Mutasi KLHL3 Homozigot Baru Sebagai Penyebab Pseudohipoaldosteronisme Resesif Autosomal Tipe II Didiagnosis di Akhir Kehidupan
Nov 02, 2023
Pendahuluan Abstrak:
Pseudohypoaldosteronism tipe II (PHA II) adalah kelainan Mendel, yang ditandai dengan asidosis hiperkalemik dan kadar renin plasma rendah, biasanya berhubungan dengan hipertensi. Mutasi pada WNK1, WNK4, CUL3, dan KLHL3 menyebabkan PHA II, dengan mutasi dominan pada WNK1, WNK4, dan CUL3 serta mutasi dominan atau resesif pada KLHL3. Empat belas keluarga dengan mutasi KLHL3 resesif telah dilaporkan, dengan diagnosis pada usia 3 bulan hingga 56 tahun, biasanya pada individu dengan fungsi ginjal normal.
Metode: Kami melakukan penyelidikan klinis dan genetik pada pasien dengan hipertensi hiperkalemia dan menggunakan simulasi dinamika molekuler, ekspresi heterolog dalam sel COS7, dan Western blotting untuk menyelidiki efek mutasi kandidat penyakit KLHL3 terhadap ekspresi protein WNK4.
KLIK DI SINI UNTUK MENDAPATKAN FORMULASI HERBAL CISTANCHE UNTUK GINJAL
Hasil: Pasien, seorang wanita berusia 58-tahun dari keluarga sedarah, menunjukkan hipertensi, asidosis hiperkalemik persisten yang berhubungan dengan nyeri otot parah, nefrolitiasis, penyakit ginjal kronis (CKD), dan penyakit jantung koroner. Terapi dengan hidroklorotiazid mengoreksi hiperkalemia, hipertensi, dan nyeri otot. Analisis genetik menunjukkan mutasi p.Arg431Trp homozigot pada posisi KLHL3 yang sangat terpelihara. Simulasi menunjukkan berkurangnya stabilitas protein mutan, yang dikonfirmasi oleh Western blot. Dibandingkan dengan KLHL3 tipe liar, kotransfeksi p.Arg- 431Trp KLHL3 menyebabkan peningkatan kadar protein WNK4, yang diduga menyebabkan peningkatan reabsorpsi NaCl melalui pembawa sensitif thiazide dan PHA II.
Kesimpulan: Bahkan pada pasien yang datang pada usia lanjut dan dengan adanya CKD, PHA II harus dicurigai jika kadar renin rendah dan asidosis hiperkalemik serta hipertensi tidak memadai untuk stadium CKD, terutama jika terdapat riwayat keluarga yang mencurigakan.
Perkenalan
Hipertensi arteri sistemik mempengaruhi lebih dari 1,1 miliar orang dewasa di seluruh dunia [1] dan dianggap sebagai faktor risiko terpenting yang dapat dimodifikasi untuk semua penyebab morbiditas dan mortalitas di seluruh dunia [2]. Sekitar 90% pasien dewasa menderita hipertensi primer atau esensial dengan etiologi gen-lingkungan multifaktorial [2], sedangkan penyebab hipertensi dapat diidentifikasi pada sisanya. Penyebab umum hipertensi sekunder adalah aldosteronisme primer, apnea tidur obstruktif, penyakit ginjal parenkim, dan stenosis arteri ginjal [3]. Dalam kasus yang jarang terjadi, hipertensi diturunkan sebagai sifat monogenik. Pasien yang terkena biasanya datang dengan kadar renin plasma yang rendah, sedangkan kadar aldosteron dan elektrolit bervariasi tergantung pada etiologi yang mendasarinya [4]. Bentuk hipertensi Mendel sering bermanifestasi pada masa kanak-kanak atau remaja. Orang dewasa jarang diperiksa untuk hipertensi monogenik; dengan demikian, prevalensinya pada populasi umum masih belum diketahui. Dalam kohort yang dipilih (kriteria inklusi setidaknya satu dari: usia saat onset Kurang dari atau sama dengan 35 tahun, hipertensi resisten, hipertensi dengan kelainan elektrolit, kelainan hormonal, hasil pencitraan abnormal, atau tanda-tanda klinis yang sugestif), 37 kandidat gen disaring, dan varian patogen atau kemungkinan patogen diidentifikasi pada 33 dari 1.179 kasus (2,8%) [5].
Penelitian ini berfokus pada pseudohypoaldosteronism tipe II (PHA II), suatu bentuk hipertensi Mendel yang ditandai dengan asidosis hiperkalemik dan kadar renin plasma yang rendah [6]. PHA II juga dikenal sebagai hipertensi hiperkalemik familial. Penyakit ini pertama kali dideskripsikan pada tahun 1964 oleh Paver dan Pauline pada seorang laki-laki muda dengan hipertensi berat dan hiperkalemia meskipun fungsi ginjalnya normal [7] yang selanjutnya dikarakterisasi oleh Stokes dan rekannya [8] dan Arnold dan Healy [9] dan terbukti mempunyai efek samping yang rendah. renin plasma. Mengikuti laporan seorang gadis berusia 10-tahun dengan perawakan pendek, hipertensi, hiperkalemia berat, Acidemia ringan, kelumpuhan periodik, dan penekanan renin pada tahun 1970 oleh Gordon dkk. [10], sindrom ini juga kadang-kadang disebut sebagai sindrom Gordon.
Pada tahun 2001, mutasi pada gen serine-treonin kinase tanpa lisin (WNK) WNK1 dan WNK4 diidentifikasi sebagai penyebab PHA II [11], dan mutasi lebih lanjut pada KLHL3 (pengkodean kelch-like 3) dan CUL3 (pengkodean kelch-like 3) dan CUL3 (pengkodean kelch-like 3) gen cullin 3) dideskripsikan pada tahun 2012 [12, 13]. Subbentuk PHA II yang disebabkan oleh mutasi pada WNK1, WNK4, dan CUL3 adalah kelainan autosomal dominan, sedangkan mutasi KLHL3 dapat diwariskan baik secara autosomal dominan atau resesif autosomal. KLHL3 memiliki fitur domain BTB terminal-N, diikuti oleh domain BACK dan struktur baling-baling enam bilah terminal-C yang terdiri dari apa yang disebut pengulangan mirip kelch (ditunjukkan pada Gambar 1d, 2a). Mutasi KLHL3 yang dominan berkelompok di dalam atau di antara bilah baling-baling, sedangkan mutasi resesif didistribusikan ke seluruh protein [12]. Kasus resesif lebih jarang terjadi dibandingkan kasus dominan; secara total, 21 pasien dari 14 keluarga dengan mutasi KLHL3 resesif telah dipublikasikan [12-15] (Tabel 1).
Patofisiologi yang mendasari hipertensi pada PHA II adalah peningkatan reabsorpsi NaCl melalui pembawa sensitif thiazide (Na-Cl cotransporter, NCCT) di tubulus kontortus distal ginjal, dan terapi dengan thiazide memperbaiki hipertensi dan kelainan elektrolit pada pasien dengan PHA II. [16]. Singkatnya, WNK1 dan WNK4 memfosforilasi OSR1 (gen 1 yang responsif terhadap stres oksidatif) dan SPAK (kinase kaya prolin-alanin terkait Ste20-), yang kemudian memfosforilasi dan mengaktifkan NCCT [17, 18]. KLHL3 adalah adaptor substrat dari ubiquitin ligase CUL3; kompleks KLHL3-CUL3 melakukan ubiquitinylate kinase WNK dan dengan demikian mendorong degradasinya [19]. Hilangnya fungsi ligase ubiquitin atau gangguan pengikatan terhadap kinase WNK menyebabkan peningkatan kelimpahan WNK, peningkatan fosforilasi NCCT [18], dan peningkatan penyerapan NaCl di tubulus berbelit-belit distal. Pada segmen nefron selanjutnya, reabsorpsi NaCl melalui ENaC (saluran natrium epitel) dan sekresi K+ melalui ROMK (saluran kalium medula luar ginjal) berkurang [20, 21]. Tikus knockout KLHL3 menunjukkan hipoplasia tubulus berbelit-belit distal, peningkatan kadar WNK1 dan WNK4 yang sangat tinggi, dan peningkatan fosforilasi OSR1, SPAK, dan NCC di ginjal. Selanjutnya, mereka menunjukkan hiperkalemia, hiperkloremia, dan asidosis metabolik [22]. Di sini, kami melaporkan pasien dengan PHA II resesif autosomal dan mengkarakterisasi mutasi genetik dan patofisiologi yang mendasarinya
Bahan dan metode
Persiapan DNA dan Pengurutan Sanger DNA dibuat dari sampel darah vena perifer menggunakan QIAamp DNA Blood Maxi Kit (Qiagen) sesuai dengan instruksi pabrik. PCR standar dan pengurutan DNA genom Sanger dua arah langsung dilakukan menggunakan primer yang diterbitkan untuk KLHL3 (13), WNK1, dan WNK4 (11), dan CUL3_9F (5′-AGGAGACACTTTCTCAAACCG-3′) dan primer CUL3_9R (5′-TGTTCTTCTCCAAAACAATCTACC-3′) untuk CUL3. Urutan sanger dilakukan di Eurofins Genomics.
Penyelarasan Urutan
Urutan protein homolog diidentifikasi menggunakan NCBI Protein BLAST (//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) dan database eggNOG (//eggnogdb.embl.de). Urutan yang ditampilkan termasuk KLHL3 manusia dan ortolognya: Homo sapiens (NP_059111.2), Mus musculus (NP_001349344.2), Gallus gallus (XP_015149442.1), Danio rerio (XP_021328460.1), Ciona usus (XP_009862126.1), Drosophila melanogaster (NP_724095.1), dan Caenorhabditis elegans (NP_001254310.1) . Paralog manusia diidentifikasi melalui penelitian literatur dan mencakup KLHL1 hingga KLHL42 seperti yang ditunjukkan pada Tabel 1 tambahan online (untuk semua materi tambahan online, lihat www.karger.com/doi/10.1159/000521626) [23]. Urutan diselaraskan menggunakan Jalview versi 2.10.5 [24]. Struktur domain berasal dari UniProt (Q9UH77, diakses pada 13 April 2021) dan divisualisasikan menggunakan DOG [25].
Plasmid dan Mutagenesis Terarah Situs
Plasmid pTRE2hyg WNK4 dan pFN21A KLHL3 adalah hadiah baik dari Dr. Shinichi Uchida (Universitas Kedokteran dan Gigi Tokyo). Untuk memperkenalkan mutasi p.R431W, primer dirancang menggunakan Primer X (https://www.bioinformatics.org/primerx): 5′- GATGAACACGCGGTGGAGCAGTGTGG -3′ (KLHL3_ R431W{{10} }F) dan 5′- CCACACTGCTCCACCGCGTGTTCATC -3′ (KLHL3_R431W_1R). Residu mutan ditampilkan dalam huruf tebal. Mutagenesis terarah-situs dilakukan menggunakan Kit Mutagenesis Terarah-Situs QuikChange dengan Polimerase DNA Fidelitas Tinggi PfuUltra (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) sesuai dengan instruksi pabrik. CDNA tersebut diurutkan Sanger di Eurofins Genomics. Plasmid disiapkan menggunakan QIAGEN Plasmid Plus Maxi Kit.
Kultur Jaringan, Transfeksi Sementara, dan Western Blot
Sel COS7 dikultur dalam DMEM + L-glutamin, 10% FBS, dan 1% penisilin/streptomisin (semua Gibco, Thermo Fisher). Untuk transfeksi, sel diunggulkan pada 6-pelat sumur dengan kepadatan 1,9 × 105 sel/sumur dan ditanam hingga kepadatan sekitar 90%. Sel ditransfeksi dengan 1 µg pTRE2hyg WNK4 dan 2 µg pFN21A (vektor kosong atau tipe liar KLHL3 [WT]) atau cDNA KLHL3 R431W menggunakan Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific) sesuai dengan instruksi pabrik. Dua klon independen masing-masing digunakan untuk transfeksi. Empat puluh delapan jam setelah transfeksi, sel dicuci dalam PBS dingin dan dilisiskan dalam 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, dan 1% NP40 yang mengandung Protease Inhibitor Cocktail lengkap (Roche, Merck). Lisat disentrifugasi pada 20,000 g selama 30 menit pada suhu 4 derajat, dan supernatan disimpan pada suhu −20 derajat. Konsentrasi protein ditentukan dalam rangkap dua (standar) atau rangkap tiga (sampel) dengan uji BCA (Pierce, Thermo Fisher) sesuai dengan instruksi pabrik. Sekitar 20 µg total protein difraksinasi oleh SDSPAGE dan dipindahkan ke membran PVDF (1,5 jam, 100 V). Membran diblokir dalam 2% susu kering di TBST. Western blot dilakukan menggunakan anti-HaloTag kelinci poliklonal (Promega #G9281, 1:500, 4 derajat semalam), diikuti dengan pencucian dan inkubasi dengan IgG anti-kelinci keledai IgG (H + L)-HRPO (Jackson ImmunoResearch # {{46 }}, dianova, 1:20,000, 1 jam pada suhu kamar), pencucian, dan peningkatan deteksi chemiluminescent (Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagent, GE Healthcare). Noda dihilangkan menggunakan ROTIFree Stripping Buffer 2.0 (Carl Roth), diblokir dalam 2% susu kering dalam TBST semalaman pada suhu 4 derajat, dan diinkubasi dengan tikus monoklonal anti-FLAG M2 (SigmaAldrich #F1804, Merck, 1:1,{{69} }, 1,5 jam pada suhu kamar), diikuti oleh IgG anti-tikus keledai (H + L)-HRPO (Jackson ImmunoResearch # 715-035-151, dianova, 1:20,000, 1 jam di kamar suhu), deteksi ECL, pengupasan, dan pemblokiran seperti di atas. Bercak kemudian diinkubasi dengan antiaktin tikus monoklonal (Sigma-Aldrich # A2228, Merck, 1:5.000, 1 jam pada suhu kamar) dan IgG anti-tikus IgG keledai, sekali lagi diikuti dengan deteksi ECL. Pita diukur menggunakan Perangkat Lunak Image Lab pada ChemiDoc XRS+ (Bio-Rad). Intensitas pita yang dideteksi oleh antibodi anti-HaloTag dan antibodi anti-FLAG M2, masing-masing, dibagi berdasarkan intensitas pita yang sesuai yang dideteksi oleh antibodi anti- - aktin. Untuk menilai tingkat ekspresi KLHL3, sel ditransfeksi seperti di atas dengan menggunakan 0 µg, 0,5 µg, 1 µg, 2 µg, 4 µg, dan 8 µg pFN21A KLHL3 WT atau R431W. Elektroforesis gel dan blotting dilakukan seperti di atas. Untuk uji pengejaran sikloheksimida, sel diunggulkan seperti di atas dan ditransfeksi seperti di atas dengan 2 µg pFN21A KLHL3 WT atau 4 µg KLHL3 R431W. Empat puluh delapan jam setelah transfeksi, 100 µM sikloheksimid ditambahkan, dan sel-sel dilisiskan setelah titik waktu yang ditentukan. Langkah analisis selanjutnya seperti di atas.
Gambar 2. Simulasi MD domain WT dan p.Arg431Trp (R431W) KLHL3 Kelch. tampilan domain Kelch dari atas ke bawah (PDBID: 4CH9), diwarnai dengan bilah -baling-baling (K1 – K6). Situs mutasi ditunjukkan oleh bintang kuning, dan wilayah yang diinginkan berwarna abu-abu (residu 425–465), dan peptida WNK4 (tidak termasuk dalam simulasi) transparan dan berwarna abu-abu. b Perbedaan MSF domain Kelch yang dipetakan pada tulang punggung protein. Lokasi mutasi ditandai dengan bintang kuning. Warna merah menunjukkan bagian protein yang lebih dinamis (kurang stabil). c RMSD seluruh protein (atas), residu 425–465 (tengah), dan kantong pengikat WNK4-(bawah) dari struktur kristal untuk tiga replika simulasi independen (garis tebal, rata-rata berjalan). d Plot biola dari hbonds (kiri) dan jarak COM (tengah) antara K3 (residu 425–441) dan K4 (442–465) -bilah baling-baling dan elektrostatika saku pengikat (kanan). e Hamparan struktural antarmuka K3–K4 dari bingkai akhir (1,1 μs) setiap replika (WT, biru; R431W, abu-abu) dengan model eksperimental/awal (hitam). Tulang punggung protein ditampilkan sebagai kartun, dengan residu 431 ditampilkan sebagai batang. MSF, berarti fluktuasi kuadrat.
Simulasi Dinamika Molekuler
Model WT didasarkan pada struktur kristal sinar-X (PDBID: 4CH9) dari domain Kelch manusia yang kompleks dengan fragmen peptida WNK4 [26]. Atom yang hilang dan tutup terminal ditambahkan menggunakan utilitas psfgen dalam dinamika molekul visual versi 1.9.3 [27]. Model KLHL3 mutan (R431W) dihasilkan menggunakan Modeller versi 9.18 [28]. Kisaran residu akhir untuk setiap sistem adalah 300–585. N- dan C-termini dari model WT dan R431W masing-masing dinetralkan dengan asetilasi dan N-metilamidasi. Status protonasi default ditetapkan untuk setiap residu yang dapat dititrasi berdasarkan analisis dengan PROPKA versi 3.0 [29]. Peptida WNK4 telah dihapus dari simulasi produksi karena disosiasi dari KLHL3 setelah simulasi keseimbangan awal.
Semua simulasi dilakukan menggunakan paket perangkat lunak GROMACS versi 2021 [30]. Parameter medan gaya CHARMM36m digunakan untuk atom protein [31]. Ion dideskripsikan menggunakan parameter CHARMM default, dan model TIP3P digunakan untuk perairan [32]. Langkah waktu integrasi 1 fs digunakan untuk langkah keseimbangan awal, dengan 2 fs digunakan untuk semua simulasi berikutnya. Semua ikatan yang melibatkan hidrogen dibatasi menggunakan LINCS [33]. Interaksi Van der Waals non-ikatan dihitung menggunakan potensial Lennard-Jones dengan radius batas 1,2 nm; kekuatan dimatikan dengan lancar dalam kisaran 1,2-1,0 nm. Semua elektrostatika dihitung menggunakan metode mesh partikel halus Ewald [34] dengan jarak cutoff ruang nyata 1,2 nm. Setelah simulasi awal dalam ansambel isokorik-isotermal (NVT), semua simulasi selanjutnya dilakukan dalam ansambel isobarik-isotermal (NPT) pada suhu 310,15 K menggunakan termostat penskalaan kecepatan [35] dengan konstanta waktu 0,5 ps. Termostat diterapkan secara terpisah pada protein dan pelarut (yaitu air dan ion); kelompok yang sama digunakan untuk menghilangkan gerakan pusat massa (COM). Tekanan 1 bar dikenakan menggunakan barostat Berendsen [36] atau Parrinello-Rahman [37] secara isotropik dengan konstanta waktu 5 ps.
Model WT dan R431W dilarutkan dalam kotak kubik dengan dimensi awal 1,2 × 1,2 × 1,2 nm3. Setiap sistem dinetralkan dengan 150 mM NaCl. Setelah minimalisasi energi penurunan paling curam awal, setiap sistem diseimbangkan dalam ansambel NVT selama 5 ns dengan batasan posisi pada semua atom protein. Langkah keseimbangan selanjutnya dilakukan dalam ansambel NPT selama 5 ns dengan pengekangan yang sama seperti pada langkah sebelumnya. Pembatas posisi telah dilepas dari semua rantai samping untuk simulasi keseimbangan 5-ns akhir. Tiga struktur awal dihasilkan dari tahap akhir keseimbangan untuk simulasi produksi independen sistem WT dan R431W dengan semua batasan posisi dihilangkan. Setiap replika produksi disimulasikan selama 1,1 µs; 0,1 µs pertama dikeluarkan dari analisis.
Untuk menilai stabilitas struktural selama simulasi, deviasi kuadrat rata-rata akar (RMSD) dari struktur kristal dihitung untuk atom C dari seluruh protein, serta antarmuka K3-K4 (residu 425–465) dan Kantong pengikat WNK4- (residu 339, 355, 360, 386, 402, 407, 432, 449, 451, 481, 498, 528, dan 577). Rata-rata berjalan dari jejak RMSD dihitung dan ditumpangkan dengan data mentah.
Efek mutasi terhadap stabilitas struktural divisualisasikan dengan menghitung perbedaan fluktuasi kuadrat rata-rata atom protein C, dirata-ratakan pada kerangka dan replika, serta memetakan ke struktur protein WT. Semua visualisasi protein dihasilkan menggunakan ChimeraX (38). Efek mutasi R431W pada antarmuka K3 (residu 425–441) hingga K4 (residu 442–465) dikarakterisasi dengan analisis ikatan hidrogen (ikatan H) dan jarak COM antara kedua kelompok. Ikatan-H dinilai pada setiap bingkai menggunakan alat GROMACS gmx hbond, dengan jarak dan sudut potongan masing-masing 3,5 Å dan 30 derajat. Jarak COM juga dinilai pada setiap frame – distribusi jarak Hbonds dan COM divisualisasikan sebagai plot biola. Rata-rata dihitung berdasarkan lintasan dan replika.
Elektrostatis kantong pengikat4-WNK dihitung menggunakan g_elpot [39]. Perjalanan waktu potensial elektrostatis dalam kantong pengikat dievaluasi dengan menentukan volume bola dengan radius 8 Å, berpusat pada pusat geometrik residu yang membentuk kantong pengikat. Untuk mengevaluasi varians dalam elektrostatika, rata-rata blok 50-ns dihitung. Distribusi potensi elektrostatik dalam kantong pengikat untuk mutan WT dan R431W divisualisasikan sebagai plot biola, dengan rata-rata dihitung pada blok dan lintasan 50-ns.
Layanan Pendukung Wecistanche-Ekspor cistanche terbesar di Cina:
Surel:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Telp:+86 15292862950
Belanja Untuk Detail Spesifikasi Lebih Lanjut:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
