Distribusi Khas Faktor Terinduksi Hipoksia-1 dalam Sel Tubular Ginjal yang Dikultur Dengan Hipoperfusi yang Disimulasikan Dengan Penempatan Coverslip

Kontak: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:{0}}

Tomoko Honda¹| Yosuke Hirakawa¹ | Kiichi Mizukami²| Toshitada Yoshihara²| Tetsuhiro Tanaka¹| Seiji Tobita²| Masaomi Nangaku

Abstrak

Hipoksia kronis di tubulointerstitium ginjal memainkan peran kunci dalam perkembangan kronisginjalpenyakit(CKD). Oleh karena itu penting untuk menyelidiki hipoksia tubulus dan aktivitas faktor yang diinduksi hipoksia (HIF)-1 sebagai respons terhadap hipoksia. Jarangnya kapiler peritubular menyebabkan hipoperfusi pada CKD; namun, efek hipoperfusi pada HIF jarang diselidiki. Kami menginduksi hipoperfusi yang disebabkan oleh penempatan kaca penutup pada manusiaginjal-2 sel dan mengamati gradien oksigen di bawah kaca penutup. Imunositokimia HIF-1 menunjukkan formasi berbentuk donat di tepi area positif pimonidazole, yang kami beri nama "cincin HIF". Ketegangan oksigen cincin HIF diperkirakan antara sekitar 4 mmHg dan 20 mmHg. Hasil ini tidak sesuai dengan penelitian sebelumnya yang menunjukkan akumulasi HIF-1 pada kisaran anoksik dengan tekanan oksigen homogen. Kami selanjutnya mengamati adanya gradien pH di bawah kaca penutup, serta pergeseran cincin HIF karena perubahan pH media kultur, menunjukkan bahwa cincin HIF dibentuk oleh penekanan HIF-1 terkait ke pH rendah. Penelitian ini menunjukkan bahwa aktivasi HIF-1 meniru keadaan fisiologis dalam sel yang dikultur dengan hipoperfusi.

KATA KUNCIhipoperfusi, hipoksia, faktor yang dapat diinduksi hipoksia, gradien oksigen, pH

Herbal Cistanchemencegah penyakit ginjal, klik di sini untuk mendapatkan sampelnya

1|PENGANTAR

Insiden kronisginjalpenyakit(CKD) meningkat di seluruh dunia seiring bertambahnya usia masyarakat (Tonelli & Riella, 2014). Perkembangan CKD tidak dapat diubah setelah kerusakan ginjal mencapai tingkat tertentu dan akhirnya menyebabkan penyakit ginjal stadium akhir (ESRD), terlepas dari penyakit yang mendasarinya. Hasil ini menunjukkan adanya "jalur akhir bersama". Menurut analisis patologis masa lalu, penurunan fungsi ginjal berkorelasi lebih kuat dengan kerusakan tubulointerstitial dibandingkan dengan kerusakan glomerulus. Ada beberapa laporan yang menunjukkan bahwa fibrosis ginjal menginduksi hipoksia kronis di tubulointerstitium, dan hipoksia tubulointerstisial ini memperburuk CKD dan menyebabkan ESRD. Bukti ini menunjukkan bahwa hipoksia tubulointerstitial berperan dalam jalur umum akhir CKD (Mimura & Nangaku, 2010; Nangaku, 2006). Ituginjalsangat rentan terhadap hipoksia karena tingginya permintaan oksigen, dan adanya pirau oksigen antara arteri dan vena intrarenal (Nangaku, 2006; Welch et al., 2001; Zhang et al., 2014). Oleh karena itu, kami menganggap bahwa penting untuk menyelidiki hipoksia dan respons terhadap hipoksia di tubulointerstitium ginjal.

Respon biologis utama terhadap hipoksia pada organisme hidup terjadi melalui jalur hypoxia-inducible factor (HIF) (Hypoxia, 2011; Semenza & Wang, 1992; Zhou et al., 2003). HIF terdiri dari - dan -subunit. Meskipun -subunit secara konstitutif aktif, -subunit terdegradasi dengan adanya oksigen. Dalam kondisi normal, HIF- dihidroksilasi oleh domain prolyl hydroxylase (Ph.D.), membuatnya dikenali oleh penekan tumor von Hippel–Lindau (VHL). Pengakuan ini menghasilkan ubiquitinasi dan degradasi HIF- terhidroksilasi dalam proteasome. Dalam kondisi hipoksia, HIF- terakumulasi dalam sitosol, karena HIF- yang tidak terhidroksilasi lolos dari degradasi. Akumulasi HIF- ditranslokasi dari sitosol ke nukleus, di mana ia berdimerisasi dengan HIF-, dan bertindak sebagai faktor transkripsi, mempromosikan ekspresi gen hilir. Dari tiga isoform subunit HIF yang teridentifikasi—HIF-1 , HIF-2 , dan HIF-3 —sel epitel tubulus ginjal diketahui mengekspresikan HIF-1 (Tanaka et al ., 2016). Studi sebelumnya telah menunjukkan akumulasi sementara atau regional dari HIF diginjaldengan CKD (Goldfarb et al., 2006; Yu et al., 2012), dan HIF ini diaktifkan dalam penurunan tekanan oksigen di lingkungan CKD. Maladaptasi terhadap hipoksia pada CKD mungkin disebabkan oleh adanya faktor yang menekan jalur HIF (Asai et al., 2016; Tanaka et al., 2013; Thangarajah et al., 2009). Efek perlindungan dari aktivasi HIF telah dilaporkan pada beberapa model hewan, termasuk tikus diabetes yang diinduksi streptozotocin dan tikus nephrectomy 5/6 (Deng et al., 2010; Nordquist et al., 2015). Ph.D. inhibitor baru-baru ini menarik perhatian sebagai pendekatan terapi baru untuk anemia ginjal pada pasien dengan CKD (Akizawa et al., 2019; Chen et al., 2017, 2019; Coyne et al., 2017; Miyata et al., 2011; Pergola et al. ., 2016; Provenzano et al., 2016). Namun, rincian perkembangan hipoksia ginjal, dan cara akumulasi HIF terjadi diginjaldengan CKD, tetap tidak jelas. Hidroksilasi tergantung oksigen dari HIF- terjadi di sitosol, dan oleh karena itu penting untuk mengukur tekanan oksigen intraseluler dan ekstraseluler. Ada beberapa metode yang digunakan untuk mengukur tekanan oksigen, termasuk penggunaan mikroelektroda atau pencitraan resonansi magnetik bergantung tingkat oksigen darah (BOLD-MRI). Kami menggunakan mikroskop pencitraan seumur hidup fosforesensi (PLIM) untuk pengukuran kuantitatif status oksigen intraseluler (Hirakawa et al., 2017; Yoshihara et al., 2015). BTPDM1 adalah pewarna berpendar berdasarkan kompleks iridium (III) BTP, (bp)2Ir(acc) (bp=benzoat-piridin, aac=asetilaseton) dengan gugus dimetilamino kationik, yang secara pasif didistribusikan dalam lisosom intraseluler. Itu disintesis sebagai probe fosfo-baru untuk mengukur tekanan oksigen intraseluler (Yoshihara et al., 2015). PLIM dengan BTPDM1 memungkinkan perolehan gambar resolusi tinggi dari tekanan parsial oksigen dalam sel tubulus ginjal pada permukaan ginjal tikus normal, memberikan data yang menunjukkan adanya gradien oksigen, bahkan pada ginjal normal (Hirakawa et al., 2018 ).

Ada gradien oksigen dalam organ hidup, termasuk:ginjal, bahkan dalam kondisi normal (Hirakawa et al., 2018; Kietzmann, 2017; Zhdanov et al., 2015), dan gradien seperti itu juga dapat diharapkan pada CKD. Hipoperfusi disebabkan oleh penyempitan mikrovaskular pada CKD, di mana cedera glomerulus progresif menyebabkan penurunan aliran darah kapiler peritubulus, memperburuk fibrosis interstisial. Fibrosis interstisial mengganggu difusi dan suplai oksigen ke sel tubulus, dan menyebabkan penipisan pembuluh darah mikro, yang selanjutnya memperburuk hipoksia tubulointerstisial (Mimura & Nangaku, 2010; Nangaku, 2006). Efek biologis hipoperfusi, bagaimanapun, tetap tidak jelas, karena sebagian besar penelitian telah menyelidiki efek hipoksia dan HIF-1 pada sel yang dikultur dalam kondisi perfusi homogen dan tekanan oksigen (Rexius-Hall et al., 2017). Studi sebelumnya telah menunjukkan bahwa sel kultur berlapis tunggal yang ditutupi dengan penutup memberikan model hipoperfusi yang baik yang disebabkan oleh penghalang difusi dalam media kultur. Model hipoperfusi dikaitkan dengan gradien oksigen karena kaca penutup mencegah difusi oksigen dari bagian atas media ke sel (Pitts & Toombs, 2004; Takahashi & Sato, 2010; Yoshihara et al., 2015). Dalam satu lapisan sel yang dikultur yang ditutupi dengan kaca penutup, tegangan oksigen intraseluler turun dengan jarak dari tepi kaca penutup karena difusi oksigen yang terbatas ke dalam sel yang dikultur. Akibatnya, gradien oksigen terbentuk dari tepi ke tengah kaca penutup, dan tegangan oksigen intraseluler dapat turun ke kisaran anoksik di tengah kaca penutup (Takahashi & Sato, 2010; Yoshihara et al., 2015) . Dalam penelitian ini, kami fokus pada aktivasi HIF dan menyelidiki apakah ada perubahan bebas oksigen dalam ekspresi HIF dengan adanya hipoperfusi dengan gradien oksigen. Sejak hipoperfusi dengan gradien oksigen ada di tubulus ginjal in vivo, pengamatan efek oksigen-independen pada ekspresi HIF dalam model kaca penutup dapat memberikan wawasan tentang mekanisme yang mendasari insufisiensi akumulasi HIF pada CKD.

ekstrak cistancheuntuk ginjal

2|BAHAN DAN METODE

2.1|Budaya sel

Sel-sel yang dikultur diinkubasi dalam inkubator yang dilembabkan dengan 5 persen CO2. Inkubasi hipoksia dilakukan dalam inkubator CO2/multi-gas pribadi APM-30D (Astec). Anoksia diinduksi dengan kantong anoksia, AnaeroPack, dan set budidaya Anaerobik #A-13 (Mitsubishi Gas Chemical).

HK-2 sel (Homo sapiens, manusiaginjal, laki-laki, CRL- 2190, ATCC, RRID: CVCL_0302), garis sel epitel tubulus proksimal yang diabadikan dari ginjal manusia dewasa normal, dikultur dalam campuran medium/nutrisi Eagle yang dimodifikasi Dulbecco F{{2} } Ham (DMEM/F12) (D8062, Sigma Aldrich) yang mengandung 10 persen serum janin sapi (FBS) (F7524, Sigma Aldrich), dan larutan penisilin-streptomisin (15070063, Thermo Fisher Scientific) dalam cawan kultur 10 cm. Untuk bagian, sel HK-2 dipisahkan dengan tripsin (204-16935, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) dan disentrifugasi pada 300 g selama 5 menit.

Sel kanker serviks HeLa dan embrio manusiaginjalsel 293 (HEK293) dikultur dalam DMEM dengan glukosa rendah (1000 mg/L) (D6046, Sigma Aldrich) yang mengandung 5 persen FBS dalam cawan kultur 10 cm. Sel-sel ini dilewatkan sebagai sel HK-2.

Sel epitel tubulus proksimal ginjal (RPTECs) (CC- 2553, Cambrex) dipelihara menggunakan kit RenaLifeTM Comp (LRC-LL0025, Lonza Ltd.). Untuk bagian, RPTEC dipisahkan menggunakan tripsin, dinetralkan dengan Trypsin Neutralizing Solution (CC-5002, Lonza Ltd.), dan disentrifugasi pada 200 g selama 5 menit.

2.2|Pembentukan model hipoperfusi dengan penempatan kaca penutup

Coverslips berbentuk bulat berdiameter 15 mm (C015001, Matsunami) dibersihkan menggunakan ultrasound dan disimpan dalam etanol 99,5 persen sebelum digunakan. Dua metode digunakan, berdasarkan pengamatan sel di luar kaca penutup.

Sel kultur berlapis tunggal diapit di antara kaca penutup dan bagian bawah cawan (Gambar S1a,b), atau metode alternatif (Gambar S1c), seperti dijelaskan di bawah. Baik metode tradisional atau alternatif dipilih untuk menetapkan model kaca penutup kami untuk pencitraan langsung, baik pencitraan oksigen atau pencitraan PH. Untuk imunositokimia (ICC), metode alternatif dipilih, karena ketika menggunakan metode tradisional, sebagian besar sel sering terlepas dari dasar cawan selama pelepasan penutup untuk fiksasi sel (Gambar S2a).

2.2.1|Metode tradisional

Pada Hari 1, sel ditempatkan di bagian bawah piringan berbasis kaca 27 mm (3910-035, Iwaki) pada pertemuan 100 persen * (sekitar 5,0 × 105/piring). Mereka dikultur dalam DMEM/ F12 yang mengandung 10 persen FBS tanpa larutan antibiotik semalaman. Pada Hari 2, kaca penutup ditempatkan di atas sel yang dikultur untuk periode yang ditunjukkan (Gambar S1b).

2.2.2|Metode alternatif

Sel diunggulkan pada kaca penutup dalam cawan kultur 35 mm pada pertemuan 100 persen (sekitar 5,0 × 105/piring) pada Hari.

1. Mereka dikultur dalam DMEM/F12 yang mengandung 10 persen FBS tanpa larutan antibiotik semalaman. Pada Hari 2, kaca penutup dibalik, untuk menempelkan permukaan selnya ke dasar piringan kaca 27 mm baru untuk jangka waktu tertentu (Gambar S1c).

Kami juga membuat model kaca penutup menggunakan kaca penutup berbentuk bulat dengan diameter 10 mm (CS01005, Matsunami) (Gambar S2b).

2.3|Pencitraan oksigen langsung dengan BTPDM1

Sel yang dikultur disiapkan pada Hari 1, seperti dijelaskan di atas. Pada Hari 2, sel-sel dibilas dua kali dengan larutan Hanks' Balanced Salt (HBSS) (H8264, Sigma Aldrich) dan diinkubasi dengan 500 nM BTPDM1, pewarna lipofilik kationik berbasis iridium yang digunakan sebagai probe berpendar intraseluler (Yoshihara et al., 2015), dalam DMEM/F12 tanpa fenol merah (21041-025, Thermo Fisher Scientific) selama 30 menit. Setelah sel-sel dicuci dua kali dengan HBSS, sel-sel itu diapit di antara kaca penutup dan bagian bawah cawan, seperti dijelaskan di atas. Intensitas pendar dari BTPDM1 dalam sel kultur yang ditutupi dengan kaca penutup diamati menggunakan filter eksitasi dan emisi, dan pendar BTPDM1 (Hirakawa et al., 2015) dideteksi menggunakan mikroskop fluoresensi, BZ-X710 (Keyence Corporation). Gambar yang diperoleh dari mikroskop fluoresen terbalik disesuaikan untuk kecerahan dan kontras menggunakan perangkat lunak analisis BZ-X.

2.4|Imunositokimia

Sel-sel pada kaca penutup dikultur dengan 200 M pimonidazole HCl (HP3-100, Hypoxyprobe, Inc.) dalam DMEM/F12 tanpa fenol merah selama 1 jam, setelah itu kaca penutup dibalik dan dilekatkan pada cawan kaca penutup, sebagai dijelaskan sebelumnya. Sel-sel kemudian dikultur dalam DMEM/F12 tanpa fenol merah untuk jangka waktu tertentu. Ketika counterstaining pimonidazole tidak digunakan, pretreatment dengan pimonidazole dihilangkan.

Setelah periode kultur selesai, masing-masing kaca penutup dikumpulkan, dan sel segera difiksasi dengan metanol/aseton (1:1) di atas es, di mana mereka tetap selama 30 menit. Setelah dicuci dua kali dengan Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) (D5652, Sigma Aldrich), membran sel ditembus selama 30 menit, diinkubasi dengan 5 persen bovine serum albumin (BSA) (A3059, Sigma Aldrich) selama 30 menit, dan selanjutnya dengan blok protein bebas serum (X0909, DAKO) selama 10 menit. Sel-sel diwarnai dengan antibodi pertama dan kemudian dengan antibodi fluoresen kedua. Daftar antibodi pertama diberikan pada Tabel S1. Imunoglobulin anti-kelinci poliklonal FITC-babi (F0205, pengenceran 1:20, DAKO) digunakan sebagai antibodi pertama jika inangnya adalah kelinci. Antibodi fluoresen Alexa Fluor 594 streptavidin (S11227, pengenceran 1:500, Thermo Fisher Scientific) digunakan sebagai antibodi pertama jika inangnya adalah tikus, diikuti oleh IgG anti-tikus terbiotinilasi (H plus L) (BA{{23} }, pengenceran 1:1000, Laboratorium Vektor), sebagai antibodi kedua. Pewarnaan nuklir dilakukan dengan menggunakan bisBenzimide H 33342 trihydrochloride (B2261, Sigma Aldrich) untuk setiap sampel.

Sinyal fluoresen diamati menggunakan mikroskop fluoresen terbalik, BZ-X710 (Keyence Corporation) dengan filter berikut: Texas Red dengan panjang gelombang eksitasi (Ex) 560/40 nm, panjang gelombang emisi (Em) 630/75 nm, GFP ( Mis: 470/40 nm, Em: 525/50 nm), dan DAPI (Mis: 360/40 nm, Em: 460/50 nm). Gambar disesuaikan untuk kecerahan dan kontras menggunakan perangkat lunak analisis BZ-X.

2.5|ICC dari HIF sel HK-2 diobati dengan kobalt klorida

Metode alternatif dimodifikasi untuk menghasilkan model penutup sel HK-2 yang diolah dengan kobalt klorida. Sel HK-2 diunggulkan pada kepadatan setengah konfluen (2,5 × 105/piringan) pada kaca penutup pada Hari 1 dan diperlakukan dengan 300 M kobalt klorida heksahidrat (C 8661, Sigma Aldrich) selama 16 jam pada Hari 2. Pada Hari 3, kaca penutup dibalik untuk menempelkan permukaan sel ke dasar piringan berbasis kaca 27 mm baru selama 3 jam, dan ICC HIF dilakukan.

2.6|blotting barat

Untuk menyelidiki akumulasi HIF{{0}} di bawah tekanan oksigen yang berbeda dan pada tingkat pH yang berbeda, 1.0 × 106 sel HK-2 per cawan kultur 10 cm diinkubasi baik di bawah normoksia, 2 persen oksigen, 1 persen oksigen, atau anoksia, selama 5 jam, atau dalam DMEM/F12 pada pH 7,4, pH 6,0, atau pH 5,0 selama 5 jam.

Sel-sel ini dilisiskan dalam buffer RIPA yang mengandung 50 mM Tris-buffer (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.5 b/v persen natrium deoxycholate, 0,1 b/v persen SDS, dan 1,0 b/v persen NP40.

Untuk western blotting, buffer sampel SDS yang mengandung {{0}}.35 M Tris-HCl (pH 6,8), 10 persen SDS, 36 persen gliserol, 0,012 persen bromophenol blue, dan 0,1 M dithiothreitol (DTT) ditambahkan ke protein. Protein yang mengandung buffer sampel SDS dielusi dengan cara direbus pada suhu 95 derajat selama 5 menit.

Protein dipisahkan dengan elektroforesis pada 10 persen gel poliakrilamida SDS. Protein kemudian dipindahkan ke membran AmershamTM HybondTM PVDF (10600023, GE Healthcare) dalam buffer transfer (48 mM buffer Tris-base, 39 mM glisin, 0,04 persen SDS, dan 20 v/v persen metanol) menggunakan Trans-Blot® Sistem Transfer TurboTM (Bio-Rad). Membran diinkubasi pada suhu kamar dengan antibodi primer, anti-HIF1 anti-body (NB100-134, pengenceran 1:500, Novus Biologicals, RRID: AB_350071), dan antibodi anti-aktin (A2066 , pengenceran 1:2000, Sigma Aldrich, RRID: AB_476693), dan selanjutnya dalam antibodi sekunder, imunoglobulin/HRP anti-kelinci poliklonal kambing (P0448, pengenceran 1:10000, DAKO, RRID: AB{{26 }}). PierceTM ECL Plus Western Blotting Substrate (32132, ThermoFisher Scientific) digunakan untuk deteksi. Chemiluminescence diamati menggunakan Luminoimage Analyzer ImageQuantLAS4000mini (GE Healthcare). Reproduksibilitas dikonfirmasi dengan melakukan setidaknya tiga percobaan independen. Intensitas pita diukur menggunakan perangkat lunak National Institutes of Health ImageJ (Schneider et al., 2012).

2.7|Uji reporter Luciferase

Uji reporter luciferase dilakukan untuk mengukur akumulasi HIF1 dalam inkubasi kultur hipoksia homogen. Kami sebelumnya membangun gen luciferase yang ditandai yang didorong oleh elemen responsif hipoksia (HRE) dan mengembangkan Vektor Reporter Responsif Hipoksia (Konstruksi Transgen). Ini dibangun dari salinan tandem HRE dari gen faktor pertumbuhan endotel vaskular tikus yang dikloning ke dalam wilayah 5' unit transkripsi am CMV-promoter-luciferase (pra-Luc) (Chiang et al., 2011; Tanaka et al., 2004).

Sel HK{{0}} pada konsentrasi 1,0 × 105 per sumur disiapkan dalam 12-pelat kultur sumur (150628, Thermo Fisher Scientific). Sel-sel ditransfeksi bersama dengan 500 ng vektor pGL3-Basic HRE-luciferase vector dan 30 ng pRL-SV40 vektor kontrol Renilla luciferase (Promega), menggunakan 2 l FuGENE® HD Transfection Reagent (E2311, Promega) per dengan baik. Sel HK-2 yang ditransfeksi bersama dengan 500 ng ofpGL3-vektor luciferase kunang-kunang dasar dan 30 ng ofpRL-SV40 vektor kontrol Renilla luciferase (Promega) digunakan sebagai kontrol negatif.

Sel-sel yang ditransfeksi diinkubasi di bawah normoksia, hipoksia 2 persen, hipoksia 1 persen, atau kantong anoksia, selama 5 jam. Sel-sel kemudian dipanen menggunakan 100 l buffer lisis protein pasif, untuk uji luciferase ganda. Sebuah luminometer LB9507 (EG dan Berthold) digunakan untuk pengukuran. Untuk mengoreksi efisiensi transfeksi, nilai relatif dari unit lampu luciferase kunang-kunang dibagi dengan nilai dari Renilla luciferase.

cistanche untuk ed

2.8|Analisis apoptosis

Sel yang dikultur ditutup dengan kaca penutup selama 0 menit, 15 menit, 30 menit, 1 jam, 3 jam, 6 jam, dan 24 jam, dan kemudian dikumpulkan menggunakan tripsin. Sel diperlakukan dengan 3 persen hidrogen peroksida (081- 04215, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) selama 30 menit disiapkan sebagai kontrol apoptosis. Analisis kuantitatif apoptosis dilakukan menggunakan Muse Annexin V dan Dead Cell Kits (MCH100105, Millipore) dalam Muse™ Cell Analyzer (Millipore), sesuai dengan instruksi pabrik.

2.9|PCR waktu-nyata kuantitatif (qRT-PCR)

Ekstraksi RNA total dan sintesis cDNA dilakukan sesuai dengan instruksi pabrik untuk masing-masing RNAiso Plus (9109, Takara) dan PrimeScript™ RT Master Mix (RR036B, Perfect Real Time) (Takara). PCR real-time dilakukan menggunakan THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix (QPS- 201, Toyobo) di CFX Connect Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad). Tingkat transkrip dinormalisasi ke tingkat ekspresi mRNA -aktin. qRT-PCR dilakukan dalam rangkap tiga menggunakan primer spesifik gen. HIF-1 diamplifikasi menggunakan forward, 5′-CCATTAGAAAGCAGTTCCGC-3′ dan reverse, 5′-TGGGTAGGAGATGGAGATGC-3′ primer. -aktin diamplifikasi menggunakan forward, 5′-TCCCCCAACTTGA GATGTATGAAG-3′, dan membalikkan 5′-AACTGGTTCCAAG TCAGTGTACAGG-3′ primer.

2.10|Transfeksi dengan siRNA

Untuk menyelidiki knockdown HIF-1 yang diinduksi RNAi dalam sel HK-2, 5.0 × 104 HK-2 sel per sumur disiapkan dalam pelat enam sumur. Dua jenis RNAi—HIF-1 siRNA (siHIF-1 #1 [HSS104774, Thermo Fisher Scientific] dan siHIF-1 #2 [HSS104775, ThermoFisher Scientific])—digunakan dengan Lipofectamine RNAiMAX Reagen Transfeksi (Thermo Fisher Scientific). Sebagai kontrol negatif, Stealth RNAi™ siRNA Negative Control Med GC Duplex #3 (12935-113) digunakan; 1,5 l masing-masing siRNA dan 5 l RNAiMAX dicampur. sel-sel yang ditransfeksi siRNA diinkubasi dalam kondisi normoksik atau hipoksia (1 persen O2) selama 48 jam dan RNA diekstraksi. Efisiensi knockdown-HIF-1 diperiksa menggunakan qRT-PCR.

2.11|Pencitraan langsung efek gradien PH

Kami memvisualisasikan gradien pH intraseluler sel hidup di bawah kaca penutup. Sel diperlakukan dengan pHrodo Green AM Intracellular pH Indicator (p35373, ThermoFisher Scientific) sesuai dengan instruksi pabrik, sebelum menerapkan model kaca penutup. Mikroskop fluoresensi terbalik, BZ-X710 (Keyence Corporation) dengan filter GFP digunakan untuk mengamati transisi waktu dari gradien intensitas fluoresensi di bawah kaca penutup.

2.12|Analisis kuantitatif cincin HIF

2.12.1|Situs cincin HIF

Kami mengukur jarak cincin HIF dan area positif pimonidazole dari tepi kaca penutup menggunakan ImageJ, sebagai berikut. Area lingkaran luar dan dalam cincin HIF dan lingkaran positif pimonidazole ditentukan, dan jari-jari setiap lingkaran dihitung. Setiap nilai dikurangi dari 7,5 mm, yang merupakan jari-jari kaca penutup 15 mm, untuk menghitung jaraknya dari tepi kaca penutup. Tiga percobaan independen ICC HIF di setiap kondisi dilakukan.

2.12.2|Definisi cincin HIF

Kami menggunakan gambar fluoresen yang diperoleh dari model kaca penutup yang diinkubasi di bawah normoksia dan pH netral. Kami mendefinisikan situs cincin HIF dan bagian luar dan dalamnya sebagai skala 2,5–3.0 (0.22–0.45 mm), 0.5 skala –1.0 (1,12– 1,35 mm), dan skala 5.0–5,5 (2,24–2,47 mm) dari tepi kaca penutup, masing-masing, menggunakan ImageJ. Kami mengukur lima situs sinyal HIF-1 per sampel dan menghitung rata-ratanya. Tiga percobaan independen ICC HIF dilakukan.

bubuk ekstrak cistanche

2.13|Pengukuran tekanan oksigen dengan gambar PLIM

2.13.1|Konstruksi jalur kalibrasi untuk mengukur tekanan oksigen

Kurva kalibrasi sel HK-2 dibuat, berdasarkan metode yang dijelaskan dalam laporan kami sebelumnya (Yoshihara et al., 2015). Sel HK-2 yang dimuat dengan 500 nM BTPDM1 selama 30 menit dikultur dalam inkubator multi-gas yang dapat diubah-konsentrasi oksigen yang dilengkapi dengan mikroskop fluoresen terbalik yang terhubung ke sistem pengukuran seumur hidup. Garis kalibrasi berdasarkan analisis Stern-Volmer dibangun menggunakan masa pakai fosforesensi (PL) sel HK-2 di bawah beberapa tekanan oksigen yang berbeda menggunakan

Persamaan (1)

di mana p mewakili PL dalam pO2, 0 mewakili PL dalam deoksigenasi, kq mewakili konstanta laju pendinginan, dan pO2 mewakili tekanan parsial oksigen. Menggunakan garis kalibrasi ini, tekanan oksigen dapat dihitung dari PL.

2.13.2|Gambar PLIM dari model kaca penutup

Sel HK-2 yang dimuat dengan 500 nM BTPDM1 selama 30 menit disiapkan. Model kaca penutup dibuat dan dikultur dalam inkubator multi-gas yang dapat diubah konsentrasi O2 yang dilengkapi dengan mikroskop fluoresen terbalik, yang terhubung ke sistem pengukuran seumur hidup.

Gambar mikroskop pencitraan seumur hidup fosforesensi (PLIM) direkam menggunakan mikroskop fluoresensi terbalik yang dilengkapi dengan sistem pemindaian confocal (Hirakawa et al., 2018). Gambar PLIM diperoleh setelah inkubasi 30 menit dalam 21 persen O2 atau 4 persen O2. Empat gambar PLIM per sampel, dari bagian atas, bawah, kiri, dan kanan di dekat tepi kaca penutup, diambil, untuk menentukan PL rata-rata, dengan mempertimbangkan variasi PL dalam kaca penutup.

2.13.3|Identifikasi cincin HIF dalam gambar PLIM

Pimonidazole positif di bawah 10 mmHg dari tekanan oksigen. Setara PL 10 mmHg tekanan oksigen adalah 4034,6 ns, menurut garis kalibrasi, sehingga garis luar lingkaran pimonidazole pada gambar PLIM dapat diidentifikasi. Selanjutnya, situs cincin HIF luar dan dalam pada citra PLIM dapat ditemukan dengan menggunakan analisis kuantitatif jarak. Kami mengukur kisaran rata-rata PL yang setara dengan cincin HIF dalam 21 persen O2 dan 4 persen O2.

2.13.4|Pengukuran tekanan oksigen cincin HIF

Kami menghitung kisaran tekanan oksigen cincin HIF dari PL, menggunakan garis kalibrasi. Gambar PLIM dianalisis menggunakan SPCImage 5.0 (Becker & Hickl GmbH).

2.14|Analisis statistik

Uji Dunnett digunakan untuk membandingkan kelompok eksperimen dan kontrol, dan nilai < 0,05="" dianggap="" menunjukkan="" perbedaan="" yang="" signifikan="" secara="" statistik.="" uji-t="" siswa="" digunakan="" untuk="" membandingkan="" tiga="" atau="" lebih="" kelompok,="" dan="" nilai="" p="" yang="" disesuaikan="" bonferroni="" diterapkan.="" semua="" analisis="" statistik="" dilakukan="" dengan="" menggunakan="" jmp="" pro="" ver13.2.1="" (sas).="" nilai="" diasumsikan="" berasal="" dari="" populasi="" yang="" terdistribusi="" normal,="" dan="" ditampilkan="" sebagai="" mean="" ±="" standar="" deviasi="">

apa itu cistanche?

3|HASIL

3.1|Pembentukan gradien oksigen dalam model hipoperfusi

Kami mengkonfirmasi adanya gradien oksigen dalam model hipoperfusi yang diinduksi oleh penempatan kaca penutup dengan menilai secara langsung tegangan oksigen, menggunakan fosforesensi. Pengukuran intensitas fosforesensi dapat memprediksi perkiraan tren tekanan oksigen (Hirakawa et al., 2015; Yoshihara et al., 2015). Kami mengamati intensitas pendar dari model penutup sel HK-2 yang diobati dengan BTPDM1. Gambar intensitas pendar menunjukkan hipoksia di sebagian besar area di dalam kaca penutup, tetapi tidak ada hipoksia di dekat tepi, pengamatan yang menunjukkan adanya gradien oksigen di sekitar tepi kaca penutup pada sel HK-2 yang ditutupi dengan kaca penutup (Gambar 1a). Karena intensitas pendar bergantung pada konsentrasi probe, dan pada waktu eksitasi, pengukuran masa pakai pendar (PL) berguna untuk analisis kuantitatif tekanan oksigen (Yoshihara et al., 2015). Jadi, untuk pengukuran kuantitatif tegangan oksigen sel yang dikultur di sekitar tepi kaca penutup, kami memperoleh gambar PLIM dari sel HK-2 yang ditutup dengan kaca penutup selama 30 menit (Gambar 1b). PL diperpanjang saat jarak dari tepi kaca penutup meningkat. Kami mengkonfirmasi bahwa tegangan oksigen, dihitung menggunakan garis kalibrasi (Gambar S3), menurun seiring jarak dari tepi kaca penutup meningkat, memberikan bukti adanya gradien oksigen di sekitar tepi kaca penutup (Gambar 1c). Pemeriksaan profil temporal intensitas pendar menunjukkan bahwa gradien oksigen mulai terbentuk 10 menit setelah penempatan kaca penutup

(Gambar 1d).

3.2|Distribusi HIF-1 unik dalam model hipoperfusi, "cincin HIF"

Kami memeriksa distribusi HIF-1 dalam model hipoperfusi dengan gradien oksigen. ICC HIF-1 dalam sel HK-2 menunjukkan peningkatan berbentuk donat di tepi area positif pimonidazole, yang kami sebut "cincin HIF" (Gambar 2a). Intensitas sinyal HIF-1 secara signifikan lebih tinggi pada cincin HIF daripada di area dalam atau luarnya (Gambar 2b). Fenomena ini dikonfirmasi menggunakan ICC dengan antibodi HIF-1 lain (Gambar S4a) atau garis sel tubular lainnya (Gambar S4b,c). Kami juga melakukan analisis ICC terhadap HIF-1 pada jenis sel lain yang dikultur, seperti sel kanker serviks HeLa. Meskipun adhesi yang lemah dari sel-sel ini ke kaca penutup membuat evaluasi rinci distribusi HIF-1 menjadi sulit, kami mengamati peningkatan HIF-1 berbentuk donat dalam sel HeLa (Gambar S4d).

Cincin HIF dan area positif pimonidazole mulai terbentuk beberapa jam setelah penempatan kaca penutup, dan cincin HIF tampak statis selama 3 jam (Gambar 2c). Knockdown HIF-1 mengakibatkan hilangnya sinyal HIF-1 , termasuk cincin HIF (Gambar 2d, Gambar S4e), yang menunjukkan bahwa cincin HIF bergantung pada HIF-1 .

Untuk menyelidiki kemungkinan bahwa pembentukan cincin HIF bergantung pada oksigen, kami menyelidiki distribusi HIF-1 dalam model kaca penutup di bawah inkubasi dengan tekanan oksigen yang berbeda. Kami menempatkan piringan ke dalam ruang hipoksia dengan tekanan oksigen yang berbeda segera setelah membuat model kaca penutup. Selama inkubasi hipoksia, kami mengamati bahwa cincin HIF dan area positif pimonidazole tampak melebar ke luar (Gambar 3a). Kami mengukur jarak setiap cincin HIF dan area positif pimonidazole dari tepi kaca penutup di bawah inkubasi normoksia, 4 persen O2, dan 1 persen O2. Baik cincin HIF dan area positif pimonidazole meluas ke luar saat tekanan oksigen di sekitarnya menurun (Gambar 3b). Hasil ini menunjukkan bahwa cincin HIF bergantung pada HIF-1 dan tegangan oksigen.

Untuk mengonfirmasi bahwa akumulasi berbentuk donat adalah fenomena spesifik HIF, kami melakukan ICC dengan gen rumah tangga dalam model penutup. Sinyal GAPDH dan aktin dipertahankan di seluruh area kaca penutup dan sebanding antara wilayah cincin HIF dan wilayah lainnya (Gambar S5a, b).

3.3|Pengukuran rentang tekanan oksigen cincin HIF

Kami mengkonfirmasi peningkatan akumulasi HIF-1 berbentuk cincin dalam sel yang dikultur yang ditutupi dengan kaca penutup, sebuah fenomena yang bergantung pada tekanan oksigen. Untuk menentukan kisaran ketegangan oksigen yang terlibat, kami menganalisis tekanan oksigen cincin HIF menggunakan teknik seumur hidup pendar. Kami memperoleh gambar PLIM dari model kaca penutup setelah inkubasi 30 menit dalam 21 persen O2 atau 4 persen O2 (Gambar 4a). Cincin HIF terbentuk di tepi lingkaran pimonidazole di ICC HIF (Gambar 3b). Kami mengidentifikasi situs pada gambar PLIM yang setara dengan area positif pimonidazole di ICC HIF dan kemudian mengidentifikasi situs yang sesuai dengan cincin HIF (Gambar 4b), menggunakan analisis kuantitatif dari data jarak dari cincin HIF dan area positif pimonidazole (Gambar 3b). Kami juga mengukur kisaran PL cincin HIF dan kemudian menggunakan garis kalibrasi (Gambar S3) untuk menghitung tekanan oksigen cincin HIF dalam 21 persen O2 (4,20 [3,46-4,97] ~35,9 [28,5–44,9] mmHg) , dan 4 persen O2 (2,19 [0.21–4.32] ~20.4 [17,1–24.1] mmHg) (Gambar 4c).

3.4|Akumulasi HIF-1 di bawah tekanan oksigen homogen

Sementara sinyal lemah HIF-1 di luar cincin HIF dalam model kaca penutup dapat dikaitkan dengan hipoksia yang tidak mencukupi, sinyal di dalam cincin, di mana HIF-1 seharusnya diaktifkan lebih kuat oleh tekanan oksigen yang lebih rendah, harus dikendalikan oleh fenomena oksigen-independen. Untuk menguji fenomena yang menyebabkan kurangnya akumulasi maksimum HIF-1 di daerah anoksik yang terjadi hanya pada model hipoperfusi, kami memeriksa apakah ada hubungan terbalik antara tekanan oksigen dan akumulasi HIF-1 di bawah inkubasi. dengan tekanan oksigen homogen. Analisis western blot dari lisat sel di bawah tekanan oksigen homogen yang berbeda menunjukkan peningkatan akumulasi HIF-1 selama inkubasi anoksik (Gambar 5a). Uji reporter HRE-luciferase juga menunjukkan bahwa akumulasi HIF-1 meningkat dengan tekanan oksigen yang lebih rendah di bawah kondisi tekanan oksigen homogen (Gambar 5b). Hasil ini menunjukkan bahwa akumulasi HIF-1 bergantung pada tekanan oksigen, dengan akumulasi maksimum diamati pada kisaran anoksik. Karakteristik HIF-1 harus bervariasi antara model hipoperfusi dan model dengan tekanan oksigen homogen. Kami berspekulasi bahwa fenomena unik akumulasi HIF-1 dalam model hipoperfusi ini mungkin ditentukan oleh faktor selain tekanan oksigen.

3.5|Pembentukan cincin HIF tidak tergantung pada PhD

Kami memeriksa apakah degradasi HIF-1, kemungkinan mekanisme pembentukan cincin HIF, diregulasi di dalam cincin HIF. Ide ini tampaknya tidak valid, karena hidroksilasi oleh Ph.D., suatu proses yang membatasi laju degradasi HIF, membutuhkan oksigen sebagai substrat. Cobalt chloride banyak digunakan sebagai bahan kimia penstabil HIF. Kami membuat model penutup sel HK-2 yang diberi kobalt klorida dan melakukan analisis ICC terhadap HIF. Sinyal HIF-1 tidak meningkat di dalam cincin HIF, yang menjadi tidak jelas karena peningkatan sinyal HIF-1 di luar cincin (Gambar 6c). ICC sel HK-2 dengan knockdown PHD2, yang diyakini sebagai prolyl hidroksilase HIF utama dalam percobaan kultur sel (Strowitzki et al., 2019), menghasilkan hasil yang serupa (Gambar S6). Hasil ini menunjukkan bahwa sumbu PHD-VHL dari degradasi HIF tidak berhubungan dengan pembentukan cincin HIF.

3.6|Dampak pH pada akumulasi-1 HIF

Laporan sebelumnya menjelaskan penggunaan model kaca penutup miosit jantung yang mengalami penurunan pH di dalam kaca penutup (Pitts & Toombs, 2004). Kami menyelidiki pH di bawah kaca penutup dan dampaknya pada pembentukan cincin HIF. Kami memperlakukan sel HK-2 dengan indikator pH intraseluler, intensitas fluoresensi yang memungkinkan evaluasi pH dalam sel. Pencitraan langsung menunjukkan bahwa pH menurun di sebagian besar area bagian dalam, tetapi tidak di dekat tepi kaca penutup, menunjukkan adanya gradien pH di sekitar tepi dalam model kaca penutup (Gambar 6a). Analisis kuantitatif korelasi antara intensitas fluoresensi dan jarak dari tepi kaca penutup menunjukkan bahwa yang pertama meningkat seiring dengan bertambahnya jarak, sebuah pengamatan yang mendukung keberadaan gradien pH dan oksigen di sekitar tepi kaca penutup (Gambar 6b). Analisis Western blot lisat sel di bawah konsentrasi oksigen homogen menemukan bahwa inkubasi dengan media pH 5,0 menekan akumulasi HIF-1 di bawah kondisi hipoksia (Gambar S7a-d). Kami juga mengkonfirmasi bahwa akumulasi HIF-1 di bawah hipoksia di bawah kondisi pH yang berbeda menurun di bawah pH 6,0 (Gambar S8a-c).

Satu laporan menekankan pentingnya kondisi sedikit asam, pada pH sekitar 6.0. Menurut penelitian ini, reoksigenasi setelah hipoksia mengasamkan media, yang menyebabkan sekuestrasi nukleolus VHL. Pada gilirannya, degradasi HIF dicegah di myotube C2C12, neuron PC12, dan 786-0 sel kanker ginjal (Mekhail et al., 2004). Dalam penelitian kami, tidak ada perubahan dalam distribusi VHL dalam sel tubulus antara daerah dengan akumulasi HIF-1 dan daerah di mana ia ditekan, dalam model kaca penutup dengan nilai pH dari 5.0 hingga 7,4 (Gambar S9a-c). Sel-sel tubular terpapar pada berbagai kondisi pH (Burke et al., 1999; Pavuluri et al., 2019; Raghunand et al., 2003), jadi kami menyelidiki variasi cincin HIF di media pH yang berbeda. nilai antara 5.0 dan 8.5. Cincin HIF terlihat jelas pada media dengan pH 8,5 dan 7,4 (Gambar 6c). Cincin HIF juga ada pada pH 6,5 tetapi dikaburkan (Gambar 6c). Sinyal HIF-1 dilemahkan di seluruh area kaca penutup pada pH 5,0. (Gambar 6c). Kami melakukan analisis kuantitatif lebih lanjut dari hubungan posisi antara cincin HIF dan tepi area positif pimonidazole (Gambar 7a) dan menemukan bahwa posisi cincin bervariasi tergantung pada pH. Lingkaran dalam cenderung melebar keluar pada pH 6,5, dibandingkan dengan pH 7,4, sedangkan lingkaran luar secara signifikan menyusut ke dalam pada pH 8,5, berdasarkan tepi area positif pimonidazole (Gambar 7b,c). Kami juga mengkonfirmasi bahwa aktivitas gen rumah tangga dipertahankan dalam model penutup di bawah inkubasi asam (Gambar S10). Oleh karena itu, pH tampaknya memainkan peran penting dalam mekanisme yang mendasari pembentukan cincin HIF.

4|DISKUSI

Dalam penelitian ini, kami mengidentifikasi distribusi unik HIF-1 dalam sel tubulus ginjal, menggunakan model hipoperfusi yang diinduksi oleh penempatan kaca penutup. Kami menemukan bahwa pembentukan dan pemeliharaan cincin HIF diatur oleh tekanan oksigen dan pH, yang keduanya ada dalam gradien di tepi kaca penutup model kaca penutup. Berdasarkan hasil ini, kami mengusulkan mekanisme yang mungkin untuk pembentukan cincin HIF, yang melibatkan akumulasi HIF-1 dengan penurunan tekanan oksigen, dan akumulasi tersebut ditekan karena pH rendah dalam jarak tertentu dari tepi kaca penutup (Gambar 8 ).

Hipoperfusi diinduksi oleh penghalusan pembuluh darah mikro pada CKD (Mimura & Nangaku, 2{{20}}10; Nangaku, 2006). Dalam pekerjaan kami sebelumnya, kami menggunakan pencitraan in vivo untuk menunjukkan adanya gradien oksigen dalam sel tubulus ginjal ginjal tikus normal (Hirakawa et al., 2018). Ketegangan oksigen juga diharapkan menjadi heterogen dalam sel tubulus pada CKD. Namun, masih belum jelas apakah keberadaan hipoperfusi dengan gradien oksigen mempengaruhi sistem pertahanan terhadap hipoksia, HIF. Dalam penelitian ini, kami menyelidiki distribusi HIF dalam sel tubulus proksimal yang dikultur di bawah model hipoperfusi dan menemukan bahwa gradien oksigen dalam sel tubulus ginjal yang dikultur berhasil dimodelkan menggunakan kaca penutup bundar. Bukti dari percobaan menggunakan tegangan oksigen homogen menunjukkan bahwa HIF-1, yang hidroksilasi dan degradasi selanjutnya terutama bergantung pada oksigen, terakumulasi. Itu adalah jumlah HIF-1 yang meningkat seiring dengan penurunan tegangan oksigen. Namun, dalam model kaca penutup kami, HIF-1 ditekan di area anoksik dan memiliki akumulasi tertinggi pada jarak tertentu dari tepi kaca penutup. Akumulasi HIF berbentuk donat ini belum pernah ditunjukkan sebelumnya. Kami menunjukkan bahwa pembentukan cincin HIF dapat diamati terlepas dari tegangan oksigen dari atmosfer inkubasi, tetapi lokasinya tergantung pada tegangan oksigen. Kisaran tekanan oksigen pada cincin HIF diukur pada sekitar 4-20 mmHg menggunakan PLIM dengan BTPDM1. Sebagian besar penelitian sebelumnya, yang difokuskan pada sel yang dikultur dalam atmosfer dengan tekanan oksigen yang homogen, menemukan bahwa jumlah protein HIF-1 meningkat dalam rentang hipoksia atau anoksik (Ameri et al., 2002; Carrera et al. , 2014). Jadi, dalam model kami, pembentukan cincin HIF pasti dipengaruhi oleh faktor selain tegangan oksigen; itu tidak tergantung pada Ph.D., proses degradasi HIF yang membatasi laju. Sebuah terobosan dalam penjelasan mekanisme pembentukan cincin HIF adalah penemuan kami tentang peran gradien pH, serta gradien oksigen, dalam model penutup-bibir, yang membatasi aliran media yang mirip dengan hipoperfusi in vivo. model. Dalam model hipoperfusi ini, pH intraseluler menurun seiring dengan meningkatnya jarak dari tepi kaca penutup, dan gradien pH diamati di sekitar tepi kaca penutup. Kami menunjukkan bahwa akumulasi HIF-1 ditekan pada pH rendah, sekitar pH 5,0, dibandingkan dengan inkubasi pada sekitar pH netral di bawah tekanan oksigen homogen. Tepi luar cincin HIF melebar ke luar pada pH 6,5, dan tepi dalam cincin HIF menyusut ke dalam pada pH 8,5, berdasarkan tepi area positif pimonidazole. Cincin HIF dikaburkan dalam kondisi asam, dan sinyal HIF-1 menghilang pada pH 5,0. Dengan demikian, kami menjelaskan pentingnya pH untuk pembentukan cincin HIF dalam model kaca penutup. Kami menunjukkan kemungkinan bahwa cincin HIF dibentuk oleh penekanan akumulasi HIF-1 oleh pH rendah di dalam cincin.

Beberapa penelitian sebelumnya yang menggunakan metode kaca penutup telah menggunakan sel kanker. Menurut satu laporan yang menggunakan garis sel hepatoma manusia Hep3B, yang mengekspresikan pergeseran merah yang bergantung pada oksigen dari protein fluoresen hijau (AcGFP1), pencitraan langsung sel yang ditutupi dengan kaca penutup persegi panjang menunjukkan pergeseran merah karena jarak dari tepi kaca penutup meningkat (Takahashi & Sato, 2010). Spektrum emisi sel hepatoma bergeser dari panjang gelombang fluoresensi protein fluoresen hijau (GFP) menjadi merah saat tekanan oksigen menurun. Dalam studi lain, tegangan oksigen sel SCC-7 dengan kaca penutup bulat 15-mm diukur menggunakan teknik seumur hidup fosforesensi. Ketegangan oksigen adalah 6,9 mmHg dan 166 mmHg, dihitung dari PL, masing-masing adalah 3,89 s dan 893 s, 0–2 mm di dalam, dan 0-1 mm di luar tepi kaca penutup (Yoshihara et al., 2015). Metode penutup kaca juga telah digunakan dengan miosit jantung, sebuah sistem yang telah menarik perhatian sebagai model reperfusi iskemia in vivo yang menjanjikan. Kelly et al menunjukkan bahwa miosit yang ditutupi dengan penutup mengalami perubahan morfologi yang nyata dari waktu ke waktu, disertai dengan perubahan potensial membran mitokondria dan dinamika membran plasma, yang akhirnya mengakibatkan kematian miosit. Mereka juga menunjukkan bahwa pH intraseluler miosit yang ditutupi dengan kaca penutup turun dengan cepat hingga kira-kira pH 4 di tengah kaca penutup (Pitts & Toombs, 2004). Model kaca penutup, yang menghambat difusi oksigen atau nutrisi ke sel yang dikultur di bawah kaca penutup, dapat meniru model in vivo dari zona iskemik, normal, dan marginal di bagian tengah, luar, dan tepi kaca penutup masing-masing. Beberapa penelitian telah menggunakan model ini sebagai model iskemia-reperfusi miosit in vitro (Chun et al., 2015; Pitts et al., 2008; Solhjoo & O'Rourke, 2015; Wang et al., 2012). Sejauh pengetahuan kami, penelitian kami adalah yang pertama menerapkan metode kaca penutup pada sel tubulus. Dalam sistem kami, jarak dari tepi kaca penutup ke daerah yang setara dengan 10 mmHg tekanan oksigen, di mana pimonidazole seharusnya menjadi positif, adalah 1,22 mm, dan tekanan oksigen turun hingga serendah nol dalam jarak 2 mm dari tepi kaca penutup. . Hasil ini mungkin kompatibel dengan laporan sebelumnya yang menggunakan kaca penutup sekitar 15 mm, yang menunjukkan adanya gradien oksigen setidaknya dalam jarak 2 mm dari tepi (Akiyama et al., 2018; Yoshihara et al., 2015). Kami memeriksa tingkat apoptosis sel di bawah penutup (Gambar S11) dan menemukan bahwa GAPDH dan aktin dipertahankan bahkan di dalam cincin HIF, menunjukkan bahwa cincin HIF tidak hanya disebabkan oleh apoptosis sel atau kematian di dalam cincin HIF.

Beberapa penelitian telah mengukur tekanan oksigen di ginjal dengan menggunakan metode yang berbeda. Beberapa contoh pengukuran tekanan oksigen ginjal normal adalah sebagai berikut: 50 mmHg dan 30 mmHg di korteks dan medula menggunakan mikroelektroda; dan 49 mmHg dan 41 mmHg pada segmen S1 dan S2 sel tubulus korteks menggunakan PLIM (Hirakawa et al., 2017, 2018; Zhang et al., 2014). Tekanan oksigen pada ginjal yang sakit akan lebih rendah. Menurut laporan sebelumnya menggunakan mikroelektroda oksigen, tikus diabetes memiliki tekanan oksigen parenkim ginjal yang lebih rendah: 36 mmHg dan 11 mmHg di korteks dan medula masing-masing (Heyman et al., 2013; Palm et al., 2003). Karena mikroelektroda oksigen mengukur tegangan oksigen parenkim rata-rata, kisaran yang lebih luas diharapkan pada ginjal yang sakit. Ketegangan oksigen intraseluler menurun menjadi nol mmHg pada model ginjal iskemik yang arteri dan vena ginjal lateralnya dijepit (Hirakawa et al., 2015). Mempertimbangkan temuan ini, kisaran tekanan oksigen pada cincin HIF, sekitar 4-20 mmHg, tampaknya masuk akal secara in vivo.

Kami selanjutnya menemukan bahwa pH mempengaruhi pembentukan cincin HIF serta ketegangan oksigen. Karena sel-sel epitel tubulus di ginjal terus menerus terpapar cairan urin, pH sel-sel tubulus harus dipengaruhi oleh urin. Mempertimbangkan kisaran pH yang luas dalam urin, kami memutuskan untuk mempelajari sel yang diinkubasi pada kisaran pH 5.0–8,5. Ada penelitian tentang kisaran pH pada ginjal normal. Satu studi menemukan bahwa pH korteks adalah 7,39 ± 0.{{10}}8, dan medula adalah 7,20 ± {{2{{39} }}}.09, yang diukur menggunakan mikroelektroda (Burke et al., 1999). Studi lain, menggunakan pencitraan pH berbasis MRI, menunjukkan nilai pH masing-masing 7,3 ± 0.13 dan 7.0 ± 0,29 (Raghunand et al., 2003). Dilaporkan bahwa pH ginjal menurun dari 6,5 menjadi 6,32, dan serendah 5,83 dalam kasus yang parah, pada model tikus CKD dengan asidosis (Pavuluri et al., 2019). Pengamatan ini telah memberikan bukti penurunan pH dan variasi pada CKD. Namun, dampak pH pada HIF-1 yang diinduksi oleh hipoksia kronis pada CKD belum diteliti dengan baik. Dalam penelitian ini, pergeseran cincin HIF diamati antara pH 6,5 dan pH 7,4, kisaran pH yang masuk akal pada CKD. Hasil ini mendukung hipotesis bahwa penurunan pH yang ringan mempengaruhi akumulasi HIF-1 pada CKD. Berdasarkan bukti penurunan pH di bawah 6,0 pada kasus CKD yang parah, perlu juga untuk menilai keadaan fisiologis HIF-1 pada pH yang lebih rendah. Meskipun ada laporan bahwa lingkungan asam, bahkan di normoksia, menstabilkan HIF-1 , sebagian besar laporan ini menyelidiki kondisi keasaman ringan, di atas pH 6,0 (Filatova et al., 2016; Mekhail et al., 2004) . Dalam karya ini, kami menunjukkan penekanan akumulasi HIF-1 dalam sel tubular pada pH 5,0, dan pelemahan sinyal HIF-1 dalam model kaca penutup yang diinkubasi pada pH 5,0. Oleh karena itu, penurunan pH ginjal pada CKD in vivo mungkin berkorelasi dengan aktivasi HIF yang tidak mencukupi, serta dengan racun uremik di ginjal hipoksia, yang memperburuk perkembangan CKD (Tanaka et al., 2013).

Penelitian kami memiliki beberapa keterbatasan. Pertama, di daerah hipoperfusi, media kultur harus kekurangan nutrisi, selain adanya kekurangan oksigen dan penurunan pH. Namun, sulit untuk menggambarkan efek pH, tekanan oksigen, dan faktor lain yang disebabkan oleh hipoperfusi. Di dalam tubuh, iskemia, hipoperfusi patologis darah yang disebabkan oleh kombinasi oksigen rendah dan nutrisi rendah, terjadi pada organ dan sel. Penting untuk memahami perbedaan antara penginderaan hipoksia dan penginderaan iskemia. Terlepas dari kesulitan dalam menjelaskan efek biologis dari masing-masing faktor, model hipoperfusi kami secara fisiologis masuk akal, meniru status patologis in vivo. Kedua, membuat model kaca penutup membutuhkan keterampilan dan latihan, karena sebagian besar sel kadang-kadang terlepas selama pelepasan kaca penutup, terutama bila menggunakan metode tradisional (Gambar S2a). Masalah ini tergantung pada garis sel yang digunakan. Misalnya, sulit bagi kami untuk menerapkan model kaca penutup pada sel HEK 293 karena daya rekatnya pada kaca penutup relatif lemah. Ketiga, diinginkan untuk meminimalkan kerusakan pada sel yang dikultur di bawah kaca penutup. Jumlah sel yang rusak meningkat seiring dengan peningkatan periode sel yang ditutupi, seperti yang ditunjukkan oleh analisis apoptosis. Kami menentukan bahwa 3 jam sesuai untuk memperkirakan cincin HIF ketika tampaknya statis, dan kira-kira hanya 10 persen sel menjadi apoptosis (Gambar S11). Keterbatasan keempat adalah kesulitan menempelkan sel yang dikultur ke kaca penutup dengan cara yang seragam di setiap sampel (Gambar S2b,c). Perbedaan keterikatan antara metode tradisional dan alternatif dalam membuat model penutup bibir juga dapat mempengaruhi penelitian. Kami mengukur rentang tegangan oksigen yang setara dengan cincin HIF dengan teknik masa pakai fosforesensi, di mana kami membuat model kaca penutup menggunakan metode tradisional. Karena cincin HIF selama imunositokimia divisualisasikan menggunakan metode alternatif, tegangan oksigen yang sebenarnya mungkin berbeda. Kami meminimalkan kesalahan ini dengan menggunakan bukti bahwa pimonidazole positif pada tekanan oksigen 10 mmHg atau kurang. Keterbatasan kelima adalah bahwa pH intraseluler tidak selalu sama dengan pH media kultur. Beberapa laporan sebelumnya telah menunjukkan bahwa pH intraseluler konsisten dengan pH sedang sampai batas tertentu dalam sel yang dikultur (Michl et al., 2019), kami hanya dapat menilai tren pH intraseluler dengan mengubah pH media. In vivo, hubungan antara pH daerah intraseluler dan ekstraseluler, seperti urin atau cairan tubuh, lebih rumit daripada di sel yang dikultur. Dengan demikian, studi lebih lanjut tentang cara perubahan pH mengatur akumulasi protein HIF-1 in vivo akan diperlukan untuk masa depan.

Manfaat Cistanche: tingkatkan ginjalfungsi

Keterbatasan lain adalah bahwa pH harus memiliki efek pada penanda hipoksia, pimonidazole. Kami membandingkan jarak tepi area positif pimonidazole dari pusat kaca penutup di bawah kondisi pH yang berbeda dalam model kaca penutup kami. Tepi area positif pimonidazole sebanding antara pH 6,5, 7,4, dan 8,5 (Gambar S12a,b). Sebuah studi sebelumnya juga menunjukkan pemeliharaan ikatan pimonidazole pada nilai pH yang berbeda (Kleiter et al., 2006). Berdasarkan bukti ini, kami menyimpulkan bahwa pimonidazole adalah penanda hipoksia yang tepat untuk percobaan kaca penutup kami. Batasan terakhir adalah bahwa dengan kisaran tekanan oksigen antara kira-kira 4 mmHg dan 20 mmHg (0,52 persen O2 hingga 2,6 persen O2) dari cincin HIF, Pt(II)- dan Pd(II)-porfirin, yang banyak digunakan sebagai bahan biologis. probe oksigen, memiliki keunggulan untuk mengukur konsentrasi oksigen yang sangat rendah karena masa pakai fosforesensinya lebih lama secara signifikan dibandingkan dengan yang menggunakan kompleks Ir(III) (Yoshihara et al., 2017). Namun, secara umum, pengukuran oksigen kuantitatif berdasarkan pendar, dihitung menggunakan persamaan Stern-Volmer, memiliki kinerja yang lebih baik pada rentang O2 rendah (Papkovsky & Zhdanov, 2016). Beberapa penelitian sebelumnya telah menunjukkan pengukuran tekanan oksigen berbasis kompleks Ir(III) serendah sekitar 10 mmHg (Akiyama et al., 2018; Yoshihara et al., 2015). Oleh karena itu, kami percaya bahwa kisaran tegangan oksigen dari cincin HIF harus menjadi hasil yang tepat.

5|KESIMPULAN

Singkatnya, kami menemukan bahwa memahami peran oksigen dan pH sangat penting untuk memahami keadaan fisiologis HIF-1 pada CKD, dan dapat diperoleh dengan menyelidiki sel tubulus dengan hipoperfusi. Model kaca penutup, dengan keterbatasan aliran media, merupakan model hipoperfusi in vivo yang baik, terutama di tubulus pada CKD, karena penghalusan kapiler peritubulus merupakan ciri utama CKD (Mimura & Nangaku, 2010; Nangaku, 2006). Model hipoperfusi ini juga dapat meniru gradien oksigen dan pH in vivo, seperti tumor dan lesi iskemik. Model ini memberikan pendekatan yang menjanjikan untuk penjelasan mekanisme biologis ini.

KONFLIK KEPENTINGAN

Semua penulis tidak memiliki konflik kepentingan untuk dideklarasikan.

KONTRIBUSI PENULIS

Semua penulis berkontribusi pada pembentukan konsep keseluruhan. TH melakukan eksperimen keseluruhan. TH dan YH menganalisis hasilnya dan membuat angka-angkanya. TH menulis naskah aslinya. KM, TY, dan ST melakukan percobaan menggunakan teknik fosforesensi seumur hidup dan mengedit bagian naskah. YH, TT, dan MN mengedit keseluruhan naskah. Semua penulis telah membaca dan menyetujui naskah akhir.

REFERENSI

Akiyama, H., Takahashi, I., Shimoda, Y., Mukai, R., Yoshihara, T., & Tobita, S. (2018). Ir(iii) pencitraan oksigen berbasis kompleks dari sel hidup dan fundus okular dengan kamera ICCD berpagar. Ilmu Fotokimia dan Fotobiologi, 17(6), 846–853.

Akizawa, T., Nangaku, M., Yamaguchi, T., Arai, M., Koretomo, R., Maeda, K., Miyazawa, Y., & Hirakata, H. (2019). Enarodustat, terapi konversi dan pemeliharaan untuk anemia pada pasien hemodialisis: Uji coba fase 2b acak terkontrol plasebo diikuti oleh uji coba jangka panjang. Nefron, 143(2), 77–85.

Ameri, K., Burke, B., Lewis, CE, & Harris, AL (2002). Regulasi elemen VL30 tikus dalam sel kanker payudara manusia pada hipoksia dan anoksia: Peran HIF-1. Jurnal Kanker Inggris, 87 (10), 1173– 1181.

Asai, H., Hirata, J., Hirano, A., Hirai, K., Seki, S., & Watanabe- Akanuma, M. (2016). Aktivasi reseptor aril hidrokarbon menengahi penekanan ekspresi eritropoietin yang bergantung pada faktor hipoksia yang diinduksi oleh indoksil sulfat. Jurnal Fisiologi Amerika. Fisiologi Sel, 310(2), C142–C150.

Burke, TJ, Malhotra, D., & Shapiro, JI (1999). Faktor mempertahankan gradien pH dalam ginjal: peran arsitektur pembuluh darah. Ginjal Internasional, 56(5), 1826–1837.

Carrera, S., Senra, J., Acosta, MI, Althubiti, M., Hammond, EM, de Verdier, PJ, & Macip, S. (2014). Peran HIF-1faktor transkripsi alfa dalam peningkatan pembelahan sel pada tekanan oksigen fisiologis. PLoS Satu, 9(5), e97938.

Chen, N., Hao, C., Peng, X., Lin, H., Yin, A., Hao, L., Tao, Y., Liang, X., Liu, Z., Xing, C., Chen, J., Luo, L., Zuo, L., Liao, Y., Liu, BC, Leong, R., Wang, C., Liu, C., Neff, T., … Yu, KHP (2019 ).

Roxadustat untuk anemia pada pasien dengan penyakit ginjal yang tidak menerima dialisis. Jurnal Kedokteran New England, 381(11), 1001– 1010.

Chen, N., Qian, J., Chen, J., Yu, X., Mei, C., Hao, C., Jiang, G., Lin, H., Zhang, X., Zuo, L., He, Q., Fu, P., Li, X., Ni, D., Hemerich, S., Liu, C., Szczech, L., Besarab, A., Neff, TB, … Valone, F.

H. (2017). Studi fase 2 dari penghambat prolyl hidroksilase faktor hipoksia-diinduksi oral FG-4592 untuk pengobatan anemia di Cina. Nefrologi, Dialisis, Transplantasi, 32(8), 1373–1386.

Chiang, CK, Tanaka, T., Inagi, R., Fujita, T., & Nangaku, M. (2011). Indoksil sulfat, toksin uremik yang representatif, menekan produksi eritropoietin dengan cara yang bergantung pada HIF. Investigasi Laboratorium, 91(11), 1564–1571.

Chun, WJ, Nah, DY, Bae, JH, Chung, JW, Lee, H., & Moon, IS (2015). Larutan glukosa-insulin-kalium melindungi miosit ventrikel tikus neonatus dalam model iskemia/reperfusi selubung penutup in vitro. Jurnal Sirkulasi Korea, 45(3), 234–241.

Coyne, DW, Tukang Emas, D., & Macdougall, IC (2017). Pilihan baru untuk anemia penyakit ginjal kronis. Suplemen Internasional Ginjal, 7(3), 157-163. ciuman.2017.09.002

Deng, A., Arndt, MA, Satriano, J., Singh, P., Rieg, T., Thomson, S. dkk (2010). Perlindungan ginjal pada penyakit ginjal kronis: aktivasi faktor yang diinduksi hipoksia vs. blokade angiotensin II. Jurnal Fisiologi Amerika. Fisiologi Ginjal, 299(6), F1365–F1373.

Filatova, A., Seidel, S., Bogurcu, N., Graf, S., Garvalov, BK, & Acker, T. (2016). Asidosis bekerja melalui HSP90 secara independen Ph.D./VHL untuk meningkatkan fungsi HIF dan pemeliharaan sel induk pada glioma. Penelitian Kanker, 76(19), 5845–5856. BISA-15-2630

Goldfarb, M., Rosenberger, C., Abassi, Z., Shina, A., Zilbersat, F., Eckardt, KU, Rosen, S., & Heyman, SN (2006). Gagal ginjal akut-on- kronis pada tikus: kompensasi fungsional dan toleransi hipoksia. Jurnal Nefrologi Amerika, 26(1), 22–33.

Heyman, SN, Rosenberger, C., Rosen, S., & Khamaisi, M. (2013). Mengapa diabetes mellitus merupakan faktor risiko nefropati akibat kontras? BioMed Penelitian Internasional, 2013, 123589.

Hirakawa, Y., Mizukami, K., Yoshihara, T., Takahashi, I., Khulan, P.,Honda, T., Mimura, I., Tanaka, T., Tobita, S., & Nangaku, M. (2018). Pencitraan fosforesensi intravital seumur hidup dari korteks ginjal secara akurat mengukur hipoksia ginjal. Ginjal Internasional, 93(6), 1483–1489.

Hirakawa, Y., Tanaka, T., & Nangaku, M. (2017). Hipoksia ginjal pada CKD; Patofisiologi dan metode deteksi. Perbatasan dalam Fisiologi, 8, 99.