing-masing kelompok dipindai dengan menggunakan kamera lensa mata Amscope MD35 seperti yang dijelaskan sebelumnya[1]. Setiap fotomikrograf diunggah ke Adobe photoshop CS6 dan kemudian ditumpangkan pada kisi stereologis. Jumlah persimpangan di atas stroma pulau pankreas dihitung. Luas penampang pulau pankreas Langerhans dari perwakilan pankreas ditentukan dengan menggunakan metode Cavalieri dan penghitungan titik [36]. Luas penampang ditentukan dengan rumus:

di mana

A mewakili luas penampang pulau-pulau Langerhans pankreas

XP mewakili jumlah total persimpangan di atas stroma pulau pankreas

a/p mewakili area per titik dari kisi stereologis M mewakili perbesaran linier.

2.15. Ekstraksi -Amylase dari Pankreas Guinea Pig.Setelah 20 jam kelaparan, seekor marmot dikorbankan dengan anestesi yang dalam, dan pankreasnya diangkat melalui pembedahan. Pankreas dipangkas bebas dari lemak dan jaringan lain dan segera dicuci dalam buffer natrium fosfat (pH7.4). Setelah ditimbang, pankreas disimpan dalam freezer pada suhu 4 derajat. Pankreas yang telah beku kemudian dihomogenkan (1g pankreas: 5 mL buffer) dengan buffer natrium fosfat 0,1 M dingin (pH 7,4) dengan menggunakan homogenizer (WiseTis HG-15D homogenizer) dan kemudian disentrifugasi pada 4400rpm selama 30 menit pada 4 derajat. Supernatan dipipet ke dalam tabung microfuge terpisah dan disimpan dalam freezer pada suhu -20 . Untuk mengkonfirmasi enzim yang diekstraksi (-amilase), sebuah -amilase yang tersedia secara komersial dibandingkan dengan enzim yang diekstraksi (-amilase) menggunakan pati dan yodium. Pingsan atau hilangnya warna biru-hitam dianggap sebagai indikasi aktivitas -amilase dibandingkan dengan pengaturan kontrol (tidak ada enzim ditambah pati ditambah yodium) di mana ada warna biru-hitam pekat.

2.16.Pengaruh APLE terhadap Aktivitas Enzim -Amilase.Penghambatan aktivitas enzim alfa ( )-amilase diuji per metode sebelumnya [37] dengan beberapa modifikasi. Secara singkat, APLE(125uL) atau acarbose pada konsentrasi yang meningkat (100-1500 ug/mL) ditambahkan ke satu set tabung reaksi berlabel yang mengandung 125 uL larutan -amilase dalam 20mM buffer natrium fosfat (pH6,9). Campuran APLE atau acarbose/-amilase diinkubasi pada 25 derajat selama 10 menit. Selanjutnya, 125 uL pati 1 persen (disiapkan dalam buffer fosfat 20mM, pH=6.9) ditambahkan pada interval waktu yang dipilih. Campuran reaksi dalam setiap kasus diinkubasi pada 25 derajat selama 10 menit. Pemutusan setiap reaksi dilakukan pada selang waktu tertentu dengan menambahkan 250uL pereaksi 3,5-asam dinitrosalisilat (DNSA) dan selanjutnya dipanaskan dalam penangas air pada suhu 100 derajat C selama 5 menit, kemudian dibiarkan dingin hingga suhu kamar. Setiap reaksi dibuat hingga 2.5mL dengan air suling dan absorbansi diukur pada 540 nm menggunakan spektrofotometer (UV-vis, T70 PG Instruments). Sebuah set-up kontrol disiapkan menggunakan prosedur yang sama kecuali bahwa -amilase diinkubasi dengan air suling bukan APLE. Aktivitas penghambatan Alpha( )-Amylase dihitung sebagai berikut:

2.17. Cara Penghambatan Aktivitas Enzim -Amylase oleh APLE.Modus penghambatan aktivitas enzim -amilase oleh APLE dilakukan per metode sebelumnya [38] dengan beberapa modifikasi. Secara singkat, 125 L APLE（5mg/mL） pertama kali diinkubasi dengan 125 uL larutan -amilase dalam 20mM fosfat pada 25 derajat selama 10 menit dalam satu set tabung reaksi berlabel. Setelah itu, 125uL larutan kanji pada berbagai konsentrasi (0.3-5 mg/mL) ditambahkan ke dalam campuran reaksi untuk

memulai reaksi. Campuran reaksi kemudian diinkubasi pada 25 derajat selama 10 menit sebelum penambahan 250uL 3,5-asam dinitrosalisilat (DNSA) untuk menghentikan reaksi. Jumlah produk yang terbentuk diuji dengan mengukur absorbansi pada panjang gelombang 540nm menggunakan spektrofotometer (UV-vis, T70 PG Instruments). Prosedur ini diulangi untuk pengaturan kontrol dengan prainkubasi -amilase dengan buffer, bukan APLE. Plot Lineweaver-Burk dari plot Michaeles-Menten dilakukan dengan menggunakan Graph-Pad prisma versi 8 (Graph Pad Software, San Diego, CA, USA) untuk estimasi Km dan Vmax. Modus penghambatan aktivitas enzim -amilase oleh APLE disimpulkan dari perkiraan Km dan Vmax.

2.18. Ekstraksi -Glucosidase dari Usus Kecil Guinea Pig.Ekstraksi -glukosidase dari usus babi guinea dilakukan menurut metode sebelumnya [39] dengan beberapa modifikasi. Secara singkat, guinea pig pertama kali dibiarkan kelaparan selama 20 jam dan kemudian dikorbankan dengan anestesi yang dalam. Usus halus yang terletak tepat di atas sekum dan tepat di bawah duodenum diangkat melalui pembedahan dan dibilas secara menyeluruh dalam buffer natrium fosfat 0,02 M (pH6,9) sedingin es sebelum dicelupkan ke dalam larutan buffer segar. Pada proporsi 1g usus-ne:5 mL buffer, usus terisolasi dihomogenisasi (WiseTis HG-15D homogenizer, Jerman) pada 4400rpm selama 10 menit pada penghentian intermiten 2 menit di atas es. Homogenat disentrifugasi (sentrifuge Eppendorf 5430R) selama 30 menit pada suhu 4 derajat dan supernatan dipanen dengan hati-hati. Aliquots dimasukkan ke dalam cryotube 2mL dan disimpan pada-20 derajat untuk segera digunakan dalam percobaan. Untuk mengkonfirmasi enzim yang diekstraksi ( -glucosidase), -glucosidase yang tersedia secara komersial di-benchmark dengan enzim yang diekstraksi (a-glucosidase） dengan menginkubasi 50μL 3mM p-nitrophenyl glucopyranoside（pNPG） dengan 25 L -glucosidase yang tersedia secara komersial atau 25 L enzim yang diekstraksi a-glukosidase) pada 25 derajat . Pengamatan produk p-nitrofenol kuning setelah 5 menit dalam setiap kasus dianggap sebagai konfirmasi aktivitas -glukosidase.

2.19.Pengaruh APLE terhadap Aktivitas Enzim -Glukosidase.Efek penghambatan APLE dan acarbose (penghambat -glukosidase standar) dinilai berdasarkan metode sebelumnya [40]dengan beberapa modifikasi. Secara singkat, buffer fosfat (20mM;pH=6.9) digunakan untuk membuat p-nitrofenil glukopiranosa (pNPG) (substrat untuk -glukosidase). Dalam percobaan terpisah, a-glukosidase（50 L） diinkubasi dengan peningkatan konsentrasi APLE（25μL dalam setiap kasus）, acarbose, atau buffer selama 10 menit dalam setiap kasus. Setelah itu, 25uL 3mM p-nitrophenyl glucopyranoside ditambahkan ke campuran APLE/a-glucosidase atau acarbose/a-glucosidase untuk memulai reaksi. Campuran reaksi dalam setiap kasus diinkubasi pada 25 derajat selama 20 menit. Setelah 20 menit inkubasi, reaksi dihentikan dengan menambahkan 0,1 M Na,CO,(1 mL). Kontrol disiapkan dengan menggunakan prosedur yang sama kecuali bahwa -glukosidase diinkubasi dengan buffer, bukan APLE atau acarbose. Produk reaksi (p-nitrofenol berwarna kuning) setelah penghentian reaksi diukur dengan menggunakan spektrofotometer (Instrumen UV-vis, T70 PG) pada 405 nm untuk penentuan aktivitas -glukosidase. Hasilnya dinyatakan sebagai persentase dari kontrol. Dalam setiap kasus, percobaan diulang tiga kali. Persentase ( persen ) penghambatan aktivitas -glukosidase diperkirakan menggunakan rumus:

2.20. Cara Penghambatan -Glucosidase oleh APLE.Modus penghambatan aktivitas enzim -glukosidase oleh APLE dilakukan sesuai dengan prosedur sebelumnya [41] dengan beberapa modifikasi. Secara singkat, dalam satu set tabung reaksi, tepat 25 L 5 mg/mL APLE diprainkubasi dengan larutan -glukosidase（50 L） pada 25 derajat selama 10 menit. Pada tabung set kedua, a -glukosidase diinkubasi dengan 50 L buffer fosfat 20mM（pH=6.9）. Kemudian, 25uL p-nitrophenyl glucopyranoside (PNP) pada konsentrasi yang bervariasi (0.3-3.0 mg/mL) ditambahkan ke kedua set tabung reaksi untuk memulai reaksi. Campuran reaksi kemudian diinkubasi pada 25 derajat selama 20 menit setelah itu Na, CO, 1000μL） ditambahkan untuk menghentikan reaksi. Jumlah produk yang dilepaskan diukur secara spektrofotometri menggunakan kurva standar p-nitrofenol dan diubah menjadi kecepatan reaksi, (v). Plot timbal balik ganda (1/v melawan 1/S) di mana S adalah konsentrasi substrat diplot. Cara penghambatan aktivitas -glukosidase oleh APLE ditentukan dengan analisis plot Line weaver-Burk.

2.21. Penilaian 2,2-Difenil-1-Picrylhydrazy(DPPH)Aktivitas Pemulungan Radikal.Aktivitas scavenging radikal DPPH dilakukan menurut metode sebelumnya [42] dengan beberapa modifikasi. Secara singkat, campuran reaksi 2mL dibuat dengan mencampurkan DPPH(1.0 mL dari 0.135mM) yang dibuat dalam metanol dan 1.0mL berbagai konsentrasi APLE (40,80,120,160 , dan 200 ug/mL) atau asam askorbat. Campuran reaksi dikocok kuat-kuat dan dibiarkan di tempat gelap pada suhu kamar selama 30 menit. Absorbansi diukur (UV-vis, T70 PG Instruments) pada 517nm terhadap blanko. Semua tes dilakukan dalam rangkap tiga. Jumlah yang sama dari larutan metanol dan DPPH berfungsi sebagai kontrol. Aktivitas penangkal radikal DPPH diperkirakan dengan menggunakan rumus:

2.22.Nitric Oxide (NO) Radical Scavenging Assay.NO aktivitas scavenging radikal APLE dan standar diperkirakan menggunakan reaksi Griess Illosvory seperti yang dijelaskan sebelumnya [43] dengan beberapa sedikit modifikasi. Secara singkat, reagen Griess Ilosvory menggunakan 0,1 persen (b/v) naphthyl ethylene diamine dihydrochloride alih-alih 5 persen 1-naphthyl amine. Memvariasikan konsentrasi

({{{{10}}}}ug/mL) dari APLE dan standar (asam galat dan asam askorbat) disiapkan dan dibuat hingga 167uL ditempatkan dalam tabung reaksi berlabel, dan kemudian, 667 uL 10mM natrium nitroprusside ditambahkan. Buffer natrium fosfat (167uL, pH7.4) kemudian ditambahkan, dan campuran diinkubasi pada 25 derajat selama 150 menit. Setelah itu, ditambahkan 2000 L reagen asam sulfanilat (0,33 persen dalam 20 persen asam asetat glasial) dan didiamkan selama 5 menit untuk menyelesaikan reaksi diazotisasi. Akhirnya, 2000μL lebih lanjut 0,1 persen naptil etilena diamina dihidroklorida ditambahkan, dicampur, dan kemudian didiamkan selama 30 menit pada 25 derajat. Konsentrasi nitrit diukur (UV-vis, T70 PG Instrumen) pada 546nm dan dihitung dengan larutan nitrat kontrol yang tidak memiliki APPLE/atau standar tetapi memiliki semua komponen lain dari campuran reaksi. Buffer natrium fosfat digunakan sebagai larutan blanko. Persentase ( persen ) NO kemampuan mengais APLE dan standar dihitung dengan menggunakan rumus:

di mana Ac adalah absorbansi kontrol dan At adalah absorbansi uji (APLE/standar).

2.23.Pengujian Kapasitas Antioksidan Pengurang Besi (FRAC).FRAC diuji berdasarkan metode sebelumnya [44] dengan sedikit modifikasi. Secara singkat, reaksi terdiri dari 250uL APLE/larutan standar pada konsentrasi yang berbeda (12.5-200ug/mL), 625 uL buffer natrium fosfat(0.2M pada pH6,6 ), dan 625 uL 1 persen kalium ferri sianida, [K,Fe(CN)] ke dalam berbagai tabung reaksi. Ini diinkubasi selama 20 menit pada 50 derajat untuk menyelesaikan reaksi. Kemudian, 625uL larutan asam trikloro asetat (TCA) 10 persen ditambahkan ke dalam tabung reaksi. Campuran total disentrifugasi pada 3000rpm selama 10 menit, setelah itu diambil 1800 uL supernatan dan dicampur dengan 1800 L air suling. Setelah itu, 360 L larutan besi klorida 0,1 persen (FeCl), ditambahkan dan dicampur secara menyeluruh. Absorbansi larutan diukur pada 700nm menggunakan spektrofotometer (UV-vis, T70 PG Instruments) terhadap blanko reaksi. Larutan blanko tipikal yang mengandung campuran larutan yang sama tanpa APLE/atau quercetin diinkubasi dalam kondisi yang sama. Peningkatan absorbansi campuran reaksi menunjukkan peningkatan kapasitas reduksi. Percobaan diulang tiga kali pada setiap konsentrasi. FRAC diukur sebagai quercetin setara (QE).

2.24. Estimasi ICs dan ECs0 Untuk menentukan IC dan ECsoof APLE masing-masing dengan antioksidan, penangkap radikal bebas, dan efek penghambatan pada aktivitas enzim -amilase dan -glukosidase, serangkaian peningkatan konsentrasi APLE diuji terhadap masing-masing kegiatan. Setelah mengubah konsentrasi menjadi logout diplot pada sumbu horizontal terhadap persen aktivitas maksimal (antioksidan, penangkal radikal bebas, dan efek penghambatan pada aktivitas enzim -amilase dan a-glukosidase) pada sumbu vertikal. Konsentrasi APLE yang menghasilkan 50 persen aktivitas maksimal (antioksidan,

scavenging radikal bebas, dan efek penghambatan pada aktivitas enzim -amilase dan a-glukosidase) diuji ditentukan secara grafis menggunakan perangkat lunak statistik GraphPad prisma versi 8.

2.25. Analisis statistik.Data yang diperoleh disajikan sebagai mean±SD. Analisis statistik dilakukan dengan menggunakan Graph Pad Prism Versi 8 untuk Windows (Graph Pad Software, San Diego, CA, USA). Perbandingan rata-rata antar kelompok dilakukan dengan menggunakan one way analysis of variance (ANOVA) dilanjutkan dengan uji komparasi ganda Tukey. P Kurang dari atau sama dengan 0.05 dianggap signifikan secara statistik dalam semua analisis.

Artikel ini disarikan dari Hindawi BioMed Research International Volume 2021, ID Artikel 9920826, 17 halaman https://doi.org/10.1155/2021/9920826